JP2903853B2 - 新規中性アミラーゼおよびその製造法 - Google Patents
新規中性アミラーゼおよびその製造法Info
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Description
【0001】 [発明の背景]
【産業上の利用分野】本発明は、新規な中性アミラーゼ
およびその製造法ならびに該アミラーゼ産性能を有する
新規細菌に関する。
およびその製造法ならびに該アミラーゼ産性能を有する
新規細菌に関する。
【0002】
【従来の技術】アミラーゼは、デンプンのα−1,4−
グリコシド結合を特異的に加水分解する酵素であり、そ
の性質を利用して特に食品工業で広く用いられている。
とりわけデンプン工業では、実用上の問題から耐熱性の
アミラーゼが要求されており、バシラス属由来の極めて
耐熱性の高い酵素が実用化されている(特公昭46−1
2946号、特公昭53−2955号)。また、このよ
うな耐熱性のアミラーゼは、製パン、製餅などの食品加
工分野にも広く使用されている。
グリコシド結合を特異的に加水分解する酵素であり、そ
の性質を利用して特に食品工業で広く用いられている。
とりわけデンプン工業では、実用上の問題から耐熱性の
アミラーゼが要求されており、バシラス属由来の極めて
耐熱性の高い酵素が実用化されている(特公昭46−1
2946号、特公昭53−2955号)。また、このよ
うな耐熱性のアミラーゼは、製パン、製餅などの食品加
工分野にも広く使用されている。
【0003】一方このような食品加工分野では、近年、
いわゆるソフト化の傾向が顕著であり、ソフトパンなど
の製品が急速に普及し始めている。しかしながら、耐熱
性のアミラーゼは焼き上げの昇温時にその活性が最大と
なってしまい、望ましい性状を著しく損なうことから、
直ちにこれらの製品に応用することはできない。このよ
うな製品に望ましいアミラーゼとしては、中性付近で作
用する性質を有し、かつ、一定の温度以上では速やかに
失活するような耐熱性の低いものが望ましい。
いわゆるソフト化の傾向が顕著であり、ソフトパンなど
の製品が急速に普及し始めている。しかしながら、耐熱
性のアミラーゼは焼き上げの昇温時にその活性が最大と
なってしまい、望ましい性状を著しく損なうことから、
直ちにこれらの製品に応用することはできない。このよ
うな製品に望ましいアミラーゼとしては、中性付近で作
用する性質を有し、かつ、一定の温度以上では速やかに
失活するような耐熱性の低いものが望ましい。
【0004】また、近年食器用あるいは洗濯用洗剤に酵
素が配合され利用されている。しかし、我国においては
食器洗いや洗濯が水によって行なわれる場合が多く、こ
のような用途にアミラーゼを用いる場合には低温におけ
る活性が充分にあることが必要である。しかしながら、
従来のアミラーゼでは、水温(10〜20℃)付近での
活性がほとんど無く、実用化には至っていない。したが
って、このような用途に対しては、低温においても十分
な活性を保持しているアミラーゼが望まれている。
素が配合され利用されている。しかし、我国においては
食器洗いや洗濯が水によって行なわれる場合が多く、こ
のような用途にアミラーゼを用いる場合には低温におけ
る活性が充分にあることが必要である。しかしながら、
従来のアミラーゼでは、水温(10〜20℃)付近での
活性がほとんど無く、実用化には至っていない。したが
って、このような用途に対しては、低温においても十分
な活性を保持しているアミラーゼが望まれている。
【0005】さらに、アミラーゼは研究分析用の試薬と
しても利用されている。例えば、畜産の分野において飼
料中の細胞壁物質の定量は飼料の栄養評価の上で必須で
あるが、ほとんどの飼料がデンプンを含んでおり、前記
定量に先立ちデンプンの除去が必要となる。現在、バシ
ラス・サブチリス由来のアミラーゼがその目的に使用さ
れている。しかし、このアミラーゼはその最大活性をp
H5.8に持つため、まずこのpHにおいて処理が必要
であり、その後プロテアーゼ処理のためpHを7.4に
再調整する必要がある。もし、中性付近に最大活性を示
すアミラーゼが利用できれば、このpHの再調整が不要
となり、操作の簡略化が可能となる。
しても利用されている。例えば、畜産の分野において飼
料中の細胞壁物質の定量は飼料の栄養評価の上で必須で
あるが、ほとんどの飼料がデンプンを含んでおり、前記
定量に先立ちデンプンの除去が必要となる。現在、バシ
ラス・サブチリス由来のアミラーゼがその目的に使用さ
れている。しかし、このアミラーゼはその最大活性をp
H5.8に持つため、まずこのpHにおいて処理が必要
であり、その後プロテアーゼ処理のためpHを7.4に
再調整する必要がある。もし、中性付近に最大活性を示
すアミラーゼが利用できれば、このpHの再調整が不要
となり、操作の簡略化が可能となる。
【0006】以上のような観点から、耐熱性があまり高
くなく、また低温においても十分な活性を保持してお
り、かつ、中性付近に最大活性を有するアミラーゼが望
まれているといえる。
くなく、また低温においても十分な活性を保持してお
り、かつ、中性付近に最大活性を有するアミラーゼが望
まれているといえる。
【0007】 [発明の概要]
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、耐熱
性があまり高くなく、また低温においても十分な活性を
保持しており、かつ、中性付近に最大活性を有する新規
中性アミラーゼを提供することを目的としている。
性があまり高くなく、また低温においても十分な活性を
保持しており、かつ、中性付近に最大活性を有する新規
中性アミラーゼを提供することを目的としている。
【0008】また本発明は、上記中性アミラーゼを産生
する新規微生物およびその微生物を利用した前記中性ア
ミラーゼの製造法を提供することを目的としている。
する新規微生物およびその微生物を利用した前記中性ア
ミラーゼの製造法を提供することを目的としている。
【0009】さらに本発明は、上記中性アミラーゼの製
造法ならびに上記中性アミラーゼ産性能を有する新規微
生物を提供することを目的としている。
造法ならびに上記中性アミラーゼ産性能を有する新規微
生物を提供することを目的としている。
【0010】
【課題を解決するための手段】本発明による中性アミラ
ーゼは、下記の理化学的性質を有するもの、である。 作用および基質特異性:デンプン、アミロース、アミロ
ペクチンおよびそれらの部分分解物のα−1,4−グリ
コシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキストリ
ンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 最適pH:最適作用pHは6.5〜7.5である。 温度安定性:pH7.5、10分間保持の条件下で、3
0℃までは安定であるが、35℃を越える温度において
急速に失活し、45℃において90%以上の活性を失
う。
ーゼは、下記の理化学的性質を有するもの、である。 作用および基質特異性:デンプン、アミロース、アミロ
ペクチンおよびそれらの部分分解物のα−1,4−グリ
コシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキストリ
ンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 最適pH:最適作用pHは6.5〜7.5である。 温度安定性:pH7.5、10分間保持の条件下で、3
0℃までは安定であるが、35℃を越える温度において
急速に失活し、45℃において90%以上の活性を失
う。
【0011】さらに本発明の好ましい態様によれば、本
発明による中性アミラーゼは、下記の理化学的性質をさ
らに有するもの、である。 安定pH:30℃、10分間の条件下でpH6.0〜1
0.5において安定である。 最適温度:最適pHにおいて約40〜45℃である。 温度安定性:pH7.5、カルシウムイオン存在下、1
0分間保持の条件下で、35℃までは安定であるが、4
0℃を越える温度において急速に失活し、50℃におい
て90%以上の活性を失う。 分子量:約53、000(SDS電気泳動法による) 等電点:5.9〜6.1(等電点電気泳動法による)
発明による中性アミラーゼは、下記の理化学的性質をさ
らに有するもの、である。 安定pH:30℃、10分間の条件下でpH6.0〜1
0.5において安定である。 最適温度:最適pHにおいて約40〜45℃である。 温度安定性:pH7.5、カルシウムイオン存在下、1
0分間保持の条件下で、35℃までは安定であるが、4
0℃を越える温度において急速に失活し、50℃におい
て90%以上の活性を失う。 分子量:約53、000(SDS電気泳動法による) 等電点:5.9〜6.1(等電点電気泳動法による)
【0012】また本発明による酵素は低温においても十
分な活性を有しており、10℃で少なくとも40%の活
性を保持し、より好ましい態様によれば少なくとも50
%の活性を保持する。
分な活性を有しており、10℃で少なくとも40%の活
性を保持し、より好ましい態様によれば少なくとも50
%の活性を保持する。
【0013】また、本発明による中性アミラーゼの製造
法は、アクレモニウム属に属し、中性アミラーゼ産性能
を有する微生物を培養し、その培養物から中性アミラー
ゼを採取することを含んでなるものである。
法は、アクレモニウム属に属し、中性アミラーゼ産性能
を有する微生物を培養し、その培養物から中性アミラー
ゼを採取することを含んでなるものである。
【0014】さらに本発明による新規微生物は、pH1
0以上でも生育が可能であり、中性アミラーゼ産性能を
有するアクレモニウムsp.である。
0以上でも生育が可能であり、中性アミラーゼ産性能を
有するアクレモニウムsp.である。
【0015】本発明による中性アミラーゼは、従来アミ
ラーゼを産生することが知られていなかったアルカリ耐
性糸状不完全菌から得られたものである。本発明による
中性アミラーゼは、中性付近に最適pHを有し、熱安定
性も比較的低く、かつ低温でも十分な活性を示すいとい
う特徴を有している。
ラーゼを産生することが知られていなかったアルカリ耐
性糸状不完全菌から得られたものである。本発明による
中性アミラーゼは、中性付近に最適pHを有し、熱安定
性も比較的低く、かつ低温でも十分な活性を示すいとい
う特徴を有している。
【0016】 [発明の具体的説明]新規アミラーゼ産生菌 本発明による新規アミラーゼは微生物を用いて生産され
る。その生産菌としてはアクレモニウム(Acremonium)
属に属し、上記性質を有する酵素を産生する能力を有す
るものであればよい。
る。その生産菌としてはアクレモニウム(Acremonium)
属に属し、上記性質を有する酵素を産生する能力を有す
るものであればよい。
【0017】本発明による中性アミラーゼを産生する能
力を有する微生物の好ましい具体例としては、アクレモ
ニウムsp.TOTO−9202株が挙げられる。この
菌株は、本発明者らにより東京都の一般家屋内の空気中
より分離された糸状不完全菌であり、寄託番号「微工研
菌寄第12820号(FERM P−12820)のも
とに、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
力を有する微生物の好ましい具体例としては、アクレモ
ニウムsp.TOTO−9202株が挙げられる。この
菌株は、本発明者らにより東京都の一般家屋内の空気中
より分離された糸状不完全菌であり、寄託番号「微工研
菌寄第12820号(FERM P−12820)のも
とに、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
【0018】本発明によるTOTO−9202株の菌学
的性質を列挙すれば下記の通りである。 I.形態的性質 1 大型分生子:なし 2 分生子 :楕円形、2〜3×4〜5μm 一細胞性、擬頭状 3 分生子柄 :短い 4 厚膜胞子 :なし 5 菌糸 :細い 6 その他 :分生子柄上に湿潤な分生子塊を形成す
る。
的性質を列挙すれば下記の通りである。 I.形態的性質 1 大型分生子:なし 2 分生子 :楕円形、2〜3×4〜5μm 一細胞性、擬頭状 3 分生子柄 :短い 4 厚膜胞子 :なし 5 菌糸 :細い 6 その他 :分生子柄上に湿潤な分生子塊を形成す
る。
【0019】II.各培地における生育状態 1 ポテト・デキストロース寒天培地 (29℃、11日間培養) 集落直径:58mm 綿毛状、淡ピンク色、裏面無色 2 ツァペック寒天培地 (29℃、11日間培養) 集落直径:60mm 綿毛状、平坦、クリーム〜白色、 裏面中央部黄色、周辺部無色
【0020】III.生理学的性質 1 生育pH範囲:3.0〜11.0 最適生育pH4.0〜10.0、アルカリ耐性 2 生育温度範囲:10〜50℃ 最適生育温度25〜35℃ 3 中性アミラーゼ産性能を有する
【0021】以上の性状より、J.W.CarmichaelらのGene
ra of Hyphomycetes(1980)およびW.GamsらのCephalospo
rium-artige Schimmelpiltze(1971)を参照して検索した
結果、本菌株はアクレモニウム属に属する一菌種である
ことが判明した。このアクレモニウム属は、Gamsにより
詳細な検討がなされ、以前Cephalosporium属として記載
されていた属に代わって近年採用された属名であり、数
多くの種を包含している。しかしながら、本菌株のよう
にpH10以上で生育し、かつ、中性アミラーゼ産性能
を有する菌種は本属中には知られていない。
ra of Hyphomycetes(1980)およびW.GamsらのCephalospo
rium-artige Schimmelpiltze(1971)を参照して検索した
結果、本菌株はアクレモニウム属に属する一菌種である
ことが判明した。このアクレモニウム属は、Gamsにより
詳細な検討がなされ、以前Cephalosporium属として記載
されていた属に代わって近年採用された属名であり、数
多くの種を包含している。しかしながら、本菌株のよう
にpH10以上で生育し、かつ、中性アミラーゼ産性能
を有する菌種は本属中には知られていない。
【0022】従って、本菌株はアクレモニウム属に属す
る新種であると判断し、本菌株をアクレモニウムsp.
TOTO−9202と命名した。
る新種であると判断し、本菌株をアクレモニウムsp.
TOTO−9202と命名した。
【0023】なお、本発明による新規中性アミラーゼの
製造に用いられる微生物は、アクレモニウム属に属し、
上記性質を有する酵素の産生能力を有するものであれば
よく、上記した菌株とその変種、変異株に限定されるも
のではない。
製造に用いられる微生物は、アクレモニウム属に属し、
上記性質を有する酵素の産生能力を有するものであれば
よく、上記した菌株とその変種、変異株に限定されるも
のではない。
【0024】培養条件 上記菌株を培養するための培地は格別である必要はな
く、通常の培地が用いられる。炭素源としては、各種デ
ンプン(例えば、可溶性デンプン、デンプン液化液な
ど)、デキストリン、アミロペクチン、アミロースなど
が用いられる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム
塩などの無機物、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキ
ス、ダイズ粉、コーン・スティープ・リカー、カゼイ
ン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これらの炭
素源や窒素源のほかに、各種の塩、例えばマグネシウム
塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩等が必要に応
じて添加されてよい。さらに、別に殺菌した炭酸水素ナ
トリウムまたは炭酸ナトリウムなどを添加して培地のp
Hをアルカリ性にするのが好ましい。
く、通常の培地が用いられる。炭素源としては、各種デ
ンプン(例えば、可溶性デンプン、デンプン液化液な
ど)、デキストリン、アミロペクチン、アミロースなど
が用いられる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム
塩などの無機物、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキ
ス、ダイズ粉、コーン・スティープ・リカー、カゼイ
ン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これらの炭
素源や窒素源のほかに、各種の塩、例えばマグネシウム
塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩等が必要に応
じて添加されてよい。さらに、別に殺菌した炭酸水素ナ
トリウムまたは炭酸ナトリウムなどを添加して培地のp
Hをアルカリ性にするのが好ましい。
【0025】培養は上記のような培地中で、培養温度2
0〜50℃、好ましくは25〜35℃で3〜7日間、好
気的に攪はんまたは振とうしながら培養する。
0〜50℃、好ましくは25〜35℃で3〜7日間、好
気的に攪はんまたは振とうしながら培養する。
【0026】本発明による中性アミラーゼは、上記のよ
うな条件のものでの培養によって、主として培養液中に
分泌され蓄積される。さらに、本発明による中性アミラ
ーゼは基質誘導法により効率よく菌体外に分泌される性
質を有している。
うな条件のものでの培養によって、主として培養液中に
分泌され蓄積される。さらに、本発明による中性アミラ
ーゼは基質誘導法により効率よく菌体外に分泌される性
質を有している。
【0027】酵素の採取 上記培養液からの本発明による中性アミラーゼの採取、
精製には、既知の精製法が単独もしくは併用して利用で
きる。
精製には、既知の精製法が単独もしくは併用して利用で
きる。
【0028】本発明による中性アミラーゼは、主として
菌体外、すなわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘
過または遠心分離により菌体を除去することによって容
易に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さら
に既知の精製法によって精製することができる。好まし
い精製法としては、硫安などによる塩析、有機溶媒(例
えば、メタノール、エタノール、アセトンなど)による
沈殿法、生デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
その他の各種クロマトグラフィーなどが挙げられる。
菌体外、すなわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘
過または遠心分離により菌体を除去することによって容
易に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さら
に既知の精製法によって精製することができる。好まし
い精製法としては、硫安などによる塩析、有機溶媒(例
えば、メタノール、エタノール、アセトンなど)による
沈殿法、生デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
その他の各種クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【0029】より好ましい精製法を挙げれば次の通りで
ある。まず、培養瀘液に80%飽和硫安を添加して塩析
を行い、得られた沈殿を透析する。ついで、DEAE−
トヨパール(東ソー社製)カラムによるクロマトグラフ
ィー(pH8.0、0〜0.6M NaCl濃度勾配)
を行う。透析後、Mono−Qカラム(FPLC、ファ
ルマシア社製)によるクロマトグラフィー(pH8.
0、0〜0.6M NaCl濃度勾配)を行い、透析後
にセファデックスG−75(ファルマシア社製)カラム
によるゲル瀘過クロマトグラフィーを行うことによっ
て、SDS電気泳動的に均一な精製酵素を得ることがで
きる。
ある。まず、培養瀘液に80%飽和硫安を添加して塩析
を行い、得られた沈殿を透析する。ついで、DEAE−
トヨパール(東ソー社製)カラムによるクロマトグラフ
ィー(pH8.0、0〜0.6M NaCl濃度勾配)
を行う。透析後、Mono−Qカラム(FPLC、ファ
ルマシア社製)によるクロマトグラフィー(pH8.
0、0〜0.6M NaCl濃度勾配)を行い、透析後
にセファデックスG−75(ファルマシア社製)カラム
によるゲル瀘過クロマトグラフィーを行うことによっ
て、SDS電気泳動的に均一な精製酵素を得ることがで
きる。
【0030】酵素の性質 本発明による中性アミラーゼの性質を検討した。その結
果は次に示される通りである。なお、以下において活性
測定法とは次の方法をいうものとする。
果は次に示される通りである。なお、以下において活性
測定法とは次の方法をいうものとする。
【0031】(活性測定法)蒸留水に溶解させた1%の
可溶性デンプンを基質として使用する。基質溶液500
μlに0.2M MOPS緩衝液(pH7.5)300
μlを加え、適当に希釈した酵素液200μlを添加し
て、37℃で10分間反応させた後、反応液200μl
を、DNS試薬(ジニトロサリチル酸)600μlが入
った試験管に入れ反応を停止させる。これを煮沸湯浴中
で10分間加熱して、室温まで冷却した後、蒸留水4.
2mlを加えて波長540nmの吸光度を測定する。酵素の
1単位は、1μMのグルコースに相当する吸光度を増加
させる酵素量とする。
可溶性デンプンを基質として使用する。基質溶液500
μlに0.2M MOPS緩衝液(pH7.5)300
μlを加え、適当に希釈した酵素液200μlを添加し
て、37℃で10分間反応させた後、反応液200μl
を、DNS試薬(ジニトロサリチル酸)600μlが入
った試験管に入れ反応を停止させる。これを煮沸湯浴中
で10分間加熱して、室温まで冷却した後、蒸留水4.
2mlを加えて波長540nmの吸光度を測定する。酵素の
1単位は、1μMのグルコースに相当する吸光度を増加
させる酵素量とする。
【0032】 作用および基質特異性 可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチンをそれぞ
れ基質として、活性測定法に準じて酵素反応を行った。
反応液を経時的に採り、HPTLCにより反応生成物を
調べた。その結果、本発明による酵素はデンプンの他に
アミロース、アミロペクチンおよびそれらの部分分解物
に作用して、α−1,4−グリコシド結合を特異的に加
水分解(エンド型分解)して、主としてデキストリンお
よびマルトオリゴ糖を生成することが分かった。
れ基質として、活性測定法に準じて酵素反応を行った。
反応液を経時的に採り、HPTLCにより反応生成物を
調べた。その結果、本発明による酵素はデンプンの他に
アミロース、アミロペクチンおよびそれらの部分分解物
に作用して、α−1,4−グリコシド結合を特異的に加
水分解(エンド型分解)して、主としてデキストリンお
よびマルトオリゴ糖を生成することが分かった。
【0033】 最適pHおよび安定pH 本酵素を用いてpH4〜11の範囲のpH条件下で活性
測定法に準じて酵素反応を行った。なお、緩衝液として
は、ブリットン‐ロビンソン(Britton‐Rob
inson)広域緩衝液を使用した。その相対活性は図
1に示されるとおりである。図1より、本酵素の最適p
Hは30℃において約6.5〜7.5であることが分か
る。
測定法に準じて酵素反応を行った。なお、緩衝液として
は、ブリットン‐ロビンソン(Britton‐Rob
inson)広域緩衝液を使用した。その相対活性は図
1に示されるとおりである。図1より、本酵素の最適p
Hは30℃において約6.5〜7.5であることが分か
る。
【0034】また、本酵素をブリットン‐ロビンソン広
域緩衝液に加え、37℃で30分間保持した後、その残
存活性を測定した。その結果は図2に示されるとおりで
ある。図2からは本酵素の安定pH域は、30℃で10
分間の加熱条件下においてpH6.0〜10.5である
ことが分かる。
域緩衝液に加え、37℃で30分間保持した後、その残
存活性を測定した。その結果は図2に示されるとおりで
ある。図2からは本酵素の安定pH域は、30℃で10
分間の加熱条件下においてpH6.0〜10.5である
ことが分かる。
【0035】 最適温度および安定温度 本酵素を用いて10〜60℃の範囲の温度条件下で、活
性測定法に準じて酵素反応を行った。その相対活性を図
3に示す。図3から、pH7.5における本酵素の最適
温度は約40〜45℃であることが分かる。
性測定法に準じて酵素反応を行った。その相対活性を図
3に示す。図3から、pH7.5における本酵素の最適
温度は約40〜45℃であることが分かる。
【0036】本酵素を1mM塩化カルシウム添加又は無添
加の条件下でMOPS緩衝液(pH7.5)に加え、2
0〜50℃の範囲の温度条件下で10分間保持した後の
残存活性を測定した。その結果は図4に示されるとおり
である。図4において、○…○はカルシウムイオン非存
在下であり、●−●はカルシウムイオン存在下の残存活
性である。図4から、本酵素はカルシウムイオン非存在
下で30℃まで、カルシウムイオン非存在下で35℃ま
で安定であることが分かる。
加の条件下でMOPS緩衝液(pH7.5)に加え、2
0〜50℃の範囲の温度条件下で10分間保持した後の
残存活性を測定した。その結果は図4に示されるとおり
である。図4において、○…○はカルシウムイオン非存
在下であり、●−●はカルシウムイオン存在下の残存活
性である。図4から、本酵素はカルシウムイオン非存在
下で30℃まで、カルシウムイオン非存在下で35℃ま
で安定であることが分かる。
【0037】 分子量 本酵素の分子量をSDS電気泳動法によって測定したと
ころ、分子量は約53,000であった。
ころ、分子量は約53,000であった。
【0038】 等電点 本酵素の等電点を等電点電気泳動法で測定したところ、
等電点は5.94であった。
等電点は5.94であった。
【0039】次に、本酵素と、これまでに報告されてい
る糸状菌由来のアミラーゼとの比較を行った。第1表に
各種アミラーゼの特徴(最適pH、最適温度、安定p
H、安定温度、分子量および等電点)を示す。
る糸状菌由来のアミラーゼとの比較を行った。第1表に
各種アミラーゼの特徴(最適pH、最適温度、安定p
H、安定温度、分子量および等電点)を示す。
【0040】
【表1】
【0041】第1表から、本酵素の最適pHは6.5〜
7.5であり、他のいずれのアミラーゼの最適pHより
も高く、これらの酵素とは明らかに異なることが分か
る。本酵素と他のアスペルギルス属由来のアミラーゼと
は分子量において類似している。しかしながら、本酵素
はこれらのアミラーゼとは等電点が大幅に異なる上に、
かつ最適pHも0.5〜2.5の差がある。したがっ
て、本発明のアミラーゼは、既知のアミラーゼのいずれ
とも異なる新規な酵素である。
7.5であり、他のいずれのアミラーゼの最適pHより
も高く、これらの酵素とは明らかに異なることが分か
る。本酵素と他のアスペルギルス属由来のアミラーゼと
は分子量において類似している。しかしながら、本酵素
はこれらのアミラーゼとは等電点が大幅に異なる上に、
かつ最適pHも0.5〜2.5の差がある。したがっ
て、本発明のアミラーゼは、既知のアミラーゼのいずれ
とも異なる新規な酵素である。
【0042】
【実施例】本発明を以下の実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0043】実施例1 粗酵素粉末の調製 アクレモニウムsp. TOTO−9202株の前培養
液50ml(28℃、4日間振とう培養)を、可溶性デン
プン 1%、酵母エキス 0.1%、NaNO3 0.
3%、KH2PO4 0.03%、MgSO4・7H2
O 0.02%、CaCl2 0.02%、FeSO4
・7H2O 0.0001%および、別殺菌して添加し
たNaHCO3 1%を含有する培地(pH9.5)
5.51を入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、
28℃で5日間、通気量1v/v/min 、回転数200
rpmで培養を行った。培養終了後、培養液を8,00
0rpm10分間遠心分離して菌体を除去した。得られ
た上清液を凍結乾燥して、5.2単位/mgの粗酵素粉末
を2g得た。
液50ml(28℃、4日間振とう培養)を、可溶性デン
プン 1%、酵母エキス 0.1%、NaNO3 0.
3%、KH2PO4 0.03%、MgSO4・7H2
O 0.02%、CaCl2 0.02%、FeSO4
・7H2O 0.0001%および、別殺菌して添加し
たNaHCO3 1%を含有する培地(pH9.5)
5.51を入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、
28℃で5日間、通気量1v/v/min 、回転数200
rpmで培養を行った。培養終了後、培養液を8,00
0rpm10分間遠心分離して菌体を除去した。得られ
た上清液を凍結乾燥して、5.2単位/mgの粗酵素粉末
を2g得た。
【0044】実施例2 精製酵素の調製 実施例1と同様の培地5.5Lをいれた小型ジャーファ
ーメンターに、アクレモニウムsp. TOTO−92
02株の前培養液50mlを植菌した。これを実施例1と
同様に培養した後、遠心分離により上清液5Lを得た。
ーメンターに、アクレモニウムsp. TOTO−92
02株の前培養液50mlを植菌した。これを実施例1と
同様に培養した後、遠心分離により上清液5Lを得た。
【0045】この上清液のpH7.5におけるアミラー
ゼ活性は2.1単位/mlであった。次いで、この上清液
に硫安粉末を80%飽和になるまで加え、8000rp
mで10分間遠心分離してその沈澱を回収した。この沈
澱を20mM トリス緩衝液(pH8.0)に溶解し、同
緩衝液に対して透析を行った。その後、透析内液を20
mM トリス緩衝液(pH8.0)で平衡化したDEAE
‐トヨパールカラム(φ5×30cm)に通じて活性画分
を吸着させ、0〜0.5M のNaCL 濃度勾配で溶出さ
せた。活性画分を透析後、Mono−Qカラム(pH
8.0、ファルマシア社製)を用いたFPLCを行い、
吸着画分を0〜0.6M NaCl濃度勾配により溶出
させた。活性画分を透析後低温下において減圧濃縮を行
い、20mMトリス緩衝液(pH8.0)で平衡化したセ
ファデックスG−75カラム(φ2×60cm)によりゲ
ル濾過を行った。活性画分を回収することにより、11
8単位/mlの精製酵素液30mlを得た。これは、SDS
電気泳動的にもゲル濾過的にもそれぞれ単一バンドおよ
び単一ピークを示し、酵素タンパク質として均一である
ことが確認された。
ゼ活性は2.1単位/mlであった。次いで、この上清液
に硫安粉末を80%飽和になるまで加え、8000rp
mで10分間遠心分離してその沈澱を回収した。この沈
澱を20mM トリス緩衝液(pH8.0)に溶解し、同
緩衝液に対して透析を行った。その後、透析内液を20
mM トリス緩衝液(pH8.0)で平衡化したDEAE
‐トヨパールカラム(φ5×30cm)に通じて活性画分
を吸着させ、0〜0.5M のNaCL 濃度勾配で溶出さ
せた。活性画分を透析後、Mono−Qカラム(pH
8.0、ファルマシア社製)を用いたFPLCを行い、
吸着画分を0〜0.6M NaCl濃度勾配により溶出
させた。活性画分を透析後低温下において減圧濃縮を行
い、20mMトリス緩衝液(pH8.0)で平衡化したセ
ファデックスG−75カラム(φ2×60cm)によりゲ
ル濾過を行った。活性画分を回収することにより、11
8単位/mlの精製酵素液30mlを得た。これは、SDS
電気泳動的にもゲル濾過的にもそれぞれ単一バンドおよ
び単一ピークを示し、酵素タンパク質として均一である
ことが確認された。
【図1】本発明による中性アミラーゼの最適pHを示す
グラフである。
グラフである。
【図2】本発明による中性アミラーゼの安定pHを示す
グラフである。
グラフである。
【図3】本発明による中性アミラーゼの最適温度を示す
グラフである。
グラフである。
【図4】本発明による中性アミラーゼの安定温度範囲を
示すグラフである。
示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12N 9/30 C12R 1:645) (72)発明者 満 生 慎 二 福岡県北九州市小倉北区中島二丁目1番 1号 東陶機器株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 9/26 - 9/34 C11D 3/386 C12N 1/14 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)
Claims (13)
- 【請求項1】下記の理化学的性質を有する中性アミラー
ゼ。 ・ 作用および基質特異性:デンプン、アミロース、ア
ミロペクチンおよびそれらの部分分解物のα−1,4−
グリコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキス
トリンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 ・ 最適pH:最適作用pHは6.5〜7.5である。 ・ 温度安定性:pH7.5、10分間保持の条件下
で、30℃までは安定であるが、35℃を越える温度に
おいて急速に失活し、45℃において90%以上の活性
を失う。 ・ SDS電気泳動法による分子量が約53,000で
ある。 - 【請求項2】下記の理化学的性質をさらに有する、請求
項1記載の中性アミラーゼ。 ・ 安定pH:30℃、10分間保持の条件下でpH
6.0〜10.5において安定である。 ・ 最適温度:最適pHにおいて約40〜45℃であ
る。 ・ 温度安定性:pH7.5、カルシウムイオン存在
下、10分間保持の条件下で、35℃までは安定である
が、40℃を越える温度において急速に失活し、50℃
において90%以上の活性を失う。 - 【請求項3】等電点電気泳動法による等電点が5.9〜
6.1である、請求項1記載の中性アミラーゼ。 - 【請求項4】10℃で少なくとも40%の活性を保持す
る、請求項1記載の中性アミラーゼ。 - 【請求項5】アクレモニウム属に属し、中性アミラーゼ
産性能を有する微生物を培養し、その培養物から中性ア
ミラーゼを採取することを含んでなる、請求項1記載の
中性アミラーゼの製造法。 - 【請求項6】培養がpH8.0〜11.0で行われる、
請求項6記載の中性アミラーゼの製造法。 - 【請求項7】pH10以上でも生育が可能であり、請求
項1に記載の中性アミラーゼ産性能を有するアクレモニ
ウムsp.TOTO−9202株(FERM P−12
820)。 - 【請求項8】微生物が請求項7記載のアクレモニウムs
p.である、請求項5記載の中性アミラーゼの製造法。 - 【請求項9】請求項1〜4のいずれか一項に記載の中性
アミラーゼを有効成分として含んでなる、アミラーゼ製
剤。 - 【請求項10】食品加工に用いられる、請求項9に記載
のアミラーゼ製剤。 - 【請求項11】分析試薬として用いられる、請求項9に
記載のアミラーゼ製剤。 - 【請求項12】洗剤添加剤として用いられる、請求項9
に記載のアミラーゼ製剤。 - 【請求項13】請求項12に記載のアミラーゼ製剤を含
んでなる、食品用または洗濯用洗剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9114292A JP2903853B2 (ja) | 1992-04-10 | 1992-04-10 | 新規中性アミラーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9114292A JP2903853B2 (ja) | 1992-04-10 | 1992-04-10 | 新規中性アミラーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05284968A JPH05284968A (ja) | 1993-11-02 |
JP2903853B2 true JP2903853B2 (ja) | 1999-06-14 |
Family
ID=14018280
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9114292A Expired - Fee Related JP2903853B2 (ja) | 1992-04-10 | 1992-04-10 | 新規中性アミラーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2903853B2 (ja) |
-
1992
- 1992-04-10 JP JP9114292A patent/JP2903853B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05284968A (ja) | 1993-11-02 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |