KR830002799B1 - 신규한 중성 글루코아밀라제와 그의 생산물의 제법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

신규한 중성 글루코아밀라제와 그의 생산물의 제법

제1도는 본 발명의 효소와 R. niveus와 A, niger에 의해 생성된 글루코아밀라제의 pH와 효소작용력에 관한 표이다.

제2도는 본 발명 효소와 P, oryzae에 의해 생성된 글루코아밀라제의 온도와 효소 활성도에 관한 표이다.

제3도는 본 발명의 효소를 여러하지 pH상태에 두었을때 불활성화 곡선이다.

제4도는 본 발명 효소와 R, niveus, A. niger, P. oryzae에 의해 생성된 글루코아밀라제의 상대적인 열안정성을 비교한 표이다.

전분으로부터 덱스트로오즈를 공업적으로 제조할 때 당화에 사용되는 원료 글루코아밀라제는 리조푸스(Rhizopus)와 아스페르길루스(Aspergillus)속(屬)에 속하는 미생물에 의해 생성되는 것이다. 글루코아밀라제가 사용되는 조건은 리조푸스 미생물의 효소는 pH 5.0과 55℃이고 아스페르길루스 미생물의 효소는 pH4.5와 60℃이다. 또한 이러한 글루코아밀라제를 30%농도로 효소액화한 전분과 반응시켰을때 가수분해물의 최대덱스토로오즈 함량은(건조 고형물로서)약 96%이다. 덱스트로오즈의 수율이 100%에 미치지 못하는 이유중에 하나는 글루코아밀라제의 역반응에 의해 생성된 이소말토오즈 축적때문이다. 그렇지만, 최근에 발표된 문헌(미국특허 3,897,305)에 중성 pH에서 풀루라나제(pullulanase)를 반응과 함께 사용함으로써 글루코아밀라제의 역반응을 거의 줄일 수 있으며 그리하여 덱스트로오즈의 수율을 약98%까지 올릴 수 있다고 발표되었다. 플루라나제는 전분의 결함을 끊고 중성 조건하에서 글루코아밀라제의 작용을 증가시킨다. 중성 글루코아밀라제에 관 한 단한가지 문헌이 소개되었으며, 그것은 쌀눈 곰팜이(피리쿨라리아 오리자에 Piricularia oryzaei Kazuo Matsuda와 공동연구자 : Amylase Symposium, 9권, 1974)에 의해 생성된 글루코아밀라제에 관한것이지만, 이 글루코아밀라제는 온도에 대해 안정성이 낮기 때문에 공업적으로 사용할 수 없는 것이다.

그러므로 본 발명의 가장 큰 목적은 중성 pH에서 활성인 글루코아밀라제를 제조하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 열에 대해 안정한 글루코아밀라제를 제조하는 것이며 그리하여 공업반응에 이용 할 수 있도록 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전분가수분해물과 반응하여 높은 수율로 덱스트로오즈를 생성하는 글루코아밀라제를 제조하는 것이다.

6.0-6.5에서 최적 활성도를 가지며 내열 안정성이 우수한 글루코아밀라제를 생성하는 미생물이 발견되었다. 새로운 글루코아밀라제는 pH 6.0-6.5, 55℃에서 전분 가수분해물과 반응하였을 때 10 D.E,(덱스트로오즈당량)액화전분 30중량% 용액을 전환시켜 적어도 96% 덱스트로오즈를 함유하는 생성물을 만들었다. 본 발명은 글루코아밀라제를 생산하는 스타키보트리스(Stachybotrys)속 미생물을 배지에 배양하고, 배양물로부터 효소를 회수하는, 글루코아밀라제의 생산방법을 포함한다.

본 발명의 신규한 중성글루코아밀라제의 특성을 자세히 설명하고 이때까지 알려진 글루코아밀라제와 특성을 비교한다.

“D.E.”라는 용어는 “덱스트로오즈 당량”의 약어이며 덱스트로오즈로 환산한 환원당함량과 서로 바꾸어질 수 있으며 전체 고형물에 대한 퍼센트로 표시된다. “전분가수분해물”이라는 용어는 전분의 부분적인 가수분해에 의해서 만들어진 시럽이나 건조생산물을 의미한다. 그러한 생성물은 산이나 효소성 가수분해에 의해 만들어진다. “액화된전분”이라는 용어는 낮은 D.E. (2-20까지의 D.E.) 전분가수분해물을 의미한다.

1. 작용력과 기질의 특성

본 발명효소는 전분, 가용성전분, 아밀로우즈, 아밀로펙틴, 글리코겐 같은 탄수화물을 가수분해하여 그로부터 덱스트로오즈를 생산할 수 있다. 기질의 농도가 1%일때는 각 기질로부터 덱스트로오즈의 수율은 100%이다. 생성된 덱스트로오즈의 변선광 은양성이다. 그러므로, 이 효소는 글루코아릴라제이다. 본 효소의 반응속도를 리조푸스와 아스페르길루스 속에 속한 미생물로부터 생성된 글루코아밀라제와 여러기질에서 비교하였다. 그 결과는 표1에 나타나있다. 표에서 부터 알 수 있듯이 본 효소의 작용력은 다른 두개의 글루코아밀라제보다 현저하게 높다. 특히 플루란의 가수분해에 관해서는 더욱 그러하다.

[표 1]

기질의 특성

a) 각 글루코아밀라제의 효소작용력은 1% 기질농도에서 측정되었다. 각 효소의 작용력은 덱스트틴을 100으로 잡고 다른 기질은 상대적인 값으로 하였다.

b) (Enzyme Development Corporation)효소개발주식회사2 Penn Piaza, New York, N.Y.

c) 수미토도쇼지회사(주), 1, 칸다미로시로-초, 치요다-쿠, 토코, 일본.

2. 최적 pH와 안정한 pH범위

본 발명 효소의효소활성도(상대적인 값)와 작용 pH를 조사하고 리조푸스와 아스페르길루스 속 미생물에 의해 생산된 이에 알려진 글루코아밀라제와 그 관계를 비교하였다. 그 결과가 도면 1에 나타나 있다. 도면에서 보이듯이 본 효소의 최적 pH는 60℃에서 6.0-6.5이며, 다른 효소의 최적 pH보다 높다. 또한, 본 효소는 pH 6.0부근에서 가장 안정하지만 pH 4-11의 범위 밖에서 실온으로 24시간 방치하였을 때에도 본 글루코아밀라제의 불활성화는 일어나지 않았다.

3. 효력의 결정

적당히 희석된 효소용액 0.5ml씩을 0.1M-아세테이트완충용액(pH 6.0)에 용해한 말토덱스트틴(D.E.는 약10) 2% 용액 0.5ml를 가하고 60℃에서 정확한게 10분간 배양한다. 끓는 수욕에 5분간 혼합물을 가열하여 효소작용을 멈추게 한다. 생성된 덱스트로오즈의 양을 글루코즈 옥시다제 방법으로 측정한다. 1분간에 덱스트로오즈 1micro mole을 생성한 효소의 양을 1단위로 한다.

4. 최적 반응온도 범위

pH 6.0에서 본 발명 효소의 상대효소작용력에 대한 온도의 효과를 쌀눈 곰팡이인 피리쿨라리아 오리자에(Piricularia oryzae)로부터 생성된 기지의 글루코아밀라제의 상대 활성도와 비교 한다. 이러한 비교가 도면 2에 나타나 있다. 이러한 조건에서 본 효소의 최적온도는 65℃이며 피리쿨타리아 오리자에로 부터 생성된 효소보다 약 10℃가 높다.

5. pH와 온도조건에 의한 불활성화

제3도는 60℃에서 60분간 pH를 3-8범위에서 변화시켰을 때 본 효소의 상대적 효소 활성도의 불활성화 곡선을 나타낸다. 도면에서 알 수 있듯이 본 효소는 pH 6에서 가장 안정하며 pH 3에서 30분간, pH 4에서는 1시간동안 처리하였을때 불활성화 된다. 또한, 제4도는 본 효소와 리조푸스, 아스페르길루스, 피리쿨라리아 속 미생물에 의해 생성된 글루코아밀라제의 열안정성을 비교한 결과를 보여준다. 즉, 제4도는 안정성이 가장 좋은 pH에서 60℃로 처리하였을때 이러한 효소의 불활성화 곡선을 보여준다.

본 효소의 열안정성은 아스페르길루스에 의한 글루코아밀라제보다 열등하지만, 리조푸스와 피리쿨라리아에 의한 글루코아밀라제보다 열안정성이 우월한 것으로 나타났다.

6. 저해, 활성화, 안정화

본 효소는 다른 특별한 활성화제나 안정제를 필요로하지 않는다. 그렇지만, 대부분의 다른 글루코아밀라제의 경우와 같이, 본 효소는 머큐릭클로라이드, 포타슘 망가네이트, 페로스 클로라이드, 다른 금속염에 의해 저해된다.

7. 정제과정

본 효소는 다른 통상의 정제방법인, 염화암모니움 분류법, 유기용매 분류법, 전분흡수법, 크로마토그라피등의 방법으로 정제될 수 있다. 그러한 모든 정제방법이 다음에 기술된다.

세포와 다른 불용성물질을 배양물로부터 용출시키고 배양용액을 -20℃에서 하루밤 동안 얼린다. 실온에서 녹이고 불용물을 원심분리하여 제거한다. 냉(冷)이소프로파놀을 2배 용량만큼 가하고 4℃에서 하루밤 방치한다. 상등액을 딸아내어서 제거한다. 침전물을 1mM EDTA를 함유한 0.05M 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5)에 용해시키고, 같은 완충용액으로 4℃에서 하루밤동안 투석한다. 동일한 현탁용액으로 액화시킨 DEAE-셀루로오즈를 투석시킨 효소액에 가하여 효소가 흡수되도록 한다. 이 DEAE-셀루로오즈를 동일한 완충용액으로 세척한 후 0.3M NaCl을 함유시킨 완충용액과 수지로 효소를 용줄시킨다. 용줄물에 2배양의 냉소이프로파놀을 가하면 효소가 침전되고, 이 침전물을 원심분리하여 회수한다. 침전물을 1mM EDTA를 함유시킨 0.05M 트리스-염산완충용액(pH 7.5)에 용해시키고 동일한 완충용액에 대해 하루 동안 투석시킨다. 투석된 효소용액을 1mM EDTA를 함유한 0.05M 트리스-염산 완충액(pH 7.5)과 등장인 DEAE-셀루로오즈 컬럼에 가한다. NaCl을 0.5M까지 함유한 동일한 완충액으로 농도를 점차로 변화시킨 컬럼을 통해 효소를 용출시킨다. 효소를 함유한 용출물을 합하고 효소를 이소프로파놀 침전법을 이용하여 농축시킨다. 농축된 효소를 1mM EDTA를 함유한 0.05M 트리스-염산완충액(pH 7.0)과 등장인 세파덱스 G-150 컬럼에 통과시키고, 동일한 완충액으로 용줄시킨다. 이 조작이 진행될 때 얻어진 효소는 판 상전기 영동에서 단선으로 나타난다.

8. 분자량

본 효소의 분자량은 Andrews, P., Biochem. J. 96, 595(1965)에 기술된 방법에 따라 세파덱스 G-150 컬럼을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 본 효소의 분자량은 약 50,000으로 나타났다.

다음으로, 본 발명 효소와 이때까지 알려졌던 글루코아밀라제의 차이를 설명하고, 본 효소가 중성 부근에서 최적 pH를 갖는 신규한 효소라는 이유를 설명한다.

제1도와 표Ⅱ에서 알 수 있듯이, 최적 pH가 중성부근인은 본 발명 효소와 피리쿨타리아 오리자에 속의 쌀눈 미생물에 의해 생성된 글루코아밀라제뿐이다. 그렇지만 면 제2도와 표Ⅱ에서 분명히 밝혀지지만, 본 발명 효소와 쌀눈 글루코아밀라제는 최적반응온도가 전혀 다르다. 더욱이, 제4도에서 보면 본 발명 효소의 열 안정성은 쌀눈 글루코아밀라제의 그것보다 훨씬 우월하다. 또한 표Ⅱ에서, 본 효소의 분자량은 다른 글루코아밀라제의 분자량보다 훨씬 작다.

[표 Ⅱ]

여러종류 글루코아밀라제의 최적 pH, 최적온도, 분자량비교

a) 별표(*)를 제외하고는 모든 값은 대조치로부터 구한 값이다.

b) Hiromi, et al : Biochem. Biophys. Acta 302, 362(1973).

c) J.H.Pazur, et al : J. Biol. Chem. 237, 1002(1962).

d) Hattori, et al : Agr. Biol. Chem. 25, 895(1961).

e) Harada, et al : J. Ferment. Tech. 53, 559(1975).

f) Okada J. Jap. Soc. Starch Sci. 21, 283(1974).

g) H. Urbanek, et al : Appl. Micro. 30, 163(1975).

h) Matsuda, et al : Amylanse Symposium 9, 105(1974).

위의 사실들을 근거로하여 본 발명에 의하여 생산된 글루코아밀라제는 이때까지 알려지지 않았던 신규한 중성글루코아밀라제라고 결론 지을 수 있다. 본 효소를 생산하는 방법이 설명된다.

본 방법에서 사용되는 글루코아밀라제를 생산하는 미생물은 본 발명자 가흙에서 분리해낸 G30-1140계이다. 이 계(係)의 특성은 본명세서 처음에서 설명하였다.

본 미생물 계의 형태학적 특성은 아래에 열거한 연구자들의 방법에 따랐다.

Gilman, J.C. A MANUAL OF SOIL FUNGI. The Iowa State University press, Ames. 1971.

Clements, F.E. and Shear, C.L. THE GENERA OF FUNGI. Hafner, New York. 1964.

Barnett, H.L. ILLUSTRATED GENERA OF IMPERFECT FUNGI. 2nd ed. Bnrgess, Minneapolis. 1968.

Bisby G.R. Trans. Br. Mycol. Soc. 26, 133-43(1943).

Ainsworth, G.C. DICTIONARY OF THE FUNGI. 6th ed. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey. 1971.

9. G30-1140계의 형태학적 특성

본 발명의 미생물계는 5종류의 배지에서 시계접시 상에서 배양된다. 아래의 단락은 분리된 균 의 형태학적 특성이다.

a) 챠펙 한천 배지(Czapek Agar Mepium)

30℃에서 10일간 배양하였을때 균체는 직경 4-5cm의 둥글고 얇은 상태였다. 식물성 균사는 초자질이고 군체의 표면에 가주와 같이 검은 분생 포자집락이 불완전하게 자란 것이 보였다. 군체의 하부는 갈색이고 갈색부분은 배지에 조금 스며들어 있었다.

가지상의 섬유로 이루어진 식물성 균사는 거의 격막벽이 없고, 분생포자는 섬유로 균일하게 받쳐있다. 격벽을 가진 분생포자병은 오른쪽으로부터 뻗어나왔다. 분생포자병의 길이는 보통 40-60μ이지만 어떤때는 100μ이상인 것도 있다. 직경은 약 3-6μ이고, 분생포자병의 하부는 부드럽고, 표면은 대부분 사마귀가 많이 나있고, 미립의 보호물로 둘러 쌓여 있다. 이러한 분생포자병은 초자질이고 대부분은 가지가 없다. 분생포자의 끝부분은 3-8단위의 윤생체형 초자경자가 있다. 경자의 형태는 란(卵)형이거나 플라스크형이고, 길이는 8-15μ, 두께는 2-6μ이고, 표면은 부드럽다. 분생포자는 경자 끝부분에 생겨있고 3-5μ×5-10μ크기의 란형이며 표면은 부드럽다. 형성초기에는 초자질이며 성숙함에 따라 진한 녹색이 된다.

분생표자의 표면은 점조성물질로 덮여 있다. 이러한 이유 때문에, 분 생포자는 함께 모여 있고 분생포자병 끝부분에 큰 분생포자 집락을 형성한다. 점조 성물질은 생성초기에는 투명하지만 점점 검은색으로 변한다.

NaOH로 pH를 7.0으로 한다.

이 배지에서 군체의 성장은 앞에서 기술한 챠펙 배지보다 약간 느려서 30℃에서 10일간 배양했을때 약 3cm에 가까왔다.

군체는 둥글고 얇았으며, 그들의 표면은 기름과 같은 형태의 지름이 1-3mm인 검은 점조성물질이 중심에서 빛내고 있었다. 이러한 것은 점조성물질을 함유하고 기름방울과 같은 형태인 분생포자집작에 의한 것이는. 군체의 끝부분은 쟈펙배지에서 보다 진한 갈색이었고, 갈색 성분의 일부는 배지에 스며들어 있었다.

c) 감자-덱스트로우즈 한천 배지

이 배지에서 군체의 성장도 앞에서 기술한 챠펙배지 보다 느려서 30℃에서 10일간 배양 했을때 3-4cm이었다. 군체는 역시 원형이었으나 챠펙배지의 군체보다 어느정도 크고 두꺼웠다. 식물성세포의 성장도 좋았으며 광채를 발하였다. 군체의 표면은 약간 초록색 광택이 있는 검은 색이고 균사, 분생포자집락등이 많았다. 14일동안 배양한 후, 오래된 군체의 표면은 약 1-3mm 곧게된 신네마타(Synnemata)의 광채 형성을 하였다. 이러한 군체의 내부는 짙은 갈색이고 갈색성분중 많은 부분이 배지에 스며들어 있었다.

NaOH로 pH를 7.0으로 조절

30℃에서 10일간 배양시켰을 때 이 배지의 군체는 직경이 5-6cm이고 둥글고 얇았다. 식물성균사는 양호하게 자랐으며 검은 집락이었다. 분생표자의 성장은 앞에서 기순한 배지의 것보다 못했다.

군체의 하부는 갈색이었고, 갈색성분은 배지에 유리되어 있었다.

e) 데이비스 효모염 한천 배지

30℃에서 10일간 배양하였을 때 이 배지의 군체는 직경이 2-3cm이고 둥글기보다는 약간 난형이었다. 군사는 흰색이 약간 석인 갈색이고 약간 두꺼우며 부드러웠다. 균체의 내부는 갈색이지만 배지에는 전혀 스며들지 않았다.

10. G30-1140계의 형태학적 특성

a) 성장온도

이 계는 10-37℃의 범위에서 성장되었으나 30℃내외의 온도가 최적성장 온도이었다.

b) 성장 pH

이 계는 pH 3-10의 범위에서 성장될 수 있으나 최적성장 pH는 pH7 부근이었다.

c) 탄소원

이 계는 탄소원으로서 덱스트로오즈, 프룩토오즈, 갈락토오즈, 만노스, 삭카로오즈, 말토오즈, 전분을 사용하여 성장을 돕는다.

상기한 미생물 G30-1140계를 GENERA OF FUNGI와 A MANUAL OF SOIL FUNGI에 기탁한 후 글리오보트리스 알보비리디스(Gliobotrys alboviridis)라고 명명하였다. 그렇지만 DICTIONARY OF THE FUNGI 와 G.R. Bisby (Trans. Br. Mycol. Soc. 29, 133043(1943)에 따르면 이 미생물은 스타키보트리스 서브심플렉스(Stachybotrys Subsimplex)와 같으며 이러한 이유로 G30-1140계는 스타키보트리스 서브심플렉스로 명명되었다. G30-1140계는 식물성균사로 부터 곧게 솟은 분생포자병을 가지고 있으면, 가지는 거의 없으며, 격벽을 가지고 있다. 밑부분이 미끄러운 경우도 있으나 끝부분은 보호물로 덮여져 있다. 분생포자 끝부분에는 3-8개의 윤생체형 포자경자가 있다. 분생포자는 이러한 경자로 나누어진 미그러운 장타원형이며, 점조 성물질로 덮여져 있다. 이러한 특성은 G.R. Bisby (Trans, Br, Mycol, Soc. 26, 133-43(1943))에 의해 기술된 스타키보트리스 서브 심플렉스와 잘 일치한다. G30-1140계의 스타키보트리스 서브심플렉스 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Teohnology, Chiba City, 는 일본에 기탁번호4377로 보관되어 있다.

본 발명에서 사용된 미생물의 배양에 관해서는, 사상균의 배지에 사용되는 일반지식과 기술이 적용될 수 있다. 즉, 영양공급 배지로서 본래의 사상균을 배양하는데 사용되는 배지가 사용될 수 있다. 예로서, 여러가지 전분, 전분가수분해물, 옥수수가루, 밀가루, 당밀 등이 탄소원으로 사용될 수 있으며, 질소요구분은 펩톤, 면실유찌꺼기, 고기추출물, 효모추출물, 카제인, 옥수수침지액, 맥아엑스정, 콩찌꺼기, 크림을 떠낸 밀크, 유기암모니움염, 무기질소분 등으로 공급될 수 있다. 무기염으로서, 염화칼슘, 황산마그네슘, 인산염, 소금, 염화칼륨 등이 사용될 수 있다. 더욱이, 탄소원, 질소원, 무기염은 단독으로 사용되거나 적당히 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 미생물의 성장을 증진시켜서 효소생산물을 증가시킬 필요가 있을때는 미량의 금속염, 비타민, 아미노산등을 첨가할 수 있다. 사상균을 배양하는데 사용되는 배양조건은 대부분 본 발명 미생물을 배양하는데 사용될 수 있다. 즉, 액체 배지에서 본 미생물을 20℃-37℃에서 pH 5-8로 7-14일간 공기를 공급해 주면서 배양하였을 때 효소는 배지액에 집적된다. 또한, 밀기올과 같은 고형물이 사용한다면 고 형배지를 만들수 있다. 다음으로, 본 발명의 목적물인 중성글루코아밀라제를 배양물로 부터 회수하는 방법을 보인다. 액체배지의 경우, 균사체는 공지의 어느 방법에 의해서든 용출되며, 여과물을 저압하에서 농축시키거나, 여과물에 암모니움 설페이트와 같은 무기염을 가해줌으로써 다른 단백질과 함께 염으로 추출되거나, 혹은 아세톤이나 이소푸파놀과 같은 유기용매를 가해줌으로써 효소를 침전시키고 농축시킨다. 고형배지인 경우에는, 물이나 완충용액을 사용하여 배양물로 부터 효소를 먼전 추출한다. 다음에 액체배지에서 농축된 형태로 효소를 먼저 추출한다. 다음에 액체배지에서 농축된 형태로 효소를 얻을 수 있다. 이러한 방법으로 얻은 본 발명의 새로운 중성효소의 조제물을 앞에 기술한 정제기법으로 정제한다.

전분으로부터 덱스트로오즈를 생산시킬 때 액화된 전분의 당화에 본 발명의 신규한 중성글루코아밀라제를 사용할 수 있다. 특히, 앞에서 언급하였듯이 본 효소를 pH 6.0-6.5에서 당화를 수행할 때 역반응이 거의 일어나지 않으므로 산성조건하에서 이제까지 사용하던 글루코아밀라제를 사용하여 당화를 수행할 때 보다, 높은 수율로 덱스트로오즈를 얻을 수 있다.

본 발명은 다음 실시예에서 더 자세히 기술되며 모든 단위와 퍼센트는 다른 언급이 없는한 중량비이다.

[실시예 1]

가용성전분 5%, 옥수수침지액 2%, 면실유찌꺼기 0.5%, 효모추출물 0.5%, 디포타슘 포스페이트 0.1%, 마그네슘 설페이트 0.05%, 염화칼슘 0.01%를 함유한 액체 배지를 pH 7.0으로 맞추고 이액 100ml를 500ml 삼각플라스크에 담는다. 이 배지를 121℃에서 10분간 멸균하고 G30-1140 계스타키보트리스 서브심플렉스를 접종하고 30℃에서 7일간 요동기에서 배양한다. 배양이 끝난 후 여과해서 미생물을 배양액으로 부터 용출시킨다. 여과물은 밀리리터당 70단위의 글루코아밀라제 활성도를 가진다. 여과물을 -20℃에서 하루밤 얼린후 실온에서 용해시킨다. 불용물을 원심분리하여 제거한다. 이 용액에 두배 용량의 냉(冷)이소프로파놀을 가하고 효소가 침전되도록 4℃에서 하루밤 방치한다. 상동액을 따라 버리고 침전물을 pH 7.5인 1mM EDTA를 함유한 0.05M 트리스-염산완충에 용해시킨다. 효소를 함유한 이 용액을 같은 완충용액으로 4℃에서 하루밤동안 투석시킨다. 같은 완충용액으로 등장화시킨 DEAE-셀루로오즈를 투석시킨 효소용액에가하여 효소를 이 담체에 흡착시킨다. 이 DEAE-셀루로오즈를 같은 완충용액으로 세척한후 효소를 0.3M 농도의 NaCl을 함유한 같은 완충용액으로 용출시킨다. 다음, 2배용량의 냉이 소프로파놀을 가하여 용출물 중의 효소를 침전으로 만들고 침전물을 원심분리하여 모은다. 이 침전물을 1mM EDTA를 함유한 0.05M 트리스-염산완충액(pH 7.5)에 용해시킨 후 다시 같은 완충액으로 하루밤 투석시킨다. 투석된 효소용액을 1mM EDTA를 함유한 0.05M 트리스-염산 완충액(pH 7.5)로 등장시킨 DEAE-셀루로오즈 컬럼에 가한다. 이 컬럼을 사용하여 같은 완충액으로 NaCl의 농도를 점차로0.05M까지 증가시켜 효소를 용출시킨다. 효소를 함유한 용출물을 합하고 2배용량의 냉 이소프로파놀을 가하여 효소가 침전으로 떨어지게 하고 농축시킨다. 농축시킨 효소를 1mM EDTA를 함유한 0.05M트리스-염산완충액(pH 7.0)으로 등장시킨 세파덱스 G-150 컬럼에 가하고같은 완충액을 사용하여 용출시킨다. 효소작용력을 나타내는 용출물을 합하고 2배용량의 냉 이소프로파놀을 가하여 효소를 침전으로 떨어뜨다린. 이것에 정제, 농축한 회수된 효소의 형태이다. 이 정제된 효소의 비활성도는 단백질의 밀리그람당 127이다.

[실시예 2]

pH 6.5에서 0.05M 초산완충액에 분무-건조한 말토덱스트린(DE가약 10) 39%용액을 만들고 여기에 실시예 1의 정제된 글루코아밀라제를 가한다. 건조고형물로서 기질 매그람당 효소 0.20 단위씩 효소를 가한다. 용액을 55℃에서 72시간 배양한 후 여과한 가수분해물의 덱스트로오즈 함량을 고속액체 크로마토그라피로 측정하였더니 총탄수화물의 96.5%였다.

[실시예 3]

미국특허 3.912,590에 기술된 방법에 따라 B. 리케니포르미스(B. licheniformis)에 의한 세균성 알파-아밀라제를 사용하여 전분을 10.2 D.E.전분가수분해물로 전환시켰다. 잔류하는 알파-아밀라제를 불활성화시키기 위해 2N-염산을 가해 pH를 2.0로 맞추고 5분간 용액을 끊인다. 전분가수분해물 용액을 pH6.2로 맞추고 기질매 그람당 0.20 단위씩의 실시예 1의 정제된 글루코아밀라제를 가하기전에 원하는 농도로 pH를 맞춘다. 용액을 마개가 달린 시험관에서 55℃의 온도로 배양한다. pH를 5시간과 48시간 지난후 6.2로 맞춘다. 용액을 72시간동안 배양한 후 여과한 가수분해물의 덱스트로오즈 함량을 고속액체 크로마토그라피로 측정하니 총탄수화물의 97.6%였다. 용액의 최종농도는 건조고형물로서 31.2%였다.

시중의 A.니게르(A. niger)에 의한 글루코아밀라제를 사용하여 그의 최적조건(60℃에서 pH 4.3)에서 같은 기질 농도로 당화시험을 하였을 떼 상응하는 덱스트로오즈의 수율은 96.5%이었다. 유사하게, R.니베우스(R. niveus)에 의한 글루코아밀라제를 pH 5.0 55℃에서 실험하였을때 덱스트로오즈의 수율은 97%이었다. 시중의 글루코 아밀라제를 사용하여 당화를 행했을때 덱스트로오즈의 수율은 새로운 효소보다 1%가 낮았다. 이러한 것은 본 발명의 새로운 글루코아밀라제를 사용했을 때, 다른 시중의 글루코아밀라제를 그의 최적반응조건에서 실험하였음에도 불구하고, 본 발명의 새로운 효소가 더 높은 수율을 나타냄을 알려준다.

Claims (1)

1. 영양배지에서 스타키 보트리스 서브심플렉스(Stachybotrys Subsimplex)의 균주를 세포배양하여 이 배양매질에서 글루코아밀라제를 분리하는 것으로 구성되는, 세파덱스(Sephadex) G-150컬럼 크로마토그라피로 측정하여 약50,000의 분자량을 가지고 60℃에서 약 6.0내지 6.5범위에서 최적 글루코아밀라제 활성도를 가지고, pH 6.0에서 2% 말토덱스트린 용액에 10분간 반응시켜 측정하여 약 65℃에서 최대 글루코아밀라제 활성도를 가지는 글루코아밀라제 활성도를 가지는 글루코아밀라제의 제조방법.

Images