JPH06217770A - プルラナーゼ、それを生産する微生物、そのプルラナーゼの調製方法及び使用 - Google Patents

プルラナーゼ、それを生産する微生物、そのプルラナーゼの調製方法及び使用

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JPH06217770A
JPH06217770A JP5337202A JP33720293A JPH06217770A JP H06217770 A JPH06217770 A JP H06217770A JP 5337202 A JP5337202 A JP 5337202A JP 33720293 A JP33720293 A JP 33720293A JP H06217770 A JPH06217770 A JP H06217770A
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デヴェール フィリップ
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 プルラナーゼであって、バシラスデラミフィ
カンス株又はその菌株の誘導体又は変異体により生産さ
れることを特徴とするプルラナーゼ。 【効果】 アミロペクチンのα−1,６型グルコシド結合
を加水分解する特性を有し且つ酸媒体中約６０℃の温度
で酵素活性を有する熱安定性プルラナーゼが得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なプルラナーゼに
関する。本発明は、また、そのプルラナーゼを生産する
微生物の新規な菌株及びそのプルラナーゼの調製方法に
関する。本発明は、また、その使用及びその生産物を含
む組成物に関する。本発明は、また、そのプルラナーゼ
の遺伝子を含むＤＮＡ分子及びプルラナーゼをバシラス
株内で発現させるために用いることができるそのＤＮＡ
分子を含む発現ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】構成成分がアミロース及びアミロペクチ
ンであるデンプンは、デンプンを液化する段階及びその
液化したデンプンを糖化する段階の２段階で行われる酵
素法により単糖に変換することができる。デンプンの高
レベル変換を得るために、液化デンプンの糖化でα−1,
６−グルコシド結合を加水分解する酵素、例えば、プル
ラナーゼを加えることは既に提案されている。欧州特許
第 0 063 909号には、プルラナーゼ活性を有し且つ６０
℃、ｐＨ４−５において最適活性を有するいわゆる枝切
り酵素、即ち、アミロペクチンのα−1,６−グルコシド
結合を加水分解することができる酵素が記載されてい
る。この酵素は、バシラスアシドプルリチカス(Bacillu
s acidopullulyticus)株に由来している。更に、米国特
許第 5,055,403号には、酸媒体中で酵素活性を有し、バ
シラスナガノエンシス(Bacillus naganoensis)株に由来
するプルラナーゼが提案されている。この酵素は６０℃
で測定されたｐＨ約５において最大活性を有し、ｐＨ4.
５で測定した約６2.５℃の温度で最大活性を有してい
る。酸ｐＨ及び約６０℃の温度で活性であるので液化デ
ンプンの糖化に使用するのに適切であるが、従来技術の
プルラナーゼはかかる温度及びｐＨ条件下で極めて安定
性が低く、６０℃の温度及びｐＨ約4.５において基質の
存在しないときの半減期は数十分を超えないという欠点
がある。従って、液化デンプンの糖化に用いることがで
き、幅広い温度及びｐＨ範囲で、特に約６０℃の温度及
びｐＨ約4.５で非常に安定であるプルラナーゼが現在必
要とされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酸ｐ
Ｈで活性であり、酸ｐＨで従来技術のプルラナーゼより
著しく優れた熱安定性を有し、上記条件下で数時間の半
減期を有する新規なプルラナーゼを提供することであ
る。本発明の目的は、また、該プルラナーゼを自然に生
産する菌株、特にバシラス株を同定、単離及び提供する
ことである。本発明の目的は、また、該プルラナーゼを
コードするヌクレオチド配列を単離及び提供することで
ある。本発明の目的は、また、該プルラナーゼをコード
するヌクレオチド配列を含む発現ベクター及び染色体組
込みベクターを調製及び提供することである。本発明の
目的は、また、該プルラナーゼをコードするバシラス株
のヌクレオチド配列を含む発現ベクター及び組込みベク
ターで形質転換したバシラス宿主を調製及び提供するこ
とである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】これを目的として、本発
明は、バシラス、更に詳細には好気性及び非好熱性微生
物、例えば、バシラスデラミフィカンス(Bacillus dera
mificans) により産生されたプルラナーゼに関する。バ
シラスデラミフィカンス T 89.117D又はそのバシラスデ
ラミフィカンス株の誘導体又は変異体を用いることが好
ましい。単離及び精製されたプルラナーゼは、分子量約
１００（±１０）kDa を有する単一型のポリペプチドか
ら構成されることが好ましい。更に、該プルラナーゼの
Ｎ末端配列 (配列番号１）は、アミノ−カルボキシルの
向きに左から右まで下記の通りである。 本発明は、１〜９２８個のアミノ酸を有するアミノ酸配
列（配列番号１１）又はそれから誘導された修飾配列を
含む単離及び精製されたプルラナーゼに関する。この配
列は、図４〜図９に示されるように、該プルラナーゼの
全アミノ酸配列である。
【０００５】プルラナーゼをコードする全ヌクレオチド
配列（配列番号１０）及びそのアミノ酸への翻訳が図４
〜図９に示される。該プルラナーゼは、等電点4.１〜4.
５を有することが特に好ましい。本発明によるプルラナ
ーゼは、熱安定性であり、幅広い温度範囲で活性であ
る。プルラナーゼは酸ｐＨで活性である。該プルラナー
ゼは、アミロペクチン及びプルランの双方に存在するα
−1,６−グルコシド結合の加水分解を触媒することがで
きる。従って、いわゆる脱分枝あるいは枝切り酵素であ
る。該プルラナーゼは、アミロペクチンのα−1,６型グ
ルコシド結合を加水分解することができることが好まし
い。本発明によるプルラナーゼは、プルランをマルトト
リオースに、アミロペクチンをアミロースに分解するこ
とが好ましい。更に、本発明のプルラナーゼは、アミロ
ペクチンを加水分解してオリゴ糖（マルトオリゴ糖）を
生成する。この加水分解中に、約１３個のグルコース単
位から構成されたオリゴ糖の生成（重合度１３、この分
子は『鎖Ａ』とも言われる）が見られ、次いで、約４７
個のグルコース単位で構成されたオリゴ糖の生成（重合
度４７、この分子は『鎖Ｂ』とも言われる）が見られ
る。
【０００６】鎖Ａ及びＢを有するオリゴ糖は、D.J.MANN
ERS(“New Approaches to researchon Cereal Carbohyd
rates”の“Structural Analysis of Starch component
s by Debranching Enzymes", Amsterdam, 1985, p.45-5
4) 及び B.E.ENEVOLDSEN(“New Approaches to researc
h on Cereal Carbohydrates" の“Aspects of the fine
structure of starch", Amsterdam, 1985, p.55-60)
によって定義されている。本発明のプルラナーゼは、ジ
ャガイモアミロペクチンを加水分解することが好まし
い。この加水分解は、プルラナーゼの存在下にプルラナ
ーゼの最適活性条件下で、即ち、約６０℃の温度及びｐ
Ｈ約4.３でアミロペクチンの水性懸濁液を用いて行うこ
とができる。本発明のプルラナーゼは、マルトースの縮
合反応を触媒してテトラホロシド（４個のグルコース単
位を有するオリゴ糖）を生成する。本発明のプルラナー
ゼは、ｐＨ約4.５に緩衝化した溶液中基質を存在させず
に約６０℃の温度で測定した半減期約５５時間を有す
る。
【０００７】半減期は、プルラナーゼがｐＨ約4.５に緩
衝化した溶液中基質を存在させずに約６０℃の温度で５
５時間インキュベートした後測定した相対酵素活性が少
なくとも５０％を示すことを意味する。本発明によるプ
ルラナーゼは、酸ｐＨで熱安定性である。実際に、本発
明によるプルラナーゼは、ｐＨ約4.５に緩衝化した溶液
中基質を存在させずに６０℃の温度で４０時間インキュ
ベートした後測定した相対酵素活性が少なくとも５５％
を示す。同様の条件下で２４時間インキュベートした後
測定した相対酵素活性が少なくとも７０％を示す。相対
酵素活性は、あるｐＨ、温度、基質及び時間条件下で行
われた試験過程で測定された酵素活性とこの同一試験過
程で測定された最大酵素活性との間の比率を意味し、酵
素活性はプルランの加水分解より出発して測定され、最
大酵素活性は任意に１００の数値に決められる。本発明
によるプルラナーゼは、更に、幅広い範囲の酸ｐＨ値で
安定である。下記の条件下では、ｐＨ３以上で活性であ
る。実際に、該プルラナーゼは基質を存在させずにｐＨ
範囲約3.５以上で約６０℃の温度で６０分インキュベー
トした後測定された相対酵素活性が少なくとも８５％を
示す。
【０００８】下記条件下では、ｐＨ７以下で活性であ
る。実際に、該プルラナーゼは基質を存在させずにｐＨ
範囲約5.８以下で約６０℃の温度で６０分インキュベー
トした後測定された相対酵素活性が少なくとも８５％を
示す。これらの同一条件下ｐＨ範囲約3.８〜約５で測定
された相対酵素活性が９０％より大きいことが好まし
い。本発明によるプルラナーゼは、4.０より高いｐＨ範
囲において約６０℃の温度で測定された最適酵素活性を
生じるものである。本発明によるプルラナーゼは、4.８
未満のｐＨ範囲において約６０℃の温度で測定された最
適酵素活性を生じるものである。該プルラナーゼは、ｐ
Ｈ約4.３において約６０℃の温度で測定された最適酵素
活性を生じることが好ましい。本発明によるプルラナー
ゼは、更に、５５〜６５℃の温度範囲、更に詳細には６
０℃においてｐＨ約4.３で測定された最適酵素活性を生
じるものである。本発明によるプルラナーゼは、ｐＨ範
囲約3.８〜約4.９で約６０℃の温度において最大酵素活
性（最大酵素活性は６０℃及びｐＨ4.３で測定される）
の８０％以上の酵素活性を生じるものである。
【０００９】本発明によるプルラナーゼは、更に、デン
プン糖化の実際の工業的条件と一致する適切な特性のす
べてを有する。これらの特性は、最適ｐＨ５未満、最適
温度約６０℃及び酸ｐＨ及び高温のこれらの条件下での
酵素の良好な安定性である。酸媒体は、デンプンの工業
的糖化においてグルコアミラーゼ及びプルラナーゼの同
時使用により課せられる。実際に、デンプンの糖化に用
いられるグルコアミラーゼは、通常、真菌、特にアスペ
ルギルス株、例えば、アスペルギルスニガー (Aspergil
lus niger)、アスペルギルスアワモリ (Aspergillus aw
amori)又はアスペルギルスホエチダス (Aspergillus fo
etidus) により生産される。グルコアミラーゼの存在下
に液化デンプンの糖化に適切な理想的条件は、約６０℃
の温度及びｐＨ約4.０〜4.５である。これは、特に、SO
LVAY ENZYMES (Elkhart,United States)で商品名DIAZYM
E(登録商標) L-200 及び SOLVAY ENZYMES(Hanover,Germ
any)でOPTIDEX(登録商標) として販売されているグルコ
アミラーゼの場合である。糖化段階は数時間、通常、４
０〜６０時間続き、使用酵素がこの段階中安定で、活性
で、有効であることが必要であるので、これらの酵素は
酸媒体中で熱安定性が高く、最も長い半減期が可能でな
ければならない。このため、本発明のプルラナーゼは、
既知のプルラナーゼより有効である。
【００１０】本発明は、また、好気的条件下炭素源及び
窒素源及び無機塩を含む適切な栄養培地中でプルラナー
ゼを生産し、このようにして得られたプルラナーゼを回
収することができる好気性（及び非好熱性）菌の培養を
含むプルラナーゼの生産方法に関する。この培養基は固
体であっても液体であってもよい。培養基は、液体であ
ることが好ましい。本発明は、また、好気的条件下炭素
源及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養培地中でプル
ラナーゼを生産し、このようにして得られたプルラナー
ゼを回収することができるバシラスデラミフィカンス T
89.117D株 (LMG P-13056)又はこの菌株の誘導体の培養
を含むプルラナーゼの生産方法に関する。これらの細菌
に対する培養条件、例えば、培養基の成分、培養パラメ
ーター、温度、ｐＨ、通気及び攪拌は当業者に周知であ
る。
【００１１】培養基中の炭素源は、通常、デンプン、部
分加水分解デンプン、可溶性デンプン、オリゴ糖、グル
コース、アミロース、アミロペクチン又はこれらの２種
以上の混合物より選ばれる。培養基中の炭素源は、部分
加水分解デンプン、プルラン、グルコース又はこれらの
混合物より選ばれることが好ましい。良好な結果は、グ
ルコース及び部分加水分解デンプンを用いて得られた。
培養基中の窒素源は、通常、酵母エキス、大豆粉、綿実
粉、魚粉、ゼラチン、ジャガイモ粉又はこれらの２種以
上の混合物より選ばれる。培養基中の窒素源は、酵母エ
キス、大豆粉又はこれらの混合物より選ばれることが好
ましい。良好な結果は、酵母エキスを用いて得られた。
培養基中の無機塩は、通常、アニオンとして、塩化物、
炭酸塩、リン酸塩及び硫酸塩、カチオンとして、カリウ
ム、ナトリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシ
ウム又はこれらの２種以上の混合物より選ばれる。良好
な結果は、次の塩：ＫＨ2 ＰＯ4 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ・３Ｈ
2 Ｏ、（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 ０及びＣ
ａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏの混合物を用いて得られた。培養
は、通常、２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃の温
度で行われる。培養は、通常、ｐＨ3.５〜６、好ましく
は４〜６で行われる。
【００１２】培養は、好気的条件下、空気又は酸素の存
在下及び攪拌しながら行われる。産生されたプルラナー
ゼを回収するための手法は、当業者に周知である。遠
心、限外ろ過、蒸発、沈降、ろ過、ミクロろ過、結晶又
はこれらの手法の１つ又は他の組み合わせ、例えば、遠
心後に限外ろ過する、が通常用いられる。次いで場合に
よっては、プルラナーゼを精製することができる。酵素
を精製するための手法、特に硫酸アンモニウムのような
塩又は主にアセトンのような溶媒による沈降が当業者に
既知である。プルラナーゼは、また、噴霧乾燥又は凍結
乾燥により乾燥することができる。本発明は、また、プ
ルラナーゼを生産する新規な単離好気性菌の同定及び提
供に関する。一般的に、これはバシラス科に属する。バ
シラス属に属することが好ましい。該バシラスは、バシ
ラスデラミフィカンス T 89.117D株又はその菌株の誘導
体又は変異体であることが特に好ましい。この菌株の誘
導体又は変異体は、天然にあるいは人工的に修飾された
細菌を意味する。この菌株の誘導体は、既知の修飾法、
例えば、紫外線照射、Ｘ線、変異誘発物質又は遺伝工学
によって得ることができる。
【００１３】バシラスデラミフィカンス T 89.117D株
は、1993年 6月21日にブダペスト条約に基づくBELGIAN
COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS と呼ばれ
るコレクション(LMGカルチュアコレクション, Universi
ty of Ghent, Laboratory of Microbiology-K.L.Ledega
nckstraat 35, B-9000 GHENT,Belgium) に受託番号 LMG
P-13056として寄託されている。これにより、本発明
は、バシラスデラミフィカンス T 89.117Dの単離及び精
製培養及びその誘導又は変異培養に関する。本発明の菌
株は、その生化学的特性：内生胞子を形成するグラム陽
性、好気性、桿状菌により同定されている。本発明は、
また、バシラスデラミフィカンス T 89.117D (LMG P-13
056)のプルラナーゼをコードするヌクレオチド配列（配
列番号１０）又はそれから誘導された修飾配列を含むＤ
ＮＡ分子の単離及び提供に関する。このＤＮＡ分子は、
バシラスデラミフィカンス T 89.117Dのプルラナーゼの
全遺伝子を含むことが好ましい。プルラナーゼの全遺伝
子は、少なくとも転写プロモーター、シグナル配列、成
熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチド配列及び
転写ターミネーターを意味する。
【００１４】本発明によるＤＮＡ分子は、少なくともバ
シラスデラミフィカンス T 89.117D(LMG P-13056)の成
熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチド配列（配
列番号１０）及びそのシグナル配列（プレ配列）（配列
番号１３）を含む。このＤＮＡ分子は、バシラスデラミ
フィカンス T 89.117Dのプルラナーゼの全遺伝子を含む
ことが好ましい。良好な結果は、ヌクレオチド配列 (配
列番号８）を含むＤＮＡ分子を用いて得られた。ヌクレ
オチド配列 (配列番号８）は、アミノ−カルボキシルの
向きに左から右に、ヌクレオチド配列（配列番号１
４）、ヌクレオチド配列（配列番号１３）、ヌクレオチ
ド配列（配列番号１０）及びヌクレオチド配列（配列番
号１５）から構成される。本発明のプルラナーゼは、２
９個のアミノ酸を有する追加配列（配列番号１２）を含
む前駆体として合成される。本発明は、また、修飾プル
ラナーゼ、即ち、アミノ酸配列が少なくとも１個のアミ
ノ酸により野生型酵素と異なる酵素に関する。これらの
修飾は、ＤＮＡの変異誘発の慣用的な手法、例えば、紫
外線照射への露光あるいは化学生成物、例えば、亜硝酸
ナトリウム又はＯ−メチルヒドロキシルアミンへの露出
又は遺伝工学的手法、例えば、特定部位の変異誘発又は
ランダム変異誘発により得ることができる。
【００１５】本発明は、また、上で定義したプルラナー
ゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の修飾により
得られた変異プルラナーゼに関する。このような変異プ
ルラナーゼを得るための手法は当業者に既知であり、特
にMolecular Cloning-a laboratory manual-SAMBROOK,F
RITSCH,MANIATIS-second edition,1989,chapter 15に記
載されている。本発明は、また、バシラスデラミフィカ
ンス T 89.117Dのプルラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列を含むＤＮＡ分子を含む発現ベクターの調製及び
提供に関する。ＤＮＡ分子は、バシラスデラミフィカン
ス T 89.117Dの成熟したプルラナーゼをコードする構造
遺伝子を含むことが好ましい。このベクターは、ベクタ
ー pUBDEBRA1であることが特に好ましい。良好な結果
は、ベクター pUBCDEBRA11でも得られた。発現ベクター
は、レプリコン及び他のＤＮＡ領域（ヌクレオチド配
列）を含み且つ全遺伝子発現単位として宿主と無関係に
機能する任意のＤＮＡ配列を意味する。
【００１６】全遺伝子発現単位は、構造遺伝子並びに転
写及び翻訳に必要なプロモーター領域及び調節領域を意
味する。構造遺伝子は、ＲＮＡに転写するために用いら
れ且つ宿主によりタンパク質を合成するコード配列を意
味する。好ましい発現ベクターは、ベクター pUBDEBRA1
である。このベクターは、本発明によるバシラスデラミ
フィカンス T 89.117D株のプルラナーゼをコードする遺
伝子を含む。このベクターは、適切な宿主に導入するこ
とができる。この宿主は、通常、バシラス株である。こ
の宿主は、バシラスリケニホルミス(Bacillus lichenif
ormis)であることが好ましい。この宿主は、バシラスリ
ケニホルミス SE2株であることが特に好ましい。極めて
良好な結果は、このベクターを用いて宿主として用いら
れるバシラスリケニホルミス SE2 delap1 株に導入する
際に得られた。本発明は、また、バシラスデラミフィカ
ンス T 89.117Dのプルラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列を含むＤＮＡ分子を含む染色体組込みベクターの
調製及び提供に関する。ＤＮＡ分子は、バシラスデラミ
フィカンス T 89.117Dの成熟したプルラナーゼをコード
する構造遺伝子を含むことが好ましい。この染色体組込
みベクターは、ベクター pUBCDEBRA11DNSIであることが
好ましい。
【００１７】本発明は、また、プルラナーゼをコードす
る該遺伝子が遺伝工学的手法により導入されている組換
え体菌株に関する。この遺伝子は、発現ベクターによっ
てプラスミドに導入されるか又は染色体組込みベクター
によって１コピー以上で宿主染色体に組込むことができ
る。本発明は、また、出発産生菌と異なり且つプルラナ
ーゼをコードするヌクレオチドが染色体ＤＮＡに組込ま
れた形であるいは自律複製の形（プラスミド）で形質転
換により導入されている微生物株に関する。本発明は、
上記ＤＮＡ分子を含むバシラスリケニホルミスの形質転
換株に関する。本発明は、このＤＮＡ分子を含む発現ベ
クター又は染色体組込みベクターを含むバシラスリケニ
ホルミスの形質転換株に関する。本発明は、発現ベクタ
ー pUBDEBRA1又は染色体組込みベクター pUBCDEBRA11DN
SIを含むバシラスリケニホルミスの形質転換株に関す
る。
【００１８】本発明は、また、組換え体菌から出発する
プルラナーゼの調製方法であって、プルラナーゼをコー
ドするＤＮＡ断片を単離し、このＤＮＡ断片を適切なベ
クターに挿入し、このベクターを適切な宿主に導入する
か又はこのＤＮＡ断片を適切な宿主の染色体に導入し、
この宿主を培養し、プルラナーゼを発現させ、プルラナ
ーゼを回収することを含む方法に関する。適切な宿主
は、一般に、エシェリキアコリ(Escherichia coli)、バ
シラス又はアスペルギルス(Aspergillus) 微生物を含む
群より選ばれる。宿主は、通常、バシラスより選ばれ
る。宿主は、バシラス属の（好気性）微生物より選ばれ
ることが好ましい。宿主は、バシラスサチリス (Bacill
us subtilis)、バシラスリケニホルミス、バシラスアル
カロフィラス(Bacillus ａlcalophilus)、バシラスプミ
ラス(Bacillus pumilus)、バシラスレンタス (Bacillus
lentus)、バシラスアミロリクェファシエンス(Bacillu
s amyloliquefaciens)又はバシラスデラミフィカンス T
89.117D (LMG P-13056)より選ばれることが特に好まし
い。良好な結果は、本発明によるプルラナーゼの発現の
ための宿主がバシラスリケニホルミス、好ましくはバシ
ラスリケニホルミス SE2 delap1 株由来の組換え体株で
ある際に得られた。
【００１９】バシラスリケニホルミス SE2株を、1993年
6月21日にブダペスト条約に基づくBELGIAN COORDINATE
D COLLECTIONS OF MICROORGANISMS と呼ばれるコレクシ
ョン(LMGカルチュアコレクション, Ghent, Belgium) に
受託番号 LMG P-14034として寄託した。バシラスリケニ
ホルミス SE2からこのようにして得られた形質転換 SE2
delap1 株は、その染色体に成熟したプロテアーゼをコ
ードするＤＮＡ配列を含まない事実によってのみ親株と
異なっている。本発明は、また、野生状態のアルカリ性
プロテアーゼをコードする遺伝子を含むバシラス属の微
生物により異種方法で生産されたプルラナーゼに関す
る。この微生物は、バシラスデラミフィカンス T 89.11
7Dのプルラナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ分子を含むバシラスリケニホルミス株であること
が好ましい。アルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝
子は、このバシラス株から欠失していることが特に好ま
しい。この菌株は、バシラスリケニホルミス SE2 delap
1 株であることが好ましい。
【００２０】異種方法での産生は、天然微生物、即ち、
プルラナーゼをコードする遺伝子を野生状態で含む微生
物により行われない生産を意味する。本発明によるプル
ラナーゼは、種々の工業、例えば、食品工業、医薬品工
業又は化学工業において種々の用途がある。プルラナー
ゼは、特に、パン製造において『抗ステーリング』剤、
即ち、パンが貯蔵中に堅くならなくする添加剤として又
は醸造において低カロリービールの生産で用いることが
できる。プルラナーゼは、アミロースを脂肪の代替品と
して用いる低カロリー食品の調製に用いることもでき
る。プルラナーゼは、アミロペクチンを加水分解し且つ
このアミロペクチンから出発してオリゴ糖を生成するた
めに用いることもできる。プルラナーゼは、マルトース
から出発してテトラホロシドを生成するために用いるこ
ともできる。プルラナーゼは、α−1,６型結合を生じる
単糖又はオリゴ糖を縮合するために用いることもでき
る。
【００２１】プルラナーゼは、例えば、フルーツジュー
スを清澄化するために用いることもできる。プルラナー
ゼは、デンプンの液化に用いることができる。食品適用
の場合、プルラナーゼは担体に固定化することができ
る。酵素を固定化するための手法は、当業者に周知であ
る。本発明によるプルラナーゼは、デンプン及びプルラ
ンの処理に特に適切である。本発明は、液化デンプンの
糖化のためのプルラナーゼの使用に関する。本発明は、
また、プルラナーゼの存在下デンプン又は部分加水分解
デンプンの糖化段階を含むデンプン又は部分加水分解デ
ンプンの分解方法におけるプルラナーゼの使用に関す
る。本方法は、通常、１種以上の他の酵素、例えば、グ
ルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α
−グルコシダーゼ又は他の糖化酵素の存在下に行われ
る。生化学的特性を示すと、本発明によるプルラナーゼ
は、糖化段階を強酸条件下、即ち、ｐＨ少なくとも3.９
まで行うことができる。このｐＨは、既知のプルラナー
ゼに許容しうるものよりも酸が強い。
【００２２】生化学的特性を示すと、本発明によるプル
ラナーゼは、糖化段階を相対的に高温で、即ち、少なく
とも６５℃の温度で行うことができる。本発明のプルラ
ナーゼを糖化媒体に加えると、得られた最終組成物中の
グルコース含量を増加させることができるので、反応収
率を高めることができる。更に、本発明のプルラナーゼ
を糖化媒体に加えると、糖化時間を短縮することができ
る。本発明のプルラナーゼは、高いデンプン変換レベル
を達成させることができる。更に、糖化段階で、通常用
いられるグルコアミラーゼの大部分（少なくとも６０
％）が本発明によるプルラナーゼにグルコースの収率に
影響せずに置き換えることが可能である。この代用は特
に有利であり、実際に、通常得られる副生成物の量をか
なり減少させることができる。グルコアミラーゼが少量
で存在するので、グルコースから出発するオリゴ糖（α
−1,６結合を含む）の合成反応を触媒することは不可能
である。標準条件下では、デキストロース濃度が糖化媒
体中で高くなった際にグルコアミラーゼがこのオリゴ糖
合成の逆反応を触媒し、デンプン変換レベルを制限す
る。
【００２３】更に、本発明のプルラナーゼは、濃縮糖化
媒体、即ち、高含量の液化デンプンを有する媒体を使用
することができる。これは、経済的観点から有利であ
り、実際に蒸発コストを低下させることができる。本発
明は、また、本発明によるプルラナーゼを含む酵素組成
物に関する。本発明のプルラナーゼを含む組成物は、固
体又は液体として用いることができる。プルラナーゼ
は、企図される用途に従って処方される。本発明による
プルラナーゼを含む酵素組成物に安定剤又は保存剤を添
加することもできる。具体的には、プルラナーゼはプロ
ピレングリコール、エチレングリコール、グリセロー
ル、デンプン、プルラン、糖、例えば、グルコース及び
ソルビトール、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カル
シウム、ソルビン酸カリウム及び安息香酸ナトリウム又
はこれらの生成物の２種以上の混合物を添加することに
より安定化することができる。良好な結果は、プロピレ
ングリコールを用いて得られた。良好な結果は、デンプ
ン、安息香酸ナトリウム及びソルビン酸カリウムの混合
物を用いて得られた。
【００２４】本発明による酵素組成物は、プルラナーゼ
の他に、１種以上の他の酵素を含むこともできる。かか
る酵素は、特に、炭水化物ヒドロラーゼ、例えば、グル
コアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−
グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、シクロマルトデキス
トリン、グルコトランスフェラーゼ、β−グルカナーゼ
及びグルコースイソメラーゼ、糖化酵素、グルコシド結
合を切断する酵素又はこれらの２種以上の混合物であ
る。本発明は、好ましくは、グルコアミラーゼ及びプル
ラナーゼを含む酵素組成物に関するものである。
【００２５】図１はプラスミド pUBDEBRA1の制限地図を
示す。図２はプラスミドpLD1の制限地図を示す。図３は
プラスミドpUBDEBRA11DNSIの制限地図を示す。図４〜図
９は、成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチド
配列（配列番号１０）及びそのアミノ酸への翻訳（配列
番号１１）を示す。図１０〜図１６は、プラスミド pUB
CDEBRA11の BamHI部位からPstI部位までのＤＮＡ断片の
ヌクレオチド配列 (配列番号８）及びプルラナーゼのシ
グナル及び成熟配列のアミノ酸への翻訳 (配列番号９）
を示す。確信をもって決定されなかったヌクレオチド
は、記号 Nで示されている。これらの図面で用いた記号
及び略号の意味を下記表に纏める。
【００２６】 ──────────────────────────────────── 記号略号 意味 ──────────────────────────────────── ORIEC E.coliの複製起源 REP 複製に要するタンパク質 ORI+ + 鎖の複製起源 ORI- - 鎖の複製起源 KMR カナマイシン耐性を有する遺伝子 BLMR ブレオマイシン耐性を有する遺伝子 AMPR アンピシリン耐性を有する遺伝子 PP プレ／プロ配列 BLIAPR B.リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼをコードする配列 5 ′BLIAPR B.リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼをコードする配列の 前に位置する 5′配列 3 ′BLIAPR B.リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼをコードする配列の 後ろに位置する 3′配列 BDEPUL B.デラミフィカンスのプルラナーゼをコードする配列 ────────────────────────────────────
【００２７】本発明を下記実施例によって具体的に説明
する。
【実施例１】バシラスデラミフィカンス株の単離及び確認 バシラスデラミフィカンス T 89.117D株を寒天栄養培地
上で土壌から単離し、商品名 AZCL-プルランによって知
られMEGAZYME社によって販売されているプルランの着色
誘導体の分解能について選択した。この菌株を組成が下
記の通りであるＭＹＥ増殖培地中３７℃で培養した：Ｋ
Ｈ2 ＰＯ4 ３３mM；Ｋ2 ＨＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ６mM；
（ＮＨ4)2 ＳＯ4 ４５mM；ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ １m
M；ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １mM；酵母エキス0.５％
（重量／容量) ；グルコース0.５％（重量／容量）。培
地のｐＨをＨ3 ＰＯ4でｐＨ4.５に調製する。寒天培地
（ＭＹＥ／寒天）は、更に寒天２％（重量／容量）を含
む。本発明の菌株は、その生化学的特徴：内生胞子を形
成するグラム陽性、好気性、桿状菌により同定した。従
って、これはバシラス属に属する。３７℃においてＭＹ
Ｅ培地上この菌株の培養における栄養細胞は、サイズ0.
７×3.０−3.５μm の桿菌の形態をもつ。栄養細胞の運
動性は低い。
【００２８】ＭＹＥ培地上３７℃で３日間増殖した後、
顕微鏡観察の結果わずかに変形した楕円形の（次）端部
胞子嚢の存在を示す。カタラーゼ試験は、１０％の過酸
化水素の存在下弱い陽性である。オキシダーゼ試験は、
１％のテトラメチル−1,４−フェニレン−ジアンモニウ
ムジクロリドの存在下で陽性である。本菌株は好気性で
あり、即ち、好気生活下で発育する。嫌気生活下、即
ち、８４％(v/v) のＮ2 、８％(v/v) のＣＯ2 及び８％
(v/v) のＨ2 の雰囲気下３７℃で発育しないが、一方微
嫌気生活下、即ち、８2.５％(v/v) のＮ2 、６％(v/v)
のＯ2 、7.５％(v/v) のＨ2 及び４％(v/v) のＣＯ2 の
雰囲気下３７℃で発育する。略号％(v/v) は、容量／容
量として表される％を示す。本菌株は、好熱性ではな
い。ＭＹＥ培地中２０℃、３０℃、３７℃及び４５℃で
インキュベートした後、正常な発育を示すが、一方５０
℃及び５５℃では発育しない。リン酸塩バッファーで次
のｐＨ値：ｐＨ4.０、ｐＨ4.５、ｐＨ5.０及びｐＨ5.５
に緩衝化したＭＹＥ培地中でインキュベートした後、正
常な発育を示すが、一方ｐＨ7.０では発育しない。2.０
％(w/v) 及び3.５％(w/v) 濃度のＮａＣｌの存在下ＭＹ
Ｅ培地中でインキュベートした後、正常な発育を示し、
5.０％(w/v) のＮａＣｌの存在下では弱い発育を示し、
7.０(w/v) のＮａＣｌの存在下では発育しない。略号％
(w/v) は、重量／容量として表される％を示す。
【００２９】本菌株はカゼインを加水分解しない。実際
に、３７℃で２週間以上インキュベートした後、溶菌ゾ
ーンが見られなかった。チロシンをわずかに分解し、ピ
ルビン酸塩からアセトインを生産せず、硝酸塩を亜硝酸
塩あるいはＮ2 に還元しない。本発明によるバシラスデ
ラミフィカンス T 89.117D株は、欧州特許第 0 063 909
号に記載されているバシラスアシドプルリチカス株及び
米国特許第 5,055,403号に記載されているバシラスナガ
ノエンシスとは分類上異なる。バシラスデラミフィカン
ス T 89.117D株は、ｐＨ4.７〜5.５で増殖を示し、ｐＨ
7.０で増殖を示さず、3.５％(w/v) のＮａＣｌの存在下
で発育し、チロシンを分解し、硝酸塩を亜硝酸塩に還元
しない。バシラスデラミフィカンス T 89.117D株は、BE
LGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS と
呼ばれるコレクション(LMGカルチュアコレクション) に
受託番号 LMG P-13056として寄託されている。
【００３０】
【実施例２】プルラナーゼの調製 バシラスデラミフィカンス T 89.117D株を酵母エキス及
びグルコースの含量をデンプン、即ち、 酵母エキス 2.５％(w/v) ジャガイモデンプン 2.５％(w/v) に置き換えた以外は組成がＭＹＥ培地と同一である液体
培地（ＭＹＡ）中で培養する。培養を３７℃の温度で攪
拌しながら効果的に通気して行う。６８時間培養した
後、プルラナーゼ及び細胞バイオマスを遠心 (５０００
回転／分, ３０分間, BECKMAN JA-10)により分離する。
バシラスデラミフィカンス T89.117D株により産生され
たプルラナーゼは細胞外酵素である。次いで、プルラナ
ーゼを限外ろ過 (AMICON S10 Y10膜）により濃縮してプ
ルラナーゼの濃縮水溶液を得る。得られた溶液の酵素活
性を測定する。
【００３１】プルラナーゼ (PUN)の１酵素単位は、ｐＨ
4.５、６０℃の温度及びプルランの存在下で還元糖の遊
離を１μM グルコース当量／分の速度で触媒する酵素量
として定義される。プルラナーゼ酵素活性を次のプロト
コールに従って測定する。５０mM酢酸塩バッファー、ｐ
Ｈ4.５中１mlの１％濃度プルラン溶液を６０℃で１０分
間インキュベートする。活性0.２〜１PUN/mlに相当する
0.１mlのプルラナーゼ溶液をこれに加える。0.４mlの0.
５M ＮａＯＨを加えて１５分後に反応を停止する。遊離
した還元糖をSOMOGYI-NELSON法［J.Biol.Chem.,153 (19
44) p.375-380 及び J.Biol.Chem.,160 (1945) p.61-6
8］及び本出願の他の実施例でのように分析する。プル
ラナーゼを分析するために、第２法を用いる。プルラン
の存在下に酵素反応を試験条件に従って行い、次いで、
硫酸（0.１Ｎ）を加えて停止する。次いで、種々の成分
を分離するために、プルランの加水分解産物をＨＰＬＣ
クロマトグラフィー(BIO-RAD製 HPX-87Hカラム; 移動相
は１０mMＨ2 ＳＯ4 である) にかける。生成したマルト
トロリオースの量を得られたピーク領域を測定して定量
する。
【００３２】いわゆる枝切り活性、即ち、アミロペクチ
ンに存在するα−1,６−グルコシド結合の加水分解は、
ヨウ素の存在下、アミロペクチンからアミロースを遊離
することによる青色の変化により定量することができ
る。枝切り酵素活性を次のプロトコールに従って測定す
る。５０mM酢酸塩バッファー、ｐＨ4.５を含む0.４mlの
１％濃度アミロペクチン溶液を６０℃で１０分間インキ
ュベートする。0.２mlのプルラナーゼを加えて反応を開
始し、0.４mlの0.３M ＨＣｌを加えて３０分後に反応を
停止する。次いで、0.２mlのこの反応混合液に0.８mlの
0.００２５％(v/v) 濃度ヨウ素溶液を加え、５６５nmの
光学濃度を測定する。プルラナーゼを精製するために、
プルラナーゼの濃縮水溶液を９ g/lのＮａＣｌの５００
mlの水溶液６部でジアフィルトレーションし、このよう
にして得られた水溶液のｐＨを２５％(v/v) 濃度ＨＣｌ
を室温で加えてｐＨ3.５に調整する。ジアフィルトレー
ションは、プルラナーゼ溶液とＮａＣｌとを混合し、次
いで、得られた溶液を限外ろ過に供することを含む。
【００３３】得られた沈降物を遠心（５０００回転／
分, ３０分間, BECKMAN JA-10)により除去し、遠心から
の上清を集める。この上清のｐＨを５M ＮａＯＨを加え
てｐＨ6.０に調整する。得られた沈降物を遠心により除
去する。遠心からの上清を集め、５５℃で１５分間加熱
する。生成した沈降物を遠心（５０００回転／分, ３０
分間, BECKMAN JA-10)により再び除去する。遠心からの
上清を集める。この上清にアセトンを最終濃度６０％(v
/v) まで加え、生成した懸濁液を２時間かけて４℃にす
る。４℃で生成した沈降物を２０mMＭＥＳ（２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸）及び１mMＣａＣｌ
2 （ｐＨ6.０）の緩衝液に溶解する。このプルラナーゼ
溶液を溶液Ａとする。この溶液Ａを精製するためにイオ
ン交換クロマトグラフィーで再び濃縮する。商品名S-SE
PHAROSE(登録商標) HP HI LOAD 16/10として販売されて
いる約２０mlの内部容量のカラムを、まず、５０mMＣＨ
3 ＣＯＯＮａ及び１００mMＮａＣｌのバッファー（ｐＨ
4.０）を用いて流速５ml／分で平衡化する。溶液Ａを酢
酸塩バッファーで１０倍に希釈し、１５mlのこの希釈溶
液をカラムに析出させる。８０mlの酢酸塩バッファー
（１００mMＮａＣｌ）を溶離し、次いで、ＮａＣｌの直
線勾配（１００−５００mM）を含む２００mlの５０mM酢
酸塩バッファー（ｐＨ＝4.０）で溶離することにより均
一相とする。
【００３４】各画分においてプルラナーゼ活性を測定す
る。最も活性な画分をＢとした溶液（0.０２５ mg/mlを
含み、プルラナーゼ活性0.７PUN/mlを有する１２ml）に
混ぜる。この溶液Ｂから出発して、最終濃度８０％(v/
v) のアセトンを用いて沈降させる。得られた沈降物を
２０mlＭＥＳ及び１mMＣａＣｌ2 を含むバッファー0.６
ml容量に溶解する（ｐＨ6.０）。このプルラナーゼ溶液
を溶液Ｃとする。溶液Ｃは、タンパク質含量0.４ mg/m
l、酵素活性１２PUN/ml及び比活性３０PUN/mgを有す
る。結果を表１に纏める。
【００３５】
【表１】 表１ ──────────────────────────────────── 画分 容量 タンパク質 プルラナーゼ活性 比活性 ml mg/ml 全量 % PUN/ml 全量 % PUN/mg ──────────────────────────────────── 溶液 A 1.5 6.48 9.7 100 17.5 26.3 100 2.7 溶液 B 12 0.025 0.3 3 0.7 8.4 32 28 ────────────────────────────────────
【００３６】表１は、この精製段階が酵素溶液のプルラ
ナーゼ比活性を１０倍だけ増加したことを示している。
また、プルラナーゼの枝切り活性、即ち、アミロペクチ
ンのα−1,６結合についての加水分解活性を、アミロペ
クチンの加水分解後ヨウ素を用いた呈色により上記のよ
うに測定した。結果は、枝切り活性も増加したことを示
している。
【００３７】
【実施例３】分子量決定 実施例２で得られた溶液Ｃについて、トリクロロ酢酸
（最終濃度１０％(v/v))により沈降させる。得られた沈
降物を１０mMＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ＝8.０）、１mMＥ
ＤＴＡ、2.５％(w/v) のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）、５％(v/v)のβ−メルカプトエタノール及び0.０
１％(w/v) のブロモフェノールブルーからなるバッファ
ーに溶解する。バッファーに溶解した４μl の沈降物を
ポリアクリルアミドゲルで析出させる。用いられるゲル
系は PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY製の PHASTSYSTEM系
であり、ゲルはＳＤＳの存在下１０−１５％(v/v) のポ
リアクリルアミド勾配を含有する。電気泳動条件は、製
造業者により指定されているものである。ゲルをクーマ
シーブルーを用いて染色すると、溶液Ｃの主成分である
分子量約１０５キロダルトンのペプチドを示す。これを
実施例４に記載されるプルラナーゼの成熟形態のアミノ
酸配列から作られた定量により確認し、分子量１０２キ
ロダルトンが計算により推定される。
【００３８】
【実施例４】 １．Ｎ末端配列の決定 実施例３で記載したゲルから出発して、プルラナーゼの
Ｎ末端配列をBAUW等,(1987), Proc.Natl.Acad.Sci. US
A, 84, p.4806-4810 に記載されている手法に従って同
定する。このようにして決定したこの配列 (配列番号
１）は、アミノ−カルボキシルの向きに左から右に次の
通りである。Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val Hi
s Tyr Phe Cys Pro Ala Gly Asp TyrGln Pro ２．プルラナーゼのアミノ酸配列の決定 実施例２１で得られたプルラナーゼをコードする遺伝子
を含むプラスミド pUBCDEBRA11の約4.５ Kb のBamHI-Ps
tI断片のヌクレオチド配列 (SEQ ID NO:8)をSANGER等
(1977) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74, p.5463-5467の
ジデオキシ−ヌクレオチドを用いるチェインターミネー
ター法により求めた。
【００３９】Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応
を開始するために用いられる合成オリゴヌクレオチドを
BEAUCAGE等 (1981) Tetrahedron letters 22, p.1859-1
882の方法により合成した。配列決定は、配列分析キッ
ト(PHRARMACIA)の製造業者により指示されたプロトコー
ルに従って行い、ＮａＯＨで処理して二本鎖ＤＮＡを変
性した。配列分析方法は、SAMBROOK, 1989, P.13.15 及
び 13.17に記載されている。配列分析用ポリアクリルア
ミドゲルをSAMBROOK, 1989, P. 13.45-13.58に記載され
ている手法に従って調製した。BamHI部位からPstI部位
までのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号８）、
更にプルラナーゼのシグナル及び成熟配列のアミノ酸へ
の翻訳 (配列番号９）を同定した（図１０〜図１６）。
確信をもって決定されなかったヌクレオチドは記号Ｎで
示されている。本配列の分析からプルラナーゼをコード
するオープンリーディングフレームの存在が示される。
成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチド配列
（配列番号１０）を同定する。即ち、成熟したプルラナ
ーゼのアミノ酸配列（配列番号１１）がこのオープンリ
ーディングフレームの翻訳により推定される。図４〜図
９は、成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチド
配列、更にそのアミノ酸への翻訳を示すものである。
【００４０】上記タンパク質から実験的に決定したＮ末
端配列がＤＮＡ配列から翻訳されたものに相当すること
が証明される。これは、プルラナーゼが２９個のアミノ
酸を有する追加配列（プレ配列）を含む前駆体として合
成されることを示している。この２９個のアミノ酸配列
は、対応するヌクレオチド配列（配列番号１３）である
ように同定される（配列番号１２）。この追加配列は、
酵素の細胞外への放出で除去される分泌シグナル配列の
代表的な特徴を示している(Freudl,(1992), Journal of
Biotechnology, 23, p.231-240)。この２９個のアミノ
酸配列は次の通りである。 ATG GCT AAA AAA CTA ATT TAT GTG TGT Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys -25 TTA AGT GTT TGT TTA GTG TTG ACC TGG GCT TTT AAT GTA Leu Ser Val Cys Leu Val Leu Thr Trp Ala Phe Asn Val -20 -15 -10 AAA GGG CAA TCT GCT CAT GCT Lys Gly Gln Ser Ala His Ala -5 -1
【００４１】
【実施例５】アミノ酸分布 プルラナーゼのアミノ酸配列（実施例４）から求めた成
熟したプルラナーゼのアミノ酸分布を表２に纏める。
【００４２】
【表２】 表２ ────────────────────────────────── 記号 アミノ酸 数 % (分子量による) ────────────────────────────────── D アスパラギン酸 75 8.5 N アスパラギン 69 7.7 V バリン 72 7.0 T トレオニン 70 6.9 Y チロシン 42 6.7 L ロイシン 60 6.7 K リシン 48 6.0 S セリン 64 5.5 I イソロイシン 47 5.2 E グルタミン酸 40 5.1 Q グルタミン 39 4.9 A アラニン 69 4.8 P プロリン 46 4.4 G グリシン 75 4.2 F フェニルアラニン 27 3.9 W トリプトファン 18 3.3 M メチオニン 23 3.0 H ヒスチジン 22 3.0 R アルギニン 18 2.8 X 未知 3 0.3 C システイン 1 0.1 ──────────────────────────────────
【００４３】
【実施例６】等電点の決定 実施例２で得られた溶液Ｃについて、ＩＥＦ（イソエレ
クトロフォーカシング）電気泳動をｐＨ勾配4.０〜6.５
に変動させて行う。0.１２プルラナーゼ単位に相当する
容量をゲル上に３回実験して析出させる。泳動後、ゲル
の１／３をクーマシーブルーで染色する。ゲルの他の２
部分を１００mMＣＨ3 ＣＯＯＮａ、１mMＣａＣｌ2 及び
１mMＭｇＣｌ2(ｐＨ4.５）で緩衝化され且つ各々0.１％
(w/v) の AZCL-プルラナーゼ又は１％(w/v) のアミロペ
クチンを含む寒天ゲル（１％(w/v) ）で被覆する。次い
でこのようにして得られた組み合わせ（アクリルアミド
ゲル／寒天ゲル）を飽和湿度の雰囲気下６０℃で１６時
間インキュベートする。次いで、ブルー染色の呈色によ
る枝切り活性を証明するために、上層のアミロペクチン
で被覆されたゲルを３mMＩ2 及び５０mMＫＩの含有溶液
中室温でインキュベートする。
【００４４】アミロペクチンゲルのヨウ素の発色は濃い
青色ハロを示し、本発明の酵素の場合等電点約4.１〜約
4.５で枝切り活性を示す。プルラナーゼ活性の発色も同
様の結果を示す。これは、本発明のプルラナーゼがプル
ラナーゼ活性及び枝切り活性を有することを示してい
る。これは、本発明のプルラナーゼがプルラン及びアミ
ロペクチンの双方においてα−1,６型結合を加水分解す
ることができることを示している。これは、本発明のプ
ルラナーゼのその基質に対する特異性が低いことを示し
ている。これは、実施例４で記載したプルラナーゼの成
熟形態のアミノ酸配列（シグナル配列を含まない）から
出発して行われた定量により確認され、等電点4.５が計
算により推定される。
【００４５】
【実施例７】 天然菌株（バシラスデラミフィカンス）により産生され
たプルラナーゼに対するｐＨ及び温度作用に関する活性
プロファイル ５０mMクエン酸塩／リン酸塩バッファー中種々の温度
（５５，６０及び６５℃）及び種々のｐＨ値（3.２５〜
７）において遊離した還元糖を測定することにより、プ
ルラナーゼの酵素活性を測定する。実施例２で得られた
プルラナーゼの溶液Ｃを約１PUN/mlまで希釈して用い
る。結果を表３に纏める。本試験の過程において、ｐＨ
約4.３及び約６０℃の温度で１５分間置いた試料の場合
遊離した還元糖を測定することにより最大酵素活性が測
定された。即ち、相対酵素活性１００％は当然本試料に
よるものである。本実施例は、本発明によるプルラナー
ゼがｐＨ4.０〜4.８の範囲で約６０℃において測定した
最適酵素活性を有することを示すものである。本実施例
は、また、本発明によるプルラナーゼが５５〜６５℃の
温度範囲でｐＨ約4.３で測定した最適酵素活性を有する
ことを示すものである。更に、本実施例は、本発明によ
るプルラナーゼがｐＨ約3.８〜約4.９の範囲で最大酵素
活性８０％以上の酵素活性を生じることを示すものであ
る。
【００４６】
【表３】 表３ ───────────────────── 相対酵素活性％ pH 温度℃ 55 60 65 ───────────────────── 3.25 5.7 2.2 4.3 3.75 80.8 83.7 11.5 4.30 87.9 100 84.1 4.90 82.4 87.1 68 5.50 50.6 39.6 13.5 6.00 7.5 2.9 0 6.40 0 0 0 ─────────────────────
【００４７】
【実施例８】 天然菌株（バシラスデラミフィカンス）により産生され
たプルラナーゼのｐＨ安定性 実施例２で得られたプルラナーゼの溶液Ａを種々の１０
０mMクエン酸塩／リン酸塩バッファー中ｐＨ3.０〜7.０
に変動させるｐＨ値で酵素活性約0.７PUN/mlを生じるよ
うに希釈する。プルラナーゼを含む種々の希釈溶液を６
０℃で６０分間インキュベートする。次いで、プルラン
1.６％（重量／容量）の存在下６０℃、ｐＨ4.２で６０
分間インキュベートした後、これらの種々の溶液の酵素
活性を測定する。生成したマルトトリオースの量をＨＰ
ＬＣクロマトグラフィーで測定する（実施例２に記
載）。結果を表４に纏める。本試験の過程において、ｐ
Ｈ約4.５及び約６０℃の温度に置いた試料の場合最大酵
素活性を測定した。即ち、相対酵素活性１００％は当然
本試料によるものである。本実施例は、本発明によるプ
ルラナーゼが幅広い酸ｐＨ範囲で安定であることを示す
ものであり、実際に、基質を存在させずに約６０℃の温
度でｐＨ約3.５〜約5.８の範囲で６０分間インキュベー
トした後測定した相対酵素活性が少なくとも８５％であ
る。本実施例は、また、これらの同一条件下ｐＨ約3.８
〜約５の範囲で測定した相対酵素活性が９０％より高
く、ｐＨ３以下又は７以上においてのみ失活することを
示すものである。
【００４８】
【表４】表４ ──────────────── pH 相対活性 % ──────────────── 3 0 3.5 90 4 98 4.5 100 5 96 5.5 92 6 89 6.5 75 7 0 ────────────────
【００４９】
【実施例９】 天然菌株（バシラスデラミフィカンス）により産生され
たプルラナーゼの半減期の決定 実施例２で得られたプルラナーゼの溶液Ｃを１００mM酢
酸ナトリウム中ｐＨ4.５において酵素活性約0.７PUN/ml
を生じるように希釈する。このプルラナーゼを含む希釈
液を６０℃でインキュベートし、種々の時間で試料を採
取する。次いで、酵素活性を還元糖法（上記 SOMOGYIの
方法) により測定する。この試験の過程において、時間
０の試料の場合最大活性を測定した。相対酵素活性１０
０％は当然本試料によるものである。結果を表５に纏め
る。
【００５０】
【表５】 表５ ───────────────────── 時間（時間） 相対活性（%) ───────────────────── 0 100 16 76 24 74 40 57 48 54 64 47 ─────────────────────
【００５１】本実施例は、プルラナーゼが酸ｐＨにおい
て熱安定性であることを示すものである。本実施例は、
プルラナーゼの半減期がこれらの条件下で約５５時間で
あることを示すものである。実際に、プルラナーゼは、
ｐＨ約4.５に緩衝化した溶液中基質を存在させずに約６
０℃の温度で５５時間インキュベートした後測定した相
対酵素活性少なくとも５０％を有する。本実施例は、更
に、本発明によるプルラナーゼがｐＨ約4.５に緩衝化し
た溶液中基質を存在させずに約６０℃の温度で４０時間
インキュベートした後測定した相対酵素活性少なくとも
５５％を有することを示すものである。本実施例は、ま
た、これらの同一条件下２４時間インキュベートした後
測定した相対酵素活性少なくとも７０％を有することを
示すものである。
【００５２】
【実施例１０及び実施例１１Ｒ（比較）】糖化 デンプン乾燥分３５％（重量／重量）の濃度のトウモロ
コシデンプン及び0.０２％（重量／容量）の濃度の塩化
カルシウムを水に懸濁することにより糖化媒体を調製す
る。このトウモロコシデンプン懸濁液を商品名TAKATHER
M(登録商標) L-340 としてSOLVAY ENZYMESで販売されて
いるα−アミラーゼの存在下１０５℃で５分間ｐＨ6.０
において液化する。このようにして得られた液化デンプ
ンを９５℃の温度まで急速に冷却し、９５℃で１２０分
間攪拌しながら加水分解を続ける。この段階において加
水分解の程度は１０〜１２ＤＥである（ＤＥは『デキス
トロース当量』の単位、即ち、グルコース当量として表
される還元末端数を示す）。このようにして得られた液
化デンプンを糖化媒体１００ｇ当たり乾燥重量３２ｇの
最終濃度まで希釈する。得られた糖化媒体を６０℃の温
度まで冷却する。この糖化媒体のｐＨを酢酸で3.９〜4.
８の種々の数値に調整し、糖化過程中一定に保つ。
【００５３】0.１７６PUN/g.ds( 糖化媒体の乾燥分１ｇ
当たりグルコアミラーゼの酵素単位）に相当するグルコ
アミラーゼ量を糖化媒体に加える。使用したグルコアミ
ラーゼは商品名 DIAZYME L-200としてSOLVAY ENZYMESで
販売されている。本発明による実施例１０の場合にも、
乾燥分0.０７５ PUN/gに相当するプルラナーゼ量を実施
例２で記載したプルラナーゼの濃縮水溶液（溶液Ａ）と
して糖化媒体に加える。比較例１１Ｒは、プルラナーゼ
を加えない以外上記実施例１０のように行われる。４８
時間後、糖化を停止し、得られた生成物をクロマトグラ
フィーで分析する（実施例２に記載）。結果を表６に纏
める。本実施例は、本発明によるプルラナーゼが糖化に
有効であることを示すものである。即ち、本発明のプル
ラナーゼは、デンプン糖化の実際の工業的条件と一致す
る適切な特性をすべて有する。本実施例は、本発明によ
るプルラナーゼの存在下強い酸ｐＨまで、即ち、少なく
とも3.９までの種々のｐＨ値においてデンプン変換レベ
ルが高いことを示すものである。
【００５４】
【表６】 表６ ──────────────────────────────────── pH 実施例 得られた生産物 % グルコース DP2 DP3 > DP3 ──────────────────────────────────── 3.9 11R 94.18 2.92 0.54 2.37 10 95.63 2.90 0.73 0.73 4.2 11R 94.18 2.98 0.56 2.29 10 94.79 4.30 0.56 0.38 4.5 11R 93.72 2.88 0.57 2.83 10 95.49 3.00 0.75 0.76 4.8 11R 93.32 2.79 0.60 3.30 10 95.25 2.70 0.87 1.18 ────────────────────────────────────
【００５５】ＤＰ２は２グルコース単位（グルコース二
量体）を含むオリゴ糖、ＤＰ３は３グルコース単位（三
量体）を含むオリゴ糖及び＞ＤＰ３は３グルコース単位
以上を含むオリゴ糖を示す。
【００５６】
【実施例１２及び実施例１３Ｒ（比較）】糖化 糖化のｐＨをｐＨ4.２に定める以外は実施例１０を繰り
返す。0.１７PUN/g.ds( 糖化媒体の乾燥分１ｇ当たりの
酵素単位）に相当するグルコアミラーゼ量を糖化媒体に
加える。使用したグルコアミラーゼは商品名 DIAZYMEL-
200としてSOLVAY ENZYMESで販売されている。本発明に
よる実施例１２の場合にも、0.０３２５PUN/g.ds、0.０
５０PUN/g.ds、0.０７５PUN/g.ds及び0.１０PUN/g.ds
（糖化媒体の乾燥分１ｇ当たりのプルラナーゼの酵素単
位）に各々相当する種々のプルラナーゼ量を実施例２で
記載したプルラナーゼの濃縮水溶液（溶液Ａ）として糖
化媒体に加える。比較例１３Ｒは、プルラナーゼを加え
ない以外上記実施例１２のように行われる。結果を表７
に纏める。本実施例は、生産されるグルコース％の増加
を見るために用いることが必要なプルラナーゼ量が0.０
３２５PUN/g.ds未満であることを示すものである。
【００５７】
【表７】 表７ ──────────────────────────────────── 実施例 プルラナーゼ 得られた生産物 % PUN/g.ds グルコース DP2 DP3 > DP3 ──────────────────────────────────── 13R 0 94.78 3.55 0.73 0.94 12 0.0325 95.16 3.45 0.78 0.61 0.050 95.30 3.39 0.74 0.56 0.075 95.25 3.47 0.74 0.55 0.10 95.27 3.49 0.70 0.53 ────────────────────────────────────
【００５８】
【実施例１４】プラスミド pUBDEBRA1の構築 プラスミド pUBDEBRA1（図１）は、ベクターpUB131に導
入したそれ自体の転写プロモーターの制御によってバシ
ラスデラミフィカンス T 89.117D株のプルラナーゼをコ
ードする遺伝子を含む。染色体ＤＮＡを抽出し、バシラ
スデラミフィカンス T 89.117D株の培養（受託番号 LMG
-13056として同定) から精製する。これを目的として、
２００mlのこのバシラスの培養をＭＹＥ液体培地（実施
例１）中で行う。この培養を確認し、定常期にあるとき
に、５０００回転／分で１０分間遠心する(BECKMAN JA-
10回転子）。このようにして得られた遠心沈降物を１８
mgのリゾチームを含有するｐＨ８の0.１M ＴＲＩＳ−Ｈ
Ｃｌ（ＨＣｌで酸性にしたトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン）、0.１M ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸）及び0.１５M ＮａＣｌを含む９mlのバッファーに
溶解し、このようにして得られた浮遊液を３７℃で１５
分間インキュベートする。
【００５９】次いで、このようにして得られた溶解物を
２００μl の１０ mg/mlＲＮＡse溶液で５０℃において
２０分間処理する。次いで、この溶解物に１mlの１０％
濃度ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加える。
次いで、この溶解物を７０℃で３０分間インキュベート
する。次いで、この溶解物を約４５℃まで冷却し、次い
で、これに0.５mlの２０ mg/mlプロテイナーゼＫ溶液
（用時調製）を加える。この溶解物を透明な溶液が得ら
れるまで手で攪拌しながら４５℃でインキュベートす
る。この透明溶液について、Molecular Cloning - a la
boratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS - se
cond edition, 1989, p.E.3 に記載されている条件及び
手順に従ってこれに記載されている適度な界面が得られ
るまでフェノールで数回抽出を行う。２０mlのエタノー
ルでＤＮＡを沈降する。この沈降物を５０００回転／分
で５分間遠心して集め、次いでｐＨ0.８の２mlのＴＥ溶
液（１０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ、ｐＨ0.
８）に浮遊する。
【００６０】次いで、このようにして得られたＤＮＡを
制限酵素Sau3AIで部分的に切断する。本実施例及び本出
願の他の実施例すべてにおける制限条件は、次の精製段
階に十分な量のＤＮＡを得るためにこれらの制限条件を
１０倍だけ増加する以外はSAMBROOK等 (p.5.28-5.32)に
記載されているものである。最大断片サイズ５〜１０ k
bp (kbp:１０3 塩基対）を得るために、使用ＤＮＡ量と
酵素量との間の比率を調節する。次いで、このようにし
て得られた結合断片をSAMBROOK等 (p.6.01-6.19)に記載
されているようにアガロースゲル電気泳動（0.８％）に
かけ、サイズ５〜１０ kbpの断片を単離し、GENE CLEAN
法で精製する。次いで、SAMBROOK等 (p.6.01-6.19)に記
載されているように BIOLABS社［CLONTECH LABORATORIE
S(USA)カタログ No.6210-1］で販売されているプラスミ
ドpBR322でスプライスし、 BamHI部位で切断し、脱リン
酸する。この手法は、他の実施例においても用いられ
る。このようにして得られたスプライスを大腸菌MC1061
［CLONTECH LABORATORIES(USA)カタログ No.C-1070-1］
の細胞に電気穿孔法 (SAMBROOK等,p.1.75-1.81) で形質
転換し、この形質転換株を３７℃で約１８時間増殖した
後、ＬＢ（Luria-Bertani)寒天培地及び１００μg/mlの
アンピシリンを含有するペトリ皿で選択する。ＬＢ培地
は、SAMBROOK等(p.A.4) に記載されている。この培地
は、１０ g/lのトリプトン、５ g/lの酵母エキス及び１
０ g/lの塩化ナトリウムを含む。
【００６１】次いで、これらの皿に得られたコロニーを
同一培地の２皿で複製する。２皿のうちの１つに１％
(w/v)の寒天、１００mM酢酸ナトリウム（ｐＨ4.５）及
び0.１％ (w/v)の AZCL-プルランを含む寒天培地で被覆
する。６０℃で１８時間インキュベートした後、 AZCL-
プルランの加水分解の最大ゾーンを示すコロニーを同定
し、対応するコロニーを他の複製皿に単離する。これに
より pBRDEBRA3と呼ばれるプラスミドを抽出する菌株を
得る。 BamHIとEcoRIを含むプラスミド pBRDEBRA3を二
重消化し、アガロースゲル電気泳動（0.８％w/v)で精製
してプラスミド pBRDEBRA3の約4.６ kbpの EcoRI-BamHI
断片を得る。次いで、以前には宿主としてバシラスサチ
リスPSL1株を用いて BamHI及び EcoRI部位の BamHI及び
EcoRIで二重消化する内容であったベクターpUB131（欧
州特許第 0 415 296号に記載されている）でこの断片を
スプライスする。バシラスサチリスPSL1株は、B.G.S.C.
コレクションから受託番号 1A510として入手することが
できる(BACILLUS GENETIC STOCK CENTER, Ohio State U
niversity,United States)。
【００６２】このようにして得られたプラスミド pUBDE
BRA1をアルカリ性溶菌 (SAMBROOK等,p.1.25-1.28) の手
法により形質転換PSL1細胞から単離及び精製する。この
手法は、他の実施例においても用いられる。バシラスサ
チリスの形質転換株はすべて、プルラナーゼの遺伝子を
発現し且つプルラナーゼを分泌することができる。２５
μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地を含むペトリ皿
で、プラスミド pUBDEBRA1を含む形質転換PSL1株を継代
培養する。得られたコロニーを AZCL-プルラン（0.１％
重量／容量）及び酢酸ナトリウム（１００mM，ｐＨ4.
５）を含むアガロース（１％重量／容量）の上層で被覆
する。６０℃で１８時間インキュベートした後、形質転
換株のコロニーすべてが AZCL-プルランの加水分解ハロ
で取り囲まれていることが見られる。
【００６３】
【実施例１５】バシラスリケニホルミス SE2 delap1 株の調製 宿主バシラスリケニホルミス SE2株のアルカリ性プロテ
アーゼの遺伝子末端部分の同定 本実施例は、バシラスリケニホルミス SE2の該遺伝子を
欠失する欠失プラスミドを調製するために、宿主バシラ
スリケニホルミス株のアルカリ性プロテアーゼの遺伝子
末端部分の同定に関するものである。 １．染色体ＤＮＡのB.リケニホルミス SE2からの抽出 バシラスリケニホルミス SE2の染色体ＤＮＡのアルカリ
性プロテアーゼの遺伝子を単離するために、まず、培養
基がＬＢ培地を含む以外は染色体ＤＮＡの抽出の実施例
１４で記載した方法に従って抽出し、精製する。 ２．アルカリ性プロテアーゼの遺伝子のＣ末端部分の同
定 抽出した染色体ＤＮＡをMolecular Cloning - SAMBROOK
等(p.1.85)及びMolecular Cloning,a laboratory Manua
l,MANIATIS等,1982 Cold Spring Harbor Laboratory,
p.374-379に記載されている制限分析に供する。これら
の消化から得られたＤＮＡ断片をそのサイズにより0.８
％（重量／容量）アガロースゲルで分離する。
【００６４】次いで、アルカリ性プロテアーゼの遺伝子
のＣ末端部分のヌクレオチド配列を含む断片を同定する
ために、サザンブロット法 (SAMBROOK等- p.9.31に記載
されている手法）による分析に供する。ハイブリッド形
成に用いられる構築されるプローブは、アルカリ性プロ
テアーゼの遺伝子のＣ末端部分に相当する合成オリゴヌ
クレオチドである。合成オリゴヌクレオチドを構築する
ために用いられる手法は、BEAUCAGE, S.L.等(1981), Te
trahedron Letters, 22, p.1859-1882に記載されてお
り、BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER 装置でβ−シアノ
エチル−ホスホラミダイトを用いる。構築された合成オ
リゴヌクレオチド配列は次の通りである (配列番号
２）。 5′-GGCGGAGCAAGCTTTGTGG-3′ これらの結果は、アルカリ性プロテアーゼの遺伝子のＣ
末端部分が約2.７ kbpのPstI断片に位置することを示し
ている。ＤＮＡプローブによるハイブリッド形成は、Mo
lecular Cloning - SAMBROOK等-p.9.52-9.55に記載され
ている手法に従って行われる。この手法は、他の実施例
においても用いられる。
【００６５】次いで、バシラスリケニホルミス SE2株に
由来する抽出染色体ＤＮＡの標品を酵素PstIで消化し、
得られた断片をそのサイズによりアガロースゲル電気泳
動（0.８％）で分離する。約2.７ kbpの得られたPstI断
片をゲルから抽出し、ガラスビーズを用いBIO101社 (US
A)で販売されているいわゆる『GENE CLEAN』法で精製す
る。次いで、PstI部位でまず消化され脱リン酸されたプ
ラスミド pUC18(CLONTECHLaboratories, No.6110-1)で
2.７ kbpのPstI断片をスプライスする (SAMBROOK等-p.
1.68-1.69) 。次いで、このようにして得られたスプラ
イスをＣａＣｌ2 を用いた手法 (SAMBROOK等 -p.1.82-
1.84)でエシェリキアコリMC1061の細胞に形質転換し
た。ＤＮＡ断片を脱リン酸又はベクターを線形にする手
法は、SAMBROOK等 (p.1.60-1.61)に記載されている。ス
プライシングの手法もSAMBROOK等 (p.1.68-1.69)に記載
されている。１００μg/mlのアンピシリンで補足したＬ
Ｂ寒天培地を含むペトリ皿で形質転換菌株を選択する。
次いで、このようにして得られた大腸菌MC1061から出発
して形質転換した菌株を、サザン法で用いられるＣ末端
プローブを用いて標識した合成オリゴヌクレオチドでハ
イブリッド形成により選択し、プラスミドpKC1を単離す
る。
【００６６】合成オリゴヌクレオチドは、ファージT4の
T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた 32pγ−ＡＴＰで
SAMBROOK等 (p.11.31-11.33)に記載されている手法に従
ってリン酸化して標識する。 ３．アルカリ性プロテアーゼの遺伝子のＮ末端部分の同
定 抽出した染色体ＤＮＡを制限分析に供する。これらの消
化から得られたＤＮＡ断片をそのサイズにより0.８％ア
ガロースゲルで分離する。次いで、アルカリ性プロテア
ーゼの遺伝子のＮ末端部分のヌクレオチド配列を含む断
片を同定するために、サザンブロット法による分析に供
する。ハイブリッド形成に用いられるプローブは、アル
カリ性プロテアーゼの遺伝子のＮ末端部分に相当する合
成オリゴヌクレオチドである。構築された合成オリゴヌ
クレオチドの配列は次の通りである (配列番号３）。 5′-ATGGCTCCTGGCGCAGGC-3 ′ これらの結果は、アルカリ性プロテアーゼの遺伝子のＮ
末端部分が約5.５ kbpのPstI断片と約２ kbpのより小さ
な BclI-PstI断片にも位置することを示している。この
断片は、制限部位XbaI、ClaI、HpaI及びSphIを含まな
い。
【００６７】次いで、バシラスリケニホルミス SE2株に
由来する抽出染色体ＤＮＡの標品を酵素PstIで消化し、
得られた断片をそのサイズによりアガロースゲル電気泳
動（0.８％）で分離する。約5.５ kbpの得られたPstI断
片をゲルから抽出し、いわゆる『GENE CLEAN』法(BIO 1
01 社) で精製する。次いで、このようにして得られた
5.５ kbpのPstI断片をBclI、XbaI、ClaI、HpaI及びSphI
による一連の消化に供する。このようにして作製された
ＤＮＡ断片を、 BamHI及びPstIでまず線形にしたプラス
ミド pMK4(SULLIVAN等,(1984),Gene 29, p.1-26)でスプ
ライスする。プラスミドpMK4はB.G.S.C.コレクション(B
acillus Genetic Stock Center (Ohio State Universit
y) Columbus, Ohio, USA) から受託番号1E26として入手
することができる。次いで、このようにして得られたス
プライスをＣａＣｌ2 を用いた手法でエシェリキアコリ
MC1061 の細胞に形質転換した。１００μg/mlのアンピ
シリンで補足したＬＢ寒天培地を含むペトリ皿で形質転
換株を選択する。次いで、このようにして得られた大腸
菌MC1061から出発して形質転換した菌株を、サザン法の
Ｎ末端プローブを用いて標識した合成オリゴヌクレオチ
ドでハイブリッド形成により選択し、プラスミドpKP1を
単離する。
【００６８】
【実施例１６】アルカリ性プロテアーゼの配列 プラスミドpKP1及びpKC1に導入した断片の配列をSAMBRO
OK等(p.13.15及び13.17 及び図13.3B)に記載されている
手法に従ってPst1部位からSacI部位まで決定する。
【００６９】
【実施例１７】プラスミドpLD1の構築 バシラスリケニホルミス SE2 delap1 株を調製するため
にプラスミドpLD1（図２）を構築する。プラスミドpLD1
の構築を以下に記載する。プラスミドpKP1（実施例１５
で得られた）は大腸菌MC1061に不安定である。このた
め、B.リケニホルミス SE2のアルカリ性プロテアーゼの
遺伝子のＮ末端部分を含む染色体ＤＮＡ断片をベクター
pACYC184(BIOLABS, USA,受託番号#401-M) に導入した。
この導入はプラスミドpKP1の１８４９bpの EcoRI-EcoRI
断片をプラスミドpACYC184の EcoRI部位に導入して行わ
れ、スプライシングを用いて大腸菌MC1061の細胞を形質
転換する。これによりプラスミドpKPN11が得られる。１
2.５μg/mlのテトラサイクリンで補足したＬＢ寒天培地
を含むペトリ皿で形質転換株を選択する。プラスミドpK
PN11の１８４９bpの EcoRI-EcoRI断片の方向づけを制限
分析 (SAMBROOK等 -p.1.85及びMANIATIS等 -p.374-379)
により決定する。プラスミドpKPN12は次の方法で得られ
る：プラスミドpKPN11の１６７１bpの StyI-StyI断片を
StyIで消化して除去し、次いで、この断片を予め生産さ
れた下記の合成二本鎖ＤＮＡで置き換える。
【００７０】5′-CTTG GAGCTC GTTAAC AGATCT -
3′（配列番号４） 3′- CTCGAG CAATTG TCTAGA GTTC -5′（配列番号
５） (StyI) SacI HpaI BalII (StyI) プラスミドの制限酵素による消化はSAMBROOK等-1989-ch
apter 5.28-5.32 に記載されている手法に従って行われ
る。カナマイシン及びブレオマイシン又はフレオマイシ
ン耐性をコードするプラスミドpUB131に由来するＤＮＡ
断片を次のようにして得た。カナマイシン及びブレオマ
イシン又はフレオマイシン耐性をコードする遺伝子を有
する２６６６bpの PstI-TaqI断片をプラスミドpUB131の
PstI-TaqIを二重消化して得る。この断片をプラスミド
pBS-(STRATAGENE,USA,受託番号 211202)の PstI-AccI部
位に導入する。これによりプラスミド pBSKMPMが得られ
る。プラスミド pBSKMPMの調製では、プラスミドpBS-と
の結合領域に小さな欠失が見られ、これはプラスミド p
BSKMPMのSphI及びPstI部位の欠損を生じる。プラスミド
pBSKMPMを用いて２種の合成ヌクレオチドを導入する目
的で特定部位の変異誘発を行うために用いられる一本鎖
ＤＮＡを作製し、そのSmaI部位が下記で同定され、１種
がカナマイシン及びフレオマイシン耐性の遺伝子の前に
もう１種が後ろに位置する。
【００７１】特定部位の変異誘発の手法は、SAMBROOK等
-p.15.74-15.79 に記載されている。BIO-RAD(No.170-3
576)で販売されている変異誘発キットを用いる。変異誘
発に用いられる合成オリゴヌクレオチドの配列は次の通
りである（各々配列番号６及び配列番号７）。 ２種のオリゴヌクレオチドの存在下この変異誘発で得ら
れるプラスミドはプラスミドpBSKMPM1である。このプラ
スミドは、カナマイシン及びフレオマイシン耐性をコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することができる
２つのSmaI制限部位を含む。
【００７２】次いで、プラスミドpBSKMPM1の１５９７bp
の SmaI-SmaI断片をプラスミドpKPN12のSmaI部位に導入
し、これによりプラスミドpKPN14が得られる。プラスミ
ドpKPN14に導入した断片の正しい方向づけは、制限分析
によるプラスミドＤＮＡの標品について選択を行うこと
により証明される (SAMBROOK等 -p.1.85) 。プラスミド
pKC1(実施例１５で得られた）の1.２ kbpのSacI-HindI
II断片についてまず HindIIIで消化することにより、プ
ラスミドpKC1に存在し且つアルカリ性プロテアーゼのＮ
末端配列の前に位置するＤＮＡ断片を単離する。HindII
Iの突出している 5′端をＤＮＡポリメラーゼのクレノ
ウ断片で処理してブラント末端にする (SAMBROOK等 -p.
F.2-F.3)。即ち、所望のブラント末端SacI-HindIII断片
を作製するためにSacI制限を行う。この断片をプラスミ
ドpKPN14のHpaI及びSacI部位に導入してプラスミド pLI
D1を作製する。これらの構築はすべて、形質転換株を選
択するためにテトラサイクリン（１２μg/ml) の存在下
大腸菌MC1061株を形質転換することにより行われる。
【００７３】B.サチリス及びB.リケニホルミスを増殖す
ることができるプラスミドは、プラスミド pLID1の３６
２３bpの Bg1II-Bg1II断片がもつ大腸菌の複製機能をバ
シラス：プラスミドpUB131から単離した２２３８bpの断
片 Bg1II-BamHIの複製機能をもつ断片に置き換えること
によりプラスミド pLID1から構築される。この大腸菌の
バシラス細胞による置き換えは、まず、プラスミド pLI
D1を Bg1II及び BamHIで消化して3.６ kbpの Bg1II-Bg1
II断片をプラスミド pLID1から単離することにより行っ
た。補足的 BamHI消化が必要であり、実際に、 Bg1II消
化のみでは、アガロースゲル電気泳動によって分離する
ことができない同一サイズの断片を生じた。従って、3.
６ kbpの Bg1II-Bg1II断片をプラスミドpUB131から単離
した２２３８bpの断片 Bg1II-BamHIにおけるバシラスサ
チリス SE3株でクローン化してプラスミドpLD1を作製す
る（図２）。バシラスサチリス SE3株を1993年 6月21日
にブダペスト条約に基づく BELGIANCOORDINATED COLLEC
TIONS OF MICROORGANISMSと呼ばれるコレクションに受
託番号 LMG P-14035として寄託した。
【００７４】
【実施例１８】バシラスリケニホルミス SE2 delap1 の構築 同種組換えに基づく手法により、バシラスリケニホルミ
ス SE2株の染色体ＤＮＡにおいて所望の修飾が行われ
る。バシラスリケニホルミス SE2 delap1 を生産するた
めに修飾が行われる。下記の変更以外はMolecular Biol
ogical Methods for Bacillus(p.150-151)に記載されて
いるプロトプラスト法及び規定されている条件下で、B.
リケニホルミス SE2においてプラスミドpLD1を形質転換
する：リゾチーム末を記載されている手順の段階７に規
定されている１mg/ml の代わりにＳＭＭＰ中５mg/ml の
量で加え、リゾチームで最大溶菌を得るインキュベーシ
ョン時間は６０分であり、再生は２００μg/mlのカナマ
イシンを含むＤＭ３培地(Molecular Biological Method
s for Bacillus (HARWOOD 等,eds) John Wiley & Sons
(1990)(p.150-151)に記載されている）中で行われる。
形質転換株を単離し、この菌株に導入されたプラスミド
pLD1の制限地図を証明する。
【００７５】形質転換株を２ g/lのグルコース及び２５
μg/mlのカナマイシンで補足した５０mlのＬＢ培地中３
７℃で１８時間培養する。培養試料（0.１ml）を採取
し、５０mlの同一ＬＢ培地を含む三角フラスコに種菌す
るために用いる。この培養を３７℃で１８時間インキュ
ベートする。この培養試料を採取し、２５μg/mlのカナ
マイシン及び１％（重量／容量）の脱脂乳 (DIFCO)で補
足したＬＢ寒天培地を含むペトリ皿で試験してプロテア
ーゼの存在を検出する。これらのペトリ皿に増殖を示す
コロニーのまわりに加水分解ハロがないことは、これら
のコロニーがアルカリ性プロテアーゼを生産することが
不安定であることを示している。菌株(apr- ，Kmr ) 、
即ち、アルカリ性プロテアーゼも生産せず(apr- ) カナ
マイシン耐性もない (Kmr ) ものが得られるまで培養と
試験を繰り返す。次いで、抗生物質を存在させずに３７
℃において増殖培地で培養してこのバシラスリケニホル
ミス SE2 delap1 に存在するプラスミドpLD1を除去す
る。
【００７６】この菌株を２ g/lのグルコースで補足した
５０mlのＬＢ培地中３７℃で１８時間培養する。この培
養液を0.１ml容量採取し、５０mlの同一培地を含む別の
三角フラスコに植菌するために用いて、培養を３７℃で
１８時間続ける。次いで、試料を採取し、ＬＢ培地を含
むペトリ皿で伸展させる。単離したコロニーを２５μg/
mlのカナマイシンで補足した第２ＬＢ培地皿で継代培養
する。カナマイシンに感受性のある菌株 (Kms ) を単離
する。その表現型が確認される(apr- , Kms )。次い
で、この菌株の染色体ＤＮＡを単離及び精製し、染色体
欠失の構造をサザンブロット法で証明する。同定された
欠失は位置について正しく、同種二重組換えによりアル
カリ性プロテアーゼの遺伝子の(5′) の前及び(3′) の
後に位置する配列で生じた。得られた菌株は、B.リケニ
ホルミス SE2 delap1 と呼ばれる。これは、アルカリ性
プロテアーゼを生産しない。
【００７７】
【実施例１９】バシラスリケニホルミス SE2 delap1 の発現ベクターに
よる形質発現 実施例１４で記載したプラスミドpUBDEBRA1(図１）をそ
の宿主から抽出し、単離及び精製する (SAMBROOK等,198
9,p.1.25-1.28)。実施例１８で記載したB.リケニホルミ
ス SE2 delap1 株の培養を調製し、次いで、この菌株を
このプラスミドでMANIATIS等(p.150-151) に記載されて
いるプロトプラスト法に従って形質転換する。形質転換
した菌株をペトリ皿で選択し、単離し、スクリーニング
により精製する。
【００７８】
【実施例２０】プルラナーゼのB.リケニホルミス SE2 delap1(pUBDEBRA
1)による生産 実施例１９で得られたプラスミド pUBDEBRA1で形質転換
したB.リケニホルミスSE2 delap1 株を0.５％(w/v) グ
ルコース及び２０μg/mlのカナマイシンで補足したＬＢ
予備培養基で３７℃において１７時間培養する。この予
備培養を２０μg/mlのカナマイシンで補足した５０mlの
Ｍ２培地に移す。Ｍ２培地は、３０ｇの大豆粉、７５ｇ
の可溶性デンプン、２ｇの硫酸ナトリウム、５mgの塩化
マグネシウム、３ｇのＮａＨ2 ＰＯ4 、0.２ｇのＣａＣ
ｌ2 ・Ｈ2 Ｏ及び１０００mlの水を含有する。このＭ２
培地を１０N ＮａＯＨでｐＨ5.８に調整した後、滅菌す
る。培養を攪拌しながら３７℃で８０時間インキュベー
トする。８０時間後、５０００回転／分で１０分間遠心
してバイオマスを除去する。遠心からの上清を保持す
る。この上清の酵素活性を測定し、プルラナーゼ活性の
存在を記録する。
【００７９】
【実施例２１】バシラスリケニホルミス SE2 delap1(pUBCDEBRA11DNSI)
の構築−染色体の組込み 本実施例はプルラナーゼをコードする遺伝子のバシラス
リケニホルミス SE2 delap1 株の染色体への組込みに関
する。これを目的として、プラスミド pBRDEBRA3の4.６
kbの EcoRI-BamHI断片を大腸菌MC1061株の形質転換によ
り pUBC131ベクターの EcoRI及び BamHI部位にクローン
化し、これによりプラスミド pUBCDEBRA11を作成する。
次いで、プラスミド pUBCDEBRA11の８８６bpの NsiI-Ns
iI断片を欠失することにより組込みベクター pUBCDEBRA
11DNSI（図３）を構築する。このようにして得られたプ
ラスミドは、８８６bpのNsiI断片の欠損のためにバシラ
ス内で複製する可能性を失っている。本構築を行うため
に、プラスミド pUBCDEBRA11をNsiI制限酵素で切断し、
約4.９ kbpの NsiI-NsiI断片をアガロースゲル電気泳動
で精製する。次いで、この断片を再環化するためにスプ
ライシングに供する。スプライシングを大腸菌MC1061に
形質転換し、プラスミドpUBCDEBRA11DNSI1を得る。
【００８０】プラスミドpUBCDEBRA11DNSI1をB.リケニホ
ルミス SE2 delap1 株に組込むためには、このプラスミ
ドが染色体ＤＮＡに相同なＤＮＡ断片を有することが必
要である。従って、B.リケニホルミスに由来する染色体
Sau3AI断片を組込みベクターpUBCDEBRA11DNSI1の BamHI
部位にクローン化した。これを目的として、バシラスリ
ケニホルミス SE2 delap1 株から抽出した染色体ＤＮＡ
をSau3AI制限酵素で部分的に切断する。次いで、1.５〜
３kbのサイズのＤＮＡ断片をアガロースゲルで精製し、
BamHI制限酵素で切断したプラスミド pUBCDEBRA11DNSI
でスプライスし、脱リン酸する。このようにして得られ
たスプライスをMC1061の細胞に電気穿孔法により形質転
換する。１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培
地で選択した後、約３０００コロニーが得られる。これ
らのコロニーすべてをＬＢ培地に浮遊し、アルカリ性溶
菌法 (SAMBROOK等, p.1.25-1.28)でプラスミドを抽出す
る。従って、このようにして得られたプラスミドの標品
をプロトプラスト法による形質転換によりバシラスリケ
ニホルミス SE2 delap1 に導入する。形質転換細胞をＤ
Ｍ３再生培地(Molecular Biological Methods for Baci
llus (Harwood, C.R., Cutting, S.M., eds) J.Wiley &
sons,1990,p.150-151に記載) で上記の構築されたプラ
スミドの１種の染色体組込みによってのみ与えられるフ
レオマイシン（１７μg/ml）耐性に対して選択する。
【００８１】このようにして得られたコロニーを５μg/
mlのフレオマイシン及び0.０６％のAZCL−プルランで補
足したＬＢ寒天培地で継代培養する。次いで、AZCL−プ
ルランの最大加水分解ハロを単離し、ＬＢ寒天培地で継
代培養する。次いで、この菌株のプラスミド含量を抽出
する。このようにして得られた標品をアガロースゲル電
気泳動による分析に供するとプラスミドが存在しないこ
とを示す。染色体ＤＮＡを抽出し、実施例１４で記載し
たように精製し、サザン法による分析に供すると、プラ
スミド pUBCDEBRA11DNSIが約３kbのSau3AI断片への同種
組換えにより染色体ＤＮＡに組込まれたことを示す。こ
れは、染色体に組込まれた状態のB.リケニホルミス内で
B.デラミフィカンスのプルラナーゼをコードする遺伝子
が発現することを証明するものである。
【００８２】
【実施例２２】バシラスリケニホルミス SE2 delap1 株 (pUBCDEBRA11D
NSI)によるプルラナーゼの生産方法 実施例２１で得られた染色体ＤＮＡに組込まれた形のプ
ルラナーゼの遺伝子を含むB.リケニホルミス SE2 delap
1 株を0.５％(w/v) のグルコース及び５μg/mlのフレオ
マイシンで補足したＬＢ予備培養基で３７℃において１
７時間培養する。この予備培養液１０ml容量をバッフル
付フラスコ中５μg/mlのフレオマイシンで補足した２５
０mlのＭ２培地（実施例２０に記載）に植菌する。攪拌
しながら３７℃で２４時間インキュベートした後、この
ようにして得られた培養のすべてを6.５リットルのＭ２
培地を含む醗酵槽に導入する。３７℃で７２時間醗酵を
続ける。濃縮リン酸を加えてｐＨ値7.０以下に保持し、
空気流速を４リットル／分に保持し、飽和含量の３０％
(v/v) より高い溶存酸素含量を得るように攪拌を調節す
る。得られた培養に商品名 OPTIFLOC(登録商標）として
SOLVAY DEUTSCHLANDで販売されているポリアミンに基づ
く凝集剤５０mlを加えた後、５０００回転／分で１５分
間遠心(BECKMAN JA-10) してバイオマスを除去し、得ら
れた上清を１M ＨＣｌ溶液でｐＨ4.５まで酸性にする。
得られた溶液を８０００回転／分で１５分間再び遠心す
る (BECKMAN JA-10)。
【００８３】次いで、５０００ダルトンの分解限界を有
する膜を備えた限外ろ過単位を用いた限外ろ過により、
上清を最終容量１リットルに濃縮する。次いで、この濃
縮溶液にアセトンを最終濃度６０％ (v/v)まで加える。
生成した浮遊液を４℃で２時間インキュベートし、次い
で８０００回転／分で１５分間遠心する (BECKMAN JA-1
0)。得られた遠心残留物をｐＨ4.５の商品名MALTRIN(登
録商標）250(GRAIN PROCESSING CORPORATION) の３０％
(w/v)のデンプン、0.３％ (w/v)の安息香酸ナトリウム
及び0.１５％ (w/v)のソルビン酸カリウムを含む１００
mlの水溶液に浮遊する。このようにして得られた組換え
体株により産生されたプルラナーゼの精製標品を溶液Ｄ
とする。還元糖法で測定した溶液Ｄのプルラナーゼの活
性は、１５０PUN/mlである。
【００８４】
【実施例２３】 バシラスリケニホルミス SE2 delap1 株 (pUBCDEBRA11D
NSI)により産生されたプルラナーゼの温度に関する安定
性 実施例２２で得られたプルラナーゼの溶液Ｄを0.０５M
クエン酸塩／リン酸塩バッファー中ｐＨ4.７５において
酵素活性１０〜１５PUN/mlを生じるように希釈する。プ
ルラナーゼを含むこの希釈溶液を１試験管につき５mlの
量で９試験管に分割する。希釈溶液を含む種々の試験管
を４０〜８０℃で７５分間水浴中でインキュベートす
る。このインキュベーションの後、急速に冷却するため
に試験管を氷浴中に置く。次いで、種々の溶液の酵素活
性を測定する（測定条件：温度６０℃、ｐＨ4.５、イン
キュベーション時間１５分）。本試験の過程において、
ｐＨ約4.７５及び温度約５５℃に置いた試料について最
大酵素活性が測定された。即ち、相対酵素活性１００％
は当然この本試料によるものであった。結果を表１２に
纏める。
【００８５】
【表１２】表１２ ──────────────────── 温度 相対酵素活性 % ──────────────────── 40 99 45 99 50 100 55 100 60 96 65 83 70 2 80 1 ────────────────────
【００８６】本実施例は、ｐＨ4.７５において基質を存
在させずに６５℃以下の温度範囲でインキュベートした
後測定した本発明によるプルラナーゼが相対酵素活性を
少なくとも８０％有することを示すものである。
【００８７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Cys Pro Ala Gly 1 5 10 15 Asp Tyr Gln Pro 20
【００８８】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 GGCGGAGCAA GCTTTGTGG 19
【００８９】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 ATGGCTCCTG GCGCAGGC 18
【００９０】配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 CTTGGAGCTC GTTAACAGAT CT 22
【００９１】配列番号：５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 CTTGAGATCT GTTAACGAGC TC 22
【００９２】配列番号：６ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 CATCTAATCT TCAACACCCG GGCCCGTTTG TTGAAC 36
【００９３】配列番号：７ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成オリゴヌクレオチド） 配列 CAAAATAAAA AAGATACAAC CCGGGTCTCT CGTATCTTTT AT 42
【００９４】配列番号：８ 配列の長さ：４４６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００９５】
【表１３】
【００９６】
【表１４】
【００９７】配列番号：９ 配列の長さ：４４６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００９８】
【表１５】
【００９９】
【表１６】
【０１００】
【表１７】
【０１０１】
【表１８】
【０１０２】
【表１９】
【０１０３】
【表２０】
【０１０４】
【表２１】
【０１０５】
【表２２】
【０１０６】配列番号：１０ 配列の長さ：２７８４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【０１０７】
【表２３】
【０１０８】
【表２４】
【０１０９】配列番号：１１ 配列の長さ：９２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１１０】
【表２５】
【０１１１】
【表２６】
【０１１２】
【表２７】
【０１１３】
【表２８】
【０１１４】配列番号：１２ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys Leu Ser Val Cys Leu Val Leu -25 -20 -15 Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gln Ser Ala His Ala -10 -5 -1
【０１１５】配列番号：１３ 配列の長さ：８７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 ATG GCT AAA AAA CTA ATT TAT GTG TGT TTA AGT GTT TGT TTA GTG TTG 60 Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys Leu Ser Val Cys Leu Val Leu -25 -20 -15 ACC TGG GCT TTT AAT GTA AAA GGG CAA TCT GCT CAT GCT 87 Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gln Ser Ala His Ala -10 -5 -1
【０１１６】配列番号：１４ 配列の長さ：１１６２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 GGATCCTGTT AGACTATTTG AGGAGTTTGC AACACTTGAT GTTTTATCCA AAGGAAGGGC 60 CGGAGATCAT CGCTGGTCGA GGTGCTTTCG GTGAAGCATT TTCGCTATTT TGGGTATAAC 120 CGGGCGCATT ACGATCAATT GTTTGAAGAG CATCTTGATT TACTTCAAAA GCTGAATGCT 180 TCGAAAAGAA TAACATGGAG CGGGCTTTAT CGAACACCTA TACATGATGC AGATATCGCA 240 CCCCGCCCTG TTCAGAAAAA CATTCCTTTG TGGGTTGGGG TGGGTGGGAC NMNTGAAASC 300 NSYKCKYYGT GCRNVSNNNT ATGGTGCCGG CTTAGCATGG GTATTTTGTC AGGCGATTGG 360 CTTCGGTTTA AGGCACTTTC GGACCTTTAT CGGCAGGCCG GCCAACAAGC ANGGTATTCA 420 CCGAACGATC TGAAAGTAGG AGTGACAGGG CATGCGTTTA TTGGAAAGAC GTCGCAGCAG 480 GCACTCAATG ACTATTACCC CTATCACGCG AATTATTGGC TAACACTGAA CCAACAATTA 540 GGGCAGCCGT TACCCCAGCA ATACGTGAGG GAATTTAATT TATTAGCCTC CCCAGAGCAA 600 GCCTTATATG TGGGAAGCTC TCAACAAGTG GGCAGGNAAA AATTTTGCGC CAACATGAGG 660 NATTTGGTNA TAAACGTTTT ATCGCACAGA TCGACATTGG CGGAATGCCC TTTAAAACAG 720 TGGCCAAGAA TATTGAGCGG TTAGGCCACT GAGGTTGCAC CTGTCGTACG AAGAGCAACA 780 AGAGGGTAAT GGTAATAATC TATTTAACTG TTTATTAGAA AACTTGGTAT CTGTTTAATT 840 AAATAACAGG AGCCTGGAAG TGGGCCAAGG CTCCTTTCTA GGGAAACCTT TTTCTATTTA 900 TATAGGCGTT GTTGCCTAAG GCTAAAGTAG GATTTTATTA AAAATATAGG AATTGCTCTT 960 TTATTCGACA CAATTATTCA ATGGAATACG ATAAAATGGA GAGTGTATGT AAGCGTTATA 1020 TTTTATTGGG GGGCTGATAG AAGAAAAGGG ATGCGACAGG GTCTATTAGC TAGTTTGGTA 1080 TTCGATTTCA GATCAATGCA ACGTACGAGT TTTTTATTGA CTGCTTTGTG CAAGCGATTG 1140 CATTGAAACA AAGGAGGACA TT 1162
【０１１７】配列番号：１５ 配列の長さ：４３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 TAATAGAAAA AAGTAAAATC CCCTCAAGAT GTTTGAGGGG GATTTAGTTA CTTATTATCC 60 AATTAATTTG CGGCTTCGGT GTTTTCAATG GGCTCCGTAT CCGTTCGGTT GTGTGATCGG 120 ACAAATGGGA GTGAATAGGT CACAAGAGCA GCAGCCATTT CAAGCAGACC AGCGAAAGTA 180 AACATTCGTT CTGGTGCAAA TCGGGTCATC AACCAACCGG TAATTGCTTG GGAAATAGGG 240 ATGGACCCTG ACATCACGAT AATCATAATA CTAATAACAC GACCGAATAA CTTAGGTGGA 300 ATAAGCGTAT GGTTAACGCT TGGAGCAATA ATATTAACCG CCGTTTCATG AGCGCCAACA 360 AGCACTAGAA GGGCTAAAAT AACCCATAAG TTGTGTGTAA ATCCTATAAA AAATAACATA 420 AGGCCCTGCA G 431
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミド pUBDEBRA1の制限地図を示す。
【図２】プラスミドpLD1の制限地図を示す。
【図３】プラスミドpUBDEBRA11DNSIの制限地図を示す。
【図４】成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（配列番号１０）及びそのアミノ酸への翻訳（配
列番号１１）を示す。
【図５】成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（配列番号１０）及びそのアミノ酸への翻訳（配
列番号１１）を示し、図４のつづきである。
【図６】成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（配列番号１０）及びそのアミノ酸への翻訳（配
列番号１１）を示し、図５のつづきである。
【図７】成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（配列番号１０）及びそのアミノ酸への翻訳（配
列番号１１）を示し、図６のつづきである。
【図８】成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（配列番号１０）及びそのアミノ酸への翻訳（配
列番号１１）を示し、図７のつづきである。
【図９】成熟したプルラナーゼをコードするヌクレオチ
ド配列（配列番号１０）及びそのアミノ酸への翻訳（配
列番号１１）を示し、図８のつづきである。
【図１０】プラスミド pUBCDEBRA11の BamHI部位からPs
tI部位までのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列 (配列番号
８）及びプルラナーゼのシグナル及び成熟配列のアミノ
酸への翻訳（配列番号９）を示す。
【図１１】プラスミド pUBCDEBRA11の BamHI部位からPs
tI部位までのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列 (配列番号
８）及びプルラナーゼのシグナル及び成熟配列のアミノ
酸への翻訳（配列番号９）を示し、図１０のつづきであ
る。
【図１２】プラスミド pUBCDEBRA11の BamHI部位からPs
tI部位までのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列 (配列番号
８）及びプルラナーゼのシグナル及び成熟配列のアミノ
酸への翻訳（配列番号９）を示し、図１１のつづきであ
る。
【図１３】プラスミド pUBCDEBRA11の BamHI部位からPs
tI部位までのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列 (配列番号
８）及びプルラナーゼのシグナル及び成熟配列のアミノ
酸への翻訳（配列番号９）を示し、図１２のつづきであ
る。
【図１４】プラスミド pUBCDEBRA11の BamHI部位からPs
tI部位までのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列 (配列番号
８）及びプルラナーゼのシグナル及び成熟配列のアミノ
酸への翻訳（配列番号９）を示し、図１３のつづきであ
る。
【図１５】プラスミド pUBCDEBRA11の BamHI部位からPs
tI部位までのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列 (配列番号
８）及びプルラナーゼのシグナル及び成熟配列のアミノ
酸への翻訳（配列番号９）を示し、図１４のつづきであ
る。
【図１６】プラスミド pUBCDEBRA11の BamHI部位からPs
tI部位までのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列 (配列番号
８）及びプルラナーゼのシグナル及び成熟配列のアミノ
酸への翻訳（配列番号９）を示し、図１５のつづきであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/56 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プルラナーゼであって、バシラスデラミ
    フィカンス株又はその菌株の誘導体又は変異体により生
    産されることを特徴とするプルラナーゼ。
  2. 【請求項２】 プルラナーゼであって、そのＮ末端配列
    (配列番号１）がアミノ−カルボキシルの向きに左から
    右まで下記の通りであることを特徴とするプルラナー
    ゼ。
  3. 【請求項３】 図４〜図９に示される１〜９２８個のア
    ミノ酸を有するアミノ酸配列（配列番号１１）又はそれ
    から誘導された修飾配列を含むことを特徴とする単離及
    び精製されたプルラナーゼ。
  4. 【請求項４】 ２９個の追加アミノ酸配列（配列番号１
    ２）を含む前駆体として合成されることを特徴とする請
    求項３記載のプルラナーゼ。
  5. 【請求項５】 プルラナーゼであって、野生状態のアル
    カリ性プロテアーゼをコードする遺伝子を含むバシラス
    属の微生物により異種方法で生産され、その遺伝子がバ
    シラス属の微生物から欠失しているアルカリ性プロテア
    ーゼをコードすることを特徴とするプルラナーゼ。
  6. 【請求項６】 好気的条件下炭素源及び窒素源及び無機
    塩を含む適切な栄養培地中でプルラナーゼを生産し、得
    られたプルラナーゼを回収することができるバシラスデ
    ラミフィカンス株又はその菌株の誘導体の培養を含むこ
    とを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のプ
    ルラナーゼの生産方法。
  7. 【請求項７】 プルラナーゼをコードするＤＮＡ断片を
    単離し、そのＤＮＡ断片を適切なベクターに挿入し、そ
    のベクターを適切な宿主に導入するか又はそのＤＮＡ断
    片を適切な宿主の染色体に導入し、その宿主を培養し、
    プルラナーゼを発現させ、プルラナーゼを回収すること
    を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に
    記載のプルラナーゼの調製方法。
  8. 【請求項８】 デンプンの糖化のための請求項１〜５の
    いずれか１項に記載のプルラナーゼの使用。
  9. 【請求項９】 バシラスデラミフィカンスのプルラナー
    ゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）又は
    それから誘導された修飾配列を含むＤＮＡ分子。
  10. 【請求項１０】 バシラスデラミフィカンス T 89.117D
    のプルラナーゼの全遺伝子 (配列番号８）を含むことを
    特徴とする請求項９記載のＤＮＡ分子。
  11. 【請求項１１】 請求項９記載のＤＮＡ分子を含む発現
    ベクター又は染色体組込みベクター。
  12. 【請求項１２】 発現ベクター pUBDEBRA1。
  13. 【請求項１３】 染色体組込みベクター pUBCDEBRA11DN
    SI。
  14. 【請求項１４】 請求項９記載のＤＮＡ分子を含むバシ
    ラスリケニホルミスの形質転換株。
  15. 【請求項１５】 請求項１１記載の発現ベクター又は染
    色体組込みベクターを含むバシラスリケニホルミスの形
    質転換株。
  16. 【請求項１６】 発現ベクター pUBDEBRA1又は染色体組
    込みベクター pUBCDEBRA11DNSIを含むバシラスリケニホ
    ルミスの形質転換株。
  17. 【請求項１７】 請求項１４、１５又は１６記載のバシ
    ラスリケニホルミスの形質転換株により産生されたプル
    ラナーゼ。
  18. 【請求項１８】 バシラスデラミフィカンスの単離及び
    精製された培養及びそれから誘導又は変異された培養
    物。
  19. 【請求項１９】 バシラスデラミフィカンス T 89.117D
    株 (LMG P-13056)又はその菌株の誘導体又は変異体によ
    り生産されることを特徴とするプルラナーゼ。
  20. 【請求項２０】 バシラスデラミフィカンス T 89.117D
    の単離及び精製された培養及びそれから誘導又は変異さ
    れた培養物。
JP5337202A 1992-12-28 1993-12-28 プルラナーゼ、それを生産する微生物、そのプルラナーゼの調製方法及び使用 Pending JPH06217770A (ja)

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BE09301278 1993-11-19
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