JPH0313876B2

JPH0313876B2 -

Info

Publication number: JPH0313876B2
Application number: JP58192070A
Authority: JP
Inventors: Susumu Hisaku; Junichi Abe
Original assignee: Daikin Industries Ltd
Current assignee: Daikin Industries Ltd
Priority date: 1983-10-13
Filing date: 1983-10-13
Publication date: 1991-02-25
Also published as: JPS6083595A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、デンプンの直接酵素糖化法に関し、
更に詳しくは新菌種アスペルギルス K27の産生
するデンプン分解酵素を用いるデンプンの直接酵
素糖化法に関する。

従来、デンプンを原料としてブドウ糖を製造す
るには、水に懸濁したデンプン乳を加温（85〜
120℃）し、糊化させてからα−アミラーゼによ
つて液化し、次いでグルコアミラーゼを加えて糖
化する方法が採られてきた。しかし、高濃度のデ
ンプン乳の糊化および液化には多量の熱エネルギ
ーが必要となる上、粘度が非常に高い為に特殊な
装置を必要とする。

これに対し、デンプンを25〜70℃の温度におい
て直接１段階で糖化する場合には、従来法に比べ
その容液は低粘度であり、工程も簡単となり、経
済的にも有利である。

本発明は、以上の様な状況に鑑み完成されたも
のであつて、デンプン分解能の高い特定のデンプ
ン分解酵素を用いて各種デンプンを直接１段階で
糖化する方法を提供するものである。しかしてそ
の要旨は、アスペルギルス属に属し、アスペルギ
ルスフミガートスとは (1) 分生子柄の色調が無色、 (2) 生育温度範囲が10〜55℃ である点において菌学的性質が異なる新菌種アス
ペルギルス K27の産生するデンプン分解酵素を
デンプンに作用させることを特徴とするデンプン
の直接酵素糖化法に存する。

本発明で用いるアスペルギルス K27はアスペ
ルギルス属に属する新菌株であり、その１株であ
るアスペルギルス K27 AC−１は、微工研菌寄
第7158号として工業技術院微生物工業研究所に寄
託されている。この菌株の詳細は特願昭58−
144544号（特開昭60−34178号）明細書に記載さ
れているが、その菌学的性質を以下に示す。

各培地における生育状態 (1) 麦芽エキス寒天培地生育は良好で、37℃において３日目に約50
mmの直径に達する。

基底菌糸層は薄く平担。コロニー表面はビ
ロード状〜羊毛状。コロニーの色は最初白色
で、分生子が多数形成されると緑色〜暗緑色
になる。コロニーの裏面は初め無色で、後に
淡黄色になる。

(2) ツアペツク寒天培地生育は良好で、37℃において３日目で約45
mmの直径に達する。

基底菌糸層は比較的薄く平担。コロニー表
面はビロード状〜羊毛状。コロニーの色は最
初白色で、分生子が多数形成されると緑色〜
暗緑色になる。コロニーの裏面は初め無色
で、後に淡黄色になる。

生理学的性質 (1) 生育の範囲（麦芽エキス培地使用） PH：３〜８温度：10〜55℃ (2) 最適生育条件（麦芽エキス培地使用） PH：４〜７温度：35〜45℃ 形態学的性質分生子頭：円筒形、長さ120〜200μ。直径30〜
60μ、淡緑色。

分生子柄：長さ150〜300μ、直径2.5〜8μ。基底
菌糸ないし気生菌糸から分枝して立ち上が
る。滑面、無色。

頂のう：直径15〜28μ、フラスコ型、淡緑色、
上部２分の１ぐらいよりフイアライドを形
成。

メトレ：メトレは形成されない。

フイアライド：6.5〜9.5×２〜2.5μ、淡緑色。

分生子：直径2.5〜3.0μ、球形〜亜球形、粗面、
集塊は暗緑色。

以上の菌学的性質から、本菌株はアスペルギル
ス属に属する。アスペルギルス属の公知菌種中、
高温菌に属する菌種としてはアスペルギルスフ
ミガートス（Aspergillus fumigatus）が知られ
ている。

本菌株は、分生子柄の色調が無色で、成育温度
範囲が10〜55℃であるのに対し、アスペルギルス
フミガートスは分生子柄の色調が淡緑色を呈
し、生育温度範囲も20〜50℃である（T.Awao
and K.Mitsugi，Trans.Myccl.Soc.Japan、14、
145（1973）参照）。

この様に、糸状菌の分類で重要な菌学的性質と
してとりあげられる分生子柄の色調および生育温
度において、本菌株はアスペルギルスフミガー
トスとは明確に異なつている。従つて、本発明者
は本菌株をアスペルギルス属に属する新菌種と認
め、アスペルギルス K27と命名した。

本発明の菌種を用いてデンプン分解酵素を生産
するには、通常アミラーゼ生産に用いられる培地
で、10〜55℃、好ましくは35〜45℃、PH３〜８、
好ましくは４〜７で固体培養または液体培養すれ
ばよく、３〜７日で著量のデンプン分解酵素が蓄
積される。

デンプン分解酵素の生産に用いられる培地の炭
素源としては、たとえば各種デンプン、デンプン
加水分解物、コーンミール、小麦粉、廃糖蜜等が
使用される。窒素源としては、たとえばペプト
ン、綿実油カス、肉エキス、酵母エキス、カゼイ
ン、コーンステイープリカー、麦芽エキス、大豆
油、脱脂粉乳、無機アンモニウム塩、無機硝酸塩
等が使用される。その他、KH₂PO₄、FeSO₄、
MgSO₄、KCl、CaCl₂、CoCl₂、MnSO₄等の無機
塩類、さらに必要に応じて有機微量栄養源を培地
に添加することができる。

この様にして得られる培養液は、そのまま酵素
源として使用することができるが、得られる培養
液から分離した菌体および培養液はいずれも粗
酵素として使用することもできる。また、培養
液の60％硫安画分、それのさらに55％イソプロパ
ノール画分もデンプン分解酵素として用いること
ができる。

上記のごとく得られたデンプン分解酵素の活性
は、次の様にして測定する： PH4.5の緩衝液に溶解した１％可溶性デンプン
溶液に45℃で酵素溶液を作用させ、15分後に生成
した還元糖をソモギー・ネルソン（Somogyi
Nelson）法により定量する。この条件で１分間
に1μmoleのグルコースを生成する力価を１単位
とする。

この様にして産生されたデンプン分解酵素を用
いたデンプンの分解は、通常25〜70℃、好ましく
は45〜60℃の温度において、PH３〜８、好ましく
は４〜６で行うことができる。分解反応は、静置
して行つてもよいが、デンプン乳が均一に懸濁す
る程度にゆるく撹拌して行うのが好ましい。加え
る酵素量は、デンプン１mg当り0.05〜1.0単位が
適当であるが、酵素量を少なくして反応時間を長
くしてもよい。分解されうるデンプンの種類は限
定されず、コーンスターチのほか、馬鈴薯、甘
藷、米、小麦、タピオカ、キヤツサバなどが例示
できる。

本発明の製造法において、ブドウ糖からアルコ
ールを生産する能力を有する微生物を併用すれば
１工程でデンプンからアルコールを製造すること
ができる。

以下に実施例および参考例を示し、本発明微生
物の土壌からの分離、デンプン分解酵素の生産お
よびデンプンの糖化について具体的に説明する。

参考例１鹿児島市郡元１丁目で採取した土壌を滅菌生理
食塩水で1000倍に希釈し、その１mlを下記分離用
寒天培地（）９mlと混合し、滅菌シヤーレ内に
入れ、45℃で２日間培養した。

分離用寒天培地（）％ NH₄NO₃ 0.1 MgSO₄・7H₂O 0.02 KH₂PO₄ 0.14 酵母エキス 0.01 α−RS⁽¹⁾ 0.5 寒天（PH6.1〜6.3） 1.5 注(1) 小麦デンプンを液化した際に得られる不溶
性デンプンを集め、凍結乾燥したもの。

上記培養により発生したコロニーを白金耳で下
記組成の斜面寒天培地（）に移し、45℃で２日
間培養した。

斜面寒天培地（）％ペプトン 0.5 酵母エキス 0.3 麦芽エキス 0.3 ブドウ糖 0.2 寒天（PH7.0） 1.5 上記培養により培地上に発生する菌の１白金耳
を生理食塩水で10000倍に希釈し、その１mlを上
記分離用寒天培地（）９mlと混合し、滅菌シヤ
ーレ内で、45℃で２日間培養し、発生した複数の
コロニーが相互に相異しないことを肉眼的および
顕微鏡的に確認した。

上記コロニーの内10個を各々斜面寒天培地
（）に接種し、45℃で２日間培養し、10本の斜
面寒天培地上の菌が同じ菌であることを肉眼的お
よび顕微鏡的に確認した。また、これら10本の培
養菌について各培地上の性状および生理学的性質
は同一であり、かつ前述の通りであることを確認
した。

この結果から、10本の培養菌は全て自然界から
純粋に分離された単一菌であることがわかる。

次いで、上記の様に、純粋培養された麦芽エキ
ス斜面寒天培地上の菌に、保護剤（スキムミルク
10％およびグルタミン酸ナトリウム１％の水溶
液）を加え、胞子懸濁液を調整した。この胞子懸
濁液を、アンプルに0.2mlずつ分注し、凍結乾燥
を行なつた。

乾燥方法は、−30〜−40℃まで緩慢凍結した後、
0.03torrで室温にて18〜20時間乾燥した。次い
で、ガスバーナーで真空溶封後、４℃で保存し
た。

この様にして得られた凍結乾燥菌を３カ月後に
復元した。この際の復水には滅菌生理食塩水を、
培地には麦芽エキス培地を用いた。復元菌の各培
地での性状および生理学的性質は凍結前と同じで
あつた。

参考例２アスペルギルス K27 AC−１を斜面寒天培地
（）上で45℃で２日間培養し、そのスラント上
に生育した菌体を一白金耳取り、500mlフラスコ
に入れた下記組成の培地100mlに接種した。45℃
で５日間振とう培養した後、培養液を過し、得
られた液のデンプン分解活性を測定したところ
12単位／mlであつた。

培地％小麦デンプン 2.0 NH₄NO₃ 0.1 酵母エキス 0.01 コーンステイープリカー 0.08 KH₂PO₄ 0.14 FeSO₄・7H₂O 0.001 MgSO₄・7H₂O 0.05 KCl（PH6.1〜6.3） 0.05 実施例１参考例２で得た培養液（デンプン分解活性25
単位に相当する量）を緩衝液（PH4.5）５mlに懸
濁したコーンスターチ25mgに55℃で作用させた。
生成した還元糖をソモギー・ネルソン法で経時的
に測定し、分解率（生成した還元糖／全糖）を求
め、分解曲線を作成した。コーンスターチに対す
る分解曲線を第１図に示す。

この条件で、コーンスターチの分解率は７時間
でほぼ100％に達した。

実施例２参考例２で得たデンプン分解酵素25単位を、緩
衝液（PH4.5）５mlに懸濁したコーンスターチ250
mgに55℃で作用させ、静置で糖化を行つた。生成
したブドウ糖をグルコースオキシダーゼ・パーオ
キシターゼ法により定量して糖化率を求めた。こ
の条件では、24時間で85％、48時間で95％の糖化
率であつた。

実施例３実施例２において液を100rpmで撹拌する以外
は同様の手順をくり返した。糖化率は、７時間で
98％、24時間で100％であつた。この結果を第２
図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１における分解率曲線のグラ
フ、第２図は実施例３における糖化率曲線のグラ
フである。

Claims

【特許請求の範囲】１アスペルギルス属に属し、アスペルギルス
フミガートスとは (1) 分生子柄の色調が無色、 (2) 生育温度範囲が10〜55℃ である点において菌学的性質が異なる新菌種アス
ペルギルス K27の産生するデンプン分解酵素を
デンプンに作用させることを特徴とするデンプン
の直接酵素糖化法。