JP2903853B2 - 新規中性アミラーゼおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ［発明の背景］

【産業上の利用分野】本発明は、新規な中性アミラーゼ
およびその製造法ならびに該アミラーゼ産性能を有する
新規細菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミラーゼは、デンプンのα−１，４−
グリコシド結合を特異的に加水分解する酵素であり、そ
の性質を利用して特に食品工業で広く用いられている。
とりわけデンプン工業では、実用上の問題から耐熱性の
アミラーゼが要求されており、バシラス属由来の極めて
耐熱性の高い酵素が実用化されている（特公昭４６−１
２９４６号、特公昭５３−２９５５号）。また、このよ
うな耐熱性のアミラーゼは、製パン、製餅などの食品加
工分野にも広く使用されている。

【０００３】一方このような食品加工分野では、近年、
いわゆるソフト化の傾向が顕著であり、ソフトパンなど
の製品が急速に普及し始めている。しかしながら、耐熱
性のアミラーゼは焼き上げの昇温時にその活性が最大と
なってしまい、望ましい性状を著しく損なうことから、
直ちにこれらの製品に応用することはできない。このよ
うな製品に望ましいアミラーゼとしては、中性付近で作
用する性質を有し、かつ、一定の温度以上では速やかに
失活するような耐熱性の低いものが望ましい。

【０００４】また、近年食器用あるいは洗濯用洗剤に酵
素が配合され利用されている。しかし、我国においては
食器洗いや洗濯が水によって行なわれる場合が多く、こ
のような用途にアミラーゼを用いる場合には低温におけ
る活性が充分にあることが必要である。しかしながら、
従来のアミラーゼでは、水温（１０〜２０℃）付近での
活性がほとんど無く、実用化には至っていない。したが
って、このような用途に対しては、低温においても十分
な活性を保持しているアミラーゼが望まれている。

【０００５】さらに、アミラーゼは研究分析用の試薬と
しても利用されている。例えば、畜産の分野において飼
料中の細胞壁物質の定量は飼料の栄養評価の上で必須で
あるが、ほとんどの飼料がデンプンを含んでおり、前記
定量に先立ちデンプンの除去が必要となる。現在、バシ
ラス・サブチリス由来のアミラーゼがその目的に使用さ
れている。しかし、このアミラーゼはその最大活性をｐ
Ｈ５．８に持つため、まずこのｐＨにおいて処理が必要
であり、その後プロテアーゼ処理のためｐＨを７．４に
再調整する必要がある。もし、中性付近に最大活性を示
すアミラーゼが利用できれば、このｐＨの再調整が不要
となり、操作の簡略化が可能となる。

【０００６】以上のような観点から、耐熱性があまり高
くなく、また低温においても十分な活性を保持してお
り、かつ、中性付近に最大活性を有するアミラーゼが望
まれているといえる。

【０００７】 ［発明の概要］

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、耐熱
性があまり高くなく、また低温においても十分な活性を
保持しており、かつ、中性付近に最大活性を有する新規
中性アミラーゼを提供することを目的としている。

【０００８】また本発明は、上記中性アミラーゼを産生
する新規微生物およびその微生物を利用した前記中性ア
ミラーゼの製造法を提供することを目的としている。

【０００９】さらに本発明は、上記中性アミラーゼの製
造法ならびに上記中性アミラーゼ産性能を有する新規微
生物を提供することを目的としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明による中性アミラ
ーゼは、下記の理化学的性質を有するもの、である。 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、アミロ
ペクチンおよびそれらの部分分解物のα−１，４−グリ
コシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキストリ
ンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 最適ｐＨ：最適作用ｐＨは６．５〜７．５である。 温度安定性：ｐＨ７．５、１０分間保持の条件下で、３
０℃までは安定であるが、３５℃を越える温度において
急速に失活し、４５℃において９０％以上の活性を失
う。

【００１１】さらに本発明の好ましい態様によれば、本
発明による中性アミラーゼは、下記の理化学的性質をさ
らに有するもの、である。 安定ｐＨ：３０℃、１０分間の条件下でｐＨ６．０〜１
０．５において安定である。 最適温度：最適ｐＨにおいて約４０〜４５℃である。 温度安定性：ｐＨ７．５、カルシウムイオン存在下、１
０分間保持の条件下で、３５℃までは安定であるが、４
０℃を越える温度において急速に失活し、５０℃におい
て９０％以上の活性を失う。 分子量：約５３、０００（ＳＤＳ電気泳動法による） 等電点：５．９〜６．１（等電点電気泳動法による）

【００１２】また本発明による酵素は低温においても十
分な活性を有しており、１０℃で少なくとも４０％の活
性を保持し、より好ましい態様によれば少なくとも５０
％の活性を保持する。

【００１３】また、本発明による中性アミラーゼの製造
法は、アクレモニウム属に属し、中性アミラーゼ産性能
を有する微生物を培養し、その培養物から中性アミラー
ゼを採取することを含んでなるものである。

【００１４】さらに本発明による新規微生物は、ｐＨ１
０以上でも生育が可能であり、中性アミラーゼ産性能を
有するアクレモニウムｓｐ．である。

【００１５】本発明による中性アミラーゼは、従来アミ
ラーゼを産生することが知られていなかったアルカリ耐
性糸状不完全菌から得られたものである。本発明による
中性アミラーゼは、中性付近に最適ｐＨを有し、熱安定
性も比較的低く、かつ低温でも十分な活性を示すいとい
う特徴を有している。

【００１６】 ［発明の具体的説明］新規アミラーゼ産生菌 本発明による新規アミラーゼは微生物を用いて生産され
る。その生産菌としてはアクレモニウム（Acremonium）
属に属し、上記性質を有する酵素を産生する能力を有す
るものであればよい。

【００１７】本発明による中性アミラーゼを産生する能
力を有する微生物の好ましい具体例としては、アクレモ
ニウムｓｐ．ＴＯＴＯ−９２０２株が挙げられる。この
菌株は、本発明者らにより東京都の一般家屋内の空気中
より分離された糸状不完全菌であり、寄託番号「微工研
菌寄第１２８２０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２８２０）のも
とに、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。

【００１８】本発明によるＴＯＴＯ−９２０２株の菌学
的性質を列挙すれば下記の通りである。 Ｉ．形態的性質 １ 大型分生子：なし ２ 分生子 ：楕円形、２〜３×４〜５μｍ 一細胞性、擬頭状 ３ 分生子柄 ：短い ４ 厚膜胞子 ：なし ５ 菌糸 ：細い ６ その他 ：分生子柄上に湿潤な分生子塊を形成す
る。

【００１９】II．各培地における生育状態 １ ポテト・デキストロース寒天培地 （２９℃、１１日間培養） 集落直径：５８mm 綿毛状、淡ピンク色、裏面無色 ２ ツァペック寒天培地 （２９℃、１１日間培養） 集落直径：６０mm 綿毛状、平坦、クリーム〜白色、 裏面中央部黄色、周辺部無色

【００２０】III.生理学的性質 １ 生育ｐＨ範囲：３．０〜１１．０ 最適生育ｐＨ４．０〜１０．０、アルカリ耐性 ２ 生育温度範囲：１０〜５０℃ 最適生育温度２５〜３５℃ ３ 中性アミラーゼ産性能を有する

【００２１】以上の性状より、J.W.CarmichaelらのGene
ra of Hyphomycetes(1980)およびW.GamsらのCephalospo
rium-artige Schimmelpiltze(1971)を参照して検索した
結果、本菌株はアクレモニウム属に属する一菌種である
ことが判明した。このアクレモニウム属は、Gamsにより
詳細な検討がなされ、以前Cephalosporium属として記載
されていた属に代わって近年採用された属名であり、数
多くの種を包含している。しかしながら、本菌株のよう
にｐＨ１０以上で生育し、かつ、中性アミラーゼ産性能
を有する菌種は本属中には知られていない。

【００２２】従って、本菌株はアクレモニウム属に属す
る新種であると判断し、本菌株をアクレモニウムｓｐ．
ＴＯＴＯ−９２０２と命名した。

【００２３】なお、本発明による新規中性アミラーゼの
製造に用いられる微生物は、アクレモニウム属に属し、
上記性質を有する酵素の産生能力を有するものであれば
よく、上記した菌株とその変種、変異株に限定されるも
のではない。

【００２４】培養条件 上記菌株を培養するための培地は格別である必要はな
く、通常の培地が用いられる。炭素源としては、各種デ
ンプン（例えば、可溶性デンプン、デンプン液化液な
ど）、デキストリン、アミロペクチン、アミロースなど
が用いられる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム
塩などの無機物、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキ
ス、ダイズ粉、コーン・スティープ・リカー、カゼイ
ン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これらの炭
素源や窒素源のほかに、各種の塩、例えばマグネシウム
塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩等が必要に応
じて添加されてよい。さらに、別に殺菌した炭酸水素ナ
トリウムまたは炭酸ナトリウムなどを添加して培地のｐ
Ｈをアルカリ性にするのが好ましい。

【００２５】培養は上記のような培地中で、培養温度２
０〜５０℃、好ましくは２５〜３５℃で３〜７日間、好
気的に攪はんまたは振とうしながら培養する。

【００２６】本発明による中性アミラーゼは、上記のよ
うな条件のものでの培養によって、主として培養液中に
分泌され蓄積される。さらに、本発明による中性アミラ
ーゼは基質誘導法により効率よく菌体外に分泌される性
質を有している。

【００２７】酵素の採取 上記培養液からの本発明による中性アミラーゼの採取、
精製には、既知の精製法が単独もしくは併用して利用で
きる。

【００２８】本発明による中性アミラーゼは、主として
菌体外、すなわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘
過または遠心分離により菌体を除去することによって容
易に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さら
に既知の精製法によって精製することができる。好まし
い精製法としては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例
えば、メタノール、エタノール、アセトンなど）による
沈殿法、生デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
その他の各種クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００２９】より好ましい精製法を挙げれば次の通りで
ある。まず、培養瀘液に８０％飽和硫安を添加して塩析
を行い、得られた沈殿を透析する。ついで、ＤＥＡＥ−
トヨパール（東ソー社製）カラムによるクロマトグラフ
ィー（ｐＨ８．０、０〜０．６Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配）
を行う。透析後、Ｍｏｎｏ−Ｑカラム（ＦＰＬＣ、ファ
ルマシア社製）によるクロマトグラフィー（ｐＨ８．
０、０〜０．６Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配）を行い、透析後
にセファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）カラム
によるゲル瀘過クロマトグラフィーを行うことによっ
て、ＳＤＳ電気泳動的に均一な精製酵素を得ることがで
きる。

【００３０】酵素の性質 本発明による中性アミラーゼの性質を検討した。その結
果は次に示される通りである。なお、以下において活性
測定法とは次の方法をいうものとする。

【００３１】（活性測定法）蒸留水に溶解させた１％の
可溶性デンプンを基質として使用する。基質溶液５００
μｌに０．２Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）３００
μｌを加え、適当に希釈した酵素液２００μｌを添加し
て、３７℃で１０分間反応させた後、反応液２００μｌ
を、ＤＮＳ試薬（ジニトロサリチル酸）６００μｌが入
った試験管に入れ反応を停止させる。これを煮沸湯浴中
で１０分間加熱して、室温まで冷却した後、蒸留水４．
２mlを加えて波長５４０nmの吸光度を測定する。酵素の
１単位は、１μＭのグルコースに相当する吸光度を増加
させる酵素量とする。

【００３２】 作用および基質特異性 可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチンをそれぞ
れ基質として、活性測定法に準じて酵素反応を行った。
反応液を経時的に採り、ＨＰＴＬＣにより反応生成物を
調べた。その結果、本発明による酵素はデンプンの他に
アミロース、アミロペクチンおよびそれらの部分分解物
に作用して、α−１，４−グリコシド結合を特異的に加
水分解（エンド型分解）して、主としてデキストリンお
よびマルトオリゴ糖を生成することが分かった。

【００３３】 最適ｐＨおよび安定ｐＨ 本酵素を用いてｐＨ４〜１１の範囲のｐＨ条件下で活性
測定法に準じて酵素反応を行った。なお、緩衝液として
は、ブリットン‐ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎ）広域緩衝液を使用した。その相対活性は図
１に示されるとおりである。図１より、本酵素の最適ｐ
Ｈは３０℃において約６．５〜７．５であることが分か
る。

【００３４】また、本酵素をブリットン‐ロビンソン広
域緩衝液に加え、３７℃で３０分間保持した後、その残
存活性を測定した。その結果は図２に示されるとおりで
ある。図２からは本酵素の安定ｐＨ域は、３０℃で１０
分間の加熱条件下においてｐＨ６．０〜１０．５である
ことが分かる。

【００３５】 最適温度および安定温度 本酵素を用いて１０〜６０℃の範囲の温度条件下で、活
性測定法に準じて酵素反応を行った。その相対活性を図
３に示す。図３から、ｐＨ７．５における本酵素の最適
温度は約４０〜４５℃であることが分かる。

【００３６】本酵素を１mM塩化カルシウム添加又は無添
加の条件下でＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に加え、２
０〜５０℃の範囲の温度条件下で１０分間保持した後の
残存活性を測定した。その結果は図４に示されるとおり
である。図４において、○…○はカルシウムイオン非存
在下であり、●−●はカルシウムイオン存在下の残存活
性である。図４から、本酵素はカルシウムイオン非存在
下で３０℃まで、カルシウムイオン非存在下で３５℃ま
で安定であることが分かる。

【００３７】 分子量 本酵素の分子量をＳＤＳ電気泳動法によって測定したと
ころ、分子量は約５３，０００であった。

【００３８】 等電点 本酵素の等電点を等電点電気泳動法で測定したところ、
等電点は５．９４であった。

【００３９】次に、本酵素と、これまでに報告されてい
る糸状菌由来のアミラーゼとの比較を行った。第１表に
各種アミラーゼの特徴（最適ｐＨ、最適温度、安定ｐ
Ｈ、安定温度、分子量および等電点）を示す。

【００４０】

【表１】

【００４１】第１表から、本酵素の最適ｐＨは６．５〜
７．５であり、他のいずれのアミラーゼの最適ｐＨより
も高く、これらの酵素とは明らかに異なることが分か
る。本酵素と他のアスペルギルス属由来のアミラーゼと
は分子量において類似している。しかしながら、本酵素
はこれらのアミラーゼとは等電点が大幅に異なる上に、
かつ最適ｐＨも０．５〜２．５の差がある。したがっ
て、本発明のアミラーゼは、既知のアミラーゼのいずれ
とも異なる新規な酵素である。

【００４２】

【実施例】本発明を以下の実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４３】実施例１ 粗酵素粉末の調製 アクレモニウムｓｐ． ＴＯＴＯ−９２０２株の前培養
液５０ml（２８℃、４日間振とう培養）を、可溶性デン
プン １％、酵母エキス ０．１％、ＮａＮＯ_３ ０．
３％、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．０３％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２
Ｏ ０．０２％、ＣａＣｌ_２ ０．０２％、ＦｅＳＯ_４
・７Ｈ_２Ｏ ０．０００１％および、別殺菌して添加し
たＮａＨＣＯ_３ １％を含有する培地（ｐＨ９．５）
５．５１を入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、
２８℃で５日間、通気量１ｖ／ｖ／min 、回転数２００
ｒｐｍで培養を行った。培養終了後、培養液を８，００
０ｒｐｍ１０分間遠心分離して菌体を除去した。得られ
た上清液を凍結乾燥して、５．２単位／mgの粗酵素粉末
を２ｇ得た。

【００４４】実施例２ 精製酵素の調製 実施例１と同様の培地５．５Ｌをいれた小型ジャーファ
ーメンターに、アクレモニウムｓｐ． ＴＯＴＯ−９２
０２株の前培養液５０mlを植菌した。これを実施例１と
同様に培養した後、遠心分離により上清液５Ｌを得た。

【００４５】この上清液のｐＨ７．５におけるアミラー
ゼ活性は２．１単位／mlであった。次いで、この上清液
に硫安粉末を８０％飽和になるまで加え、８０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離してその沈澱を回収した。この沈
澱を２０mM トリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同
緩衝液に対して透析を行った。その後、透析内液を２０
mM トリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ
‐トヨパールカラム（φ５×３０cm）に通じて活性画分
を吸着させ、０〜０．５M のＮａＣL 濃度勾配で溶出さ
せた。活性画分を透析後、Ｍｏｎｏ−Ｑカラム（ｐＨ
８．０、ファルマシア社製）を用いたＦＰＬＣを行い、
吸着画分を０〜０．６M ＮａＣｌ濃度勾配により溶出
させた。活性画分を透析後低温下において減圧濃縮を行
い、２０mMトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−７５カラム（φ２×６０cm）によりゲ
ル濾過を行った。活性画分を回収することにより、１１
８単位／mlの精製酵素液３０mlを得た。これは、ＳＤＳ
電気泳動的にもゲル濾過的にもそれぞれ単一バンドおよ
び単一ピークを示し、酵素タンパク質として均一である
ことが確認された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による中性アミラーゼの最適ｐＨを示す
グラフである。

【図２】本発明による中性アミラーゼの安定ｐＨを示す
グラフである。

【図３】本発明による中性アミラーゼの最適温度を示す
グラフである。

【図４】本発明による中性アミラーゼの安定温度範囲を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 満 生 慎 二 福岡県北九州市小倉北区中島二丁目１番 １号 東陶機器株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/26 - 9/34 C11D 3/386 C12N 1/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有する中性アミラー
   ゼ。 ・ 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、ア
   ミロペクチンおよびそれらの部分分解物のα−１，４−
   グリコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキス
   トリンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 ・ 最適ｐＨ：最適作用ｐＨは６．５〜７．５である。 ・ 温度安定性：ｐＨ７．５、１０分間保持の条件下
   で、３０℃までは安定であるが、３５℃を越える温度に
   おいて急速に失活し、４５℃において９０％以上の活性
   を失う。 ・ ＳＤＳ電気泳動法による分子量が約５３，０００で
   ある。
2. 【請求項２】下記の理化学的性質をさらに有する、請求
   項１記載の中性アミラーゼ。 ・ 安定ｐＨ：３０℃、１０分間保持の条件下でｐＨ
   ６．０〜１０．５において安定である。 ・ 最適温度：最適ｐＨにおいて約４０〜４５℃であ
   る。 ・ 温度安定性：ｐＨ７．５、カルシウムイオン存在
   下、１０分間保持の条件下で、３５℃までは安定である
   が、４０℃を越える温度において急速に失活し、５０℃
   において９０％以上の活性を失う。
3. 【請求項３】等電点電気泳動法による等電点が５．９〜
   ６．１である、請求項１記載の中性アミラーゼ。
4. 【請求項４】１０℃で少なくとも４０％の活性を保持す
   る、請求項１記載の中性アミラーゼ。
5. 【請求項５】アクレモニウム属に属し、中性アミラーゼ
   産性能を有する微生物を培養し、その培養物から中性ア
   ミラーゼを採取することを含んでなる、請求項１記載の
   中性アミラーゼの製造法。
6. 【請求項６】培養がｐＨ８．０〜１１．０で行われる、
   請求項６記載の中性アミラーゼの製造法。
7. 【請求項７】ｐＨ１０以上でも生育が可能であり、請求
   項１に記載の中性アミラーゼ産性能を有するアクレモニ
   ウムｓｐ．ＴＯＴＯ−９２０２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
   ８２０）。
8. 【請求項８】微生物が請求項７記載のアクレモニウムｓ
   ｐ．である、請求項５記載の中性アミラーゼの製造法。
9. 【請求項９】請求項１〜４のいずれか一項に記載の中性
   アミラーゼを有効成分として含んでなる、アミラーゼ製
   剤。
10. 【請求項１０】食品加工に用いられる、請求項９に記載
    のアミラーゼ製剤。
11. 【請求項１１】分析試薬として用いられる、請求項９に
    記載のアミラーゼ製剤。
12. 【請求項１２】洗剤添加剤として用いられる、請求項９
    に記載のアミラーゼ製剤。
13. 【請求項１３】請求項１２に記載のアミラーゼ製剤を含
    んでなる、食品用または洗濯用洗剤。