CN1090325A - 支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途 - Google Patents

支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1090325A
CN1090325A CN93121736A CN93121736A CN1090325A CN 1090325 A CN1090325 A CN 1090325A CN 93121736 A CN93121736 A CN 93121736A CN 93121736 A CN93121736 A CN 93121736A CN 1090325 A CN1090325 A CN 1090325A
Authority
CN
China
Prior art keywords
debranching enzyme
starch debranching
bacillus
bacterial strain
starch
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN93121736A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1061089C (zh
Inventor
P·迪韦尔
A·阿莫里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danisco US Inc
Original Assignee
Solvay SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from BE9201156A external-priority patent/BE1006483A3/fr
Priority claimed from BE9300744A external-priority patent/BE1007313A3/fr
Priority claimed from BE9301278A external-priority patent/BE1007723A6/fr
Application filed by Solvay SA filed Critical Solvay SA
Publication of CN1090325A publication Critical patent/CN1090325A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1061089C publication Critical patent/CN1061089C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Mechanical Means For Catching Fish (AREA)
  • Selective Calling Equipment (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

本发明涉及一种热稳定性支链淀粉酶，该支链淀 粉酶具有水解支链淀粉中α-1，6型糖苷键的性质， 并且在酸性介质中及约60℃温度下具有酶促活性。
本发明也涉及产生这种支链淀粉酶的微生物菌 株和制备这种支链淀粉酶的方法。
本发明也涉及该支链淀粉酶的用途和含有该产 物的组合物。
本发明还涉及一种DNA分子。本发明涉及含 有这种DNA分子的表达载体，并涉及含有这种 DNA分子的染色体整合载体。

Description

本发明涉及一种新的支链淀粉酶（pullulanase）。本发明也涉及产生这种支链淀粉酶的新的微生物菌株和制造这种支链淀粉酶的方法。本发明还涉及该支链淀粉酶的用途和含有该产物的组合物。本发明还涉及一种含有该支链淀粉酶基因的DNA分子并涉及能用于在芽孢杆菌菌株中表达支链淀粉酶之含有上述DNA分子的表达载体。
基本上由直链淀粉和支链淀粉（amylopectin）构成的淀粉可通过两步骤酶促过程转变成单糖：一步是淀粉的液化，一步是液化淀粉的糖化。为了获得淀粉的高转化水平，建议在液化淀粉的糖化期间加入水解α-1，6-糖苷键的酶，例如支链淀粉酶。
欧洲专利0  063  909描述了一种所谓的脱支酶，即一种能水解支链淀粉中α-1，6-糖苷键的酶，该酶具有支链淀粉酶促活性并且在PH4-5和60℃下具有最佳活性。这种酶来源于酸性淀粉水解芽孢杆菌（Bacillus  acidopullulyticus）菌株。
美国专利5，055，403进而提出了一种在酸性介质中具有酶促活性，并衍生于Bacillus  naganoensis菌株的支链淀粉酶。该酶在60℃下测定，在PH约5时具有最大活性，而在PH4.5下测定时，则在温度约62.5℃具有大活性。
尽管在酸性PH下和温度约60℃时有活性并因此适用于糖化已液化之淀粉，但现有技术的支链淀粉酶在这种温度和PH条件下具有稳定性很低、在60℃温度和约PH4.5条件下无底物存在时半衰期不超过几十分钟的缺点。
因此，目前需要有一种能用于液化淀粉的糖化，并且在宽的温度和PH值范围内（特别是在温度60℃和PH值约4.5下）很稳定的支链淀粉酶。
本发明的目的是提供一种新的支链淀粉酶，该酶在酸性PH值下有活性，在酸性PH值下有大大超过现有技术的支链淀粉酶的热稳定性，并且在上述条件下具有几小时的半衰期。
鉴别、分离和提供天然产生所说支链淀粉酶的菌株，尤其是芽孢杆菌属菌株也是本发明的目的。
分离和提供编码所说支链淀粉酶的核苷酸序列也是本发明的目的。
制备和提供含有编码所说支链淀粉酶之上述核苷酸序列的表达载体和染色体整合载体仍然是本发明的目的。
制备和提供用含有编码所说支链淀粉酶之杆菌菌株核苷酸序列的表达载体和整合载体转化的芽孢杆菌宿主同样是本发明的目的。
为此，本发明涉及由芽孢杆菌，特别是需氧和非嗜热微生物例如脱支芽孢杆菌（Bucillus  deranificans）产生的支链淀粉酶。优选使用脱支芽孢杆菌T89.117D或该脱支芽孢杆菌菌株的衍生物或突变体。
经分离和纯化的支链淀粉酶较好是由单一型（Single  type）分子量约100（±10）KDa的多肽组成。
此外，所说支链淀粉酶的N-末端序列（SEQ  ID  NO：1）如下（以从氨基到羧基方向从左到右）：
Acp  Gly  Asr  Thr  Thr  Thr  Ile  Ile  Val  His
1  5  10
Tyr  Phe  Cys  Pro  Ala  Gly  Asp  Tyr  Gln  Pro
15  20
本发明涉及经分离和纯化的含有1到928个氨基酸的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：11）或源于该序列的经修饰之序列的支链淀粉酶。这一序列是如附图4（4a到4F）所示的所说支链淀粉酶的完整氨基酸序列。
编码支链淀粉酶的完整核苷酸序列（SEQ  ID  NO：10）和其对应的氨基酸序列在附图4中给出。
特别优选地，所说支链淀粉酶具有4.1和4.5之间的等电点。
本发明的支链淀粉酶在宽的温度范围内是热稳定的，并且是有活性的。该支链淀粉酶在酸性PH值下是有活性的。
所说支链淀粉酶能催化存在于支链淀粉和出芽短梗孢糖（pullulane）中的α-1，6-糖苷链的水解。因此，它是所谓的脱支（deramifying或debranching）酶。所说支链淀粉酶更好能水解支链淀粉中的α-1，6型糖苷键。
本发明的支链淀粉酶优先将出芽短梗孢糖断裂成麦芽三糖，将支链淀粉断裂成直链淀粉。
此外，本发明的支链淀粉酶水解支链淀粉形成低聚糖（麦芽糖低聚糖），在此水解期间可观察到由约13个葡萄糖单元构成的低聚糖（聚合度为13，这种分子也称作“链A”）的形成，接着观察到由约47个葡萄糖单元构成的低聚糖（聚合度为47，这种分子也称作“链B”）的形成。
根据D.J.MANNERS（“Structural  Analysis  of  Starch  components  by  Debranching  Enzymes”in“New  Approaches  to  research  on  Cereal  Carbohydrates”，Amsterdam，1985，PP.45-54）和B.E.ENEVOLDSEN（“Aspects  of  the  fine  structure  of  starch”in“New  Appoaches  to  research  on  Cereal  Carbohydrates”，Ams-terdam，1985，PP.55-60）.的方法来定义具有链A和B的低聚糖。
本发明的支链淀粉酶较好地水解马铃薯支链淀粉。这一水解过程可在支链淀粉酶有最佳活性条件（即在温度约60℃和约PH4.3下）时在支链淀粉酶存在下用支链淀粉的含水悬浮液来完成。
本发明的支链淀粉酶催化麦芽糖的缩合反应，以形成四糖（具有4个葡萄糖单元的低聚糖）。
在PH值4.5和无底物存在的缓冲液液中，在温度约60℃下测定时，本发明的支链淀粉酶具有约55小时的半衰期。
半衰期是指在PH值约4.5和无底物存在的缓冲溶液中，在温度约60℃下保温55小时后测定时，支链淀粉酶表现出至少50%的相对酶促活性。
本发明的支链淀粉酶在酸性PH值下是热稳定性的。事实上，在PH值约4.5和无底物存在的缓冲溶液中在温度约60℃下保温40小时测定时，本发明的支链淀粉酶表现出至少55%的相对酶促活性。在这此相同的条件下温育24小时后测定时，该酶表现出至少70%的相对酶促活性。
相对酶促活性是指在给定PH值、温度，底物和持续时间条件下进行的试验中测得的酶促活性与在相同的试验过程中测得的最大酶促活性的比值。酶促活性从Pullulane的水解开始测定，最大酶促活性人为地规定为100。
本发明的支链淀粉酶还在宽范围的酸性PH值下是稳定的。
在下述的条件下，该支链淀粉酶在PH值大于或等于3时是有活性的。事实上，在温度约60℃，无底物存在和PH值大于或等于约3.5条件下温育60分钟后测定时，所说支链淀粉酶表现出至少85%的相对酶促活性。
在下述的条件下，该支链淀粉酶在PH值小于或等于7时是有活性的。事实上，在温度约60℃，无底物存在和PH值小于或等于5.8条件下温育60分钟后测定，所说支链淀粉酶表现出至少85%的相对酶促活性。
在这些相同条件下，在约3.8和5之间的PH值范围内测定时，所说支链淀粉酶最好表现出大于90%的相对酶促活性。
在温度约60℃，PH值大于4.0的范围内测定时，本发明的支链淀粉酶显示出最佳酶促活性。
在温度约60℃，PH值小于4.8的范围内测定时，本发明的支链淀粉酶显示出最佳酶促活性。在温度约60℃，PH约4.3下测定时，所说支链淀粉酶更好地显示出最佳酶促活性。
在PH值约4.3，55和65℃的温度范围内，特别是在60℃测定时，本发明的支链淀粉酶也显示出最佳酶促活性。
在温度约60℃，PH值范围约3.8和4.9之间，本发明的支链淀粉酶显示出大于最大酶促活性（在温度为60℃，PH值为4.3下测得的最大酶促活性）80%的酶促活性。
此外，本发明的支链淀粉酶具有所有与淀粉糖化的实际工业条件相适应的合适性质。这些性质是低于5的最佳PH值、约60℃的最佳温度和在这些酸性PH值和升高的温度条件下的良好的酶稳定性。淀粉的工业糖化中同时使用葡萄糖淀粉酶和支链淀粉酶，因而要使用酸性介质。事实上，用于淀粉糖化的葡萄糖淀粉酶一般是由真菌，具体地说是由曲霉属真菌菌株例如黑曲霉，泡盛酒曲霉或臭曲霉菌株产生的。适于在有葡萄糖淀粉酶存在下液化淀粉糖化的理想条件是温度约60℃，PH值约4.0到4.5。具体地说，对SOLVAYENZYMES（Elkhart，United States）的以商品名DIAZYME L-200销售的和由SOLVAY ENZYMES以商品名OPTIDEX 销售的葡糖淀粉酶来说，情况正是如此。此外，糖化阶段持续几小时，一般40到60小时，在此整个阶段中所使用的酶必须是稳定、有活性并有效的，因而这些酶应在酸性介质中具有高的热稳定性和最长的可能半衰期。由于这一原因，本发明的支链淀粉酶比已知的支链淀粉酶更有效。
本发明也涉及产生支链淀粉酶的方法，包括在含有碳源，氮源和无机盐的合适营养培养基中于需氧条件下培养能产生支链淀粉酶的需氧（和非嗜热）细菌，并收获由此获得的支链淀粉酶。这种培养基可以是固体或液体的。该培养基最好是液体。
本发明还涉及产生支链淀粉酶的方法，包括在含有碳源，氮源和无机盐的合适营养培养基中于需氧条下培养脱支芽孢杆菌T89.117D（LMG  P-130  56）菌株或这一菌株的能产生支链淀粉酶的衍化物，并收获由此获得的支链淀粉酶。
这些细菌的培养条件，例如培养基的组成、培养压力、温度、PH、通气和搅拌是本领域技术人员熟知的。
培养基中的碳源通常选自淀粉、部分水解淀粉、可溶淀粉、低聚糖、葡萄糖、直链淀粉、支链淀粉或它们中的两种或多种的混合物。培养其中的碳源最好选自部分水解淀粉、出芽短梗孢糖、葡萄糖或它们的混合物。用葡萄糖和部分水解淀粉已取得良好的结果。培养基中的氮源通常选自酵母提取物、黄豆粉、棉籽粉、鱼粉、明胶、马铃薯粉或它们中两种或多种的混合物。培养基中的氮源最好选自酵母提取物，黄豆粉或它们的混合物。用酵母提取物已取得良好结果。培养基中的无机盐就阴离子来说一般选自氯化物、碳酸盐、磷酸盐和硫酸盐;就阳离子来说一般选自钾、钠、铵、镁、钙、或它们中两种或多种的混合物。用下列盐的混合物已获得好结果：KH2PO4、K2HPO4·3H2O、（NH4）2SO4、MgCl2·6H2O和CaCl2·2H2O。
培养一般在温度为20和45℃之间，最好为25和40℃之间进行。
培养一般在PH值为3.5和6之间，最好为4和6之间进行。
培养一般在有空气或氧气存在同时进行搅拌的需氧条件下进行。
收获产生的支链淀粉酶的技术是本专业技术人员熟知的。通常采用离心、超滤、蒸发、沉淀、过滤、微量过滤、结晶或这些技术中一种或其它种的组合，例如离心后，接着进行超滤。
必要时，然后可纯化支链淀粉酶。用于纯化酶的技术是专业人员已知的，例如，具体地说可使用借助盐（如硫酸铵）或溶剂（主要如丙酮）的沉淀法。
支链淀粉酶也可以经喷雾或冷冻干燥法来干燥。
本发明也涉及鉴别并提供新的被分离的产生支链淀粉酶的需氧细菌。通常，它属于芽孢杆菌科，较好属于芽孢杆菌属。所说芽孢杆菌中最优选的是脱支芽孢杆菌T89.117D菌株或这一菌株的衍化物或突变体。
这一菌株的衍生物或突变体是指任何天然或人工改变的细菌。这一菌株的衍生物可采用已知的诱发变异技术，例如紫外线辐射、X-射线、诱变剂或基因工程技术获得。
脱支芽孢杆菌T98.117D菌株已按布达佩斯条约已于1993年6月21日保藏在称作BELGIAN  COORDINATED  COLLECTIONS  OF  MICROORGANISMS的保藏中心（LMG  culture  collection，University  of  Ghent，Laboratory  of  Microbiology-K.L.Ledeganckstraat35，B-9000  GHENT，Belgium），保藏号是P-13056。因此，本发明涉及脱支芽孢杆菌T89.117D的经分离和纯化的培养物和其衍生的或突变的培养物。
本发明的菌株已通过其生物化学特征鉴定：革兰氏阳性、需氧、形成内生孢子的杆状细菌。
本发明也涉及分离并提供一种DNA分子，该DNA分子含有编码脱支芽杆菌T89.117D（LMG  P-13056）之支链淀粉酶的核苷酸序列（SEQ  ID  NO：10）或由之衍生的经修饰的序列。该DNA分子最好含有脱支芽杆菌T89.117D支链淀粉酶的完整基因。所说支链淀粉酶的完整基因，至少是指转录启动子、信号序列、编码成熟支链淀粉酶的核苷酸序列和转录终止子。
按照本发明的DNA分子至少包括编码脱支芽孢杆菌T89.117D（LMGP-13056）之成熟支链淀粉酶的核苷酸序列（SEQ  ID  NO：10）和其信号序列（前序列）（SEQ  ID  NO：13）。该DNA分子最好含有脱支芽孢杆菌T89.117D支链淀粉酶的完整基因。用含有核苷酸序列（SEQ  ID  NO：8）的DNA分子已获得良好结果。核苷酸序列（SEQ  ID  NO：8）以从氨基到羧基方向从左到右由核苷酸序列（SEQ  ID  M：14）、核苷酸序列（SEQ  ID  NO：13）、核苷酸序列（SEQ  ID  NO：10）和核苷酸序列（SEQ  ID  NO：15）组成。
本发明的支链淀粉酶是以含有29个氨基酸之附加序列（SEQ  ID  NO：12）的前体形式合成的。
本发明也涉及被修饰的支链淀粉酶，即其中的氨基酸序列中至少有一个氨基酸不同于野生酶的氨基酸序列。这些修饰可经对DNA诱变的传统技术如暴露在紫外线辐射或化学物质（如硝酸钠或间位甲基羟基胺）下，或通过基因工程技术，例如定点诱变或随机诱变获得。
本发明还涉及突变的支链淀粉酶，该变异酶经修饰编码上文定义之支链淀粉酶基因的核苷酸序列获得。获得这类突变酶的技术是专业人员已知的，具体地说，在Molecular  Cloning-a  Laboratory  manual-SAMBROOK，FRITSCH，MANIATIS-second  edition，1989，第15章已作了描述。
本发明还涉及制备并提供一种表达载体，该载体含有包括编码脱支芽孢杆菌T89.117D支链淀粉酶之核苷酸序列的DNA分子。该DNA分子最好包含编码脱支芽孢杆菌T89.117D之成熟支链淀粉酶的结构基因。这种载体特别优选的是载体pUBDEBRA1。用载体pUBCDEBRAll也已获得良好的结果。
表达载体是指包含复制子和其它DNA区域（核苷酸序列）且作为一个完整基因表达单位不依赖宿主起作用的任何DNA序列。
完整基因表达单位是指为转录和翻译所必须的结构基因和启动区以及调节区。结构基因是指用于转录成RNA并允许由宿主合成蛋白质的编码序列。
优选的表达载体是载体pUBDEBRA1。该载体含有编码本发明脱支芽孢杆菌T89.117D菌株支链淀粉酶的基因。这种载体能引入到合适的宿主中。这种宿主一般是芽孢杆菌菌株，优选的是地衣芽孢杆菌菌株，最优选的是地衣芽孢杆菌SE2菌株。将这种载体引入到作为宿主的地衣芽孢杆菌菌株SE2  delapl中已获得了极好的结果。
本发明也涉及制备和提供一种染色体整合载体，该载体含有包括编码脱支芽孢杆菌T89.117D支链淀粉酶之核苷酸序列的DNA分子。该DNA分子最好包含编码脱支芽杆菌T89.117D之成熟支链淀粉酶的结构基因。这种染色体整合载体特别优选的是载体pUBCDEBRA11DNSI。
本发明也涉及用基因工程技术引入了编码支链淀粉酶之所说基因的重组菌株。该基因可由表达载体引入到质粒上或由染色体整合载体以一个或多个拷贝整合到宿主染色体中。
本发明涉及包含上述的DNA分子的地衣芽孢杆菌转化菌株。本发明涉及含有包括这种DNA分子之表达载体或染色体整合载体的地衣芽孢杆菌转化菌株。本发明更涉及包含表达载体pUBDEBRA1或染色体整合载体pUBCDEBRA11DNSI的地衣芽孢杆菌转化菌株。
本发明涉及从重组生物体开始制备所说支链淀粉酶的方法，该方法包括分离编码所说支链淀粉酶的DNA片段，将该DNA片段插入到合适的载体中，将这一载体引入到合适的宿主中或将该DNA片段引入到合适宿主的染色体中，培养所说宿主，表达所说支链淀粉酶和收获所说支链淀粉酶。所说的合适宿主一般选自大肠杆菌、芽孢杆菌属或曲霉属微生物。所说宿主一般选自芽孢杆菌属微生物。所说宿主较好选自（需氧）芽孢杆菌属微生物。所说宿主最好选自枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌（Bacillus  alcalopholus），短小芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌（Bacillus  Lentus）、淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus  amyloliquefaciens）或脱支芽孢杆菌（Bacillus  deramificans）T89.117D（LMG  P-13056）。
当用于表达本发明的支链淀粉酶的宿主是衍生于地衣芽孢杆菌，特别是地衣芽孢杆菌SE2  delapl菌株的重组菌株时，已获得了良好的结果。
地衣芽孢杆菌SE2菌株已按布达佩斯条约于1993年6月21日保藏在称作BELGIAN  COORDINATED  COLLECTIONS  OF  MICROORGANISMS的名藏中心（LMG  Culture  collection，Ghent，Belgium），保藏号为LMG  P-14034。
从地衣芽孢杆菌SE2如此获得的转化菌株SE2  delapl不同于亲本菌株的唯一事实在于在其染色体中不含有编码成熟蛋白酶的DNA序列。
本发明也涉及由在野生状态含有编码碱性蛋白酶基因的芽孢杆菌属微生物以异种方式产生的支链淀粉酶。这种微生物最好是含有包含编码脱支芽孢杆菌T89.117D支链淀粉酶之核苷酸序列的DNA分子的地衣芽孢杆菌菌株。编码碱性蛋白酶的基因最好是已从该芽孢杆菌菌株中缺失。这种菌株优选的是地衣芽孢杆菌SE2  delapl。
以异种方式产生的是指不受天然微生物（即在野生状态下含有编码支链淀粉酶之基因的微生物）的影响而产生的。
本发明的支链淀粉酶在各种工业例如食品工业、制药工业或化学工业中有几种用途。
该支链淀粉酶具体来说可作为“抗腐”剂即作为防止面包在贮藏过程中发生腐败的添加剂用于面包工业或用于产生低热量啤酒的酿造工业。
该支链淀粉酶也可用于以直链淀粉作为脂肪代用品的低热量食品的制备中。
该支链淀粉酶也可用于水解支链淀粉和从这种支链淀粉开始形成低聚糖。
该支链淀粉酶也可用于从麦芽糖形成四糖。
该支链淀粉酶也可用于缩合单糖或低聚糖，产生α-1，6型键。
该支链淀粉酶也可用于例如澄清果汁。
该支链淀粉酶也可用于淀粉的液化。
为用于食品，该支链淀粉酶可固定在载体上，酶的固定化技术是专业人员熟知的。
本发明的支链淀粉酶特别适于处理淀粉和出芽短梗孢糖。
本发明涉及该支链淀粉酶在液化淀粉的糖化上的应用。
本发明也涉及该支链淀粉酶在分解淀粉或部分水解之淀粉过程中的应用，所述过程包括一个在有支链淀粉酶存在下糖化淀粉和部分水解之淀粉的阶段。这一过程通常在有一种或多种其它酶例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶或其它糖化酶存在下进行。
就其生物化学性质来说，本发明的支链淀粉酶允许糖化阶段在更强的酸性条件（即PH低到至少3.9，这一PH值较已知支链淀粉酶可接受的PH值的酸度更大）下进行。
就其生物化学性质来说，本发明的支链淀粉酶允许糖化阶段在相对高即高达至少65℃的温度下进行。
将本发明的支链淀粉酶加入到糖化介质中使最终获得的组合物中葡萄糖含量增加，因而，使反应产率增加。
此外，将本发明的支链淀粉酶加入到糖化介质中使得糖化周期缩短。
本发明的支链淀粉酶可实现高的淀粉转化水平。
而且，在糖化阶段，有可能用本发明的支链淀粉酶代替大部分通常使用的葡糖淀粉酶（至少60%），而不影响葡萄糖产率。这种替代很有好处，而且事实上它可使通常得到的副产物的量大大减少。因为葡糖淀粉酶只以小比例存在，所以它不能催化从葡萄糖开始的低聚糖（含α-1，6键）的合成反应;在正常条件下，当糖化介质中达到高浓度右旋糖时，葡糖淀粉酶催化这种低聚糖合成的逆反应，它便限制了淀粉的转化水平。
另外，本发明的支链淀粉酶可使浓缩的糖化介质即具有高含量液化淀粉的介质得以使用，从经济的角度来看这是有利的，并且事实上可使得蒸发费用降低。
本发明也涉及含有本发明支链淀粉酶的酶组合物。
含有本发明支链淀粉酶的所述组合物可以固体或液体形式被使用。
可根据所期望的用途来配制支链淀粉酶。也可将稳定剂或防腐剂加入到含有本发明支链淀粉酶的酶组合物中。例如，该支链淀粉酶可通过加入丙二醇、乙二醇、甘油、淀粉、出芽短梗孢糖、糖例如葡萄糖和山梨醇、盐例如氯化钠、氯化钙、山梨酸钾和苯甲酸钠或这些物质中的两种或多种来稳定。用丙二醇已获得了良好的结果，用淀粉、苯甲酸钠和山梨酸钾的混合物也已获得了良好的结果。
按照本发明的酶组合物除了所说支链淀粉酶外还可以包含一种或多种其它酶，具体地说这些酶是碳水化合物水解酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、环麦芽糖糊精葡糖转移酶、β-葡糖聚糖酶和葡萄糖异构酶、糖化酶、断裂糖苷键的酶或这些酶中的两种或多种的混合物。
本发明优选涉及包含葡糖苷酶和支链淀粉酶的酶组合物。
附图1显示质粒pUBDEBRA1的限制性酶切图。
附图2显示出质粒PLD1的限制性酶切图。
附图3显示出质粒pUBCDEBRAllDNSI的限制性酶切图。
附图4（图4a到4f）示出了编码成熟支链淀粉酶的核苷酸序列（SEQ  ID  NO：10）和其相应的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：11）。
附图5（图5a到5g）示出了从质粒pUBCDEBRAll的BamHI位点到PstI位点之DNA片段的核苷酸序列（SEQ  ID  NO：8）和其相应的所说支链淀粉酶的信号和成熟序列的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：9）。未准确确定的核苷酸用符号N表示。
在这些附图中使用的符号和缩写词的含义总结下表中：
符号缩写词 含义
ORIECREPORI+ORI-KMRBLMR 大肠杆菌中的复制原点复制所需的蛋白质＋股的复制起点－股的复制起点携带卡那霉素抗性的基因携带博莱霉素抗性的基因
AMPRPPBLIAPR5′BLIAPR3′BLIAPRBDEPUL 携带氨芐青霉素抗性的基因por/por序列编码地衣芽孢杆菌之碱性蛋白酶序列位于编码地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶序列之前的5′序列位于编码地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶序列之后的3′序列编码地衣芽孢杆菌支链淀粉酶的序列
下列实施例进一步举例说明本发明。
实施例1
脱支芽孢杆菌菌株的分离和特征
在琼脂一琼脂营养培养基上分离土壤中的脱支芽孢杆菌T89.117D菌株并根据其分解由MEGAZYME公司出售的称之为AZCL的出芽短梗孢糖之显色衍生物的能力选择之。
于37℃在MYE生长培养基上培养该菌株，培养基的组成如下：
KH2PO433mM;K2HPO4·2H2O mM;（MH4）2SO445mM;MgCl2·6H2O 1mM;CaCl2·2H2O 1mM;酵母提取物0.5%（重量/体积）;葡萄糖0.5%（重量/体积）。培养基的PH值用H4PO4调节到4.5。
所说琼脂一琼脂培养基（MYE/琼脂）还含有2%（重量/体积）的琼脂。
根据其生物化学性质鉴别本发明的菌株;革兰氏阳性、需氧、形成内生孢子的杆状细菌。因而它属于芽孢杆菌属。
在MYE培养基中37℃培养的该菌株的营养细胞具有大小为0.7×3.0-3.5μm的芽孢杆菌外形。营养细胞的泳动性是低的。
在MYE培养基上37℃生长3天后，显微镜观察显示出出现轻微变形的和椭园形的（亚）末端孢子囊。
在10%过氧化氢存在下的过氧化氢酶试验呈弱阳性，在1%二氯化四甲基-1，4-次苯二铵存在下的氧化酶试验呈阳性。
这一菌株是需氧的，即它在需氧环境下发育。该菌株在厌氧环境下，即在84%（V/V）N2、8%（V/V）CO2和8%（V/V）H2和环境下在37℃不发育。但是一方面它在微厌氧环境下（即82.5%（V/V）N2、6%（V/V）O2、7.5%（V/V）H2和4%（V/V）CO2环境下，37℃发育。缩写词%（V/V）代表以体积/体积表达的百分数。
这一菌株是非嗜热的，在MYE培养基中20℃、30℃、37℃和45℃保温后表现出正常的发育，但另一方面它在50℃和55℃不发育。在以磷酸盐缓冲液缓冲到PH4.0、PH4.5、PH5.0和PH5.5的MYE培养基中保温后该菌株表现出正常的发育，但另一方面它在PH7.0下则不发育。该菌株在有浓度为2.0%（W/V）和3.5%（W/V）NaCl的MYE培养基中培养后表现出正常的发育，在有5.0%（W/V）NaCl存在时表现出差的发育，在有7.0%（W/V）NaCl存在下不发育。缩写词%（W/V）代表以重量/体积表示的百分比。
该菌株不水解酪蛋白，事实上在37℃培养两周多后未观察到溶解带。它稍微分解酪氨酸，不能从丙酮酸产生3-羟基丁酮，且不将硝酸盐还原成亚硝酸盐或N3。
本发明的脱支芽孢杆菌T89.117D菌株在分类学上不同于欧洲专利0  063  909中所描述的脱支芽孢杆菌菌株，也不同于美国专利5，055，403中描述过的Bacillus  naganoensis菌株，脱支芽孢杆菌T89.117D菌株在PH值4.7和5.5之间表现出生长，在PH值为7.0时不生长。在有3.5%（W/V）NaCl存在下发育，分解酪氨酸，并且不将硝酸盐还原成亚硝酸盐。
脱支芽孢杆菌T89.117D已以保藏登记号LMG  P-13056保藏在称为BELGIAN  COORDINATED  COLLECTIONS  OF  MICROORGANISMS的保藏中心（LNG  culture  collection）。
实施例2
支链淀粉酶的制备
在液体培养基（MYA）中培养脱支芽孢杆菌T89.117D菌株，所说液体培养基除了酵母提取物含量和葡萄糖被淀粉代替，即酵母提取物2.5%（W/V），马铃薯淀粉2.5%（W/V）外，其组成与MYE培养基相同。
培养在搅拌、有效通气、37℃温度下进行。
培养68小时后，支链淀粉酶和细胞生物量被离心（每分钟5000转，30分钟，BECKMAN  JA-10）分离。由脱支芽孢杆菌T89  117D菌株产生的支链淀粉酶是细胞外的。
然后，支链淀粉酶被超滤（AMICON  S10  Y10滤膜）浓缩，以获得支链淀粉酶的浓缩水溶液。
测定所得溶液的酶促活性。
一个支链淀粉酶单位（PUN）定义为在PH4.5，温度60℃并有出芽短梗孢糖存在下，以每分钟1μM葡萄糖当量的速率催化还原糖释放所需的酶量。
按下述方法测定支链淀粉酶的酶促活性;将1ml在50mM乙酸盐缓冲液PH4.5中的1%浓度的出芽短梗孢糖溶液在60℃保温10分钟，向其中加入0.1ml相当于活性为在0.2和1  PUN/ml之间的支链淀粉酶的溶液。15分钟后加入0.4ml  0.5M  NaOH终止反应，用SOMOGYINELSON[J.Bio.Chem.，153（1944），PP.375-380;和J.Bio，Chem.，160（1945），PP.61-68]的方法和本申请其它实施例中所述的相同方法分析释放出来的还原糖。
第二种方法用于分析支链淀粉酶。有出芽短梗孢糖存在下的酶促反应按上述试验条件进行，并加入硫酸（0.1N）仃止该反应。对出芽短梗孢糖的水解产物进行PHLC层折（BIO-RAD生产的HPX-87H柱，流动相是10mM H2SO4），以分离各种成分。测定所得峰的面积以估计形成的麦芽三糖的量。
所谓的脱支活性，即存在于支链淀粉中的α-1，6糖苷键的水解程度，可根据在碘存在下从支链淀粉释放出的直链淀粉引起的蓝色增加来定量。
按照下述方法测定脱支酶酶促活性。0.4ml含有50mM乙酸盐缓冲液PH4.5的1%浓度的支链淀粉溶液在60℃保温10分钟，加入0.2ml支链淀粉酶开始反应，30分钟后加入0.4ml  0.3M  HCl仃止该反应。然后将0.8ml  0.0025%（V/V）的碘溶液加入到0.2ml上述反应混合物中，并在565mM测定光密度。
为了纯化支链淀粉酶，将支链淀粉酶的含水浓缩溶液在室温下用6份500ml的9g/l  NaCl水溶液透析，如此得到的水溶液的PH值经加入25%（V/V）强度盐酸调节到PH3.5。该透析过程包括支链淀粉酶与NaCl溶液混合，然后将获得的溶液超滤。
离心（每分钟5000转，30分钟，BECKMAN  JA-10）除去所得沉淀，收集离心后的上清液。加入5M  NaOH将上清液的PH值调到6.0。离心除去所得沉淀物。
收集离心后的上清液，在55℃加热15分钟。再次离心（每分钟5000转，30分钟，BECKMAN  JA-10）除去所形成的沉淀物，并收集离心后的上请液。
向该上清液中加入丙酮至终浓度为60%（V/V），在2小时期间使形成的上清液的温度降至4℃。将所形成的沉淀物4℃溶解在20mM MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）和1mM CaCl2的缓冲液（PH6.0）中。该支链淀粉酶溶液称作溶液A。
溶液A再次经离子交换层折浓缩以纯化之。商品名为S-SEPHARO-SE
Figure 931217369_IMG4
HP HI LOAD 16/10的内体积约为20ml的柱首先以5ml/分钟的流速用含50mM CH3COONa和100mM NaCl的缓冲液（PH4.0）平衡。溶液A用乙酸盐缓冲液稀释10倍并将15ml该稀释液装柱。以80ml乙酸盐缓冲液（100mM NaCl）洗脱，接着用含有NaCl线性梯度（100-500mM）的200ml50mM乙酸盐缓冲液（PH4.0）洗脱以确保常液相。
测定每一管的支链淀粉酶活性。
将最大活性的各管内容物合并成溶液B（含有0.025mg/ml蛋白质和具有0.7PUN/ml支链淀粉酶活性的12ml溶液）。
从该溶液B开始用终浓度为80%（V/V）的丙酮进行沉淀。将所得沉淀物溶解在体积为0.6ml的含有20mM MES和1mM CaCl2的缓冲液（PH6.0）中。
该支链淀粉酶溶液称为溶液C。
溶液C有0.4mg/ml的蛋白质含量，12PUN/ml的酶促活性和30PUN/mg的比活性。
结果总结在表1中。
表1
部分 体积 蛋白质 支链淀部酶活性 比活性
ml mg/ml 总 ％ PUN/ml 总 ％ PUN／mg
溶液A 1.5 6.48 9.7 100 17.5 26.3 100 2.7
溶液B 12 0.025 0.3 3 0.7 8.4 32 28
表1表明，这一纯化阶段使酶溶液的支链淀粉酶比活性增加10倍。
支链淀粉酶的脱支活性，即有关支链淀粉中α-1，6键的水解活性也按上所述方法根据支链淀粉水解后与碘的颜色反应进行了测定。结果表明，脱支活性也提高了。
实施例3
分子量测定
借助三氯乙酸（终浓度10%（V/V））对实施例获得的溶液C进行沉淀。将所得沉淀物溶解在由10mM  TRIS/HCl（PH＝8.0）、1mMEDTA  2.5%（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠）、5%（V/V）β-硫基乙醇和0.01%（W/V）溴酚蓝组成的缓冲液中。
将4μl溶解在缓冲液中的沉淀物加在聚丙烯酰胺凝胶上。所使用的凝胶系统是PHARMACIA  LKB  BIOTECHNOLOGY的，含有存在SDS之10-15%（V/V）聚丙烯酰胺梯度的凝胶的PHASTSYSTEM系统。电泳条件是供货者建议的那些条件。该凝胶用考马斯蓝染色显示出分子量约105千道尔顿的多肽，它是溶液C的主要成分。
如实施例4所述，这一结果经估计成熟形式之支链淀粉酶的氨基酸序列（没有信号序列）而得以证实，并计算出其分子量为102千道尔顿。
实施例4
1.N末端序列的测定
从实施例3中描述的凝胶开始，采用BAUW  et  al.，（1978）Proc.Natl.Acal.Sei.USA，84，4806-4810描述的方法测定支链淀粉酶的N末端序列。
以从氨基到羧基从左到右方向，用上述方法测知该序列（SEQ  ID  NO：1）如下：
Asp  Gly  Asn  Thr  Thr  Thr  Ile  Tle  Val  His  Tyr  Phe  Cys  Pro  Ala  Gly  Asp  Tyr  Gln  Pro
2.支链淀粉酶氨基酸序列的测定
按照SANGER等人（（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA  74，PP.5463-5467）所述的使用二脱氧-核苷酸的链终止法测定实施例21中得到的含有支链淀粉酶基因之质粒pUBCDEBRA11的约4.5Kb的BanHI-PstI片段的核苷酸序列（SEQ  ID  NO：8）
用于启动使用T7DNA聚合酶之延伸反应的合成寡核苷酸按BEAUCAGE等人（（1981）Tetrahedron Letters 22，Pages 1859-1882）的方法合成。测序按照序列分析试剂盒（PHARMACIA）供货者给出的步骤进行，其中用NaOH处理变性双股DNA。
SAMBROOK，1989，PP.13，15和13.17描述了序列分析策略。按照SAMBROOK，1989，PP.13.45-13.58描述的技术制备序列分析用聚丙烯酰胺凝胶。
鉴定了pUBCDEBRA11从BamHI位点到PstI位点之DNA片段的核苷序列（SEQ  ID  NO：8）和相应的支链淀粉酶的信号和成熟序列的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：9）（附图5）。未被准确确定的核苷酸以符号N表示。
对该序列的分析显示存在一个编码支链淀粉酶的开放读码。鉴定了编码成熟支链淀粉酶的核苷酸序列（SEQ  ID  NO：10）。根据这一开放读码的翻译推断出成熟支链淀粉酶的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：11）。附图4示出了编码成熟支链淀粉酶的核苷酸序列和其相应的氨基酸序列。
已证实如上所述从蛋白质实验测定的N末端序列对应于从DNA序列翻译出的N末端序列。
这表明，所述支链淀粉酶以含有一个29氨基酸附加序列（前序列）的前体形式被合成。该29氨基酸序列如它对应的核苷酸序列（SEQ  ID  NO：13）一样已被鉴定（SEQ  ID  NO：12）。该附加序列表现出分泌信号序列的典型特征，后者在将酶排出到细胞外期间被除去（Freudl，（1992），Iournal  of  Biotechnology，23.PP.231-240）。
该29氨基酸序列如下：
ATG  GCT  AAA  AAA  CTA  ATT  TAT  GTG  TGT
Met  Ala  Lys  Lys  Leu  Ile  Tyr  Val  Cys
-25
TTA AGT GTT TGT TTA GTG TTG ACC TGG GCT TTT AAT GTA
Leu Ser Val Cys Leu Val Leu Thr Trp Ala Phe Asn Val
-20  -15  -10
AAA  GGG  CAA  TCT  GCT  CAT  GCT
Lys  Gly  Gln  Ser  Ala  His  Ala
-5  -1
实施例5
氨基酸分配
根据支链淀粉酶氨基酸序列（实施例4）确定的成熟支链淀粉酶的氨基酸分配总结在表2中。
表2
符号 氨基酸 数量 占分子量百分数（％）
DNVTYLKSIEQAPGFWMHRXC 天冬氨酸天冬酰胺缬氨酸苏氨酸酪氨酸亮氨酸赖氨酸丝氨酸异亮氨酸谷氨酸谷氨酰胺丙氨酸脯氨酸甘氨酸苯丙氨酸色氨酸蛋氨酸组氨酸精氨酸未知半胱氨酸 7569727042604864474039694675271823221831 8.57.77.06.96.76.76.05.55.25.14.94.84.44.23.93.33.03.02.80.30.1
实施例6
等电点的测定
以从4.0到6.5变化的PH梯度对实施例2所得的溶液C进行IEF（等电聚焦）电泳。
相当于0.12支链淀粉酶单位的体积以三份重复加在凝胶上。迁移后，三分之一的凝胶用考马斯蓝染色。
凝胶的其它两个部分用以100mM CH3COONa，1mM CaCl2和1mM MgCl2（PH4.5）缓冲的并分别含有0.1%（N/V）AZCL-Pullulane或1%（W/V）支链淀粉的琼脂胶覆盖（1%重量/体积）。如此获得的合并物（丙烯酰胺凝胶/琼脂凝胶）在饱和湿度气氛中于60℃保温16小时。然后，被支链淀粉顶层覆盖的凝胶在室温下含有3mM I2和50mM KI的溶液中保温，以便根据蓝色的出现来证明脱支链活性。
支链淀粉凝胶的碘的扩展显示出一个深蓝色的晕圈，指示出本发明的酶在约4.1和约4.5之间的等电点处有脱支链活性。支链淀粉酶活性的显现表明相同的结果。
这说明本发明的支链淀粉酶具有支链淀粉酶活性和脱支链活性。
这一结果证明本发明的支链淀粉酶能水解出芽短梗孢糖和支链淀粉两者中的α-1，6型键。这证明本发明支链淀粉酶对其底物的特异性。
这一点经按实施例4中所述估计成熟形式支链淀粉酶的氨基酸序列（无信号序列），并由计算推断其等电点为4.5而得到进一步证实。
实施例7
由天然菌株（Bacillus  deramificans）产生之支链淀粉酶的活性随PH和温度的变化。
经测定释放出的还原糖，检测在50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲盐中，在不同温度（55、60和65℃）和不同PH值（从3.25到7）条件下支链淀粉酶的酶促活性。使用稀释到约1PUN/ml的如实施例2获得的支链淀粉酶的溶液C。
结果总结在表3中。
在该试验过程中，经测定释放出的还原糖检测了置于PH约4.3和温度约60℃条件下的样品在15分钟期间的最大酶促活性。按照定义，该样品相对酶促活性应为100%。
这一实施例说明，在温度约60℃，PH在4.0和4.8范围内测定时，本发明的支链淀粉酶具有最佳酶促活性。
这一实施例也说明，在PH约4.3，温度在55和65℃之间测定时，本发明的支链淀粉酶具有最佳酶促活性。
而且，这一实施例还说明在PH约3.8和约4.9范围内，本发明的支链淀粉酶显示出大于最大酶促活性80%的酶促活性。
表3
相对酶促活性％
PH3.253.754.304.905.506.006.40 温度℃
55        60        65
5.7       2.2       4.380.8        83.7     11.587.9     100    84.182.4    87.1    6850.6    39.6     13.57.5     2.9     00      0       0
实施例8
由天然菌株（Bacillus  deramificans）产生之支链淀粉酶的PH稳定性
稀释实施例2中获得的支链淀粉酶的溶液A，以使其在PH值变化范围在PH3.0至7.0的各种100mM柠檬酸盐/硝酸盐缓冲液中表现出约0.7PUN/ml的酶促活性。含有支链淀粉酶的各稀释溶液在60℃温育60分钟。
然后测定这些在1.6%（重量/体积）出芽短梗孢糖存在下在PH4.2和60℃条件下温育60分钟后的不同溶液的酶促活性。用HPLC层析法测定所形成的麦芽三糖的量（如实施例2中描述的）。结果总结在表4中。
在这一试验过程中，测定了放置在PH约4.5和温度约60℃条件下样品的最大酶促活性。按照定义，该样品的相对酶促活性应为100%。
该实施例说明，按本发明的支链淀粉酶在宽的酸性PH范围内稳定。事实上，在温度约60℃无底物存在下，PH范围在约3.5到约5.8之间温育60分钟后测定时，该酶具有至少85%的相对酶促活性。这一实施例还说明，在这些相同的条件下，PH值范围约为3.8和5之间测定时，该酶具有大于90%的相对酶促活性。只有在PH小于或等于3或大于或等于7时，该酶才被失活。
表4
PH 相对活性％
33.544.555.566.57 09098100969289750
实施例9
由天然菌株（Bucillus  deramificans）产生之支链淀粉酶的半衰期的测定
稀释如实施例2获得的支链淀粉酶的溶液C，以使其在100mM乙酸钠缓冲溶液中PH4.5时显示约0.7PUN/ml的酶促活性。在60℃温育含有支链淀粉酶的稀释溶液，并在不同时间取样。
然后用还原糖方法（如上所述的SOMOGYI方法）测定酶促活性。
在这一试验过程中，测定了时间0时样品的最大酶促活性。因此按照定义，该样品相对酶活性应为100%。
结果总结在表5中。
表5
时间（小时） 相对活性（％）
01624404864 1007674575447
此实施例表明，支链淀粉酶在酸性PH下是稳定的。
这一实施例说明，在这些条件下，支链淀粉酶的半衰期约55小时。事实上，在温度约60℃和无底物存在下，在PH约4.5的缓冲溶液中温育55小时后测定时，该支链淀粉酶具有至少50%的相对酶促活性。
这一实施例还说明，在温度约60℃和无底物存在下，在PH约4.5的缓冲溶液中温育40小时后测定时，本发明的支链淀粉酶具有至少55%的相对酶促活性。这一实施例也说明，在这些相同条件下温育24小时后测定时，该支链淀粉酶具有至少70%的相对酶促活性。
实施例10和实施例11R（比较）
糖化
将玉米淀粉和氯化钙悬浮在水中制备糖化介质，其中玉米淀粉的浓度以淀粉干物质重量计为35%（重量/重量），氯化钙的浓度为0.02%（重量/体积）。
该玉米-淀粉悬浮液在有以商品名TAKATHERM L-340出售的来源于SOLVAY ENZYMES的α-淀粉酶存在下，105℃和PH6.0条件下液化5分钟。
将这样获得的液化淀粉迅速冷却至95℃，在搅拌的同时于95℃继续水解120分钟，在这一阶段，水解程度在10和12  DE（DE代表“右旋糖当量”单位，即以葡萄糖当量表示的还原端的数目）之间。
将如此获得的液化淀粉稀释至每100g糖化介质32g干重的终浓度。
将所得糖化介质冷却至60℃。
将此糖化介质的PH用乙酸调节至从3.9到4.8各种值，并在糖化过程中保持恒定。
向该糖化介质中加入数量相当于0.176  UD/g.ds（每克糖化介质干物质中葡糖淀粉酶的酶单位数）的葡糖淀粉酶。所用葡糖淀粉酶是由SOLVAY  ENZYMES以商品名DIAZYME  L-200出售的。
对于本发明的实施例10，将相当于0.075PUN/g干物质的支链淀粉酶以实施例2中描述的支链淀粉酶的含水浓缩液（溶液A）的形式加入到糖化介质中。
比较实施例11R按如上所述实施例10的方法进行，但不加入支链淀粉酶。
48小时后停止糖化，所得产物用层析法进行分析（如实施例2所述）。
结果总结在表6中。
这一实施例表明，按照本发明的支链淀粉酶在糖化作用中是有效的。因此，本发明的支链淀粉酶具有符合淀粉糖化之实际工业条件的所有合适性质。
这一实施例表明，在低到高酸性PH值即至少3.9的各种PH值下，在本发明的支链淀粉酶存在下，淀粉转化水平较高。
表6
PH 实施例 以％计获得的产物
葡萄糖 Dp2 Dp3 >Dp3
3.9 11R10 94.1895.63 2.922.90 0.540.73 2.370.73
4.2 11R10 94.1894.79 2.984.30 0.560.56 2.290.38
4.5 11R10 93.7295.49 2.883.00 0.570.75 2.830.76
4.8 11R10 93.3295.25 2.792.70 0.600.87 3.301.18
DP2代表含有2个葡萄糖单元的低聚糖（葡萄糖二聚体）;DP3代表含有3个葡萄糖单元的低聚糖（葡萄糖三聚体）;＞DP3表示含有大于3个葡萄糖单元的低聚糖。
实施例12和实施例13R（比较）
糖化
重复实施例10，但糖化介质PH固定在PH4.2。
将相当于0.17  DU/g.ds（每克糖化介质干物质中酶单位数）的葡糖淀粉酶加入到糖化介质中，所用葡糖淀粉酶是由SOLVAYENZYMES以商品名DIAZYME  L-200出售的。
对于本发明的实施例12，也将分别相当于0.0325  PUN/g.ds.，0.050  PUN/g.ds.，0.075  PUN/g.ds.和0.10  PUN/g.ds.（每克糖化介质干物质中支链淀粉酶的单位数）的支链淀粉酶以实施例2中描述的支链淀粉酶的含水浓缩液（溶液A）的形式加入到糖化介质中。
比较实施例13R按上述的实施例12的方法进行，但不加入支链淀粉酶。
结果总结在表7中。
这一实施例表明，观察到产生的葡萄糖百分比增加所必须使用的支链淀粉酶的量少于0.0325  PUN/g.ds。
表7
实施例 支链淀粉酶PUN／g.ds 以％计获得的产物
葡萄糖 DP2 DP3 >DP3
13R 0 94.78 3.55 0.73 0.94
12 0.03250.0500.0750.10 95.1695.3095.2595.27 3.453.393.473.49 0.780.740.740.70 0.610.560.550.53
实施例14
质粒pUBDEBRA1的构建
质粒PUBDEBRA1（附图1）含有编码脱支芽孢杆菌T89.117D菌株支链淀粉酶，在其自身转录启动子控制下引入载体pUB131中的基因。质粒pUBDEBRA1的构建如下所述。
从脱支芽孢杆菌T89.117D菌株（保藏号LMG  P-13056）提取染色体DNA并纯化之。
为此目的，在液体MYE培养基（实施例1）中制得200ml该芽孢杆菌的培养物。
当该培养物制得并处于静止期时，以每分钟5000转离心（BECKMANJA-10转子）10分钟。将如此得到的离心沉淀物加在9ml含有0.1MTRIS-HCl（三（羧甲基）氨基甲烷，以HCl酸化）PH8、0.1M  EDTA（乙二胺四乙酸）和含18ml溶菌酶之0.15M  NaCl的缓冲液中。将所得悬浮液在37℃保温15分钟。
然后在50℃将所得的溶胞产物用10mg/ml的RNAse溶液处理20分钟。向该溶胞产物中加入1ml  10%强度的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。然后将该溶胞产物在70℃保温30分钟。
将溶胞产物冷却至大约45℃，然后向其中加入0.5ml  20mg/ml蛋白酶K溶液（临时制备）。
在45℃保温溶胞产物，同时手动搅拌，直至获得透明溶液。
在所述条件下按照Molecular  Cloning-a  laboratory  Manual-SAMBROOK，FRITSCH，MANIATIS-second  edition，989，PP.E.3所述方法对上述透明溶液进行几次苯酚提取，直到出现上述文献中所述的合适介面。
用20ml乙醇沉淀DNA，以每分钟5000转离心5分钟收集沉淀物。然后将该沉淀物悬浮在2ml  PH8.0的缓冲液（10mM  TRIS-HCl，1mM  FDTA，PH8.0）中。
然后，所得DNA用限制性酶Sau3AI部分切断。除了限制性条件以因子10增加以获得用于以下纯化阶段的足够量的DNA外，本实施例和本申请所有其它实施例中的限制性条件都是SAMBROOK  et  al.（PP.5.28-5.32）所描述的那些。
调节所用DNA量和酶量的比率以得到大小在5和10kbp（kbp：103碱基对）之间的最大片段。
然后，按SAMBROOB等人（PP.6.01-6.19）描述的方法对所获得的合并片段进行琼脂糖凝胶电泳（0.8%），并用GENE  CLEAN方法分离并纯化大小在5和10kbp之间的片段。然后将这些片段与质粒pBR322（该质粒由BIOLABS公司售出[CLONTECH  LABORATORIES（USA）catalogue  No.6210-1]）拼接，按SAMBROOK等人（PP.1.60-1.61）所述方法在BamHI位点切断并脱磷酸。其它实施例中也使用同一技术。
将这样得到的拼接物电泳（SAMBOOK  et  al.，PP.1.75-1.81）转化到E.Coli  MC  1061细胞（CLONTECH  LABORATORIES;Cataloyue  No.C-1070-1]中。细胞在含有LB（Luria-Bertani）琼脂-琼脂培养基和100μg/ml氨苄青霉素的佩特里细菌培养皿上37℃生长约18小时后挑选转化菌株。SAMBROOK等人（PP.A.4）描述了所述的LB培养基，该培养基含有10g/l胰冻、5g/l酵母提取物和10g/l氯化钠。
然后，将从这些培养皿中获得的克隆复制在含有相同培养基的培养皿上。
用含有1%（W/V）琼脂、100mM乙酸钠（PH4.5）和0.1%（W/V）AZCL-Pullulane的琼脂-琼脂培养基覆盖其中两个培养皿。在60℃保温13小时后，辨认出显示最大AZCL-Pullulane水解带的克隆，并在其它培养皿上分离相应的菌落。
从这样获得的菌株中提取称为pBREDBRA3的质粒。使用BamHI和EcoRI对质粒pBRDEBRA3进行双重消化得到质粒pBRDEBRA3的约4.6Kb的EcoRI-BamHI片段，并经琼脂糖凝胶电泳（0.8%W/V）纯化之。然后将该片段与载体pUB131（欧洲专利申请0415296中描述过）拼接，该质粒使用枯草杆菌PSL1菌株作为宿主，并预先在BamHI和EcoRI位点用BamHI和EcoRI双重消化。
枯草杆菌PSL1菌株可从B.G.S.C.保藏中心以保藏号1  AS10（BACILLUS  GENETIC  STOCK  CENTER，Ohio  State  University，United  States）获得。
用碱性溶胞技术（SAMBROOK  et  al.，PP.1.25-1.28）从转化的PSL1细胞中分离并纯化如此获得的质粒pUBDEBRA1。在其它实施例中也使用这一相同的技术。
枯草杆菌的所有转化菌株均能表达支链淀粉酶的基因并能分泌支链淀粉酶。
在含加有25μg/ml卡那霉素之LB培养基的佩特里细菌培养皿中继代培养含有质粒PUBOEBRAI的转化的PSLI菌株。
用含有AZCL-pullulane（0.1%重量/体积）和乙酸钠（100mM，PH4.5）的琼脂糖顶层覆盖所得菌落。在60℃保温18小时后，可见所有转化菌株的集落均被AZCL-pullulane的水解圈包围。
实施例15
地衣芽孢杆菌SE2  delap1菌株的制备
地衣芽孢杆菌SE2宿主菌株碱性蛋白酶基因之末端部分的鉴别
本实施例涉及宿主地衣芽孢杆菌菌株碱性蛋白酶基因末端部分的鉴别，以便制备缺失地衣芽孢株菌SE2之所说基因的缺失质粒。
1.从地衣芽孢杆菌SE2中提取染色体DNA
为分离地衣芽孢杆菌SE2染色体DNA的碱性蛋白酶基因，除培养基包含LB培养基和经纯化外，均按实施例14中所描述提取染色体DNA的方法首先提取染色体DNA。
2.鉴别碱性蛋白酶基因的C末端部分
对提取的染色体DNA进行Molecular  Cloning-SAMBROOK  et  al.（PP.1.85）和Molecular  Cloning，a  laboratory  Manual，MANIATIS  et  al.，1982，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，pp，374-376中描述的限制性分析。按照它们在0.8%（重量/体积）琼脂糖凝胶上的大小分离经过这些消化后得到的DNA片段。
然后，对琼脂糖凝胶用SOUTHERN  BLOT技术（SAMBROOK  et  al.，PP.9，31描述的技术）进行分析，以便鉴别含有碱性蛋白酶基因C末端部分之核苷酸序列的片段。
为用于杂交而构建的探针是相应于碱性蛋白酶基因C末端部分的合成寡核苷酸。在BIOSEARCH  CYCLONE  SYNTHESIZER装置中使用β-氰基乙基-磷酸酰胺酯法合成寡核苷酸探针。用于构建合成寡核苷酸的技术已在BEAUCAGE，S.L.et  al.（1981），Tetrahedron  Ltters，22，pp.1859-1882中作了描述。所构建的合成寡核苷酸序列如下（SEQ  ID  NO：2）;
5′-GGCGGAGCAAGCTTTGTGG-3′
这些结果表明，碱性蛋白酶基因的C末端部分位于约2.7Kbp的PstI片段上。
按照Molecular  Cloning-SAMBROOK  et  al，-PP.9.52-9.55中描述的技术进行与DNA探针的杂交。这一技术也用于其他实施例中。
然后用酶PstI消化，从地衣芽孢杆菌菌株SE2中提取的染色体DNA制备物，所得片段按其大小用琼脂糖凝胶电泳（0.8%）分离。
从该凝胶提取出所获得的2.7KbP  PstI片段并从使用玻璃珠并使用由BIO  101（USA）投放市场的所谓“GENE  CLEAN”技术纯化之。
然后，使2.7KbP的PstI片段与质核PUC  18（CLONTECH  Latoratories，NO.6110-1）拼接（SAMBROOK  et  al.，PP.1.68-1.69）。
所说质粒已预先在PstI位点被消化并已脱磷酸。然后以使用CaCl2的技术（SAMBROOK et al.，-PP.1.82-1.84）将这样获得的拼接物转化到大肠杆菌MC 1061中，SAMBROOK等人（PP.1.60-1.61）描述了使DNA片段脱磷酸或载体线性化的技术，拼接技术也由SAMBROOK等人（PP.1.68-1.69）作了描述。
在含有添加了100μg/ml氨苄青霉素之LB琼脂-琼脂培养基的培养皿上挑选转化菌株。然后与使用SOUTHERN研究中所用的C末端探针标记的合成寡核苷酸杂交以选择如此获得的从大肠杆菌MC1061开始的转化菌株，并分离质粒pKCl。
所说合成寡核苷酸按照SAMBROOK等人（PP.11.31-11.33）描述的技术，使用T4噬菌体的T4多核苷酸激酶用32P-r-ATP使之磷酸化以标记合成的寡核苷酸。
3.鉴别碱性蛋白酶基因的N末端部分
对提取的染色体DNA进行限制性分析。按照其大小在0.8%琼脂凝胶上分离所获得的DNA片段。
然后用SOUTHERN  BLOT技术分析该琼脂糖凝胶以鉴定含有蛋白酶基因N末端部分的核苷酸序列。
用于杂交的探针是相应于碱性蛋白酶基因之N末端部分的合成寡核苷酸。所构建的合成寡核苷酸的序列如下（SEO  ID  NO：3）;
5′-ATGGCTCCTGGCGCAGGC-3′
这些结果表明，碱性蛋白酶基因的N末端部分位于5.5KbP的PstI片段上，也位于约2KbP的较小的Bc1I-PstI片段上。该片段不含有限制性位点XbaI、C1aI、HpaI和SphI。
然后将从地衣芽孢杆菌菌株SE2中提取的染色体DNA制备物用酶PstI消化，并将所得片段按其大小用琼脂糖凝胶泳法（0.8%）分离。
从该凝胶中提取所获得的5.5KbP的片段并用所谓“GENE  CLEAN”技术（BIO  101公司）纯化之。
然后用Bc1I、XbaI、ClaI、HpaI和SPhI系列消化，如此得到的5.5Kbp PstI片段。将所产生的DNA片段与事先用BamHI和PstI切成线性的质粒pMK4拼接（与在SULLIVAN et al.，（1984）Gene 29，PP.1-26描述的方法相同）。质粒pMK4可以保藏号1E29从B.G.S.C.保藏中心（Bacillus Genetic Stock Center（Ohio State University）Columbus，Ohio，USA）获得。
然后以使用CaCl2的技术将所获得的拼接物转化到大肠杆菌MC1061细胞中。
在含有添加了100μg/ml氨苄青霉素之LB琼脂-琼脂培养基的平皿上挑选转化的菌株。然后与在SOUTHERN研究中使用的末端探针标记的合成寡核苷酸杂交，以选择如此获得的从大肠杆菌MC1061开始的转化菌株，并分离质粒pKPI。
实施例16
碱性蛋白酶的序列
按照SAMBROOK等人（PP.13.15和13.17和图13.3B）描述的技术从PstI位点上至SacI位点测定已转入质粒pKCl  pKCl中之片段的序列。
实施例17
质粒pLD1的构建
为制备地衣芽孢杆菌SE2  delap1的菌株之目的构建质粒pLD1（附图2）。质粒pLD1构建方法如下：
质粒pLD1（如实施例15获得的）在大肠杆菌MC1061中不稳定。为此，将含有地衣芽孢杆菌SE2之碱性蛋白酶基因N末端部分的染色体DNA片段引入到载体pACYC 184（BIOLABS，US，保藏号＃401-M）中。将质粒pKP1的1894 bp EcoRI-EcoRI片段引入到质粒pACYC 184的EcoRI位点而完成该引入，并用拼接物转化大肠杆菌MC 1061细胞，这样便获得了质粒pKPN11。
在含有添加了1.25μg/ml四环素之LB琼脂-琼脂培养基的平皿上挑选转化菌株。用限制性分析法（SAMBROOK  et  al.PP.1.85和MANIATIS  et  al，-PP.374-379）确定质粒pKPN11中1849  bp  EcoRI-EcoRI片段的定位。
以下述方法获得质粒pKPN12：先用StyI消化，接着经用事先产生的下列合成的双股DNA取代以除去质粒pKNPN11中的1671  bp  StyI-StyI片段。
5＇-  CTTG  GAGCTC  GTTAAC  AGATCT  -3＇(SEQ  ID  NO:4)
3＇-  CTCGAG  CAATTG  TCTAGA  GTTC  -5＇(SEQ  ID  NO:5)
(StyI)  SacI  HpaI  BalII  (StyI)
按照SAMBROOR  et  al.-1989-Chapters  5.28-5.32中描述的技术进行质粒的限制性酶消化。
按下述方法获得源于质粒pUB131的编码卡那霉素和博莱霉素及腐草霉素抗性的DNA片段：
对质粒pUB131进行PstI-TaqI双重消化以获得2666  bp  PstI-TaqI片段，该片段携带编码卡那霉素、博莱霉素或腐草霉素抗性的基因。将此片段引入到质粒pBS-（STRATAGENE，USA，b编号211202）的PstI-AccI位点。这样获得质粒pBSKMPM。
在制备质粒pBSKMPM期间，在与质粒pBS-结合区出现小的缺失，该缺失导致质粒pBSKMPM中SphI和PstI位点的丧失。质粒pBSKMPM被用于产生可影响位点针对性诱变的单股DNA借以引入两个合成的核苷酸。该质粒的SamI位点鉴别如下：一个在抗卡那霉素和腐草霉素抗性基因的前面，另一个在其后面。
SAMBROOK等人（PP.15.74-15.79）描述了位点针对性诱变技术，该技术使用了BIO-RAD出售的诱变试验盒（No.170-3756）。
用于诱变的合成寡核苷酸序列如下（分别为SEQ  ID  NO：6和SEQ  ID  NO：7）：
5＇-CATCTAATCTTCAACACCCGGGCCGTTTGTTGAAC-3＇
SmaI
5＇-CAAAATAAAAAAGATACAACCCGGGTCTCTCGTATCTTTTAT-3＇
Smal
在两种寡核苷酸存在下用这种诱变方法获得的质粒是质粒pBSKMPM1。该质粒含有两个SmaI限制性位点，该位点使含有编码抗卡那霉素和腐草霉素抗性之基因的DNA片段分离开。
然后，将质粒pBSKMPM1的1597  bp  SmaI-SmaI片段引入到质粒pKPN12的SmaI位点，由此得到质粒pKPN14。
通过限制性分析对质粒DNA制剂进行选择，以证实被引入到质粒pKPN14中之片段的合适方位（SAMBROOK  et  al.-PP.1.85）。
通过最初用Hind  Ⅲ对质粒pKCl的1.2Kbp  SamI-Hind  Ⅲ片段（如实施例15获得的）进行消化，分离存在于质粒pKCl上并位于碱性蛋白酶N末端序列之前的DNA片段。
用DNA聚合聚Klenow片段处理，使Hind  Ⅲ的5′突出末端变成平头末端（SAMBROOK  et  al.-PP.F.2-F.3）。使SacI的限制性起作用，以产生所需平头末端SacI-Hind  Ⅲ片段。将该片段引入到质粒pKPN14的HpaI和SacI位点，产生质粒pLID1。
所有这些构建体都在用来选择已转化菌株的四环素（12μg/ml）存在下转化大肠杆菌MC1061菌株。
通过替代大肠杆菌的复制功能从质粒pLID1构建能在枯草杆菌和地衣芽孢杆菌中复制的质粒。所说复制功能由质粒pLID1的3623  bp  BglⅡ-BglⅡ片段携带，其被携带芽孢杆菌复制功能的片段即从质粒pUB131分离到的2238  bp  BglⅡ-BamHI片段所取代。
经用BglⅡ和BamHI消化质粒pLID首先从质粒pLLDI中分离出3.6kbp  BglⅡ-BglⅡ片段，以由芽孢杆菌细胞替代大肠杆菌复制功能。补充性BamHI消化是必需的，事实上，BglⅡ单独消化会产生不能用琼脂糖凝胶电泳法分离的相同大小的片段。这样3.6Kbp  BglⅡ-BglⅡ片段在枯草杆菌SE3菌株2238bp  BglⅡ-BamHⅠ片段中克隆，所说2238bp  BglⅡ-BamHⅠ片段已从质粒pUB131A中分离到。如此产生质粒pLD1（附图2）。
枯草杆菌SE3菌株按布达佩斯条约以保藏号LMG  P-14035于1993年6月21日保藏在称作BELGIAN  COORDINATED  COLLECTIONS  OF  MICROORGANISMS的保藏中心。
实施例18
地衣芽孢杆菌SE2  delap1的构建
用基于同源重组的技术对地衣芽孢杆菌SE2菌株染色体DNA进行所期望的修饰。进行该修饰是为了产生地衣芽孢杆菌SE2  delap1菌株。
使用Molecular  Biological  Methods  for  Bacillus（PP.150-151）中描述的原生质体技术，按照所限定的条件将质粒pLD1转化到地衣芽孢杆菌SE2中，所不同的是，将溶菌酶粉末以5mg/ml的量加入SMMP中，代替所述方法第7阶段中限定的1mg/ml、用溶菌酶获得最大胞溶作用的保温时间是60分钟、并在含有200μm/ml卡那霉素的DM3培养基（Molecular  Biological  Methods  for  Bacillus（HARWOOD  et  al.，eds）John  Wiley  and  Sons（1990）（PP.150-151）中描述的）中进行再生。
分离已转化的菌株并证实已引入到该菌株中之质粒pLD1的限制性酶切图。
将转化菌株在添加2g/l葡萄糖和25μg/ml卡那霉素的50mlLB培养基中于37℃培养18小时。
取培养物样品（0.1ml）并用来接种含有50ml相同LB培养基的锥形瓶。该培养物在37℃保温18小时。取出该培养物样品，在盛有添加了25μg/ml卡那霉素和1%（重量/体积）脱脂牛奶的LB琼脂-琼脂培养基（DIFCO）的佩特里细菌培养皿上试验，以检测蛋白酶的存在。
如在克隆周围不存在显示它们在这些培养皿上生长的水解晕圈即指示这些克隆不能够产生碱性蛋白酶。
重复培养和试验，直到获得不再产生碱性蛋白酶（apr-）和卡那霉素抗性（km′）的菌株（apr-，km′）。
然后在37℃无抗生素存在的生长培养基上培养，以除去存在于该地衣芽孢杆菌SE2  delap1菌株中的质粒pLD1。
将这一菌株在添加有2g/l葡萄糖的50ml LB培养基中于37℃培养18小时。取该培养物0.1ml，用来接种另一个含有50ml相同培养基的锥形瓶，在37℃持续培养18小时。然后，取出一份样品将其散布在含有LB培养基的细菌培养皿上。将分离到的克隆在装有含25μg/ml卡那霉素之LB培养基的培养皿上再次克隆。分离一个对卡那霉素敏感（kma）的菌株，其表型被证实为（apr-，kma）。
然后分离并纯化这一菌株的染色体DNA，并且用SOUTHERN  BLOT技术证实染色体缺失的结构。证实的缺失在位置上是正确的，已在位于碱性蛋白酶基因之前（5′）和之后（3′）的序列中发生了同源双股重组。
获得的该菌株被称作地衣芽孢杆菌SE2  delap1。它不产生碱性蛋白酶。
实施例19
用表达载体转化地衣芽孢杆菌SE2  delap1
从实施例14所述质粒pUBDERA1（附图1）的宿主中提取、分离并纯化该质粒（SAMBROOK  et  al.，1989，PP.1.25-1.28）。
制备实施例18中所述的地衣芽孢杆菌SE2菌株的培养物，然后按照MANIATIS（PP.150-151）描述的原生质体技术用上述质粒转化该菌株。
在佩特里细菌培养皿上选择转化菌株，分离并筛选纯化之。
实施例20
用地衣芽孢杆菌SE2  delap1（pUBDEBRA1）产生支链淀粉酶
将用实施例19所获得之质粒pUBDEBRA1转化的地衣芽孢杆菌SE2 delap1菌株在37℃在加有0.5%（W/V）葡萄糖和20μg/ml卡那霉素的预培养LB培养基中培养17小时。将该预培养物转移（5%V/V）到50ml补充以20μg/ml卡那霉素的M2培养基中。该M2培养基含有30g大豆粉、75g可溶性淀粉、2g硫酸钠、5mg氯化镁、3g NaH2PO4，0.2g CaCl2·H2O和1000ml水。在灭菌前，该M2培养基的PH值用10N NaOH调至5.8。培养在搅拌的同时于37℃进行30小时。80小时后，以每分钟5000转离心10分钟以除去生物量。保留离心上清液。测定该上清液的酶促活性并记录其支链淀粉酶酶促活性。
实施例21
地衣芽孢杆菌SE2  delap1（pUBCDEBRAllDNSI）的构建-染色体整合
这一实施涉及将编码支链淀粉酶的基因整合到地衣芽孢杆菌SE2  delap1菌株中。
为此目的，通过转化大肠杆菌MC  1061菌株，将质粒pBRDEBRA3的4.6kb  EcoRI-BamHI片段克隆到pUBC131载体的EcoRI和BamHI位点，由此产生质粒pUBCDEBRA11。
然后经缺失质粒pUBCDEBRA11的886  bp  NsiI-NsiI片段构建重组载体pUBCDEBRAllDNST（附图3）。如此得到的质粒由于丢失886bp的NsiI片段而丧失了在芽孢杆菌中自身复制的可能性。
为实现这一构建，用NsiI限制性酶切割质粒pUBCDEBRAll，用琼脂糖凝胶电泳法纯化约9.4kbp的NsiI-NsiI片段。然后，切接该片段，以使其重新环化。将该切接产物转化到大肠杆菌MC1061中，获得质粒pUBCDEBRAllDNSIl。
为了将质粒pUBCDEBRAllDNSIl整合到地衣芽孢杆菌SE2  delap1菌株中，该质粒携带同源于染色体DNA的DNA片段是必要的。这样，源于地衣芽孢杆菌的染色体Sau3AI片段便被克隆到整合载体pUBCDEBRAllDNSIl的BamHI位点。
为此目的，用Sau3A1限制性酶部分切割从地衣芽孢杆菌SE2  delap1菌株中提取的染色体DNA。然后用琼脂糖凝胶纯化大小在1.5和3kb之间的DNA片段，并将这些片段与被BamHI限制性切割并脱硝酸化的质粒pUBCDEBRAllDNSI拼接。用电穿孔法将这样获得的拼接物转化到MC1061细胞中。在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂-琼脂养基上选择后，获得约3000个克隆。将所有这些克隆悬浮在LB培养基中，用碱性溶胞技术（SAMBROOK  et  al.，PP.1.25-1.28）提取这些质粒。
用原生质体技术转化，将这样获得的质粒制备物引入到地衣芽孢菌SE2  delap1菌株中。在DM3再生培养基（参见Molecular  Biological  Methods  for  Bacillus（Harwood，C.R.and  Cutting，S.M.eds）J.Wiley  and  Sons，1990，PP.150-151）上选择对腐草霉素（17μg/ml）有抗性的菌株，该抗性只有通过对上述已构建之质粒之一的染色体整合来获得。
将这样获得的菌落在添加了5μg/ml腐草霉素和0.06%  AZCL-Pullulane的LB琼脂-琼脂培养基上继代培养。然后分离具有最大AZCL-Pullulane水解圈的菌落，并在LB琼脂-琼脂培养基上继代培养。
然后提取该菌株的质粒内含物。用琼脂糖凝胶电泳法分析这样获得的制备物，结果表明无质粒存在。
按实施例14中所述，提取和纯化染色体DNA，并用SOUTHERN技术进行分析。分析表明，通过同源重组到约3kb的Sau3AI片段中，质粒pUBCDEBRAllDNSI已整合到染色体DNA内。
这说明，编码脱支芽孢杆菌支链淀粉酶的基因在地衣芽孢杆菌中以染色体整合状态被表达。
实施例22
用地衣芽孢杆菌SE2  delap  1菌株（pUBCDEBRAllDNSI）产生支链淀粉酶的方法
将如实施例21获得的含有呈染色体DNA整合形式之支链淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌SE2 delap 1菌株在添加有0.5%（W/W）葡萄糖和5μg/ml腐草霉素的预培养LB培养基中于37℃培养17小时。将10ml该预培养物接种在250ml折流瓶中的加有5μg/ml腐草霉素的M2培养基（如实施例20中描述的）中。
在搅拌的同时于37℃培养24小时，将这样获得的所有培养物转入到含有6.51 M2培养基的发酵罐中，发酵在37℃持续72小时。加入浓磷酸保持PH值在7.0以下，空气流速保持在4升/分钟，并调节搅拌速度，以使溶解氧含量大于饱和含量的30%（V/V）。
在向所获得的培养物中加入基于聚胺的以商品名OPTIFLOC FC205出售的絮凝剂50ml后，以每分钟5000转离心（BECKMAN JA-10）15分钟除去生物量，并用1M HCl溶液将所获得的上清液酸化到PH4.5。将所得溶液以每分钟8000转再次离心（BECKMAN JA-10）15分钟。
使用配有分辨极限为5000道尔顿膜的超滤设备进行超滤，将该上清液浓缩至终体积为1升。
以60%终浓度（V/V）将丙酮加入到该浓溶液中。形成的上清液在4℃保温2小时，并经每分钟8000转离心（BECKMAN JA-10）15分钟。将所获得的离心残渣在PH4.5下悬浮在100ml含有30%（W/V）商品名为MALTRIN
Figure 931217369_IMG7
250（GRAIN PROCESSING CORPORATION）的淀粉、0.3%（W/V）苯甲酸钠和0.15%（W/V）山梨酸钾的水溶液中。如此得到的由重组菌株产生的支链淀粉酶的纯化制剂称作溶液D。
用还原糖法测得的溶液D的支链淀粉酶活性为150PUN/ml。
实施例23
由地衣芽孢杆菌SE2  delap  1菌株（pUBCDEBRAllDNSI）产生之支链淀粉酶对温度的稳定性
稀释如实施例22中获得的支链淀粉酶的溶液D，使其在PH4.75的0.05M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲溶液中表现酶促活性为10至15PUN/ml。
将含有支链淀粉酶的该稀溶液以每管5ml稀溶液分袋到9个试管内。
将含有该稀溶液的所述各试管在温度40和80℃的水浴中保温75分钟。
保温后，将试管放入冰浴中迅速冷却。
然后测定（测定条件：温度60℃，PH4.5，保温时间15分钟）各溶液的酶促活性。
这一试验期间，测定了在温度约55℃置于PH约4.75下的样品的最大酶促活性。按照定义，该样品的相对酶促活性应为100%。
结果总结在表12中。
表12
温度 相对酶促活性％
4045505560657080 9099100100968321
这一实施例表明，当在PH4.75，无底物存在下，温度小于或等于65℃的范围内保温75分钟后测定时，本发明的支链淀粉酶具有至少80%的相对酶促活性。
序列表
（1）一般情况
（ⅰ）申请人：
（A）名称：SOLVAL（Société  Anonyme）
（B）街：rue  du  Prince  Albert，33
（C）城市：Bruxelles
（E）国家：Belgique
（F）邮政代码：1050
（G）电话：（02）509.61.11
（ⅱ）发明名称：支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途
（ⅲ）序列数  15
（ⅳ）计算机可读形式：
（A）介质类型：Floppy  disk
（B）计算机：IBM  PC  compatable
（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS
（D）软件：Patent In Release＃1.0，Version＃1.25（OEB）
（2）SEQ  ID  NO：1信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：20氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（ⅴ）片段类型：N末端片段
（ⅵ）来源
（A）生物体：脱支芽孢杆菌（Bacillus  deramificans）
（B）菌株：T89.117D
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：1
Figure 931217369_IMG8
（2）SEQ  ID  NO：2信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：19碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸（oligonucleotide  synthetique）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：2
GGCGGAGCAA  GCTTTGTGG
（2）SEQ  ID  NO：3信息：
（ⅰ）序列特征
（A）长度：18碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸（合成寡核苷酸）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：3
ATGGCTCCTG  GCGCAGGC
（2）SEQ  ID  NO：4的信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：22碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸（合成寡核苷酸）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：4
CTTGGAGCTC  GATAACAGAT  CT
（2）SEQ  ID  NO：5信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：22碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸（合成寡核苷酸）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：5
CTTGAGATCT  GTTAACGAGC  TC
（2）SEQ  ID  NO：6信息：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：36碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸（合成寡核苷酸）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：6
CATCTAATCT  TCAACACCCG  GGCCCGTTTG  TTGAAC
（2）SEQ  ID  NO：7信息：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：42碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸（合成寡核苷酸）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：7：
CAAAATAAAA  AAGATACAAC  CCGGGTCTCT  CGTATCTTTTAT
（2）SEQ  ID  NO：8信息：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：4464碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：基因组DNA
（ⅹⅰ）序列描述  SEQ  ID  NO：8：
（2）SEQ  ID  NO：9信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：4464碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：基因组DNA
（ⅹⅰ）序列描述  SEQ  ID  NO：9：
Figure 931217369_IMG11
Figure 931217369_IMG12
Figure 931217369_IMG13
Figure 931217369_IMG14
Figure 931217369_IMG15
Figure 931217369_IMG16
（2）SEQ  ID  NO：10信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：2784碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：基因组DNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：10
Figure 931217369_IMG17
Figure 931217369_IMG18
（2）SEQ  ID  NO：11信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：928氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：11
Figure 931217369_IMG20
（2）SEQ  ID  NO：12信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：29氨基酸
（B）类型：肽
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（ⅹⅰ）序列描述  SEQ  ID  NO：12：
Figure 931217369_IMG22
（2）SEQ  ID  NO：13信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：87碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸
（ⅹⅰ）序列描述  SEQ  ID  NO：13：
（2）SEQ  ID  NO：14信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：1162碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸
（ⅹⅰ）序列描述  SEQ  ID  NO：14：
Figure 931217369_IMG24
（2）SEQ  ID  NO：15信息
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：431碱基对
（B）类型：核酸
（C）股数：单股
（D）拓扑学：线性
（ⅱ）分子类型：核酸
（ⅹⅰ）序列描述  SEQ  ID  NO：15：
Figure 931217369_IMG25

Claims (20)

1、支链淀粉酶，其特征在于它是由脱支芽孢杆菌(Bacillusderamificans)菌株或该菌株的衍生物或突变体产生的。
2、支链淀粉酶，其特征在于它的N末端序列（SEQ  ID  NO：1）以氨基到羧基方向并从左到右如下所示：
Asp  Gly  Asn  Thr  Thr  Thr  Ile  Ile  Val  His
1  5  10
Tyr  Phe  Cys  Pro  Ala  Gly  Asp  Tyr  Gln  Pro
15  20
3、分离和纯化的支链淀粉酶，其特征在于它含有如附图4说明的1-928个氨基酸的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：11）或来源于该序列的修饰序列。
4、按照权利要求3的支链淀粉酶，其特征在于它以含有29个氨基酸的附加序列（SEQ  ID  NO：12）的前体形式被合成。
5、支链淀粉酶，其特征在于它是由芽孢杆菌属的微生物以异源方式产生的，所说的微生物在野生状态含有碱性蛋白酶的基因，该编码碱性蛋白的基因已从芽孢杆菌属的微生物中缺失。
6、制备按照权利要求1-4中任一项之支链淀粉酶的方法，其特征在于它包括在需氧条件下，在含有碳源、氮源和无机盐的合适营养培养基中培养能产生支链淀粉酶的脱支芽孢杆菌（Bacillus  deramificans）菌株或该菌株的衍生物，并收获所获得的支链淀粉酶。
7、制备按照权利要求1-4中任一项之支链淀粉酶的方法，其特征在于它包括分离编码该支链淀粉酶的DNA片段，将该DNA片段插入到合适的载体中，将该载体引入到合适的宿主中或者将DNA片段引入到合适宿主的染色体中，培养该宿主，表达支链淀粉酶并收获该支链淀粉酶。
8、按照权利要求1-5中任一项的支链淀粉酶在淀粉糖化上的应用。
9、包含编码脱支芽孢杆菌（Bacillus  deramificans）支链淀粉酶之核苷酸序列（SEQ  ID  NO：10）或由之修饰的序列的DNA分子。
10、按照权利要求9的DNA分子，其特征在于它包含脱支芽孢杆菌（Bacillus  deramificans）T89.117D之支链淀粉酶的完整基因（SEQ  ID  NO：8）。
11、含有按照权利要求9的DNA分子的表达载体或染色体整合载体。
12、表达载体pUBDEBRA1。
13、染色体整合载体pUBCDEBRA11DNSI。
14、包含按照权利要求9之DNA分子的地衣芽孢杆菌的转化菌株。
15、包含按照权利要求11之表达载体或染色体整合载体的地衣芽孢杆菌的转化菌株。
16、包含表达载体pUBDEBRA1或染色体整合载体pUBCDEBRAll-DNSI的地衣芽孢杆菌的转化菌株。
17、由按照权利要求14、15或16的地衣芽孢杆菌转化菌株产生的支链淀粉酶。
18、脱支芽孢杆菌（Bacillus  deramificans）的分离和纯化的培养物以及由之衍生或突变的培养物。
19、支链淀粉酶，其特征在于它是由脱支芽孢杆菌（Bacillus  deramificans）T89.117D菌株（LMG  P-13056）或该菌株的衍生物或突变体产生的。
20、脱支芽孢杆菌（Bacillus  deramificans）T89.117D的分离和纯化的培养物以及由之衍生或突变的培养物。
CN93121736A 1992-12-28 1993-12-28 支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途 Expired - Lifetime CN1061089C (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9201156 1992-12-28
BE9201156A BE1006483A3 (fr) 1992-12-28 1992-12-28 Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase, utilisations et compositions comprenant celle-ci.
BE9300744 1993-07-15
BE9300744A BE1007313A3 (fr) 1993-07-15 1993-07-15 Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci.
BE9301278 1993-11-19
BE9301278A BE1007723A6 (fr) 1993-11-19 1993-11-19 Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1090325A true CN1090325A (zh) 1994-08-03
CN1061089C CN1061089C (zh) 2001-01-24

Family

ID=27159793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN93121736A Expired - Lifetime CN1061089C (zh) 1992-12-28 1993-12-28 支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途

Country Status (13)

Country Link
US (6) US5721127A (zh)
EP (1) EP0605040B1 (zh)
JP (1) JPH06217770A (zh)
KR (1) KR100319442B1 (zh)
CN (1) CN1061089C (zh)
AT (1) ATE183236T1 (zh)
AU (2) AU686574B2 (zh)
CA (1) CA2112028C (zh)
DE (1) DE69325981T2 (zh)
DK (1) DK0605040T3 (zh)
ES (1) ES2137222T3 (zh)
FI (1) FI116531B (zh)
MX (1) MX9400123A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1310950C (zh) * 2002-05-14 2007-04-18 国家淀粉及化学投资控股公司 通过异淀粉酶脱支低直链淀粉的淀粉制成的耐性淀粉
CN103571812A (zh) * 2013-11-26 2014-02-12 江南大学 一种分泌效率和热稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其制备方法
CN105623937A (zh) * 2007-12-12 2016-06-01 诺维信公司 糖化方法

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE183236T1 (de) * 1992-12-28 1999-08-15 Genencor Int Pullulanase, mikroorganismen die sie produzieren, verfahren zur herstellung und ihre anwendung
JPH11514219A (ja) * 1995-09-13 1999-12-07 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素
US6962263B2 (en) 1996-01-24 2005-11-08 Sambrailo Packaging, Inc. Produce packaging system having produce containers with double-arched ventilation channels
DE19627932A1 (de) * 1996-07-11 1998-01-15 Boehringer Mannheim Gmbh Sensitiver Epstein-Barr-Virus DNA-Nachweis
CA2274112A1 (en) 1996-12-06 1998-06-11 Diversa Corporation Glycosidase enzymes
US7279316B2 (en) * 1996-12-06 2007-10-09 Verenium Corporation Enzymes having glycosidase activity and methods of use thereof
CN1249226C (zh) 1998-03-04 2006-04-05 金克克国际有限公司 支链淀粉酶的修饰形式
US6639126B1 (en) 1999-12-06 2003-10-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of modified polysaccharides
US6350599B1 (en) 2000-01-12 2002-02-26 Novozymes A/S Pullulanase variants and methods for preparing such variants with predetermined properties
CN1780560B (zh) * 2003-03-10 2011-05-25 布罗因联合公司 利用生淀粉生产乙醇的方法
US20050233030A1 (en) 2004-03-10 2005-10-20 Broin And Associates, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation
EP1662898A4 (en) * 2003-09-08 2010-09-08 Univ Louisiana State RESISTANT STRENGTH WITH COOKING CHARACTERISTICS LIKE UNKNOWN STRENGTH
US20050239181A1 (en) * 2004-03-10 2005-10-27 Broin And Associates, Inc. Continuous process for producing ethanol using raw starch
WO2006119386A2 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Broin And Associates, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation
EP1941049A4 (en) 2005-09-20 2011-12-21 Novozymes North America Inc PROCESS FOR PRODUCING A FERMENTATION PRODUCT
US7919289B2 (en) * 2005-10-10 2011-04-05 Poet Research, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and selecting plant material
US8765199B2 (en) 2006-06-15 2014-07-01 Novozymes A/S Mashing process
WO2007144393A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-21 Novozymes, Inc. Mashing process
US9969996B2 (en) 2006-08-04 2018-05-15 Amano Enzyme Inc. Method for making mutated pullulanase enzyme, mutated pullulanase enzyme, and microorganism expressing the same
WO2008015861A1 (fr) * 2006-08-04 2008-02-07 Amano Enzyme Inc. Procédé de conception d'enzyme mutée, son procédé de préparation et enzyme mutée
US7968691B2 (en) * 2006-08-23 2011-06-28 Danisco Us Inc. Pullulanase variants with increased productivity
US11041139B2 (en) 2007-12-12 2021-06-22 Novozymes A/S Brewing process
CN102186965B (zh) 2008-10-15 2014-10-08 诺维信公司 酿造方法
WO2010102063A2 (en) 2009-03-03 2010-09-10 Poet Research, Inc. System for fermentation of biomass for the production of ethanol
US8450094B1 (en) 2009-03-03 2013-05-28 Poet Research, Inc. System for management of yeast to facilitate the production of ethanol
US9068206B1 (en) 2009-03-03 2015-06-30 Poet Research, Inc. System for treatment of biomass to facilitate the production of ethanol
WO2010102060A2 (en) * 2009-03-03 2010-09-10 Poet Research, Inc. System for pre-treatment of biomass for the production of ethanol
EP2430176B1 (en) * 2009-05-11 2024-08-07 Danisco US Inc. Improved production of maltotetraose syrup using a pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolase variant and a debranching enzyme
EP2461702B1 (en) 2009-08-07 2018-11-21 Danisco US Inc. Alpha-amylase blend for starch processing and method of use thereof
BR112012011106C8 (pt) 2009-11-13 2019-11-26 Novozymes As método de mosturação
WO2012140075A2 (en) 2011-04-15 2012-10-18 Novozymes A/S Method for production of brewers wort
WO2013048700A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Danisco Us Inc. Liquefaction and saccharification of granular starch at high concentration
IN2014CN03467A (zh) 2011-10-11 2015-10-16 Novozymes North America Inc
EP2831259A1 (en) 2012-03-28 2015-02-04 Danisco US Inc. Method for making high maltose syrup
EP2847316A1 (en) 2012-05-11 2015-03-18 Novozymes A/S A brewing method
CA2878988A1 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification
CN104718289A (zh) 2012-10-17 2015-06-17 诺维信公司 用于生产啤酒麦芽汁的方法
WO2014092960A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Danisco Us Inc. Trichoderma reesei host cells expressing a glucoamylase from aspergillus fumigatus and methods of use thereof
WO2014099415A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification
US10266864B2 (en) * 2013-03-15 2019-04-23 Basf Enzymes Llc Enzymes having pullulanase activity
CA2915336C (en) 2013-07-17 2024-03-12 Novozymes A/S Pullulanase chimeras and polynucleotides encoding same
CN105960457B (zh) 2014-01-22 2021-09-03 诺维信公司 普鲁兰酶变体以及编码它们的多核苷酸
RU2019134734A (ru) 2014-02-07 2019-11-18 Новозимс А/С Композиции для получения глюкозных сиропов
WO2016087327A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 Novozymes A/S Polypeptides having pullulanase activity comprising the x25, x45 and cbm41 domains
WO2016087445A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 Novozymes A/S Improved production of glucose syrups
EP3253869A4 (en) 2015-02-04 2018-11-07 Nanjing Bestzyme Bio-Engineering Co. Ltd. Truncated pullulanases, methods of production, and methods of use thereof
WO2017014974A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Novozymes A/S Polypeptides having pullulanase activity suitable for use in liquefaction
WO2018005225A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Danisco Us Inc Aspartic proteases
RU2771261C2 (ru) 2016-12-21 2022-04-29 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Способы применения термостабильных сериновых протеаз
EP3596210A1 (en) 2017-03-15 2020-01-22 DuPont Nutrition Biosciences ApS Trypsin-like serine proteases and uses thereof cross-reference to related application
WO2018169750A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Danisco Us Inc Trypsin-like serine proteases and uses thereof
MX2019010807A (es) 2017-03-15 2019-12-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Metodos para usar una serina proteasa de arqueas.
BR112020002605A2 (pt) 2017-08-07 2020-07-28 Novozymes A/S uso de controle de fca com base em ph
FR3091703B1 (fr) 2019-01-11 2021-02-12 Fermentalg Procédé d’extraction de phycocyanines
FR3091640B1 (fr) 2019-01-11 2021-06-11 Fermentalg Procédé de purification de phycocyanines
FR3092586A1 (fr) 2019-02-08 2020-08-14 Fermentalg Procédé optimisé d’exploitation industrielle d’algues rouges unicellulaires
CA3128139A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Novozymes A/S Polypeptides having pullulanase activity suitable for use in liquefaction
EP4055157A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 Novozymes A/S Stabilized liquid enzyme compositions for brewing
CN111560077A (zh) * 2020-05-21 2020-08-21 中国海洋大学 一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4560651A (en) * 1981-04-20 1985-12-24 Novo Industri A/S Debranching enzyme product, preparation and use thereof
JPS57174089A (en) * 1981-04-20 1982-10-26 Novo Industri As Chain dividing enzyme product
US4628031A (en) * 1984-09-18 1986-12-09 Michigan Biotechnology Institute Thermostable starch converting enzymes
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
US4628028A (en) * 1985-05-23 1986-12-09 Cpc International Inc. Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production
US4612287A (en) * 1985-05-23 1986-09-16 Cpc International Inc. Plasmids containing a gene coding for a thermostable pullulanase and pullulanase-producing strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis containing the plasmids
US4902622A (en) * 1986-09-26 1990-02-20 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Novel α-1,6-glucosidase and process for producing the same
JPH0223872A (ja) * 1988-07-12 1990-01-26 Ezaki Glico Co Ltd 組換えプラスミド，それにより形質転換された枯草菌及びそれによる耐熱性プルラナーゼの製造法
EP0405283A3 (en) * 1989-06-26 1991-03-06 Enzyme Bio-Systems Ltd. Novel thermoduric and aciduric pullulanase enzyme and method for its production
US5055403A (en) * 1989-06-26 1991-10-08 Enzyme Bio-Systems, Ltd. Thermoduric and aciduric pullulanase enzyme and method for its production
DK47291D0 (da) * 1991-03-15 1991-03-15 Novo Nordisk As Pullulanase
JP3026857B2 (ja) * 1991-07-05 2000-03-27 ナガセ生化学工業株式会社 新規プルラナーゼおよびその製造法
JP3173849B2 (ja) * 1992-02-26 2001-06-04 天野エンザイム株式会社 新規な枝切り酵素及びその製造法
JPH05236959A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Yoshiyuki Takasaki プルラナーゼ、その製造法及び該酵素を用いる澱粉の 糖化法
DE4244107C2 (de) * 1992-12-24 1996-02-08 Hirschmann Richard Gmbh Co Hochfrequenz-Übertrager
ATE183236T1 (de) * 1992-12-28 1999-08-15 Genencor Int Pullulanase, mikroorganismen die sie produzieren, verfahren zur herstellung und ihre anwendung
GB2279955B (en) * 1993-07-15 1998-02-18 Solvay Xylanase derived from a Bacillus species, expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1310950C (zh) * 2002-05-14 2007-04-18 国家淀粉及化学投资控股公司 通过异淀粉酶脱支低直链淀粉的淀粉制成的耐性淀粉
CN105623937A (zh) * 2007-12-12 2016-06-01 诺维信公司 糖化方法
CN103571812A (zh) * 2013-11-26 2014-02-12 江南大学 一种分泌效率和热稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其制备方法
CN103571812B (zh) * 2013-11-26 2015-06-24 江南大学 一种分泌效率和热稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU686574B2 (en) 1998-02-12
DE69325981T2 (de) 2000-02-03
KR940014776A (ko) 1994-07-19
CA2112028A1 (fr) 1994-06-29
ES2137222T3 (es) 1999-12-16
US6074854A (en) 2000-06-13
US5721127A (en) 1998-02-24
JPH06217770A (ja) 1994-08-09
FI935900A (fi) 1994-06-29
EP0605040B1 (fr) 1999-08-11
CA2112028C (fr) 2003-03-11
ATE183236T1 (de) 1999-08-15
FI116531B (fi) 2005-12-15
US5731174A (en) 1998-03-24
DK0605040T3 (da) 2000-03-13
AU5275993A (en) 1994-07-07
DE69325981D1 (de) 1999-09-16
EP0605040A1 (fr) 1994-07-06
US5721128A (en) 1998-02-24
AU6483198A (en) 1998-07-30
KR100319442B1 (ko) 2002-11-18
MX9400123A (es) 1994-07-29
US5736375A (en) 1998-04-07
US5817498A (en) 1998-10-06
CN1061089C (zh) 2001-01-24
FI935900A0 (fi) 1993-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1061089C (zh) 支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途
CN1246455C (zh) α－淀粉酶变体
CN1262639C (zh) 新的宿主细胞和生产蛋白质的方法
CN1234854C (zh) 具有碱性α－淀粉酶活性的多肽以及编码该多肽的核酸
CN1101470C (zh) 新型腈水合酶
CN1203174C (zh) 多肽
CN1284129A (zh) 热稳定的葡糖淀粉酶
CN1944639A (zh) 酶混合物
CN1726280A (zh) 耐热的α－淀粉酶
CN1351657A (zh) 具有碱性α－淀粉酶活性的多肽及其编码核酸
CN1535279A (zh) 二肽生产方法,所用的l-氨基酸酰胺水解酶,以及l-氨基酸酰胺水解酶生产方法
CN101074435A (zh) α－半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和应用
CN1611601A (zh) 三肽基氨肽酶
CN1195058C (zh) 草酰乙酸水解酶缺陷型真菌宿主细胞
CN1175104C (zh) 内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因
CN1656225A (zh) 新型羰基还原酶及其编码基因、以及利用它们制备光学活性醇的方法
CN1020471C (zh) 改进蒸馏酒质量的方法
CN1150323C (zh) 具有碱性支链淀粉酶和碱性α-淀粉酶两种活性的酶的基因
CN1891820A (zh) 在表面活性剂存在下稳定的胆固醇氧化酶
CN1639328A (zh) 新型脱氢酶和编码该脱氢酶的基因
CN1387566A (zh) 环状缩肽合成酶及其基因、以及环状缩肽的大规模生产系统
CN1219200A (zh) 谷氨酸脱氢酶、β－N－乙酰氨基己糖苷酶和γ－肌动蛋白基因的启动子以及它们在丝状真菌表达,分泌和反义系统中的应用
CN1768136A (zh) 琼脂分解酶及其应用
CN1141387C (zh) ppGpp合成酶及用于改善目的蛋白产生的表达系统
CN1179042C (zh) α-琼脂糖酶及其生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: SOLVAY TO: ZANLUNCO INTERNATIONAL CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address

Address after: American New York

Applicant after: Genencor International, Inc.

Address before: Brussels

Applicant before: Solvay & Cie

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CX01 Expiry of patent term

Expiration termination date: 20131228

Granted publication date: 20010124