CN1249226C - 支链淀粉酶的修饰形式 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于淀粉工业的修饰的支链淀粉酶。本发明提供了制备修饰的支链淀粉酶的方法，包含修饰的支链淀粉酶的酶组合物以及糖化淀粉的方法，包括使用该酶组合物。

Description

支链淀粉酶的修饰形式
发明领域
本发明涉及支链淀粉酶的修饰形式，其保留了催化α-1.6糖苷键水解的能力，涉及含修饰的支链淀粉酶的组合物，涉及制备修饰的支链淀粉酶的方法，以及利用修饰的支链淀粉酶特别是用于淀粉糖化的方法。
本发明的背景
淀粉是主要组分为线性直链淀粉和分支支链淀粉的葡萄糖聚合物，可经过在如下两个阶段中进行酶加工将其被转化为简单糖：一个阶段是淀粉的液化，一个阶段是液化淀粉的糖化。为了获得淀粉的高转化率，已使用支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，α-糊精6-葡聚糖水解酶，也称为α-1.6-葡糖苷酶)催化α-1.6-糖苷键的水解。
本领域中支链淀粉酶包括那些已知在酸性pH具有最优活性的酶和那些在碱性pH具有活性的酶。本领域中所述支链淀粉酶包括来自Bacillusacidopullulytics的菌株的支链淀粉酶，其在60℃，pH4-5时具有最优活性(美国专利4,560,651)；来自长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)的支链淀粉酶，其在60℃约pH5下具有最大活性，且在温度约62.5℃，pH4.5时有最大活性(美国专利5,055,403)；来自Bacillus sectorramus的支链淀粉酶，最适pH为5.0-5.5，最适温度为50℃(美国专利4,902,622)；以及来自短芽孢杆菌(Bacillus brevis)PL-1的支链淀粉酶，在60℃，pH4.5-5.5时有活性(JP 04/023985)。
支链淀粉酶可与葡糖淀粉酶或β-淀粉酶一起用于制备高葡萄糖和高麦芽糖糖浆。除了增加糖产量，支链淀粉酶减少反应时间，允许高底物浓度以及可使葡糖淀粉酶的使用减少高达50％(Bakshi等，1992，生物工程通讯(Biotechology Letters)，14：689-694)。
发明概述
本发明涉及发明人的令人惊讶和出人意料的发现，即修饰的支链淀粉酶保持了催化α-1，6-糖苷键水解的能力。本发明提供了修饰的支链淀粉酶以及制备修饰的支链淀粉酶的方法，特别是在重组宿主微生物中。本发明还涉及包含用于淀粉糖化之修饰的支链淀粉酶的酶组合物，以及用于淀粉糖化的方法，包括酶组合物的使用。
本发明部分基于这样的发现，即获自Bacillus deramificans的支链淀粉酶经重组表达并培养在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中，产生的支链淀粉酶是修饰形式的混合物，但是支链淀粉酶的修饰形式出人意外地保留催化α-1，6-糖苷键水解的能力。所述修饰形式包括在氨基端截短的B.deramificans支链淀粉酶，即具有自氨基端的氨基酸缺失；以及在成熟支链淀粉酶的氨基端有添加氨基酸的B.deramificans。因此，一方面本发明提供这样的修饰的支链淀粉酶，其具有从可获自革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物中的支链淀粉酶之氨基端上的氨基酸缺失，只要修饰的支链淀粉酶保持催化α-1，6-糖苷键水解的能力。另一方面，本发明提供了这样的修饰的支链淀粉酶，其具有从可获自革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物中的支链淀粉酶之氨基端上的氨基酸添加，只要修饰的支链淀粉酶保持催化α-1，6-糖苷键水解的能力。本发明还包括可获自革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物的支链淀粉酶的氨基酸变体，只要修饰的支链淀粉酶保持催化α-1，6-糖苷键水解的能力。
在一个实施方案中，修饰的支链淀粉酶是可获自克雷伯氏菌属的(Klebsiella)种的支链淀粉酶的修饰。在另一实施方案中，修饰的支链淀粉酶是可获自芽孢杆菌属的(Bacillus)种的支链淀粉酶的修饰。在另一实施方案中，修饰的支链淀粉酶是可获自如下芽孢杆菌的支链淀粉酶的修饰，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，B.deramificans，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，长野芽孢杆菌，B.flavocaldarius，B.acidopullulyticus，芽孢杆菌属的种APC-9603，B.sectorramus，蜡状芽孢杆菌(B.cereus)，B.fermus。在一个优选实施方案中，修饰的支链淀粉酶是可获自B.deramificans的支链淀粉酶的修饰，该菌株称为T89.117D(LMG P-13056)，于1993年6月21日保藏于LMG培养物中心，Ghent大学，微生物实验室，K.L.Ledeganckstratt 35，B-9000GHENT，比利时。
在一个实施方案中，修饰的支链淀粉酶具有自支链淀粉酶氨基端约100个氨基酸的缺失。在另一实施方案中，修饰的支链淀粉酶具有从支链淀粉酶氨基端约200个氨基酸的缺失，而在又一实施方案中，修饰的支链淀粉酶具有从支链淀粉酶氨基端约300个氨基酸的缺失。
在又一实施方案中，修饰的支链淀粉酶具有从可获自B.deramificans的支链淀粉酶之氨基端98个氨基酸的缺失。在另一实施方案中，修饰的支链淀粉酶具有从可获自B.deramificans的支链淀粉酶之氨基端约102个氨基酸的缺失。在又一实施方案中，修饰的支链淀粉酶具有在可获自B.deramificans的支链淀粉酶之氨基端至少一个添加的氨基酸。在另一实施方案中，修饰的支链淀粉酶具有在可获自B.deramificans的支链淀粉酶之氨基端上添加了一个氨基酸丙氨酸。
分子量减少的支链淀粉酶的修饰形式提供了较高比活性(活性/单位重量)的优点，因此在糖化步骤中，与使用获自或由微生物产生和天然支链淀粉酶以达到同样结果相比，所需的支链淀粉酶活性的重量少。此处教导的修饰的支链淀粉酶的重组生产提供了包含至少60％和至少80％支链淀粉酶活性的酶组合物。在一个实施方案中，酶组合物包括至少一种修饰的支链淀粉酶。在另一实施方案中，酶组合物包含一种以上的修饰的支链淀粉酶。由于它们可在缩短的糖化时间内产生高葡萄糖产量而没有与副反应产物相伴的葡萄糖产量减少这种的能力，这类酶组合物对于淀粉加工工业是有利的。此外，意外发现在使用包含20％葡糖淀粉酶和80％支链淀粉酶的酶组合物时，可在糖化步骤内使用更高的起始溶解性固体(DS)，由此可增加工厂的生产能力而无需增加设备。此外，含有更高的溶解固体的糖化增加了机械压力的容量，由此提供更为节能的工艺。
在一个实施方案中，本发明提供了通过如下方法制备的修饰的支链淀粉酶，该方法包括获得包含编码成熟支链淀粉酶的重组宿主细胞，在适于修饰的支链淀粉酶产生的条件下培养该宿主细胞，且任选地回收修饰的支链淀粉酶。在一个实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属的，包括但不局限于枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌(B.lentus)，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，凝结芽孢杆菌(B.coagulans)，环状芽孢菌(B.circlulans)，灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。在一个优选实施方案中，芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌，其包括编码Carlsberg蛋白酶的第一基因和编码内切Glu C的第二基因，在芽孢杆菌属的种中编码蛋白酶的第一和/或第二基因已被改变，使得蛋白酶活性基本被消除，还包括编码成熟支链淀粉酶的核酸，其可从B.deramificans中获得。
在另一个可选实施方案中，本发明提供了在重组宿主细胞中用于制备修饰的支链淀粉酶的方法，包括如下步骤：获得包含编码修饰的支链淀粉酶的核酸之重组微生物，在适于生产修饰的支链淀粉酶的条件下培养微生物，任选地回收所产生的修饰的支链淀粉酶。在一个实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物。在另一实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。在另一实施方案中，芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌，其包含编码Carsberg蛋白酶的第一基因，和编码内切Glu C的第二基因，在芽孢杆菌属的种中编码蛋白酶的第一和/或第二基因已被改变，使得蛋白酶活性基本被消除，还包括编码修饰的支链淀粉酶的核酸，其为可获自B.deramificans的支链淀粉酶的修饰形式。
本发明也提供一种包含编码修饰的支链淀粉酶的多核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，核酸与编码可获自B.deramificans的支链淀粉酶之示于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的相同性。本发明还提供了表达载体，以及包含编码本发明的修饰的支链淀粉酶的核酸之宿主微生物。
本发明提供了包含至少一种本发明修饰的支链淀粉酶的酶组合物。在一个实施方案中，酶组合物包含多种修饰的支链淀粉酶形式。在另一实施方案中，组合物还包括选自葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-糖苷酶、异淀粉酶、环麦芽糖糊精酶、糖基转移酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖异构酶、糖化酶、和/或切割糖苷键的酶中的酶。在一个优选实施方案中，酶组合物包含修饰的支链淀粉酶和葡糖淀粉酶。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶来自曲霉属的种，包括但不限于黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和臭曲霉(Aspergillus foetidus)。酶组合物可为固体或液体形式。在本发明的一个实施方案中，酶组合物中包含至少60％修饰的支链淀粉酶，在另一实施方案中，组合物包含至少80％修饰的支链淀粉酶。
本发明还提供了一种淀粉液化的方法，其中所述方法使糖化回复副产物的浓度降低，方法包括将含有修饰的支链淀粉酶的酶组合物与含水液体化淀粉接触的步骤。在一个实施方案中，方法还包括加热所述液体化淀粉以及回收产物的步骤。在方法的一个实施方案中，酶组合物还包括葡糖淀粉酶，在方法的另一实施方案中，接触是在pH大约等于或低于7.0至等于或高于3的范围中进行，在另一实施方案中，pH为约4.2。在方法的又一实施方案中，所述加热是在温度55至65℃范围内。在另一实施方案中，温度是约60℃。
附图简述
图1A-1E显示编码可获自B.deramificans的支链淀粉酶之成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的核酸(SEQ ID NO：1)。
图2A-2D是可获自B.deramificans(称为pullseqsig.seq.PRO)、枯草芽孢杆菌(称为subpull.seq.pro)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)(称为Klebpnseqsig.seq.pro)的氨基酸序列比较，显示保守结构域和这些支链淀粉酶的氨基端变化性。这个比较也包括各自支链淀粉酶的信号序列。
图3A-3C显示发酵时程和在发酵过程中形成的修饰的支链淀粉酶的多种种类。峰1称为成熟的B.deramificans支链淀粉酶，具有分子量105KD；峰2称为修饰的支链淀粉酶，具有从成熟B.deramificans支链淀粉酶氨基端的102个氨基酸的缺失；峰3称为修饰的支链淀粉酶，如标准HPLC分析，具有从氨基端98个氨基酸的缺失。图3A显示经过37小时的发酵。图3B显示经过60小时的发酵。图3C显示经过70小时的发酵。
图4A-4D显示如标准HPLC分析所测，修饰的支链淀粉酶种类的稳定性为pH的函数。图4A显示室温下pH4.5时24小时的支链淀粉酶稳定性。图4B显示室温下pH5.5时24小时支链淀粉酶的稳定性。图4C显示室温下pH6.5时24小时支链淀粉酶的稳定性。图4D显示室温下pH4.5时96小时支链淀粉酶的稳定性。
图5A-5C显示包括多种支链淀粉酶和葡糖淀粉酶的浓度之酶组合物，对终葡萄糖产生和经过糖化时间后二糖的形成的影响。实线表示含有80％支链淀粉酶活性和20％葡糖淀粉酶的酶混合物(20∶80)，其中支链淀粉酶包括B.deramificans支链淀粉酶的具有氨基端98个氨基酸缺失的修饰的支链淀粉酶；B.deramificans支链淀粉酶的具有氨基端102个氨基酸缺失的修饰的支链淀粉酶；成熟B.deramificans支链淀粉酶和具有氨基端添加氨基酸(丙氨酸)的成熟B.deramificans支链淀粉酶。点划线表示包含具有75％获自曲霉属的种的葡糖淀粉酶及25％获自B.deramificans的成熟支链淀粉酶的酶混合物的酶组合物(75∶25)。带有方框的实线表示用上述含有20％葡糖淀粉酶和80％支链淀粉酶活性的酶混合物(20∶80)在糖化时间后形成的二糖，带有圆形的点划线是指用75∶25的酶混合物在糖化时间后形成的二糖。左边的X-轴是产生的％葡萄糖，右边的X-轴是％二糖。图5A表示每吨溶解的固体中使用0.550升酶组合物的糖化方法；图5B表示每吨溶解的固体中使用0.635升酶组合物的糖化方法；图5C表示每吨溶解的固体使用0.718升酶组合物的糖化方法。此图显示20∶80酶组合物可增加终葡萄糖产生而不增加不期望的二糖形成。
图6显示在每吨溶解的固体中使用0.55升酶的液化淀粉之糖化过程中(其中酶组合物为20∶80，75∶25和100％葡糖淀粉酶)溶解的固体(％W/W)(Y轴)对终葡萄糖产生的影响。线A是图5A-5C中所述的酶组合物20∶80；线B是酶组合物75∶25；线C是包含100％葡糖淀粉酶的酶组合物。
发明详述
定义
术语支链淀粉酶如此处所述是指任何具有切割淀粉中α-1，6糖苷键以产生直链淀粉的能力的酶。这些酶优选被归类入E.C.3.2.1.41，且包括新支链淀粉酶。
如图2A-2D所示，在从革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物中获得的多种支链淀粉酶之间有相似区域。获自B.deramificans的支链淀粉酶与获自肺炎克雷伯氏菌及枯草芽孢杆菌的支链淀粉酶的氨基酸比较揭示，当排列比较保守结构域时，不与保守结构域相关的氨基端有多种长度。如此处所用，术语“修饰的”当用来指支链淀粉酶时表示一种支链淀粉酶，其中保留保守结构域，而不与保守结构域相关的天然存在之氨基酸序列的氨基端部分之任何氨基酸长度可被改变，这可通过这些氨基酸残基的缺失或向氨基端添加至少一个氨基酸来完成，只要修饰的支链淀粉酶保持了催化α-1，6-糖苷键水解的能力。支链淀粉酶之氨基端的缺失可为多种长度，但至少为3个氨基酸的长度，但缺失不能超过第一个保守结构域的起点，在B.deramificans支链淀粉酶中为在310位氨基酸残基的酪氨酸，如图1A-1E所示。在一个实施方案中，缺失是从成熟支链淀粉酶的氨基端约100个氨基酸。在另一实施方案中，缺失是从成熟支链淀粉酶的氨基端约200个氨基酸，在另一实施方案中，缺失是从成熟支链淀粉酶的氨基端约300个氨基酸。在一个优选实施方案中，修饰是B.deramificans支链淀粉酶氨基端98个氨基酸的缺失。在另一实施方案中，缺失是B.deramificans支链淀粉酶氨基端102个氨基酸的缺失。在又一实施方案中，修饰是在可获自B.deramificans的天然存在的成熟支链淀粉酶的氨基端添加至少一个氨基酸。在又一优选实施方案中，将氨基酸残基丙氨酸添加至成熟支链淀粉酶的氨基端。如此处所用，术语“成熟”是指包括在信号序列天然切割位点后的N-末端氨基酸残基的蛋白质。
如图2A-2D所示，B.deramificans支链淀粉酶和肺炎克雷伯氏菌支链淀粉酶是具有相似性的支链淀粉酶的例子，其在直至第一个保守结构域的起始处(在B.deramificans中为第310氨基酸残基酪氨酸)的氨基端长度上相似。如图2B所示，在直至第一个保守结构域起点的氨基酸残基长度较短的支链淀粉酶例子是枯草芽孢杆菌支链淀粉酶。
如此处所用，“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列或其片段或部分，以及可以是双链或单链的基因组或合成来源的DNA或RNA，或代表有义链，或代表反义链。如此处所用，“氨基酸”是指肽或蛋白质序列或其部分。本发明包括与编码B.deramificans支链淀粉酶的多核苷酸以及与编码支链淀粉酶活性的多核苷酸(其在高度严格条件下可与编码B.deramificans支链淀粉酶的核酸杂交)至少具有70％、至少80％、至少90％和至少95％相同性的多核苷酸。
术语“分离的”或“纯化的”如此处所用，是指与其天然结合的至少一种成分被去除的核酸或氨基酸。
优选实施方案的详细描述
本发明涉及这样的发现：在芽孢杆菌宿主中重组生产的支链淀粉酶被修饰，但出人意料地保持催化α-1，6-糖苷键水解的能力。对重组生产的支链淀粉酶产物的修饰似乎是信号肽对信号序列的错误加工，以及对胞外蛋白裂解加工的敏感性的结果。修饰的支链淀粉酶用于制备用在淀粉工业中的组合物及方法。
1.支链淀粉酶序列
本发明包括任何保持催化α-1，6-糖苷键水解能力的修饰的支链淀粉酶。本领域中已描述了多种支链淀粉酶，包括从革兰氏阳性微生物及革兰氏阴性微生物中获得的或天然产生的那些。天然产生支链淀粉酶的微生物包括但不限于公开于图1A-1E中的核酸(SEQ ID NO：1)和氨基酸(SEQ ID NO：2)序列的支链淀粉酶的B.deramificans(称为T89.117D，保藏于LMG培养物保藏中心，Ghent大学，微生物学实验室-K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000，Ghent，比利时)；公开于在1991年10月8日授权的美国专利5,056,403中的长野芽孢杆菌(美国典型培养物保藏中心，ATCC保藏号53909)；公开于1985年12月24日授权的美国专利4,560,651中的B.acidopullulytics(工业细菌保藏中心，Torry ResearchStation，Aberdeen，苏格兰，NCIB 11607，NCIB11610，NCIB11611，NCIB11636，NCIB11637，NCIB11639，NCIB11638，NCIB11647，NCIB11777)；公开了1998年2月20日授权的美国专利4,902,622中的B.sectorramus(发酵研究所，工业科技部，1-3，Higashi 1-Chome，Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki 305，日本，FERM BP-1471)；公开于1995年2月7日授权的美国专利5,387,516中的芽孢杆菌FERM BP-4204；嗜热脂肪芽孢杆菌(SWISS-PROT id NEPU-BACST acP38940)；公开于Y.Takasaki等人，农业生物化学(Agric，Biol.Chem)40：1515中的蜡状芽孢杆菌var mycoides(IFO 300)；B.fermus(IFO3330)；肺炎克雷伯氏菌，美国专利3,897,305(SWISS-PROT id PULA-KLEPN ac P07206)和ATCC15050；产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)(SWISS-PROT id PULA-KLEAE ac P07811)；布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)(ATCC NO，33705)，美国专利4,628,028；在M.Yagisawa等1972，发酵技术杂志(J.Ferment.Technology)50：572中所述的链霉属的种(Streptomyces sp.)；在Albertson等，1997年，生物化学与生物物理学学报(Biochimicaet Biophysica Acta 1354：35-39)中公开的解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolytics)；中间埃希氏菌(Eschericia intermedia)，Ueda等，1967应用微生物学(AppliedMicrobiology)15：492，美国专利3,716,455(1973年授权)；缓症链球菌(Streptococcus mites)，Walker 1968，生物化学杂志(Biochem.J.)108：33；放线菌属(Ueda.等，1971，发酵技术杂志，49：552)；美国专利4,902,622中所述的Flavochromogenes；日本专利申请Kokoku 18826(1973，酯香黄杆菌(Flavobacterium esteromaticum)；1974年授权的美国专利3,790,446，Cytophaga；乳杆菌属(Lactobacillus)，微球菌属(Micrococcus)，诺卡氏菌属(Nocardia)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，Azotobactger，Sarcina，英国专利11260418，美国专利3,827,940(1974年授权)；以及放线菌属(Actinomycetes)，1973年授权的美国专利3,741,873。任何本领域中已知的支链淀粉酶如图2A至2D所示包括保守的支链淀粉酶区域，该支链淀粉酶可经修饰以在氨基端具有缺失或添加，只要修饰的支链淀粉酶保持催化α-1，6-糖苷键水解的能力。
利用杂交技术，使用编码支链淀粉酶保守性结构域(如图2A-2D所示)的核酸序列作为探针和/或引物，可从微生物中获得编码支链淀粉酶的核酸序列(美国专利，5,514,576；Southern，E.1979，酶学方法(MethodsEnzymol.)68：152-176；Saiki等，1988，科学239：487-491)。在此处公开的关于B.deramificans支链淀粉酶的一个实施方案中，将编码成熟支链淀粉酶的天然存在的核酸(SEQ ID NO：1)导入具有Carlsberg蛋白酶和内切Glu C蛋白酶缺失的地衣芽孢杆菌中(Jacobs.等，1985，核酸研究(Nudeic Acid Research)13：8913-8926)(Kakudo等，1992，生物化学杂志(J.Bio.Chem)267：23782-23788)，将包含编码成熟支链淀粉酶的核酸之地衣芽孢杆菌在适于所述核酸表达及适于表达的支链淀粉酶分泌的条件下，培养地衣芽孢杆菌。通过本领域中公知的技术制造地衣芽孢杆菌中的蛋白酶缺失。经过发酵，表达的支链淀粉酶经过胞外切割，成为保持催化α-1，6-糖苷键水解能力的多种支链淀粉酶。所述多种支链淀粉酶是一种自氨基端起缺失前98个氨基酸且起始于谷氨酸的支链淀粉酶，一种自氨基端起缺失前102个氨基酸的(起始于谷氨酸)的支链淀粉酶，和一种具有向成熟支链淀粉酶的氨基端添加至少一个氨基酸的支链淀粉酶，以及如图1A-1E中所示的成熟支链淀粉酶。如实施例II所示，似乎胞外切割成为多种支链淀粉酶是由于发酵液中的蛋白酶活性。
在本发明的另一实施方案中，编码成熟支链淀粉酶的核酸经基因工程化以产生在氨基端具有氨基酸缺失或在氨基端具有氨基酸添加的修饰的支链淀粉酶。将基因工程化的支链淀粉酶导入宿主细胞，优选为芽孢杆菌宿主细胞，在适于表达和分泌修饰的支链淀粉酶的条件下培养。编码成熟支链淀粉酶的核酸可以是天然存在的序列，核酸序列的变体形式，且可为任何来源，无论是天然的、合成的或是重组的。
淀粉降解酶中的区域性序列同源性已公开于Janse等人(1993)，当代遗传学，24：400-407。Janse公开了α-淀粉酶中的保守性区域，其包含于底物结合区、催化区和钙结合区。图2A-2D中显示了B.deramificans、枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌支链淀粉酶的氨基酸排列比较。
当Janse等在淀粉降解酶中比较同源性时，有四个称为区域1、2、3和区域4的保守性区域。其中三个区域与见于淀粉降解酶中的特定功能相关：区域1：DVVINH；区域2：GFRLDAAKH；以及区域4：FVDVHD。通过Albertson等人(1997，生物化学与生物物理学通报，1354：35-39)，对五种I型支链淀粉酶序列的进一步分析，发现了在一组革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物中的支链淀粉酶的其它保守区域，这些区域包括称为DPY、A、B、C、D、E和YNWGY的区域。DPY和YNWGY这两个区域已被鉴定为真支链淀粉酶的特征。如淀粉酶定义，保守性区域A-E与β-片层元件排列比较紧密相关。此外，图2A-2D中称为Y和VWAP的靠近支链淀粉酶之N-端的两个其它保守性区域，表明通常支链淀粉酶N末端中氨基酸截短的局限。这一预言基于这样的情况：除了Y区在N-末端之前，在已知支链淀粉酶中未见更多的相同性的保守性区域。由于已知支链淀粉酶的体积差异性，Y区域之前的N端在大约100-300个氨基酸之间变化。对于B.deramificans支链淀粉酶，309个残基的截短可使第一个保守性区域(图1A-1E中Y在310位氨基酸)完整。
B.deramificans支链淀粉酶.
成熟B.deramificans支链淀粉酶包含示于图1A-1E的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。下列特征性描述是指成熟B.deramificans支链淀粉酶。B.deramificans支链淀粉酶具有4.1-4.5之间的等电点，其为热稳定的，且在宽温度范围内有活性。在酸性pH下B.deramificans支链淀粉酶有活性。此种支链淀粉酶能催化支链淀粉amylopectin和pulluan中均存在的α-1，6-糖苷键的水解。其可降解支链淀粉pullan为麦芽三糖，而将支链淀粉amylopectin降解为直链淀粉。通过Ueda等，应用微生物学，11：211-215，1963，的方法可从Aureobasidium pullulans(Pullaria pullulans)获得多糖支链淀粉(pullulan)，其是麦芽三糖单位通过α-1，6-键相互连接的多聚物。
B.deramificans支链淀粉酶水解支链淀粉(amylopectin)形成寡糖(麦芽寡糖)。在此水解过程中，观察到由约13个葡萄糖单位(聚合度13，此分子也称为“链A”)组成的寡糖的形成，随后为约47个葡萄糖单位组成的寡糖(聚合度47，此分子也称为“链B”)的形成。
参照D.J.MANNERS(“研究谷物类碳水化合物的新方法”中的“通过去支链酶对淀粉成分的结构性分析”，Amsterdam，1985，45-54页)和B.E.ENEVOLDSEN(“研究谷物类碳水化合物的新方法”中“关于淀粉的精细结构”，Amsterdam，1985，55-60页)。
B.deramificans支链淀粉酶水解马铃薯支链淀粉(amylopectin)。此水解可用支链淀粉水溶液在支链淀粉酶存在下于支链淀粉酶的最适活性条件下进行，即在约60℃温度和约pH4.3的条件下。
B.deramificans支链淀粉酶催化麦芽糖缩合反应以形成tetraholosides(具有4个葡萄糖单位的寡糖)。
B.deramificans支链淀粉酶的半寿期约55小时，这是在约60℃温度于缓冲在约pH4.5的溶液中及底物存在下测定的。
半寿期是指在约60℃温度于缓冲在约pH4.5的溶液中及底物存在下温育55小时测量，显示至少50％相对酶活性的支链淀粉酶。
在酸性pH下B.deramificans支链淀粉酶是热稳定的，在60℃温度于缓冲在pH约4.5的溶液中及底物存在下经40小时温育后测量，其显示有至少55％的相对酶活性。在相同条件下温育24小时后测量，显示至少70％的相对酶活性。
相对酶活性是指在给定pH、温度、底物和持续条件下进行的测试过程中测量的酶活性，与在相同测试条件过程中测量的最大酶活性之间的比率，从支链淀粉的水解开始测量酶活性，而最大酶活性人为固定在100。
而且，B.deramificans支链淀粉酶在宽酸性pH范围中也稳定。在下述条件下，其在pH高于或等于3时有活性。事实上，在pH高于或等于约3.5的范围中，底物不存在下于约60℃温度时温育60分钟后测量，B.deramificans支链淀粉酶显示至少85％的相对酶活性。
在下述条件下，其在pH低于或等于7时有活性。事实上，在pH低于或等于约5.8的范围中，底物不存在下于约60℃温度下温育60分钟后测量，B.deramificans支链淀粉酶显示至少85％的相对酶活性。
在相同条件下于pH范围约3.8至约5之间测量，其优选显示相对酶活性高于90％。
在温度约60℃，pH范围大于pH4.0时测量，B.deramificans支链淀粉酶形成最优酶活性。在温度约60℃，pH低于4.8范围时测量，其形成最优酶活性。在温度约60℃，pH约4.3时测量，B.deramificans支链淀粉酶优选地形成最优酶活性。此外，在pH约4.3，在温度范围55到65℃之间，特别是在60℃时，其形成最优酶活性。
在温度约60℃，pH范围在约3.8到约4.9之间，B.deramificans支链淀粉酶形成高于最大酶活性的80％的酶活性(在60℃温度和pH4.3时测定为最大酶活性)。
B.deramificans菌株T89.117D已于1993年6月21日依布达佩斯条约保藏于比利时标准微生物保藏中心(LMG培养物保藏中心，Ghent大学，微生物学实验室，KL.Ledeganckstraat 35，B-9000GHENT，比利时)，保藏号LMG P-13056。
II 表达系统
本发明提供了用于在革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物中生产和分泌修饰的支链淀粉酶的宿主细胞、表达方法和系统。在一个实施方案中，宿主细胞通常经基因工程改造以包含编码修饰的支链淀粉酶的核酸。在另一实施方案中，宿主细胞经基因工程改造以包含编码全长或成熟支链淀粉酶的核酸，其经培养产生修饰的支链淀粉酶。在一优选实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属的一员，其已经过修饰以具有内源蛋白酶的突变或缺失。
宿主细胞中蛋白酶的失活
不能产生天然存在的蛋白酶之表达宿主细胞的制备，需要将该宿主细胞基因组中天然存在的基因替换和/或失活。在一优选实施方案中，突变是不可逆突变。
一种突变编码蛋白酶的核酸的方法是克隆该核酸或其部分，通过定点突变修饰该核酸，在质粒上将突变了的核酸重新导入细胞。通过同源重组，该突变的基因可导入染色体。在亲本宿主细胞中，造成天然存在的核酸与突变的核酸在染色体上串联分布。经过第二次重组，修饰的序列留在染色体中，借此将该突变有效导入亲本宿主细胞之子代的染色体中。
另一种失活蛋白酶蛋白裂解活性的方法是通过删除染色体基因拷贝。在一个优选实施方案中，删除了整个基因，以这样方式进行的删除使回复不可能发生。在另一优选实施方案中，进行部分删除，只要留在染色体中的核酸序列足够短，从而不能与编码金属蛋白酶基因的质粒发生同源重组。在另一优选实施方案中，删除了编码催化性氨基酸残基的核酸。
可如下进行天然存在的微生物蛋白酶的删除。分离包括其5′和3′区的蛋白酶基因，并插入克隆载体，体外从克隆载体上删除蛋白酶基因的编码区，留下足够量的5′和3′侧翼序列，以供在亲体宿主细胞中与天然存在的基因进行同源重组。然后将该载体转化入宿主细胞。通过在侧翼区的同源重组将该载体整合入染色体。由此方法得到其中蛋白酶基因被删除了的菌株。
用于整合方法的载体优选的是质粒。其中可包括一种选择性标记以便于鉴定所希望的重组微生物。此外，如本领域技术人员所知晓的，载体优选的是可选择性整合到染色体上的那种。这可通过向质粒中导入一种可诱导的复制起点来实现，如一种温度敏感型起点。通过在该复制起点敏感的温度下培养所述转化子，使该质粒的复制功能失活，由此提供了一种筛选染色体整合子的方法。可通过在选择性标记如一种抗生素存在下于高温中生长筛选整合子。整合机制如WO88/06623中所述。
经坎贝尔型(Campbell-type)机制的整合可在蛋白酶基因的5′侧翼区发生，得到在支链淀粉酶基因座的染色体中带有完整质粒载体的蛋白酶阳性菌株。由于错误的重组会产生不同的结果，因此需确定全部基因是否已被删除，例如通过核酸测序或限制性图谱。
另一种失活天然存在的蛋白酶基因的方法是，通过用致突变的寡核苷酸转化微生物从而突变染色体基因拷贝。或者，可通过同源重组用突变基因置换染色体蛋白酶基因。
本发明涵盖具有蛋白酶缺失或突变的芽孢杆菌宿主细胞，诸如在apr、npr、epr、mpr、isp和/或bpf和/或其它本领域人员周知的位置中的缺失或突变。涉及革兰氏阳性微生物芽孢杆菌的蛋白酶缺失的公开可见于美国专利申请5,264,366；5,585,253；5,620,880和欧洲专利EP0369817B1。
一种突变体的检测包括：在含有蛋白酶底物的培养基上培养芽孢杆菌宿主细胞，测量菌落周围出现(或不出现)透明或空白的区带。带有失活蛋白酶的宿主细胞的菌落周围几乎没有或没有空白区带。
III.修饰的支链淀粉酶的制备
为了在宿主细胞中制备修饰的支链淀粉酶，在适于表达修饰的支链淀粉酶的条件下，将带有至少一个编码修饰的支链淀粉酶的核酸之拷贝的表达载体(优选带有多个拷贝的载体)转化入宿主细胞。依本发明，可采用编码修饰的支链淀粉酶的多核苷酸或融合蛋白，或是编码修饰的支链淀粉酶氨基酸变体的多核苷酸同系物(只要变体保留催化α-1，6-糖苷键水解的能力)，以产生指导在宿主细胞中表达的重组DNA分子。宿主细胞可为革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，宿主细胞属于芽孢杆菌属。在另一实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。在一个优选实施方案中，革兰氏阳性宿主细胞是地衣芽孢杆菌。
如本领域技术人员理解，产生拥有非天然存在的密码子的多核苷酸序列可能是有利的。例如，可选择特定革兰氏阳性宿主细胞优选的密码子(Murray E.等(1989)核酸研究17：477-508)，以增加具有希望的性质(如较长的半寿期)的重组RNA转录子相比于由天然存在的序列产生的转录子之产生速率或表达速率。
可用于本发明的改变的支链淀粉酶多核苷酸序列包括：产生编码相同或功能上等同的修饰的支链淀粉酶之多核苷酸的不同核苷酸残基的删除、插入或替换。如此处所用“删除”定义为核苷酸或氨基酸序列中的改变，其中分别有一个或多个核苷酸或氨基酸残基不存在。
如此处所用“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列的改变，相对于天然存在的修饰的支链淀粉酶而言，其分别造成一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加。
如此处所用，“替换”是分别由不同的核苷酸(或氨基酸)替代一个或多个核苷酸(或氨基酸)造成的。
编码的蛋白质也可显示氨基酸残基的删除、插入或替换，其产生沉默突变，且造成功能上等同的修饰的支链淀粉酶。有意的氨基酸替换可以基于残基极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性上的相似性来进行，只要变体保留调节分泌的能力。例如带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺；谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
为了修饰基因产物的克隆、加工和/或表达，可以工程化编码本发明修饰的支链淀粉酶的多核苷酸。例如，利用本领域中周知的技术可引入突变，如定点突变插入新限制性位点，改变例如糖基化模式或改变密码子偏好。
在本发明一个实施方案中，编码修饰的支链淀粉酶的多核苷酸可连接于异源序列以编码融合蛋白。融合蛋白也可经工程化以含有位于修饰的支链淀粉酶核苷酸序列和异源蛋白质序列之间的切割位点，从而使修饰的支链淀粉酶可从异源融合伴侣上切割下来并纯化。
IV 载体序列
用于在宿主微生物中表达本发明支链淀粉酶的表达载体包含至少一个与修饰的支链淀粉酶结合的启动子，该启动子在宿主细胞中有功能。在本发明的一个实施方案中，启动子是对于所选支链淀粉酶而言野生型的启动子，在本发明另一实施方案中，对于支链淀粉酶而言启动子是异源的，但在宿主细胞中仍有功能。在本发明的一个实施方案中，编码修饰的支链淀粉酶的核酸稳定地整合入微生物基因组中。
在一个优选的实施方案中，表达载体含有多重克隆位点盒，其优选地包含至少一个对于载体为唯一的限制性内切酶位点，以便于核酸操作。在一优选实施方案中，载体也包含一种或多种选择性标记。如此处所用，术语选择性标记是指一种能在宿主中表达的基因，其允许容易地筛选含有这种载体的那些宿主。这种选择性标记的例子包括仅不限于抗生素，如红霉素、放线菌素、氯霉素和四环素。
V 转化
多种宿主细胞可用于生产修饰的支链淀粉酶，包括细胞、真菌、哺乳动物和昆虫细胞。一般的转化步骤在分子生物学现代方法中有教导(Ausubel编，卷1，John Wiley & Sons，Inc.1987，第9章)，并包括磷酸钙法、利用DEAE-葡聚糖的转化法和电穿孔法。植物转化方法在Rodriquez(WO 95/14099，公开于1995年5月26日)中有教导。
在一优选实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性微生物，在另一实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌。在又一优选实施方案中，芽孢杆菌宿主是地衣芽孢杆菌。在本发明的一个实施方案中，将编码本发明修饰的支链淀粉酶的核酸导入宿主细胞，这是通过能在芽孢杆菌宿主细胞中复制的表达载体进行。对于芽孢杆菌合适的复制质粒在“芽孢杆菌分子生物学方法”中有描述，(Harwood和Cutting编，John Wiley & Sons，1990)，在此引入作为参考；见关于质粒的第3章。适于枯草芽孢杆菌的复制质粒列于第92页。
在另一实施方案中，编码本发明的修饰的支链淀粉酶之核酸被稳定整合入宿主微生物基因组。优选的宿主细胞是革兰氏阳性宿主细胞。另一优选的宿主是芽孢杆菌。芽孢杆菌宿主细胞包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。优选的宿主是枯草芽孢杆菌。另一优选的宿主是地衣芽孢杆菌。文献中已有许多关于在芽孢杆菌中DNA克隆的几种策略的描述。质粒标记拯救转化包括：带有部分同源驻留质粒的感受态细胞对供体质粒的吸收(Contente等，质粒2：555-571(1979)；Haima等分子普通遗传学223：185-191(1990)；Winrach等，细菌学杂志，154(3)：1077-1087(1983)；及Weinranch等，细菌学杂志169(3)：1205-1211(1987)。进入的供体质体以模拟染色体重组的方法与驻留的“辅助”质粒同源区重组。
枯草芽孢杆菌通过原生质体转化描述于Chang和Cohen(1979)，分子普通遗传学168：111-115；对于巨大芽孢杆菌的转化见于Vorobjeva等(1980)FEMS微生物通讯7：261-263；对于解淀粉芽孢杆菌见于Smith等，(1986)应用和环境微生物51：634；对于苏云金芽孢杆菌，见于Fisher等(1981)，微生物学文献139：213-217；对于球形芽孢杆菌(B.sphaericus)，见于McDonald(1984)普通微生物学杂志130：203；和B.larvae见于Bakhiet等(1985)，应用与环境微生物，49：577)，Mann年(1986，当代微生物学13：131-135)报道了对芽孢杆菌原生质体的转化，及Holubova(1985)傅里叶微生物(Folia Microbiol.30：97)公开了利用含DNA的脂质体将DNA导入原生质体中的方法。
VI 转化子的鉴定
通过检测标记基因表达与否提示宿主细胞是否已由编码支链淀粉酶活性的修饰的或天然存在的基因转化，是否存在目的基因，但是应证实其表达。例如，如果编码修饰的支链淀粉酶的核酸插入到标记基因序列中，可通过标记基因功能的丧失鉴别含有插入物的重组细胞。或者，可将标记基因与在单个启动子控制下的编码支链淀粉酶的核酸串联放置。应答诱导或筛选的标记基因的表达通常表明支链淀粉酶也表达。
或者，可通过本领域普通技术人员周知的多种方法鉴定含有修饰的支链淀粉酶编码序列并表达该蛋白质的宿主细胞。这些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交，和蛋白质生物检测或免疫检测技术，包括用以检测和/或定量核酸或蛋白质的基于膜的、基于溶液的或基于芯片的技术。
可通过利用探针、支链淀粉酶多核苷酸序列的部分或片段的DNA-DNA杂交或DNA-RNA杂交或者扩增，检测宿主微生物中支链淀粉酶多核苷酸序列存在与否。
VII 支链淀粉酶活性检测
本领域普通技术人员知晓有多种检测和测定支链淀粉酶活性的检测法。B.deramificans支链淀粉酶酶单位(PUN)定义为在pH4.5、温度60℃及支链淀粉存在下，催化每分钟以1μM葡萄糖当量的速率释放还原糖的酶量。
可在存在或不存在底物时测量支链淀粉酶活性。一方面，可根据如下方法在存在支链淀粉时测量支链淀粉酶活性。60℃下温育1ml 50nM乙酸缓冲液中1％浓度的支链淀粉溶液10分钟，向其中加入0.1ml相当于0.2-1PUN/ml活性的支链淀粉酶溶液。15分钟后通过加入0.5M NaOH4ml终止反应。通过SOMOGY1-NELSON方法分析释放的还原糖(生化杂志，153(1944)。375-380，生化杂志(1945)，61-68)。
可用另一方法分析支链淀粉酶。依上述测试条件在支链淀粉酶存在下进行酶促反应，然后通过加入硫酸(0.1N)终止。为了分离各种组分，用HPLC色谱(HPX-87H柱，Bio-RAD；流动相为10mM H2SO4)处理支链淀粉的水解产物。由测量获得的峰面积评估形成的麦芽三糖的量。
所谓去分支活性，即存在于支链淀粉(amylopectin)中的α-1，6-糖苷键的水解，可通过如下方法定量：即在碘存在下通过从支链淀粉中释放的直链淀粉所引起的蓝色生成增加。根据如下方法测量去分支酶活性：pH4.5 60℃下温育0.4ml的50mM乙酸缓冲液中含1％支链淀粉溶液10分钟。通过加入0.2ml支链淀粉酶启动反应，30分钟后通过加入0.4ml的0.3M HCl终止反应。然后向0.2ml这种反应混合物中加入0.8ml0.0025％(V/V)浓度的碘溶液，于565nm测量光密度。
一种优选方法公开于实施例IV，且依赖所用的测定支链淀粉酶活性的可溶性红色支链淀粉底物的比色法。随着支链淀粉酶水解底物，染色的底物之可溶性片段就释放到反应溶液中。然后用乙醇溶液沉淀底物，用分光光度计测量上清液的色密度。在这种检测中，色密度的程度与酶活性成比例。
VIII 重组蛋白质的分泌
测定修饰的支链淀粉酶在宿主微生物中的分泌水平以及检测分泌蛋白质的方法包括使用特异于该蛋白质的单克隆或多克隆抗体。实施例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。这些和其它检测述于Hampton R等(1990，血清学方法实验室手册，APS出版社，St Paul M)和Maddox DE等(1983，实验医学杂志(J.Exp.Med)158：1211)等处。
本领域技术人员周知标记和偶联技术的多种变体形式，可用于多种核酸和氨基酸检测。制备用于检测特定多核苷酸序列的标记的杂交探针或PCR探针的方法包括：oligo标记、缺口翻译、末端标记或使用标记的核苷酸的PCR扩增。或者，可将核苷酸序列或其任一部分克隆入载体，用于制备mRNA探针。这种载体为本领域周知且可购得，可经添加合适的RNA聚合酶(如T7、T3或SP6和标记的核苷酸)用于体外合成RNA探针。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(MadisonWI)和US Biomedical Corp(Cleveland OH)提供用于这些方法的商业试剂盒和步骤。适合的报告基因分子或标记包括放射性核素、酶、荧光物、化学发光物或发色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。教导使用这种标记的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。还有重组免疫球蛋白可如美国专利4,816,567所示制备，且此处引入作为参考。
IX 蛋白质纯化
可在适于表达和从细胞培养液中回收支链淀粉酶的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞已用编码修饰的支链淀粉酶的多核苷酸序列转化。由重组革兰氏阳性宿主细胞产生的蛋白质将被分泌到培养液中，其中宿主细胞的内源蛋白酶活性被突变或删除。其它重组构建方法可以将修饰的支链淀粉酶多核苷酸序列与编码种多肽结构域的核苷酸序列连接起来，这会有助于可溶性蛋白质的纯化(Kroll DJ等，(1993)DNA细胞生物学(DNA Cell Biol.)12：441-453)。
合适的助于纯化的结构域包括但不限于，金属鳌合肽，如组氨酸-色氨酸结构，其有助于在固定化金属上纯化(Porath J.(1992)蛋白质实验纯化(Protein Expr.Purif.)3：263-281)，允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统中应用的结构域(Immunex Corp，Seattle，WA)。可在纯化结构域和异源蛋白质之间包含有可切割接头序列(如第XA因子或肠激酶(Invitrogen，San Diego，CA)，以便于纯化。
X 本发明修饰的支链淀粉酶的应用
本发明修饰的支链淀粉酶可用于多种工业，包括食品工业、医药工业和化学工业。修饰的支链淀粉酶可在焙烤中用作“抗陈化”剂，即可作为添加剂防止面包在贮存时陈化，或可用于制造低热量啤酒的酿造中。支链淀粉酶可用于制造低热量食品，其中直链淀粉用作脂肪的替代品。支链淀粉酶可用于例如使果汁澄清。
对于食品应用而言，支链淀粉酶可固定于支持物上。用于将酶固定化的技术为本领域公知。
支链淀粉酶也可用于水解支链淀粉，且从此支链淀粉形成寡糖。支链淀粉酶也可用于从麦芽糖形成tetraholoside。
支链淀粉酶还可用于缩合单糖或寡糖，产生α-1，6型键。支链淀粉酶也可用于淀粉液化。
修饰的支链淀粉酶可以与其各个非修饰形式一样的方式使用。其非修饰型在碱性条件下有活性的修饰的支链淀粉酶，在碱性条件下仍保持活性。其非修饰型在酸性条件下有活性的修饰的支链淀粉酶，在酸性条件下保持活性。可以依使用目的配制特定的修饰的支链淀粉酶。也可将稳定剂或防腐剂加入到含有修饰的支链淀粉酶的酶组合物中。例如，通过加入丙二醇、乙二醇、甘油、淀粉、支链淀粉、糖(如葡萄糖或山梨醇)、盐(如氯化钠、氯化钙、山梨酸钾和苯甲酸钠)或两种或多种这些物质的混合物，可以稳定修饰的支链淀粉酶。依本发明的修饰的支链淀粉酶组合物也可包含一种或多种其它酶。这些酶包括但不限于葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-糖苷酶、异淀粉酶、环麦芽糊精、葡糖转移酶、β-葡聚糖酶、葡糖异构酶、糖化酶、和切割糖苷键的酶，或两种或多种这些酶的混合物。在一优选实施方案中，酶组合物包括80％的本发明修饰的支链淀粉酶和20％的葡糖淀粉酶。
参照如下实施例，本领域技术人员可更完全理解实施本发明的方式和方法，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围或后附权利要求所指的范围。
实施例
实施例I
实施例I显示如此所述修饰的支链淀粉酶的生产。编码支链淀粉酶的核酸经如下方法修饰：利用热稳定性DNA聚合酶在诸如标准PCR引物指导的DNA酶法扩增中通过重组DNA技术(Saiki，R.K等，1980，科学，238：487-491)和PCR融合技术(Fleming，A，B等，应用环境微生物，61：3775-3780)。将编码所需修饰的支链淀粉酶的DNA融合到信号序列的C-端，优选宿主微生物信号序列。克隆此构建物并转化入宿主细胞，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，在标准发酵条件下培养。从发酵培养液中纯化修饰的支链淀粉酶，并检测活性。
实施例II
实施例II描述了经培养重组地衣芽孢杆菌宿主细胞获得的修饰的支链淀粉酶，其中地衣芽孢杆菌宿主细胞包含编码成熟B.deramificans支链淀粉酶的核酸，该宿主细胞具有Carsburg和内切Glu C蛋白酶的缺失。在复合培养基中标准发酵条件下培养地衣芽孢杆菌。将发酵液经标准HPLC分析处理，结果示于图3A-3C，其显示在发酵过程中形成的多种修饰的支链淀粉酶的时程。如标准HPLC分析测得，峰1为具有105KD分子量的成熟B.deramificans支链淀粉酶；峰2为具有自成熟B.deramificans支链淀粉酶氨基端102个氨基酸缺失的修饰的支链淀粉酶；峰3为自氨基端有98个氨基酸缺失的修饰的支链淀粉酶。在成熟序列上具有添加氨基酸的修饰的支链淀粉酶不能由HPLC分析检测，但可经核酸测序检测。图3A-3C显示，经过发酵，相应于成熟B.deramificans支链淀粉酶的峰1降低，而峰2和3增加。图4A-4D显示经过具有Carlsburg和内切Glu C蛋白酶缺失的地衣芽孢杆菌发酵，产生的修饰的支链淀粉酶的稳定性。地衣芽孢杆菌包含编码成熟B.deramificans支链淀粉酶的核酸，在适于表达和分泌修饰的支链淀粉酶的条件下培养，室温下将发酵液调至pH4.5、5.5和6.5。在pH4.5时修饰的支链淀粉酶最稳定。
实施例III
实施例III描述带有不同比例支链淀粉酶的酶组合物之糖化作用的比较。在浓度为每吨溶解固体0.550、0.635和0.718升酶组合物下，于糖化过程中测试含有20％葡糖淀粉酶：80％修饰的支链淀粉酶(20∶80)活性的酶组合物或含75％葡糖淀粉酶∶25％支链淀粉酶活性(75∶25)的酶组合物。如图5A-5C所示，含有20％葡糖淀粉酶和80％支链淀粉酶活性的酶组合物能增加最终葡萄糖产生而不增加不希望的二糖形成。此外，20∶80酶组合物的绝对浓度可增加而不会如同75∶25酶组合物或仅有葡糖淀粉酶那样，伴随不希望的二糖形成增加。
实施例IV
实施例IV描述了本发明修饰的支链淀粉酶活性测定的一种检测法。该检测法基于利用可溶性红色支链淀粉底物的比色法，用于支链淀粉酶活性检测。
试剂制备
200mM乙酸钠缓冲液pH5.0W/Acarbose(密度约1.010)如下制备：称量无水乙酸钠16.406克或三水乙酸钠27.21克，将其溶于1升量简中的900ml去离子水中(DI)，磁力搅拌棒搅拌。用冰乙酸将pH调至5.0。加入0.300g Acarbose至溶液中使溶解。用去离子水将体积补加到1000ml，并混匀。
2％红色支链淀粉底物制备
称量1.00g红色支链淀粉底物，溶于50ml乙酸钠缓冲液，用磁力搅拌棒搅拌约20-30分钟。此溶液在4℃下可稳定2周。
工作标准的制备
使用正替换(positive displacenent)吸尖制备1∶10的支链淀粉酶标准稀释液。所得标准的活性为195.9ASPU/ml。后续工作浓度从1∶10贮存稀释液的标准制备。
样品制备
作为对照，使用可购自Genecor International的Optimax L-300MA7EC191PU B1 3-19A作对照。在乙酸钠缓冲液中将对照1∶1000稀释。所有样品均在乙酸钠缓冲液中稀释，以获得落在标准曲线之内的终反应吸光度。样品置为室温。使用最少为100μl的样品作为最初稀释液。
检测步骤：
将标准工作浓度、对照和样品各250μl置入适当标记的微离心管。每管用往复式吸枪和装有1个的12.5ml Combitip加入250μl 2％底物浓度。样品振荡涡旋3秒，于40℃温育20分钟。从水浴中取出样品，立即向样品中以如上顺序加入1.0ml 95％的EtOH。使用装有4个或1个12.5ml或50ml Combitip和往复式吸枪。样品振荡涡旋3秒。室温下温育样品5-10分钟，然后在台式离心机上离心10分钟。在510nm下于分光光度计中用1.5ml比色杯读取标准和样品上清液(用95％EtOH校正分光光度计)。
计算
利用标准曲线和相关吸光度(减去空白吸光度)用计算尺、可编程计算器或绘图纸绘成标准曲线。标准曲线在标准浓度范围内应为线性，且相关系数(r)为0.998或更高。测量精度应落在5-10％CV之间。对于液体：U/ml＝(U/ml标准曲线)*(样品稀释度)

Claims (79)

1.截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其包含从获自Bacillusderamificans的支链淀粉酶氨基末端最多100个氨基酸的缺失，其中，所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
2.权利要求1的支链淀粉酶，其中所述支链淀粉酶从具有LMG培养物保藏中心保藏号T89.117D的Bacillus deramificans获得。
3.权利要求1的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其中所述缺失是从具有SEQ ID NO：2所示序列的支链淀粉酶缺失。
4.权利要求1的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其进一步包含保守的VWAP区。
5.截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其包含从获自Bacillusderamificans的支链淀粉酶氨基末端最多200个氨基酸的缺失，其中，所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
6.权利要求5的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其中所述缺失是从具有SEQ ID NO：2所示序列的支链淀粉酶缺失。
7.权利要求5的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其进一步包含保守的VWAP区。
8.截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其包含从获自Bacillusderamificans的支链淀粉酶氨基末端最多300个氨基酸的缺失，其中，所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
9.权利要求8的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其中所述缺失是从具有SEQ ID NO：2所示序列的支链淀粉酶缺失。
10.权利要求8的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其进一步包含保守的VWAP区。
11.截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其包含缺失，所述缺失是从Bacillus deramificans的支链淀粉酶氨基末端98个氨基酸的缺失，其中，所述截短的支链淀粉酶能催化α-1，6-糖苷键水解。
12.权利要求11的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其中所述支链淀粉酶从具有LMG培养物保藏中心保藏号T89.117D的Bacillusderamificans获得。
13.截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其包含缺失，所述缺失是从Bacillus deramificans的支链淀粉酶氨基末端102个氨基酸的缺失，其中，所述截短的支链淀粉酶能催化α-1，6-糖苷键水解。
14.权利要求13的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其中所述支链淀粉酶从具有LMG培养物保藏中心保藏号T89.117D的Bacillusderamificans获得。
15.修饰的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解，其中，所述修饰是获自Bacillus deramificans的成熟支链淀粉酶氨基酸序列氨基末端至少一个氨基酸的添加，其中，在氨基末端添加的氨基酸是丙氨酸。
16.通过如下方法获得的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，所述方法包括步骤：
(a)获得包含编码成熟支链淀粉酶的核酸的重组宿主细胞，所述核酸与SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列具有至少90％相同性，
(b)在适于截短的支链淀粉酶生产的条件下培养所述宿主细胞，和
(c)回收截短的支链淀粉酶，其中，所述截短的支链淀粉酶包含从Bacillus deramificans的支链淀粉酶氨基末端最多100个氨基酸的缺失，其中，所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
17.权利要求16的支链淀粉酶，其中所述宿主细胞是地衣芽孢杆菌，其包含编码Carlsberg蛋白酶的第一种基因和编码内切Glu C蛋白酶的第二种基因，编码蛋白酶的第一种和/或第二种基因已经被删除或失活。
18.权利要求16的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其中，所述编码成熟支链淀粉酶的核酸序列是SEQ ID NO：1。
19.权利要求16的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其中，所述成熟支链淀粉酶具有SEQ ID NO：2所示的序列。
20.权利要求16的截短的芽孢杆菌属支链淀粉酶，其进一步包含保守的VWAP区。
21.一种含有截短的Bacillus deramificans支链淀粉酶的酶组合物，其中所述截短的支链淀粉酶选自如下支链淀粉酶，所述支链淀粉酶包含
(a)从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多100个氨基酸的缺失，
(b)从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多200个氨基酸的缺失，或
(c)从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多300个氨基酸的缺失，
其中，(a)、(b)或(c)的所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
22.权利要求21的酶组合物，其中截短的支链淀粉酶具有氨基末端最多100个氨基酸的氨基酸缺失。
23.权利要求21的酶组合物，其中截短的支链淀粉酶具有氨基末端最多200个氨基酸的氨基酸缺失。
24.权利要求21的酶组合物，其中截短的支链淀粉酶具有氨基末端最多300个氨基酸的氨基酸缺失。
25.权利要求21的组合物，其还包括选自如下的酶：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、环麦芽糖糊精、葡糖转移酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖异构酶、糖化酶和/或切割糖苷键的酶。
26.权利要求21的组合物，其还包括葡糖淀粉酶。
27.权利要求26的组合物，其中葡糖淀粉酶获自曲霉属的菌株。
28.权利要求27的组合物，其中曲霉属的菌株包括黑曲霉、泡盛曲霉和臭曲霉。
29.权利要求21的组合物，其中所述组合物是固体形式。
30.权利要求21的组合物，其中所述组合物是液体形式。
31.权利要求21的组合物，其包含至少60％的截短的支链淀粉酶。
32.权利要求21的组合物，其包含至少80％的截短的支链淀粉酶。
33.权利要求21的酶组合物，其中所述缺失是从具有SEQ ID NO：2所示序列的支链淀粉酶缺失。
34.权利要求21的组合物，其中所述截短的支链淀粉酶还包含保守的VWAP区。
35.包含权利要求11的支链淀粉酶的酶组合物，其中所述支链淀粉酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，起始于99位的氨基酸残基谷氨酸。
36.权利要求35的组合物，其还包含选自如下的酶：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、环麦芽糖糊精、葡糖转移酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖异构酶、糖化酶和/或切割糖苷键的酶。
37.包含权利要求13的支链淀粉酶的酶组合物，其中所述支链淀粉酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，起始于103位的氨基酸残基谷氨酸。
38.权利要求37的组合物，其还包含选自如下的酶：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、环麦芽糖糊精、葡糖转移酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖异构酶、糖化酶和/或切割糖苷键的酶。
39.包含编码截短的支链淀粉酶的多核苷酸序列的核酸，其中，所述截短的支链淀粉酶包含Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多100个氨基酸的缺失，其中所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
40.权利要求39的核酸，其与SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列有至少70％相同性。
41.权利要求40的核酸，其与SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列有至少80％序列相同性。
42.权利要求40的核酸，其与SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列有至少90％序列相同性。
43.权利要求40的核酸，其与SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列有至少95％序列相同性。
44.权利要求39的核酸，其具有SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列。
45.权利要求39的核酸，其中所述Bacillus deramificans具有LMG培养物保藏中心保藏号T89.117D。
46.权利要求39的核酸，其中所述缺失是从Bacillusderamificans支链淀粉酶氨基末端98个氨基酸的缺失。
47.权利要求39的核酸，其中所述缺失是从Bacillusderamificans支链淀粉酶氨基末端102个氨基酸的缺失。
48.包含编码截短的支链淀粉酶的多核苷酸序列的核酸，其中，所述截短的支链淀粉酶包含从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多200个氨基酸的缺失，其中所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
49.包含编码截短的支链淀粉酶的多核苷酸序列的核酸，其中，所述截短的支链淀粉酶包含从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多300个氨基酸的缺失，其中所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
50.编码修饰的芽孢杆菌属支链淀粉酶的核酸，其中，所述支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解，其中所述修饰是获自Bacillus deramificans的成熟支链淀粉酶氨基酸序列氨基末端至少一个氨基酸的添加。
51.权利要求50的核酸，其中在氨基末端添加的氨基酸是丙氨酸。
52.含有权利要求39的核酸的表达载体。
53.含有权利要求42的核酸的表达载体。
54.包含权利要求52的表达载体的宿主微生物。
55.权利要求54的宿主微生物，其中所述微生物是芽孢杆菌。
56.权利要求55的宿主微生物，其中所述芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
57.一种在宿主细胞中生产截短的支链淀粉酶的方法，包括如下步骤：
(a)获得包含编码截短的支链淀粉酶的核酸的重组宿主细胞，其中，所述支链淀粉酶包含从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多100个氨基酸的缺失，其中，所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化0-1，6-糖苷键水解；和
(b)在适于截短的支链淀粉酶生产的条件下培养所述宿主细胞。
58.权利要求57的方法，其还包括步骤：(c)回收截短的支链淀粉酶。
59.权利要求57的方法，其中所述宿主细胞是选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的芽孢杆菌。
60.权利要求59的方法，其中芽孢杆菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌。
61.权利要求57的方法，其中所述截短的支链淀粉酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，起始于99位的氨基酸残基谷氨酸。
62.权利要求57的方法，其中所述截短的支链淀粉酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，起始于103位的氨基酸残基谷氨酸。
63.一种在地衣芽孢杆菌宿主细胞中生产截短的支链淀粉酶的方法，包括如下步骤：
(a)用编码截短的支链淀粉酶的核酸转化地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中，所述截短的支链淀粉酶包含从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多100个氨基酸的缺失，其中，所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解；和
(b)在适于截短的支链淀粉酶生产的条件下培养所述转化的地衣芽孢杆菌宿主细胞。
64.权利要求63的方法，其还包括回收所述截短的支链淀粉酶。
65.权利要求63的方法，其中截短的支链淀粉酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，起始于99位的氨基酸残基谷氨酸。
66.权利要求63的方法，其中截短的支链淀粉酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，起始于103位的氨基酸残基谷氨酸。
67.权利要求63的方法，其中地衣芽孢杆菌是重组地衣芽孢杆菌宿主细胞。
68.权利要求63的方法，其中地衣芽孢杆菌还包含异源蛋白质。
69.地衣芽孢杆菌，其包含编码截短的支链淀粉酶的核酸，其中所述支链淀粉酶能催化α-1，6-糖苷键水解，并选自包含从Bacillusderamificans支链淀粉酶氨基末端最多100个氨基酸的缺失、最多200个氨基酸的缺失、或最多300个氨基酸的缺失的支链淀粉酶，其中，所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，其中，所述地衣芽孢杆菌包含编码Carlsberg蛋白酶的第一基因和编码内切Glu C蛋白酶的第二基因，所述第一基因或第二基因中的至少一个已经被删除或失活。
70.根据权利要求63的方法产生的地衣芽孢杆菌宿主细胞。
71.一种淀粉糖化的方法，其中所述方法降低糖化副产物的浓度，包括将水性液化淀粉与含有截短的Bacillus deramificans支链淀粉酶的酶组合物相接触的步骤，其中所述截短的支链淀粉酶选自如下支链淀粉酶，所述支链淀粉酶包含
(a)从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多100个氨基酸的缺失，
(b)从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多200个氨基酸的缺失，或
(c)从Bacillus deramificans支链淀粉酶氨基末端最多300个氨基酸的缺失，
其中，(a)、(b)或(c)的所述截短的支链淀粉酶包含保守的Y区，并能催化α-1，6-糖苷键水解。
72.权利要求71的方法，其还包括加热所述液化淀粉的步骤。
73.权利要求72的方法，其还包括回收产物的步骤。
74.权利要求71的方法，其中所述酶组合物还含有葡糖淀粉酶。
75.权利要求71的方法，其中所述酶组合物包含至少80％截短的支链淀粉酶。
76.权利要求71的方法，其中所述接触是在pH低于或等于7.0至高于或等于3。
77.权利要求76的方法，其中所述pH是4.2。
78.权利要求72的方法，其中所述加热是在温度范围55-65℃之间。
79.权利要求78的方法，其中所述温度是60℃。
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