JP2903886B2

JP2903886B2 - 新規アミラーゼおよびその製造法

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Publication number: JP2903886B2
Application number: JP21154792A
Authority: JP
Inventors: 山康司森; 口昭弘川; 木敏宏高; 生慎二満; 井基夫荒; 憲二南
Original assignee: TOTO KIKI KK
Current assignee: TOTO KIKI KK
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1992-08-07
Publication date: 1999-06-14
Anticipated expiration: 2014-06-14
Also published as: JPH0654685A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］

【産業上の利用分野】本発明は、新規なアミラーゼおよ
びその製造法ならびに該アミラーゼ産性能を有する新規
糸状菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミラーゼは、デンプンのα−１，４−
グリコシド結合を特異的に加水分解する酵素であり、そ
の性質を利用して特に食品工業で広く用いられている。
とりわけデンプン工業では、実用上の問題から耐熱性の
アミラーゼが要求されており、バシラス属由来の極めて
耐熱性の高い酵素が実用化されている（特公昭４６−１
２９４６号、特公昭５３−２９５５号）。また、このよ
うな耐熱性のアミラーゼは、製パン、製餅などの食品加
工分野にも広く使用されている。

【０００３】一方このような食品加工分野では、近年、
いわゆるソフト化の傾向が顕著であり、ソフトパンなど
の製品が急速に普及し始めている。しかしながら、耐熱
性のアミラーゼは焼き上げの昇温時にその活性が最大と
なってしまい、望ましい性状を著しく損なうことから、
直ちにこれらの製品に応用することはできない。このよ
うな製品に望ましいアミラーゼとしては、中性付近で作
用する性質を有し、かつ、一定の温度以上では速やかに
失活するような耐熱性の低いものが望ましい。

【０００４】また、アミラーゼは研究分析用の試薬とし
ても利用されている。例えば、畜産の分野において飼料
中の細胞壁物質の定量は飼料の栄養評価の上で必須であ
るが、ほとんどの飼料がデンプンを含んでおり、前記定
量に先立ちデンプンの除去が必要となる。現在、バシラ
ス・サブチリス由来のアミラーゼがその目的に使用され
ている。しかし、このアミラーゼはその最大活性をｐＨ
５．８に持つため、まずこのｐＨにおいて処理が必要で
あり、その後プロテアーゼ処理のためｐＨを７．４に再
調整する必要がある。もし、中性付近に最大活性を示す
アミラーゼが利用できれば、このｐＨの再調整が不要と
なり、操作の簡略化が可能となる。

【０００５】以上のような観点から、耐熱性があまり高
くなく、かつ、中性付近に最大活性を有するアミラーゼ
が望まれているといえる。

【０００６】［発明の概要］

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、耐熱
性があまり高くなく、かつ、中性付近に最大活性を有す
る新規なアミラーゼを提供することを目的としている。

【０００７】また本発明は、上記アミラーゼを産生する
新規微生物およびその微生物を利用した上記アミラーゼ
の製造法を提供することを目的としている。

【０００８】さらに本発明は、上記アミラーゼの製造法
ならびに上記アミラーゼ産性能を有する新規微生物を提
供することを目的としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明による第一のアミ
ラーゼ（以下、「アミラーゼＩ」という場合がある）
は、下記の理化学的性質を有するもの、である。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、
アミロペクチンおよびそれらの部分分解物のα−１，４
−グリコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキ
ストリンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適ｐＨ：最適作用ｐＨは６．０〜６．５であ
る。 (c) 温度安定性：ｐＨ７．５、カルシウムイオン存在
下１０分間保持の条件下で、５０℃までは安定である
が、５５℃を越える温度において急速に失活し、６５℃
において９０％以上の活性を失う。 (d) 等電点が７．０〜７．２である。

【００１０】本発明による第二のアミラーゼ（以下、
「アミラーゼII」という場合がある）は、下記の理化学
的性質を有するもの、である。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、
アミロペクチンおよびそれらの部分分解物のα−１，４
−グリコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキ
ストリンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適ｐＨ：最適作用ｐＨは６．０〜６．５であ
る。 (c) 温度安定性：ｐＨ７．５、カルシウムイオン存在
下１０分間保持の条件下で、５０℃までは安定である
が、５５℃を越える温度において急速に失活し、６５℃
において９０％以上の活性を失う。 (d) 等電点が７．８〜８．０である。

【００１１】さらに本発明の好ましい態様によれば、本
発明による二種のアミラーゼは、下記の理化学的性質を
さらに有するもの、である。安定ｐＨ：３７℃、３０分間の条件下でｐＨ６．０〜
８．５において安定である。最適温度：最適ｐＨにおいて約４５〜５０℃である。分子量：約５０、０００（ＳＤＳ電気泳動法による）

【００１２】また、本発明によるアミラーゼの製造法
は、アクレモニウム属に属し、アミラーゼ産性能を有す
る微生物を培養し、その培養物からアミラーゼを採取す
ることを含んでなるものである。

【００１３】さらに本発明による新規微生物は、ｐＨ１
０以上でも生育が可能であり、アミラーゼ産性能を有す
るアクレモニウムｓｐ．である。

【００１４】本発明によるアミラーゼＩおよびIIは、従
来アミラーゼを産生することが知られていなかったアル
カリ耐性糸状不完全菌から得られたものである。本発明
によるアミラーゼは、中性付近に最適ｐＨを有し、熱安
定性も比較的低いという特徴を有している。

【００１５】［発明の具体的説明］新規アミラーゼ産生菌本発明による新規アミラーゼＩおよびIIは微生物を用い
て生産され得る。その生産菌としてはアクレモニウム
（Acremonium）属に属し、上記性質を有する酵素を産生
する能力を有するものであればよい。

【００１６】本発明によるアミラーゼを産生する能力を
有する微生物の好ましい具体例としては、アクレモニウ
ムｓｐ．ＴＯＴＯ−９１０２株が挙げられる。この菌株
は、本発明者らにより北九州市の一般家屋内の空気中よ
り分離された糸状不完全菌であり、寄託番号「微工研菌
寄第１２０１８号（ＦＥＲＭＰ−１２０１８）のもと
に、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。

【００１７】本発明によるＴＯＴＯ−９１０２株の菌学
的性質を列挙すれば下記の通りである。Ｉ．形態的性質１大型分生子：なし２分生子：楕円形、２〜３×３〜７μｍ一細胞性、擬頭状３分生子柄：長い４厚膜胞子：なし５菌糸：細い６その他：分生子柄上に湿潤な分生子塊を形成す
る。

【００１８】II．各培地における生育状態１ポテト・デキストロース寒天培地（２９℃、１１日間培養）集落直径：８５mm以上綿毛状、クリーム色、裏面無色、一部湿性菌糸を放射状
に形成する。２ツァペック寒天培地（２９℃、１１日間培養）集落直径：８５mm以上綿毛状、クリーム〜白色、裏面無色

【００１９】III.生理学的性質１生育ｐＨ範囲：３．０〜１１．０最適生育ｐＨ４．０〜１０．０、アルカリ耐性２生育温度範囲：１０〜５０℃ 最適生育温度２５〜３５℃ ３アミラーゼ産性能を有する

【００２０】以上の性状より、J.W.CarmichaelらのGene
ra of Hyphomycetes(1980)およびW.GamsらのCephalospo
rium-artige Schimmelpiltze(1971)を参照して検索した
結果、本菌株はアクレモニウム属に属する一菌種である
ことが判明した。このアクレモニウム属は、Gamsにより
詳細な検討がなされ、以前Cephalosporium属として記載
されていた属に代わって近年採用された属名であり、数
多くの種を包含している。しかしながら、本菌株のよう
にｐＨ１０以上で生育し、かつ、アミラーゼ産性能を有
する菌種は本属中には知られていない。

【００２１】従って、本菌株はアクレモニウム属に属す
る新種であると判断し、本菌株をアクレモニウムｓｐ．
ＴＯＴＯ−９１０２と命名した。

【００２２】なお、本発明による新規アミラーゼの製造
に用いられる微生物は、アクレモニウム属に属し、上記
性質を有する酵素の産生能力を有するものであればよ
く、上記した菌株とその変種、変異株に限定されるもの
ではない。

【００２３】培養条件上記菌株を培養するための培地は格別である必要はな
く、通常の培地が用いられる。炭素源としては、各種デ
ンプン（例えば、可溶性デンプン、デンプン液化液な
ど）、デキストリン、アミロペクチン、アミロースなど
が用いられる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム
塩などの無機物、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキ
ス、ダイズ粉、コーン・スティープ・リカー、カゼイ
ン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これらの炭
素源や窒素源のほかに、各種の塩、例えばマグネシウム
塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩等が必要に応
じて添加されてよい。さらに、別に殺菌した炭酸水素ナ
トリウムまたは炭酸ナトリウムなどを添加して培地のｐ
Ｈをアルカリ性にするのが好ましい。

【００２４】培養は上記のような培地中で、培養温度２
０〜５０℃、好ましくは２５〜３５℃で３〜７日間、好
気的に攪はんまたは振とうしながら培養する。

【００２５】本発明によるアミラーゼは、上記のような
条件のもとでの培養によって、主として培養液中に分泌
され蓄積される。さらに、本発明による中性アミラーゼ
は基質誘導法により効率よく菌体外に分泌される性質を
有している。

【００２６】酵素の採取上記培養液からの本発明によるアミラーゼの採取、精製
には、既知の精製法が単独もしくは併用して利用でき
る。

【００２７】本発明によるアミラーゼＩおよびIIは、主
として菌体外、すなわち培養液中に分泌されるため、例
えば瀘過または遠心分離により菌体を除去することによ
って容易に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素
は、さらに既知の精製法によって精製することができ
る。好ましい精製法としては、硫安などによる塩析、有
機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトンな
ど）による沈殿法、生デンプンによる吸着法、限外瀘
過、ゲル瀘過クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、その他の各種クロマトグラフィーなどが挙
げられる。

【００２８】また、多くの場合、アミラーゼＩおよびII
は同時に産生されるので、これを分離したい場合には分
離操作が必要となる。その方法としては、その等電点の
差を利用した方法、例えばショ糖密度勾配等電点電気泳
動法、ＩＥＦ（等電点焦点電気泳動法）、イオン交換樹
脂を用いたＨＰＬＣ等によるのが好ましい。

【００２９】より好ましい精製法を挙げれば次の通りで
ある。まず、培養瀘液に８５％飽和硫安を添加して塩析
を行い、得られた沈殿を透析する。ついで、ＤＥＡＥ−
トヨパール（東ソー社製）カラムによるクロマトグラフ
ィー（ｐＨ８．５、０〜０．６ＭＮａＣｌ濃度勾配）
を行う。透析後、HiLoad Q-Sepharoseカラム（ＦＰＬ
Ｃ、ファルマシア社製）によるクロマトグラフィー（ｐ
Ｈ８．５、０〜１ＭＮａＣｌ濃度勾配）を行い、透析
後にＬＫＢ社製１１０ml容量カラムを用いたショ糖密度
勾配等電点電気泳動を行うことによって、ＳＤＳ電気泳
動的に均一な精製酵素を得ることができる。

【００３０】酵素の性質本発明によるアミラーゼＩおよびIIの性質を検討した。
その結果は次に示される通りである。なお、以下におい
て活性測定法とは次の方法をいうものとする。

【００３１】（活性測定法）０．２Ｍリン酸緩衝液に溶
解させた０．１５％の可溶性デンプンを基質として使用
する。基質溶液５００μｌに、１ｍＭ酢酸カルシウムで
適当に希釈した酵素液５００μｌを添加して、３７℃で
１０分間反応させた後、０．５Ｎ酢酸・塩酸混合液
（５：１）５mlを入れて反応停止させる。これに０．０
２％ヨウ素溶液（０．２％ヨウ化カリウムを含む）０．
３mlを加えて発色させ、室温で２０分間放置し、その後
６６０ｎｍの吸光度を測定する。アミラーゼの活性単位
（アミラーゼユニット：ＡＵ）は、次式により求める。

【００３２】

【００３３】作用および基質特異性可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチンをそれぞ
れ基質として、活性測定法に準じて酵素反応を行った。
反応液を経時的に採り、ＨＰＴＬＣにより反応生成物を
調べた。その結果、本発明による両酵素はデンプンの他
にアミロース、アミロペクチンおよびそれらの部分分解
物に作用して、α−１，４−グリコシド結合を特異的に
加水分解（エンド型分解）して、主としてデキストリン
およびマルトオリゴ糖を生成することが分かった。

【００３４】最適ｐＨおよび安定ｐＨ両酵素を用いてｐＨ２〜１０の範囲のｐＨ条件下で活性
測定法に準じてそれぞれ酵素反応を行った。なお、緩衝
液としては、ブリットン‐ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ
‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液を使用した。その相対
活性は図１に示されるとおりである。図１より、両酵素
の最適ｐＨは３７℃において約６．０〜６．５であるこ
とが分かる。

【００３５】また、両酵素をそれぞれブリットン‐ロビ
ンソン広域緩衝液に加え、３７℃で３０分間保持した
後、その残存活性を測定した。その結果は図２に示され
るとおりである。図２からは両酵素の安定ｐＨ域は、い
ずれも３７℃で３０分間の加熱条件下においてｐＨ６．
０〜８．５であることが分かる。

【００３６】最適温度および安定温度両酵素を用いて２５〜７０℃の範囲の温度条件下で、活
性測定法に準じてそれぞれ酵素反応を行った。その相対
活性を図３に示す。図３から、両酵素の最適温度はいず
れも約４５〜５０℃であることが分かる。

【００３７】両酵素をそれぞれ１mM塩化カルシウム添加
の条件下でＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に加え、２５
〜７０℃の範囲の温度条件下で１０分間保持した後の残
存活性を測定した。その結果は図４に示されるとおりで
ある。図４から、両酵素はいずれも５０℃まで、カルシ
ウムイオン非存在下で３５℃まで安定であることが分か
る。

【００３８】分子量両酵素の分子量をＳＤＳ電気泳動法によって測定したと
ころ、分子量はいずれも５０，０００であった。

【００３９】等電点両酵素の等電点を等電点電気泳動法でそれぞれ測定した
ところ、等電点はアミラーゼＩが７．０〜７．２であ
り、アミラーゼIIが７．８〜８．０であった。

【００４０】次に、両酵素と、これまでに報告されてい
る糸状菌由来のアミラーゼとの比較を行った。第１表に
各種アミラーゼの特徴（最適ｐＨ、最適温度、安定ｐ
Ｈ、安定温度、分子量および等電点）を示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】第１表から、両酵素の最適ｐＨはいずれも
６．０〜６．５であり、他のいずれのアミラーゼの最適
ｐＨよりも高く、これらの酵素とは明らかに異なること
が分かる。また、酵素タンパク質の重要な指標である等
電点が他の酵素に比べ著しく高い点においても大きく相
違する。したがって、本発明のアミラーゼＩおよびII
は、既知のアミラーゼのいずれとも異なる新規な酵素で
ある。

【００４３】

【実施例】本発明を以下の実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１粗酵素粉末の調製アクレモニウムｓｐ．ＴＯＴＯ−９１０２株の前培養
液５０ml（２８℃、４日間振とう培養）を、可溶性デン
プン１％、酵母エキス０．１％、ＮａＮＯ_３０．
３％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
０．０５％、ＫＣｌ０．０５％、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ
_２Ｏ０．００１％および、別殺菌して添加したＮａＨ
ＣＯ_３１％を含有する培地（ｐＨ９．５）５．５１を
入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、２８℃で５
日間、通気量１ｖ／ｖ／min 、回転数２００ｒｐｍで培
養を行った。培養終了後、培養液を８，０００ｒｐｍ１
０分間遠心分離して菌体を除去した。得られた上清液を
凍結乾燥して、３００ＡＵ／mgの粗酵素粉末を２ｇ得
た。

【００４４】実施例２精製酵素の調製実施例１と同様の培地５．５Ｌをいれた小型ジャーファ
ーメンターに、アクレモニウムｓｐ．ＴＯＴＯ−９１
０２株の前培養液５０mlを植菌した。これを実施例１と
同様に培養した後、遠心分離により上清液５Ｌを得た。
この上清液のｐＨ６．０におけるアミラーゼ活性は１０
０ＡＵ／mlであった。次いで、この上清液に硫安粉末を
８５％飽和になるまで加え、８０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離してその沈澱を回収した。この沈澱を１０mM
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液に対し
て透析を行った。その後、透析内液を１０mM トリス緩
衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ‐トヨパール
カラム（φ５×３０cm）に通じて活性画分を吸着させ、
０〜０．６M のＮａＣL 濃度勾配で溶出させた。活性画
分を透析後、HiLoad Q-Sepharoseカラム（ｐＨ８．０、
ファルマシア社製）を用いたＦＰＬＣを行い、吸着画分
を０〜１M ＮａＣｌ濃度勾配により溶出させた。活性
画分を透析後低温下において減圧濃縮を行い、ショ糖密
度勾配等電点電気泳動による分画を行なった。すなわ
ち、Ampholine （ＬＫＢ）を用いたｐＨ域６〜８でＬＫ
Ｂ社製１１０ml容量カラムを用い、初期電圧３００Ｖ、
７ｍＡ、最終電圧７００Ｖ、０．６ｍＡ、通電時間４０
時間、１℃の温度設定で泳動を行なった。ｐＨ７．１お
よびｐＨ７．９付近の活性画分を回収することにより、
これら２つのアミラーゼは完全に分離され、その結果６
０００ＡＵ／mlの精製アミラーゼＩを１０ml、そして６
５００ＡＵ／mlのアミラーゼIIを２０mlを得た。これら
は、ＳＤＳ電気泳動的にもゲル濾過的にもそれぞれ単一
バンドおよび単一ピークを示し、酵素タンパク質として
均一であることが確認された。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１（ａ）および（ｂ）は、それぞれ本発明に
よるアミラーゼＩおよびIIの最適ｐＨを示すグラフであ
る。

【図２】図２（ａ）および（ｂ）は、それぞれ本発明に
よるアミラーゼＩおよびIIの安定ｐＨを示すグラフであ
る。

【図３】図３（ａ）および（ｂ）は、それぞれ本発明に
よるアミラーゼＩおよびIIの最適温度を示すグラフであ
る。

【図４】図４（ａ）および（ｂ）は、それぞれ本発明に
よるアミラーゼＩおよびIIの安定温度範囲を示すグラフ
である。

【図５】ショ糖密度勾配等電点電気泳働法によるアミラ
ーゼＩおよびIIの分離パターンを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (72)発明者満生慎二福岡県北九州市小倉北区中島二丁目１番１号東陶機器株式会社内 (72)発明者荒井基夫大阪府堺市鴨谷台３丁２番20−204号 (72)発明者南憲二大阪府東大阪市中野21番地82号 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/26 - 9/34 C12N 1/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有する新規アミラー
ゼ。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、
アミロペクチンおよびそれらの部分分解物のα−１，４
−グリコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキ
ストリンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適ｐＨ：最適作用ｐＨは６．０〜６．５であ
る。 (c) 温度安定性：ｐＨ７．５、カルシウムイオン存在
下１０分間保持の条件下で、５０℃までは安定である
が、５５℃を越える温度において急速に失活し、６５℃
において９０％以上の活性を失う。 (d) 等電点が７．０〜７．２である。 (e) 安定ｐＨ：３７℃、３０分間保持の条件下でｐＨ
６．０〜８．５において安定である。 (f) 最適温度：最適ｐＨにおいて約４５〜５０℃であ
る。 (g) ＳＤＳ電気泳動法による分子量が約５０，０００
である。
【請求項２】下記の理化学的性質を有する新規アミラー
ゼ。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、
アミロペクチンおよびそれらの部分分解物のα−１，４
−グリコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキ
ストリンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適ｐＨ：最適作用ｐＨは６．０〜６．５であ
る。 (c) 温度安定性：ｐＨ７．５、カルシウムイオン存在
下１０分間保持の条件下で、５０℃までは安定である
が、５５℃を越える温度において急速に失活し、６５℃
において９０％以上の活性を失う。 (d) 等電点が７．８〜８．０である。 (e) 安定ｐＨ：３７℃、３０分間保持の条件下でｐＨ
６．０〜８．５において安定である。 (f) 最適温度：最適ｐＨにおいて約４５〜５０℃であ
る。 (g) ＳＤＳ電気泳動法による分子量が約５０，０００
である。
【請求項３】アクレモニウム属に属し、アミラーゼ産性
能を有する微生物を培養し、その培養物からアミラーゼ
を採取することを含んでなる、請求項１または２記載の
アミラーゼの製造法。
【請求項４】培養がｐＨ８．０〜１１．０で行われる、
請求項３記載のアミラーゼの製造法。
【請求項５】ｐＨ１０以上でも生育が可能であり、請求
項１または２記載のアミラーゼ産性能を有するアクレモ
ニウムｓｐ．ＴＯＴＯ−９１０２株（ＦＥＲＭＰ−１
２０１８）。
【請求項６】微生物が請求項５記載のアクレモニウムｓ
ｐ．である、請求項３記載の中性アミラーゼの製造法。
【請求項７】請求項１または２記載のアミラーゼを有効
成分として含んでなる、アミラーゼ製剤。
【請求項８】食品加工に用いられる、請求項７に記載の
アミラーゼ製剤。
【請求項９】分析試薬として用いられる、請求項７に記
載のアミラーゼ製剤。