JP2002505108A - プルラナーゼの修飾形態 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明はデンプン産業において有用な修飾プルラナーゼに関する。本発明は、修飾プルラナーゼを製造する方法、修飾プルラナーゼを含む酵素組成物、および該酵素組成物の使用を含むデンプンの糖化方法を提供する。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は、アルファ−１，６−グルコシド結合（alpha-1,6-glucosidic bond ）の加水分解を触媒する能力を維持したプルラナーゼの修飾形態、該修飾プルラ
ナーゼを含む組成物、該修飾プルラナーゼを製造する方法および特にデンプンを
糖化するための、該修飾プルラナーゼの使用方法に関する。
ナーゼを含む組成物、該修飾プルラナーゼを製造する方法および特にデンプンを
糖化するための、該修飾プルラナーゼの使用方法に関する。
【０００２】発明の背景 その主成分が直鎖アミロースおよび枝分れアミロペクチングルコース重合体で
あるデンプンは、デンプンの液化および液化されたデンプンの糖化の二段階で行
われる酵素プロセスにより単純な砂糖に転化することができる。デンプンの高転
化レベルを得るために、アルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒す
るのにプルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１、アルファ−１，６−グルコシ
ダーゼとも称されるα−デキストリン６−グルカノ−ヒドロラーゼ）が用いられ
てきた。
あるデンプンは、デンプンの液化および液化されたデンプンの糖化の二段階で行
われる酵素プロセスにより単純な砂糖に転化することができる。デンプンの高転
化レベルを得るために、アルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒す
るのにプルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１、アルファ−１，６−グルコシ
ダーゼとも称されるα−デキストリン６−グルカノ−ヒドロラーゼ）が用いられ
てきた。
【０００３】 当該技術分野におけるプルラナーゼ酵素には、酸性ｐＨで最適活性を有するこ
とが知られているもの、並びにアルカリ性ｐＨで活性を有することが知られてい
るものがある。当該技術分野におけるプルラナーゼとしては、60℃におけるｐＨ
４−５で最適活性を有すると記載されているバチルスアシドプルリチクス(Bacil
lus acidopullulyticus)のある菌株由来のプルラナーゼ（米国特許第4,560,651 号）；60℃で測定した、ｐＨが約５での最大活性およびｐＨが4.5で測定した、 約62.5℃の温度での最大活性を有すると記載されているバチルスナガノエンシス
(Bacillus naganoensis)由来のプルラナーゼ（米国特許第5,055,403号）；50℃ の最適温度および5.0から5.5までの最適ｐＨを有すると記載されているバチルス
スクトラムス(Bacillus sectorramus)由来のプルラナーゼ（米国特許第4,902,62
2号）；および60℃におけるｐＨ4.5-5.5で活性を有すると記載されているバチル
スブレビスＰＬ−１(Bacullus brevis PL-1)由来のプルラナーゼ（特開平4-2398
5）が挙げられる。
とが知られているもの、並びにアルカリ性ｐＨで活性を有することが知られてい
るものがある。当該技術分野におけるプルラナーゼとしては、60℃におけるｐＨ
４−５で最適活性を有すると記載されているバチルスアシドプルリチクス(Bacil
lus acidopullulyticus)のある菌株由来のプルラナーゼ（米国特許第4,560,651 号）；60℃で測定した、ｐＨが約５での最大活性およびｐＨが4.5で測定した、 約62.5℃の温度での最大活性を有すると記載されているバチルスナガノエンシス
(Bacillus naganoensis)由来のプルラナーゼ（米国特許第5,055,403号）；50℃ の最適温度および5.0から5.5までの最適ｐＨを有すると記載されているバチルス
スクトラムス(Bacillus sectorramus)由来のプルラナーゼ（米国特許第4,902,62
2号）；および60℃におけるｐＨ4.5-5.5で活性を有すると記載されているバチル
スブレビスＰＬ−１(Bacullus brevis PL-1)由来のプルラナーゼ（特開平4-2398
5）が挙げられる。
【０００４】 プルラナーゼは、高グルコースおよび高マルトースのシロップを製造するため
に、グルコアミラーゼまたはβ−アミラーゼとともに使用しても差し支えない。
砂糖の収率を増大させることに加えて、プルラナーゼは反応時間を減少させ、高
基質濃度を可能にし、グルコアミラーゼの使用を50％まで減少させることができ
る（Bakshi et al. (1992) Biotechnology Letters vol.14 pp.689-694）。
に、グルコアミラーゼまたはβ−アミラーゼとともに使用しても差し支えない。
砂糖の収率を増大させることに加えて、プルラナーゼは反応時間を減少させ、高
基質濃度を可能にし、グルコアミラーゼの使用を50％まで減少させることができ
る（Bakshi et al. (1992) Biotechnology Letters vol.14 pp.689-694）。
【０００５】発明の概要 本発明は、プルラナーゼの修飾形態が、アルファ−１，６−グルコシド結合の
加水分解を触媒する能力を維持するという本出願人による驚くべき、予期せぬ発
見に関する。本発明は、プルラナーゼの修飾形態および特に組換え宿主微生物中
での、前記修飾プルラナーゼを製造する方法を提供する。本発明はさらに、デン
プンの糖化において有用なプルラナーゼの修飾形態を含む酵素組成物および該酵
素組成物の使用を含むデンプンの糖化方法を提供する。
加水分解を触媒する能力を維持するという本出願人による驚くべき、予期せぬ発
見に関する。本発明は、プルラナーゼの修飾形態および特に組換え宿主微生物中
での、前記修飾プルラナーゼを製造する方法を提供する。本発明はさらに、デン
プンの糖化において有用なプルラナーゼの修飾形態を含む酵素組成物および該酵
素組成物の使用を含むデンプンの糖化方法を提供する。
【０００６】 本発明は、一部には、バチルスデラミフィカンス(Bacillus deramificans)か ら得たプルラナーゼが、バチルスリケニフォルミス(Bacillus licheniformis)中
で組換えにより発現され、培養された場合、産生されたプルラナーゼは修飾形態
の混合物であったが、それでもそのプルラナーゼの修飾形態は意外なことに、ア
ルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維持していたとい
う発見に基づく。この修飾形態は、アミノ末端で先端が切断された、すなわち、
アミノ末端からのアミノ酸が欠失したバチルスデラミフィカンスプルラナーゼ、
および成熟プルラナーゼのアミノ末端にアミノ酸が付加されたバチルスデラミフ
ィカンスを含んだ。したがって、ある態様において、本発明は、修飾プルラナー
ゼがアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維持してい
る限り、グラム陽性またはグラム陰性微生物から得られるプルラナーゼのアミノ
末端からのアミノ酸が欠失した修飾プルラナーゼを提供する。別の態様において
、本発明は、修飾プルラナーゼがアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解
を触媒する能力を維持している限り、グラム陰性またはグラム陽性微生物から得
られるプルラナーゼのアミノ末端でアミノ酸が付加された修飾プルラナーゼを提
供する。本発明はまた、修飾プルラナーゼがアルファ−１，６−グルコシド結合
の加水分解を触媒する能力を維持している限り、グラム陰性またはグラム陽性微
生物から得られるプルラナーゼのアミノ酸変種を包含する。
で組換えにより発現され、培養された場合、産生されたプルラナーゼは修飾形態
の混合物であったが、それでもそのプルラナーゼの修飾形態は意外なことに、ア
ルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維持していたとい
う発見に基づく。この修飾形態は、アミノ末端で先端が切断された、すなわち、
アミノ末端からのアミノ酸が欠失したバチルスデラミフィカンスプルラナーゼ、
および成熟プルラナーゼのアミノ末端にアミノ酸が付加されたバチルスデラミフ
ィカンスを含んだ。したがって、ある態様において、本発明は、修飾プルラナー
ゼがアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維持してい
る限り、グラム陽性またはグラム陰性微生物から得られるプルラナーゼのアミノ
末端からのアミノ酸が欠失した修飾プルラナーゼを提供する。別の態様において
、本発明は、修飾プルラナーゼがアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解
を触媒する能力を維持している限り、グラム陰性またはグラム陽性微生物から得
られるプルラナーゼのアミノ末端でアミノ酸が付加された修飾プルラナーゼを提
供する。本発明はまた、修飾プルラナーゼがアルファ−１，６−グルコシド結合
の加水分解を触媒する能力を維持している限り、グラム陰性またはグラム陽性微
生物から得られるプルラナーゼのアミノ酸変種を包含する。
【０００７】 ある実施の形態において、修飾プルラナーゼは、クレブシエラ(Klebsiella)種
から得られるプルラナーゼの修飾形態である。別の実施の形態において、修飾プ
ルラナーゼは、バチルス種から得られるプルラナーゼの修飾形態である。さらに
別の実施の形態において、修飾プルラナーゼは、以下に限定されるものではない
が、枯草菌、バチルスデラミフィカンス、バチルスステアロサーマフィルス(Bac
illus stearothermophilus)、バチルスナガノエンシス、バチルスフラボカルダ リウス(Bacillus flavocaldarius)、バチルスアシドプルリチクス(Bacillus aci
dopullulyticus)、バチルスsp APC-9603、バチルスセクトルラムス(Bacillus se
ctorramus)、バチルスセレウス(Bacillus cereus)、バチルスファームス(Bacill
us fermus)を含むバチルス属から得られるプルラナーゼの修飾形態である。好ま
しい実施の形態において、修飾プルラナーゼは、ベルギー国、B-9000 GHENT, K.
L.Ledeganckstraatのゲント大学、微生物学研究所（University of Ghent, Labo
ratory of Microbiology）により、1993年6月21日に、ブダペスト条約の元でＬ ＭＧカルチャーコレクションに寄託された名称T89.117D(LMG P-13056)を有する バチルスデラミフィカンスから得られるプルラナーゼの修飾形態である。
から得られるプルラナーゼの修飾形態である。別の実施の形態において、修飾プ
ルラナーゼは、バチルス種から得られるプルラナーゼの修飾形態である。さらに
別の実施の形態において、修飾プルラナーゼは、以下に限定されるものではない
が、枯草菌、バチルスデラミフィカンス、バチルスステアロサーマフィルス(Bac
illus stearothermophilus)、バチルスナガノエンシス、バチルスフラボカルダ リウス(Bacillus flavocaldarius)、バチルスアシドプルリチクス(Bacillus aci
dopullulyticus)、バチルスsp APC-9603、バチルスセクトルラムス(Bacillus se
ctorramus)、バチルスセレウス(Bacillus cereus)、バチルスファームス(Bacill
us fermus)を含むバチルス属から得られるプルラナーゼの修飾形態である。好ま
しい実施の形態において、修飾プルラナーゼは、ベルギー国、B-9000 GHENT, K.
L.Ledeganckstraatのゲント大学、微生物学研究所（University of Ghent, Labo
ratory of Microbiology）により、1993年6月21日に、ブダペスト条約の元でＬ ＭＧカルチャーコレクションに寄託された名称T89.117D(LMG P-13056)を有する バチルスデラミフィカンスから得られるプルラナーゼの修飾形態である。
【０００８】 ある実施の形態において、修飾プルラナーゼは、プルラナーゼのアミノ末端か
ら約100のアミノ酸が欠失されている。別の実施の形態において、修飾プルラナ ーゼは、プルラナーゼのアミノ末端から約200のアミノ酸が欠失されており、さ らに別の実施の形態において、修飾プルラナーゼは、プルラナーゼのアミノ末端
から約300のアミノ酸が欠失されている。
ら約100のアミノ酸が欠失されている。別の実施の形態において、修飾プルラナ ーゼは、プルラナーゼのアミノ末端から約200のアミノ酸が欠失されており、さ らに別の実施の形態において、修飾プルラナーゼは、プルラナーゼのアミノ末端
から約300のアミノ酸が欠失されている。
【０００９】 さらなる実施の形態において、修飾プルラナーゼは、バチルスデラミフィカン
スから得られるプルラナーゼのアミノ末端から98のアミノ酸が欠失されている。
追加の実施の形態において、修飾プルラナーゼは、バチルスデラミフィカンスか
ら得られるプルラナーゼのアミノ末端から約102のアミノ酸が欠失されている。 さらなる実施の形態において、修飾プルラナーゼは、バチルスデラミフィカンス
から得られるプルラナーゼのアミノ末端で少なくとも１つのアミノ酸が付加され
ている。別の実施の形態において、修飾プルラナーゼは、バチルスデラミフィカ
ンスから得られるプルラナーゼのアミノ末端に、追加のアミノ酸残基アラニンが
付加されている。
スから得られるプルラナーゼのアミノ末端から98のアミノ酸が欠失されている。
追加の実施の形態において、修飾プルラナーゼは、バチルスデラミフィカンスか
ら得られるプルラナーゼのアミノ末端から約102のアミノ酸が欠失されている。 さらなる実施の形態において、修飾プルラナーゼは、バチルスデラミフィカンス
から得られるプルラナーゼのアミノ末端で少なくとも１つのアミノ酸が付加され
ている。別の実施の形態において、修飾プルラナーゼは、バチルスデラミフィカ
ンスから得られるプルラナーゼのアミノ末端に、追加のアミノ酸残基アラニンが
付加されている。
【００１０】 分子量が減少したプルラナーゼの修飾形態により、より高い比活性（活性／単
位重量）の利点が得られ、したがって、微生物から得られる、またはそれより産
生される天然に存在するプルラナーゼの使用と等しい結果を得る糖化プロセスに
おいて、少ないプルラナーゼ活性の重量が必要とされる。ここに教示される修飾
プルラナーゼの組換え産生により、少なくとも60％、および少なくとも80％のプ
ルラナーゼ活性を含む酵素組成物が提供される。ある実施の形態において、酵素
組成物は少なくとも１つの修飾プルラナーゼを含む。別の実施の形態において、
酵素組成物は、１つより多くのプルラナーゼを含む。そのような酵素組成物は、
逆反応産生物に関連するグルコース収率の損失なくして、短い糖化時間でグルコ
ースを高い収率で産生するその能力のためにデンプン加工産業にとって有益であ
る。さらに、20％のグルコアミラーゼおよび80％のプルラナーゼを含む酵素組成
物を使用した場合、糖化プロセスにおいてより高い出発溶解固体（ＤＳ）を用い
ることができ、それによって、資本投資を増加させずに製造プラントの能力を増
大させられるということが予期せずに分かった。加えて、より高い溶解固体での
糖化により機械的圧縮容量が増大し、それによって、エネルギー効率のよりよい
プロセスが得られる。
位重量）の利点が得られ、したがって、微生物から得られる、またはそれより産
生される天然に存在するプルラナーゼの使用と等しい結果を得る糖化プロセスに
おいて、少ないプルラナーゼ活性の重量が必要とされる。ここに教示される修飾
プルラナーゼの組換え産生により、少なくとも60％、および少なくとも80％のプ
ルラナーゼ活性を含む酵素組成物が提供される。ある実施の形態において、酵素
組成物は少なくとも１つの修飾プルラナーゼを含む。別の実施の形態において、
酵素組成物は、１つより多くのプルラナーゼを含む。そのような酵素組成物は、
逆反応産生物に関連するグルコース収率の損失なくして、短い糖化時間でグルコ
ースを高い収率で産生するその能力のためにデンプン加工産業にとって有益であ
る。さらに、20％のグルコアミラーゼおよび80％のプルラナーゼを含む酵素組成
物を使用した場合、糖化プロセスにおいてより高い出発溶解固体（ＤＳ）を用い
ることができ、それによって、資本投資を増加させずに製造プラントの能力を増
大させられるということが予期せずに分かった。加えて、より高い溶解固体での
糖化により機械的圧縮容量が増大し、それによって、エネルギー効率のよりよい
プロセスが得られる。
【００１１】 ある実施の形態において、本発明は、成熟プルラナーゼをコードする核酸を含
む組換え宿主細胞を得、該宿主細胞を修飾プルラナーゼの産生に適した条件下で
培養し、必要に応じて該修飾プルラナーゼを回収する各工程を含む方法により産
生された修飾プルラナーゼを提供する。ある実施の形態において、宿主細胞は、
以下に限定されるものではないが、枯草菌、バチルスリケニフォルミス(Bacillu
s licheniformis)、バチルスレンタス(Bacillus lentus)、短バチルス、バチル スステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィルス(Bacillus alkalophilus
)、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルスサーキュランス(Bacillus circ
ulans)、バチルスラウタス(Bacillus lautus)およびバチルススリンギエンシス(
Bacillus thuringiensis)を含むバチルス属である。好ましい実施の形態におい て、バチルス細胞は、カールスバーグ(Carlsberg)プロテアーゼをコードする第 １遺伝子およびendo Glus Cをコードする第２遺伝子を含むバチルスリケニフォ ルミスであり、該第１および／または第２遺伝子は、プロテアーゼ活性が実質的
に除去され、かつ前記成熟プルラナーゼをコードする核酸がバチルスデラミフィ
カンスから得られるようにバチルス種中で変更されたプロテアーゼをコードして
いる。
む組換え宿主細胞を得、該宿主細胞を修飾プルラナーゼの産生に適した条件下で
培養し、必要に応じて該修飾プルラナーゼを回収する各工程を含む方法により産
生された修飾プルラナーゼを提供する。ある実施の形態において、宿主細胞は、
以下に限定されるものではないが、枯草菌、バチルスリケニフォルミス(Bacillu
s licheniformis)、バチルスレンタス(Bacillus lentus)、短バチルス、バチル スステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィルス(Bacillus alkalophilus
)、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルスサーキュランス(Bacillus circ
ulans)、バチルスラウタス(Bacillus lautus)およびバチルススリンギエンシス(
Bacillus thuringiensis)を含むバチルス属である。好ましい実施の形態におい て、バチルス細胞は、カールスバーグ(Carlsberg)プロテアーゼをコードする第 １遺伝子およびendo Glus Cをコードする第２遺伝子を含むバチルスリケニフォ ルミスであり、該第１および／または第２遺伝子は、プロテアーゼ活性が実質的
に除去され、かつ前記成熟プルラナーゼをコードする核酸がバチルスデラミフィ
カンスから得られるようにバチルス種中で変更されたプロテアーゼをコードして
いる。
【００１２】 代わりの実施の形態において、本発明は、組換え宿主細胞中で修飾プルラナー
ゼを産生する方法であって、修飾プルラナーゼをコードする核酸を含む組換え微
生物を得、該微生物を前記修飾プルラナーゼの産生に適した条件下で培養し、必
要に応じて産生した修飾プルラナーゼを回収する各工程を含む方法を提供する。
ある実施の形態において、宿主細胞はグラム陰性またはグラム陽性微生物である
。別の実施の形態において、宿主細胞は、以下に限定されるものではいなが、枯
草菌、バチルスリケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルスレンタス
(Bacillus lentus)、短バチルス、バチルスステアロサーモフィルス、バチルス アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルスアミロリケファシエンス(
Bacillus amyloliquefaciens)、バチルスコアギュランス(Bacillus coagulans) 、バチルスサーキュランス(Bacillus circulans)、バチルスラウタス(Bacillus
lautus)およびバチルススリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)を含むバチ ルス属である。別の実施の形態において、バチルス細胞は、カールスバーグ(Car
lsberg)プロテアーゼをコードする第１遺伝子およびendo Glus Cをコードする第
２遺伝子を含むバチルスリケニフォルミスであり、該第１および／または第２遺
伝子は、プロテアーゼ活性が実質的に除去され、かつ前記核酸が、バチルスデラ
ミフィカンスから得られるプルラナーゼの修飾形態である修飾プルラナーゼをコ
ードするようにバチルス種中で変更されたプロテアーゼをコードしている。
ゼを産生する方法であって、修飾プルラナーゼをコードする核酸を含む組換え微
生物を得、該微生物を前記修飾プルラナーゼの産生に適した条件下で培養し、必
要に応じて産生した修飾プルラナーゼを回収する各工程を含む方法を提供する。
ある実施の形態において、宿主細胞はグラム陰性またはグラム陽性微生物である
。別の実施の形態において、宿主細胞は、以下に限定されるものではいなが、枯
草菌、バチルスリケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルスレンタス
(Bacillus lentus)、短バチルス、バチルスステアロサーモフィルス、バチルス アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルスアミロリケファシエンス(
Bacillus amyloliquefaciens)、バチルスコアギュランス(Bacillus coagulans) 、バチルスサーキュランス(Bacillus circulans)、バチルスラウタス(Bacillus
lautus)およびバチルススリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)を含むバチ ルス属である。別の実施の形態において、バチルス細胞は、カールスバーグ(Car
lsberg)プロテアーゼをコードする第１遺伝子およびendo Glus Cをコードする第
２遺伝子を含むバチルスリケニフォルミスであり、該第１および／または第２遺
伝子は、プロテアーゼ活性が実質的に除去され、かつ前記核酸が、バチルスデラ
ミフィカンスから得られるプルラナーゼの修飾形態である修飾プルラナーゼをコ
ードするようにバチルス種中で変更されたプロテアーゼをコードしている。
【００１３】 本発明はまた、修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む核
酸を提供する。ある実施の形態において、その核酸は、バチルスデラミフィカン
スから得られるプルラナーゼをコードする、配列番号１に示されたポリヌクレオ
チド配列に対して少なくとも70％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくと
も90％の同一性または少なくとも95％の同一性を有する。本発明はまた、本発明
の修飾プルラナーゼをコードする核酸を含む宿主微生物および発現ベクターも提
供する。
酸を提供する。ある実施の形態において、その核酸は、バチルスデラミフィカン
スから得られるプルラナーゼをコードする、配列番号１に示されたポリヌクレオ
チド配列に対して少なくとも70％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくと
も90％の同一性または少なくとも95％の同一性を有する。本発明はまた、本発明
の修飾プルラナーゼをコードする核酸を含む宿主微生物および発現ベクターも提
供する。
【００１４】 本発明は、少なくとも１つの本発明の修飾プルラナーゼを含む酵素組成物を提
供する。ある実施の形態において、その酵素組成物は、多数の修飾プルラナーゼ
形態を含む。別の実施の形態において、前記組成物はさらに、グルコアミラーゼ
、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、イ
ソアミラーゼ、シクロマルトデキストリン、グルコトランスフェラーゼ、ベータ
−グルカナーゼ、グルコースイソメラーゼ、糖化酵素、および／またはグルコシ
ド結合を開裂する酵素からなる群より選択される酵素を含む。好ましい実施の形
態において、前記酵素組成物は、修飾プルラナーゼおよびグルコアミラーゼを含
む。ある実施の形態において、グルコアミラーゼはアスペルギルス菌株由来であ
る。別の実施の形態において、グルコアミラーゼは、以下に限定されるものでは
いなが、黒色アスペルギルス、アスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori) およびアスペルギルスフォーチダス(Aspergillus foetidus)を含むアスペルギル
ス菌株由来である。前記酵素組成物は、固体形態または液体形態であってもよい
。本発明のある実施の形態において、酵素組成物は少なくとも60％の修飾プルラ
ナーゼを含み、別の実施の形態において、該組成物は少なくとも80％の修飾プル
ラナーゼを含む。
供する。ある実施の形態において、その酵素組成物は、多数の修飾プルラナーゼ
形態を含む。別の実施の形態において、前記組成物はさらに、グルコアミラーゼ
、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、イ
ソアミラーゼ、シクロマルトデキストリン、グルコトランスフェラーゼ、ベータ
−グルカナーゼ、グルコースイソメラーゼ、糖化酵素、および／またはグルコシ
ド結合を開裂する酵素からなる群より選択される酵素を含む。好ましい実施の形
態において、前記酵素組成物は、修飾プルラナーゼおよびグルコアミラーゼを含
む。ある実施の形態において、グルコアミラーゼはアスペルギルス菌株由来であ
る。別の実施の形態において、グルコアミラーゼは、以下に限定されるものでは
いなが、黒色アスペルギルス、アスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori) およびアスペルギルスフォーチダス(Aspergillus foetidus)を含むアスペルギル
ス菌株由来である。前記酵素組成物は、固体形態または液体形態であってもよい
。本発明のある実施の形態において、酵素組成物は少なくとも60％の修飾プルラ
ナーゼを含み、別の実施の形態において、該組成物は少なくとも80％の修飾プル
ラナーゼを含む。
【００１５】 本発明はまた、水溶液化されたデンプンを修飾プルラナーゼを含む酵素組成物
に接触させる工程を含むデンプンの糖化方法であって、それによって、糖化戻り
副生成物の濃度が減少する方法も提供する。ある実施の形態において、本発明の
方法はさらに、前記液化デンプンを加熱し、生成物を回収する工程を含む。前記
方法のある実施の形態において、酵素組成物はさらにグルコアミラーゼを含む。
該方法の別の実施の形態において、前記接触は、約7.0以下および３以上のｐＨ で行われ、さらに別の実施の形態において、そのｐＨは約4.2である。前記方法 のさらなる実施の形態において、前記加熱は約55℃から約65℃までの間の温度範
囲で行われる。別の実施の形態において、その温度は約60℃である。
に接触させる工程を含むデンプンの糖化方法であって、それによって、糖化戻り
副生成物の濃度が減少する方法も提供する。ある実施の形態において、本発明の
方法はさらに、前記液化デンプンを加熱し、生成物を回収する工程を含む。前記
方法のある実施の形態において、酵素組成物はさらにグルコアミラーゼを含む。
該方法の別の実施の形態において、前記接触は、約7.0以下および３以上のｐＨ で行われ、さらに別の実施の形態において、そのｐＨは約4.2である。前記方法 のさらなる実施の形態において、前記加熱は約55℃から約65℃までの間の温度範
囲で行われる。別の実施の形態において、その温度は約60℃である。
【００１６】図面の説明 図１−５は、バチルスデラミフィカンスから得られるプルラナーゼの成熟アミ
ノ酸（配列番号２）配列をコードする核酸（配列番号１）を示す。
ノ酸（配列番号２）配列をコードする核酸（配列番号１）を示す。
【００１７】 図６−９は、バチルスデラミフィカンス（pullseqsig.seq.PROと表す）、枯草
菌（subpull.seq.proと表す）、および肺炎桿菌（kebpnseqsig.seq.proと表す）
から得られるプルラナーゼのアミノ末端の保存ドメインおよび変異性を示す、こ
れらのプルラナーゼのアミノ酸配列を配列したものである。この配列は、それぞ
れのプルラナーゼのシグナル配列も含む。
菌（subpull.seq.proと表す）、および肺炎桿菌（kebpnseqsig.seq.proと表す）
から得られるプルラナーゼのアミノ末端の保存ドメインおよび変異性を示す、こ
れらのプルラナーゼのアミノ酸配列を配列したものである。この配列は、それぞ
れのプルラナーゼのシグナル配列も含む。
【００１８】 図１０Ａ−１０Ｃは、発酵の時間経過および発酵中に形成された修飾プルラナ
ーゼの様々な種を示す。ピーク１は、105ｋＤの分子量を有する成熟バチルスデ ラミフィカンスプルラナーゼを表し；ピーク２は、成熟バチルスデラミフィカン
スプルラナーゼのアミノ末端から102のアミノ酸が欠失された修飾プルラナーゼ を表し；ピーク３は、標準ＨＰＬＣ分析により測定された前記アミノ酸末端から
98のアミノ酸が結失された修飾プルラナーゼを表す。図１０Ａは37時間に亘る発
酵を示す。図１０Ｂは60時間に亘る発酵を示す。図１０Ｃは70時間に亘る発酵を
示す。
ーゼの様々な種を示す。ピーク１は、105ｋＤの分子量を有する成熟バチルスデ ラミフィカンスプルラナーゼを表し；ピーク２は、成熟バチルスデラミフィカン
スプルラナーゼのアミノ末端から102のアミノ酸が欠失された修飾プルラナーゼ を表し；ピーク３は、標準ＨＰＬＣ分析により測定された前記アミノ酸末端から
98のアミノ酸が結失された修飾プルラナーゼを表す。図１０Ａは37時間に亘る発
酵を示す。図１０Ｂは60時間に亘る発酵を示す。図１０Ｃは70時間に亘る発酵を
示す。
【００１９】 図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃおよび１２は、標準ＨＰＬＣ分析により測定した、
ｐＨの関数としての修飾プルラナーゼ種の安定性を示す。図１１Ａは、室温にお
ける4.5のｐＨでの24時間のプルラナーゼの安定性を示す。図１１Ｂは、室温に おける5.5のｐＨでの24時間のプルラナーゼの安定性を示す。図１１Ｃは、室温 における6.5のｐＨでの24時間のプルラナーゼの安定性を示す。図１２は、室温 における4.5のｐＨでの96時間のプルラナーゼの安定性を示す。
ｐＨの関数としての修飾プルラナーゼ種の安定性を示す。図１１Ａは、室温にお
ける4.5のｐＨでの24時間のプルラナーゼの安定性を示す。図１１Ｂは、室温に おける5.5のｐＨでの24時間のプルラナーゼの安定性を示す。図１１Ｃは、室温 における6.5のｐＨでの24時間のプルラナーゼの安定性を示す。図１２は、室温 における4.5のｐＨでの96時間のプルラナーゼの安定性を示す。
【００２０】 図１３Ａ−１３Ｃは、様々なプルラナーゼおよびグルコアミラーゼ濃度を含む
酵素組成物の、糖化時間に亘る最終的なグルコース収率および二糖類の形成への
影響を示す。実線は、80％のプルラナーゼ活性（バチルスデラミフィカンスのア
ミノ末端から98のアミノ酸が欠失された修飾プルラナーゼ；バチルスデラミフィ
カンスのアミノ末端から102のアミノ酸が欠失された修飾プルラナーゼ；成熟バ チルスデラミフィカンスプルラナーゼおよびアミノ末端にアミノ酸（アラニン）
が付加された成熟バチルスデラミフィカンスプルラナーゼを含む）および20％の
グルコアミラーゼ（20:80）を含む酵素ブレンドを示す。点線は、アスペルギル スｓｐ．から得られる75％のグルコアミラーゼおよびバチルスデラミフィカンス
から得られる25％の成熟プルラナーゼ（75:25）を含む酵素ブレンドを含有する 酵素組成物を示す。四角い点を有する実線は、糖化時間に亘る、上述したように
20％のグルコアミラーゼおよび80％のプルラナーゼ活性（20:80）を含む酵素ブ レンドにより形成された二糖類を示し、丸い点を有する点線は、糖化時間に亘る
75:25の場合に形成された二糖類を示す。左側のＸ軸はグルコース収率の％であ り、右側のＸ軸は二糖類の％である。図１３Ａは、溶解固体のメートルトン当た
り0.550リットルの酵素組成物を用いた糖化プロセスを示し；図１３Ｂは、溶解 固体のメートルトン当たり0.635リットルの酵素組成物を用いた糖化プロセスを 示し；図１３Ｃは、溶解固体のメートルトン当たり0.718リットルの酵素組成物 を用いた糖化プロセスを示す。この図は、20:80の酵素組成物が、望ましくない 二糖類の形成を増加させずに、最終的なグルコース収率を増大させられることを
示している。
酵素組成物の、糖化時間に亘る最終的なグルコース収率および二糖類の形成への
影響を示す。実線は、80％のプルラナーゼ活性（バチルスデラミフィカンスのア
ミノ末端から98のアミノ酸が欠失された修飾プルラナーゼ；バチルスデラミフィ
カンスのアミノ末端から102のアミノ酸が欠失された修飾プルラナーゼ；成熟バ チルスデラミフィカンスプルラナーゼおよびアミノ末端にアミノ酸（アラニン）
が付加された成熟バチルスデラミフィカンスプルラナーゼを含む）および20％の
グルコアミラーゼ（20:80）を含む酵素ブレンドを示す。点線は、アスペルギル スｓｐ．から得られる75％のグルコアミラーゼおよびバチルスデラミフィカンス
から得られる25％の成熟プルラナーゼ（75:25）を含む酵素ブレンドを含有する 酵素組成物を示す。四角い点を有する実線は、糖化時間に亘る、上述したように
20％のグルコアミラーゼおよび80％のプルラナーゼ活性（20:80）を含む酵素ブ レンドにより形成された二糖類を示し、丸い点を有する点線は、糖化時間に亘る
75:25の場合に形成された二糖類を示す。左側のＸ軸はグルコース収率の％であ り、右側のＸ軸は二糖類の％である。図１３Ａは、溶解固体のメートルトン当た
り0.550リットルの酵素組成物を用いた糖化プロセスを示し；図１３Ｂは、溶解 固体のメートルトン当たり0.635リットルの酵素組成物を用いた糖化プロセスを 示し；図１３Ｃは、溶解固体のメートルトン当たり0.718リットルの酵素組成物 を用いた糖化プロセスを示す。この図は、20:80の酵素組成物が、望ましくない 二糖類の形成を増加させずに、最終的なグルコース収率を増大させられることを
示している。
【００２１】 図１４は、溶解固体のメートルトン当たり0.55リットルの酵素における、20:8
0、75:25、および100％のグルコアミラーゼを含む酵素組成物を用いた液化デン プンの糖化中の溶解固体（％ｗ／ｗ）（Ｙ軸）の最終的なグルコース収率への影
響を示す。線Ａは、図１３Ａ−１３Ｃに示した酵素組成物20:80であり；線Ｂは 、酵素組成物75:25であり；線Ｃは、100％のグルコアミラーゼからなる酵素組成
物である。
0、75:25、および100％のグルコアミラーゼを含む酵素組成物を用いた液化デン プンの糖化中の溶解固体（％ｗ／ｗ）（Ｙ軸）の最終的なグルコース収率への影
響を示す。線Ａは、図１３Ａ−１３Ｃに示した酵素組成物20:80であり；線Ｂは 、酵素組成物75:25であり；線Ｃは、100％のグルコアミラーゼからなる酵素組成
物である。
【００２２】詳細な説明 定義 ここに用いたプルラナーゼという用語は、デンプン中のアルファ−１，６−グ
ルコシド結合を開裂して直鎖アミロースを生成する能力を有する任意の酵素を称
する。これらの酵素は、好ましくは、ＥＣ３．２．１．４１に分類され、ネオプ
ルラナーゼを含む。
ルコシド結合を開裂して直鎖アミロースを生成する能力を有する任意の酵素を称
する。これらの酵素は、好ましくは、ＥＣ３．２．１．４１に分類され、ネオプ
ルラナーゼを含む。
【００２３】 図６−９に示したように、グラム陽性およびグラム陰性の微生物から得られる
プルラナーゼの中に類似性の領域がある。バチルスデラミフィカンスから得られ
るプルラナーゼの肺炎桿菌および枯草菌から得られるプルラナーゼとのアミノ酸
を配列させたことにより、保存ドメインの位置が合わせられると、保存ドメイン
に関連しないアミノ末端は様々な長さのものであることが分かる。ここで用いた
ように、プルラナーゼを称するときの「修飾」という用語は、修飾プルラナーゼ
がアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維持している
限り、保存ドメインが維持されており、一方で、保存ドメインに関連しない天然
に存在するアミノ酸配列のアミノ末端部分にある任意の長さのアミノ酸が、これ
らのアミノ酸残基の欠失により、またはこのアミノ末端への少なくとも１つのア
ミノ酸の付加により変更されているプルラナーゼ酵素を意味する。プルラナーゼ
のアミノ末端のアミノ酸における欠失は、様々な長さであって差し支えないが、
長さが少なくとも３つのアミノ酸であり、その欠失は、バチルスデラミフィカン
スにおいて、図１−５に示すようにアミノ酸残基310でチロシンである第１の保 存ドメインの始まりよりも先に及ぶことはできない。ある実施の形態において、
欠失は、成熟プルラナーゼのアミノ末端から約100のアミノ酸である。別の実施 の形態において、欠失は成熟プルラナーゼのアミノ末端から約200のアミノ酸で あり、さらに別の実施の形態において、欠失は成熟プルラナーゼのアミノ末端か
ら約300のアミノ酸である。好ましい実施の形態において、修飾は、バチルスデ ラミフィカンスのアミノ末端から98のアミノ酸の欠失である。さらに別の実施の
形態において、欠失はバチルスデラミフィカンスのアミノ末端から102のアミノ 酸である。さらなる実施の形態において、修飾は、バチルスデラミフィカンスか
ら得られる天然に存在する成熟プルラナーゼのアミノ末端への少なくとも１つの
アミノ酸の付加である。別の好ましい実施の形態において、アミノ酸残基のアラ
ニンが成熟プルラナーゼのアミノ末端に加えられる。ここで用いたように、「成
熟」という用語は、シグナル配列の天然の開裂部位の後に見つかったＮ末端アミ
ノ酸残基を含むタンパク質を称する。
プルラナーゼの中に類似性の領域がある。バチルスデラミフィカンスから得られ
るプルラナーゼの肺炎桿菌および枯草菌から得られるプルラナーゼとのアミノ酸
を配列させたことにより、保存ドメインの位置が合わせられると、保存ドメイン
に関連しないアミノ末端は様々な長さのものであることが分かる。ここで用いた
ように、プルラナーゼを称するときの「修飾」という用語は、修飾プルラナーゼ
がアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維持している
限り、保存ドメインが維持されており、一方で、保存ドメインに関連しない天然
に存在するアミノ酸配列のアミノ末端部分にある任意の長さのアミノ酸が、これ
らのアミノ酸残基の欠失により、またはこのアミノ末端への少なくとも１つのア
ミノ酸の付加により変更されているプルラナーゼ酵素を意味する。プルラナーゼ
のアミノ末端のアミノ酸における欠失は、様々な長さであって差し支えないが、
長さが少なくとも３つのアミノ酸であり、その欠失は、バチルスデラミフィカン
スにおいて、図１−５に示すようにアミノ酸残基310でチロシンである第１の保 存ドメインの始まりよりも先に及ぶことはできない。ある実施の形態において、
欠失は、成熟プルラナーゼのアミノ末端から約100のアミノ酸である。別の実施 の形態において、欠失は成熟プルラナーゼのアミノ末端から約200のアミノ酸で あり、さらに別の実施の形態において、欠失は成熟プルラナーゼのアミノ末端か
ら約300のアミノ酸である。好ましい実施の形態において、修飾は、バチルスデ ラミフィカンスのアミノ末端から98のアミノ酸の欠失である。さらに別の実施の
形態において、欠失はバチルスデラミフィカンスのアミノ末端から102のアミノ 酸である。さらなる実施の形態において、修飾は、バチルスデラミフィカンスか
ら得られる天然に存在する成熟プルラナーゼのアミノ末端への少なくとも１つの
アミノ酸の付加である。別の好ましい実施の形態において、アミノ酸残基のアラ
ニンが成熟プルラナーゼのアミノ末端に加えられる。ここで用いたように、「成
熟」という用語は、シグナル配列の天然の開裂部位の後に見つかったＮ末端アミ
ノ酸残基を含むタンパク質を称する。
【００２４】 図６−９に示したように、バチルスデラミフィカンスおよび肺炎桿菌プルラナ
ーゼは、第１の保存ドメインの始まり（バチルスデラミフィカンスにおいて、ア
ミノ酸残基310のチロシンである）までのアミノ末端の長さが類似しているプル ラナーゼの例である。枯草菌プルラナーゼは、図７に示したような第１の保存ド
メインの始まりまでのアミノ酸残基の長さが短いプルラナーゼの例である。
ーゼは、第１の保存ドメインの始まり（バチルスデラミフィカンスにおいて、ア
ミノ酸残基310のチロシンである）までのアミノ末端の長さが類似しているプル ラナーゼの例である。枯草菌プルラナーゼは、図７に示したような第１の保存ド
メインの始まりまでのアミノ酸残基の長さが短いプルラナーゼの例である。
【００２５】 ここで用いたように、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列
、およびその断片または部分、並びにセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか
を表す、二本鎖または一本鎖であってよいゲノム起源または合成起源のＤＮＡま
たはＲＮＡを称する。ここで用いた「アミノ酸」は、ペプチド配列またはタンパ
ク質配列もしくはその部分を称する。本発明は、バチルスデラミフィカンスプル
ラナーゼをコードするポリヌクレオチド、並びに高ストリンジェンシーの条件下
でバチルスデラミフィカンスプルラナーゼをコードする核酸にハイブリダイズで
きるプルラナーゼ活性をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも70％
、少なくとも80％、少なくとも90％および少なくとも95％の同一性を有するポリ
ヌクレオチドを包含する。
、およびその断片または部分、並びにセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか
を表す、二本鎖または一本鎖であってよいゲノム起源または合成起源のＤＮＡま
たはＲＮＡを称する。ここで用いた「アミノ酸」は、ペプチド配列またはタンパ
ク質配列もしくはその部分を称する。本発明は、バチルスデラミフィカンスプル
ラナーゼをコードするポリヌクレオチド、並びに高ストリンジェンシーの条件下
でバチルスデラミフィカンスプルラナーゼをコードする核酸にハイブリダイズで
きるプルラナーゼ活性をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも70％
、少なくとも80％、少なくとも90％および少なくとも95％の同一性を有するポリ
ヌクレオチドを包含する。
【００２６】 ここで用いたような「単離された」または「精製された」という用語は、それ
が天然に関連する少なくとも１つの成分から除去された１つの核酸またはアミノ
酸を称する。
が天然に関連する少なくとも１つの成分から除去された１つの核酸またはアミノ
酸を称する。
【００２７】好ましい実施の形態の詳細な説明 本発明は、バチルス属宿主中で組換えにより産生されたプルラナーゼが、修飾
されているが、予期せぬことにそれでもまだ、アルファ−１，６−グルコシド結
合の加水分解を触媒する能力を維持しているという発見に関する。組換えにより
産生されたプルラナーゼ産物の修飾は、シグナルペプチダーゼによるシグナル配
列のミスプロセシングおよび細胞外タンパク質分解プロセシングに対する感受性
の結果であるように思われる。修飾プルラナーゼは、デンプン産業に有用な組成
物を産生し、有用な方法で用いられる。
されているが、予期せぬことにそれでもまだ、アルファ−１，６−グルコシド結
合の加水分解を触媒する能力を維持しているという発見に関する。組換えにより
産生されたプルラナーゼ産物の修飾は、シグナルペプチダーゼによるシグナル配
列のミスプロセシングおよび細胞外タンパク質分解プロセシングに対する感受性
の結果であるように思われる。修飾プルラナーゼは、デンプン産業に有用な組成
物を産生し、有用な方法で用いられる。
【００２８】 Ｉ．プルラナーゼ配列 本発明は、アルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維
持する任意の修飾プルラナーゼを包含する。グラム陽性微生物並びにグラム陰性
微生物から得られるものまたはそれから天然に産生されるものを含む、様々なプ
ルラナーゼが当該分野で記載されている。プルラナーゼを天然に産生する微生物
としては、以下に限定されるものではないが、図１−５に開示されたバチルスデ
ラミフィカンス（ベルギー国、B-9000 GHENT, K.L.Ledeganckstraatのゲント大 学、微生物学研究所により、ＬＭＧカルチャーコレクションに寄託された名称T8
9.117Dを有する）の核酸（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）の配列；
1991年10月8日に発行された米国特許第5,056,403号に開示された、バチルスナガ
ノエンシス（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ受入れ番号53
909）；1985年12月24日に発行された米国特許第4,560,651号に開示された、バチ
ルスアシドブルリティクス(B.acidopullulyticus)（スコットランド、アバディ ーンのトリーリサーチステーション(Torry Research Station)、ナショナルコレ
クションオブインダストリアルバクテリア(National Collection of Industrial
Bacteria)、NCIB 11607, NCIB 11610, NCIB 11611, NCIB 11636, NCIB 11637,
NCIB 11639, NCIB 11638, NCIB 11647, NCIB 11777）；1998年2月20日に発行さ れた米国特許第4,902,622号に開示された、バチルスセクトルラムス（日本国、3
05、茨城県、筑波郡、谷田部町、東１丁目、1-3、科学技術庁、発酵研究所、FER
M BP-1471）；1995年2月7日に発行された米国特許第5,387,516号に開示されたバ
チルス属FERM BP-4204；Y.Takasaki et al., 1976, Agric.Biol.Chem. 40:1515 に開示されたバチルスセレウスvar.mycoides（IFO 3330）；肺炎桿菌、米国特許
第3,897,305号（SWISS-PROT id PULA_KLEPN ac P07206 and ATCC 15050）；クレ
ブシエラアエロゲネス(Klebsiella aerogenes)（SWISS-PROT id PULA_KLEAE ac
P07811）；サーモアナエロビウムブロッキイ(Thermoanaerobium brockii)（ＡＴ
ＣＣ受入れ飯ごう33075）、米国特許第4,628,028号；M.Yagisawa et al., 1972,
J.Ferment.Technolo. 50:572に記載されたストレプトミセスｓｐ．；Albertson
et al., 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1354:35-39に開示されたカル ジセルロシルプターサッカロリティクス(Caldicellulosiruptor saccharolyticu
s)；エシェリキアインターメディア(Eschericia intermedia)、Ueda et al., 19
67, Applied Microbiology vol 15:492、米国特許第3,716,455号（1973年発行）
；連鎖球菌ミテス(Streptococcus mites)、Walker 1968, Biochem.J., vol.108:
33；ストレプトミセス属（Ueda et al., 1971, J.Ferment.Tech. Vol.49:552） ；米国特許第4,902,622号に記載されたフラボクロモゲネス属(Flavochromogenes
)；フラボバクテリウムイステロマティカム(Flavobacterium esteromaticum)、 特公昭48-18826；サイトファーガ属(Cytophaga)、1974年に発行された米国特許 第3,790,446号；ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ミクロコッカス属、ノカル
ジア属、ブドウ球菌属、アゾトバクトガー属(Azotobactger)、サルシナ属、英国
特許第11260418号、1974年に発行された米国特許第3,827,940号；および放線菌 類、1973年に発行された米国特許第3,741,873号が挙げられる。図６−９に示し たような保存プルラナーゼ領域を含む当該分野において知られた任意のプルラナ
ーゼは、修飾プルラナーゼがアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触
媒する能力を維持する限り、そのアミノ末端に対して欠失または付加を有するよ
うに修飾することができる。
持する任意の修飾プルラナーゼを包含する。グラム陽性微生物並びにグラム陰性
微生物から得られるものまたはそれから天然に産生されるものを含む、様々なプ
ルラナーゼが当該分野で記載されている。プルラナーゼを天然に産生する微生物
としては、以下に限定されるものではないが、図１−５に開示されたバチルスデ
ラミフィカンス（ベルギー国、B-9000 GHENT, K.L.Ledeganckstraatのゲント大 学、微生物学研究所により、ＬＭＧカルチャーコレクションに寄託された名称T8
9.117Dを有する）の核酸（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）の配列；
1991年10月8日に発行された米国特許第5,056,403号に開示された、バチルスナガ
ノエンシス（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ受入れ番号53
909）；1985年12月24日に発行された米国特許第4,560,651号に開示された、バチ
ルスアシドブルリティクス(B.acidopullulyticus)（スコットランド、アバディ ーンのトリーリサーチステーション(Torry Research Station)、ナショナルコレ
クションオブインダストリアルバクテリア(National Collection of Industrial
Bacteria)、NCIB 11607, NCIB 11610, NCIB 11611, NCIB 11636, NCIB 11637,
NCIB 11639, NCIB 11638, NCIB 11647, NCIB 11777）；1998年2月20日に発行さ れた米国特許第4,902,622号に開示された、バチルスセクトルラムス（日本国、3
05、茨城県、筑波郡、谷田部町、東１丁目、1-3、科学技術庁、発酵研究所、FER
M BP-1471）；1995年2月7日に発行された米国特許第5,387,516号に開示されたバ
チルス属FERM BP-4204；Y.Takasaki et al., 1976, Agric.Biol.Chem. 40:1515 に開示されたバチルスセレウスvar.mycoides（IFO 3330）；肺炎桿菌、米国特許
第3,897,305号（SWISS-PROT id PULA_KLEPN ac P07206 and ATCC 15050）；クレ
ブシエラアエロゲネス(Klebsiella aerogenes)（SWISS-PROT id PULA_KLEAE ac
P07811）；サーモアナエロビウムブロッキイ(Thermoanaerobium brockii)（ＡＴ
ＣＣ受入れ飯ごう33075）、米国特許第4,628,028号；M.Yagisawa et al., 1972,
J.Ferment.Technolo. 50:572に記載されたストレプトミセスｓｐ．；Albertson
et al., 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1354:35-39に開示されたカル ジセルロシルプターサッカロリティクス(Caldicellulosiruptor saccharolyticu
s)；エシェリキアインターメディア(Eschericia intermedia)、Ueda et al., 19
67, Applied Microbiology vol 15:492、米国特許第3,716,455号（1973年発行）
；連鎖球菌ミテス(Streptococcus mites)、Walker 1968, Biochem.J., vol.108:
33；ストレプトミセス属（Ueda et al., 1971, J.Ferment.Tech. Vol.49:552） ；米国特許第4,902,622号に記載されたフラボクロモゲネス属(Flavochromogenes
)；フラボバクテリウムイステロマティカム(Flavobacterium esteromaticum)、 特公昭48-18826；サイトファーガ属(Cytophaga)、1974年に発行された米国特許 第3,790,446号；ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ミクロコッカス属、ノカル
ジア属、ブドウ球菌属、アゾトバクトガー属(Azotobactger)、サルシナ属、英国
特許第11260418号、1974年に発行された米国特許第3,827,940号；および放線菌 類、1973年に発行された米国特許第3,741,873号が挙げられる。図６−９に示し たような保存プルラナーゼ領域を含む当該分野において知られた任意のプルラナ
ーゼは、修飾プルラナーゼがアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触
媒する能力を維持する限り、そのアミノ末端に対して欠失または付加を有するよ
うに修飾することができる。
【００２９】 プルラナーゼをコードする核酸配列は、プライマーおよび／またはプローブと
してプルラナーゼの保存ドメイン（図６−９に示したような）をコードする核酸
配列を用いてハイブリダイゼーション技術により微生物から得ることができる（
米国特許第5,514,576号；Southern,E. 1979, Methods Enzymol. 68:152-176；Sa
iki, et al. 1988, Science 239:487-491）。バチルスデラミフィカンスプルラ ナーゼに関してここに開示されたある実施の形態において、成熟プルラナーゼを
コードする天然に存在する核酸（配列番号１）を、カールスバーグプロテアーゼ
（Jacobs et al., 1985, Nucleic Acid Research 13:8913-8926）およびｅｎｄ ｏＧｌｕＣプロテアーゼ（Kakudo et al., 1992, Journal of Bio.Chem. Vol.26
7:23782-23788）が欠失されたバチルスリケニフォルミス中に導入し、成熟プル ラナーゼをコードする核酸を含むそのバチルスリケニフォルミスを、前記核酸の
発現および発現されたプルラナーゼの分泌に適した条件下で培養した。バチルス
リケニフォルミス中のプロテアーゼ欠失は、当業者に知られた技法により作られ
た。この発酵プロセスにより、発現されたプルラナーゼは、アルファ−１，６−
グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維持する多数のプルラナーゼ種に細
胞外で開裂された。この多数の種は、図１−５に示したような成熟プルラナーゼ
の他に、アミノ末端から最初の98のアミノ酸残基が欠失され、グルタミン酸で始
まるプルラナーゼ、アミノ末端から最初の102のアミノ酸残基が欠失された（グ ルタミン酸で始まる）プルラナーゼ、および成熟プルラナーゼのアミノ末端に少
なくとも１つのアミノ酸残基が付加されたプルラナーゼである。実施例IIに示す
ように、多数の種への細胞外開裂は、発酵ブロス中にプロテアーゼ活性によるも
のであるように思われる。
してプルラナーゼの保存ドメイン（図６−９に示したような）をコードする核酸
配列を用いてハイブリダイゼーション技術により微生物から得ることができる（
米国特許第5,514,576号；Southern,E. 1979, Methods Enzymol. 68:152-176；Sa
iki, et al. 1988, Science 239:487-491）。バチルスデラミフィカンスプルラ ナーゼに関してここに開示されたある実施の形態において、成熟プルラナーゼを
コードする天然に存在する核酸（配列番号１）を、カールスバーグプロテアーゼ
（Jacobs et al., 1985, Nucleic Acid Research 13:8913-8926）およびｅｎｄ ｏＧｌｕＣプロテアーゼ（Kakudo et al., 1992, Journal of Bio.Chem. Vol.26
7:23782-23788）が欠失されたバチルスリケニフォルミス中に導入し、成熟プル ラナーゼをコードする核酸を含むそのバチルスリケニフォルミスを、前記核酸の
発現および発現されたプルラナーゼの分泌に適した条件下で培養した。バチルス
リケニフォルミス中のプロテアーゼ欠失は、当業者に知られた技法により作られ
た。この発酵プロセスにより、発現されたプルラナーゼは、アルファ−１，６−
グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を維持する多数のプルラナーゼ種に細
胞外で開裂された。この多数の種は、図１−５に示したような成熟プルラナーゼ
の他に、アミノ末端から最初の98のアミノ酸残基が欠失され、グルタミン酸で始
まるプルラナーゼ、アミノ末端から最初の102のアミノ酸残基が欠失された（グ ルタミン酸で始まる）プルラナーゼ、および成熟プルラナーゼのアミノ末端に少
なくとも１つのアミノ酸残基が付加されたプルラナーゼである。実施例IIに示す
ように、多数の種への細胞外開裂は、発酵ブロス中にプロテアーゼ活性によるも
のであるように思われる。
【００３０】 本発明の代わりの実施の形態において、成熟プルラナーゼをコードする核酸は
、アミノ末端でアミノ酸が欠失されたまたはアミノ末端にアミノ酸が付加された
修飾プルラナーゼを生成するように遺伝子操作される。遺伝子操作されたプルラ
ナーゼは、宿主細胞、好ましくは、バチルス属宿主細胞中に導入され、修飾プル
ラナーゼの発現および分泌に適した条件下で培養される。成熟プルラナーゼをコ
ードする核酸は、天然に存在する配列、前記核酸の変異形態または天然、合成、
または組換え体いずれの任意の源からのものであっても差し支えない。
、アミノ末端でアミノ酸が欠失されたまたはアミノ末端にアミノ酸が付加された
修飾プルラナーゼを生成するように遺伝子操作される。遺伝子操作されたプルラ
ナーゼは、宿主細胞、好ましくは、バチルス属宿主細胞中に導入され、修飾プル
ラナーゼの発現および分泌に適した条件下で培養される。成熟プルラナーゼをコ
ードする核酸は、天然に存在する配列、前記核酸の変異形態または天然、合成、
または組換え体いずれの任意の源からのものであっても差し支えない。
【００３１】 デンプン分解酵素における領域配列相同性が、Janse et al. (1993) Curr.Gen
et. 24:400-407に開示されている。Janseは、基質結合、触媒作用、およびカル シウム結合において含まれるα−アミラーゼ中の保存領域を開示している。バチ
ルスデラミフィカンス、枯草菌および肺炎桿菌のアミノ酸を配列したものが図６
−９に示されている。
et. 24:400-407に開示されている。Janseは、基質結合、触媒作用、およびカル シウム結合において含まれるα−アミラーゼ中の保存領域を開示している。バチ
ルスデラミフィカンス、枯草菌および肺炎桿菌のアミノ酸を配列したものが図６
−９に示されている。
【００３２】 Janse等によりデンプン分解酵素において相同性が比較されたときに、４つの 保存領域、領域１，２，３および４が示された。これらの領域の内の３つがデン
プン分解酵素において見つかった特異的機能に関連した：領域１：ＤＶＶＩＮＨ
；領域２：ＧＦＲＬＤＡＡＫＨ；および領域４：ＦＶＤＶＨＤ。Albertson等（1
997, Biochimica et Biophysica Acta 1354:35-39）による５つのＩ型プルラナ ーゼ配列のさらなる分析により、グラム陽性およびグラム陰性のプルラナーゼの
群の中に他の保存領域が見つかった。これらには、ＤＰＹ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ
、およびＹＮＷＧＹと称される領域が含まれる。２つの領域ＤＰＹおよびＹＮＷ
ＧＹは、真のプルラナーゼの特徴であると認定された。保存領域Ａ−Ｅは、アミ
ラーゼに関して定義されたβ−シートエレメントと密接に整合する。さらに、図
６−９においてＹおよびＶＷＡＰと称されるプルラナーゼのＮ末端に近い２つの
他の保存領域は、一般のプルラナーゼのＮ末端中のアミノ酸の先端切断の制限を
示している。この予測は、Ｎ末端に向かったときにＹ領域を超えると既知のプル
ラナーゼの中で同一の保存領域がさらにはないことに基づくものである。既知の
プルラナーゼのサイズ不均一性のために、Ｙ領域を超えるＮ末端領域は、約100-
300のアミノ酸の間で異なっていて差し支えない。バチルスデラミフィカンスプ ルラナーゼに関して、309の残基の先端切断により、第１の保存領域（図１−５ におけるアミノ酸残基310でのＹ）が無傷のまま残るであろう。
プン分解酵素において見つかった特異的機能に関連した：領域１：ＤＶＶＩＮＨ
；領域２：ＧＦＲＬＤＡＡＫＨ；および領域４：ＦＶＤＶＨＤ。Albertson等（1
997, Biochimica et Biophysica Acta 1354:35-39）による５つのＩ型プルラナ ーゼ配列のさらなる分析により、グラム陽性およびグラム陰性のプルラナーゼの
群の中に他の保存領域が見つかった。これらには、ＤＰＹ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ
、およびＹＮＷＧＹと称される領域が含まれる。２つの領域ＤＰＹおよびＹＮＷ
ＧＹは、真のプルラナーゼの特徴であると認定された。保存領域Ａ−Ｅは、アミ
ラーゼに関して定義されたβ−シートエレメントと密接に整合する。さらに、図
６−９においてＹおよびＶＷＡＰと称されるプルラナーゼのＮ末端に近い２つの
他の保存領域は、一般のプルラナーゼのＮ末端中のアミノ酸の先端切断の制限を
示している。この予測は、Ｎ末端に向かったときにＹ領域を超えると既知のプル
ラナーゼの中で同一の保存領域がさらにはないことに基づくものである。既知の
プルラナーゼのサイズ不均一性のために、Ｙ領域を超えるＮ末端領域は、約100-
300のアミノ酸の間で異なっていて差し支えない。バチルスデラミフィカンスプ ルラナーゼに関して、309の残基の先端切断により、第１の保存領域（図１−５ におけるアミノ酸残基310でのＹ）が無傷のまま残るであろう。
【００３３】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼ 成熟バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、図１−５に示したアミノ酸配
列（配列番号２）を含む。以下の特徴の説明は、バチルスデラミフィカンスプル
ラナーゼに関連する。バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、4.1から4.5ま
での間の等電点を有し、広い温度範囲において活性であり、熱安定性である。バ
チルスデラミフィカンスプルラナーゼは、酸性ｐＨで活性である。このプルラナ
ーゼは、アミロペクチンおよびプルラン中の両方に存在するα−１，６−グルコ
シド結合の加水分解を触媒することができる。このプルラナーゼは、プルランを
マルトトリオースに、アミロペクチンをアミロースに分解する。アルファ−１，
６−グルコシド結合により互いに結合されたマルトトリオース単位の重合体であ
る多糖類プルランは、Ueda等（Applied Microbiology, 11, 211-215 1963）の方
法によりオーレオバシジウムプルラン(Aureobasidium pullulans)（プラリアプ ルラン(Pullaria pullulans)）から得ることができる。
列（配列番号２）を含む。以下の特徴の説明は、バチルスデラミフィカンスプル
ラナーゼに関連する。バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、4.1から4.5ま
での間の等電点を有し、広い温度範囲において活性であり、熱安定性である。バ
チルスデラミフィカンスプルラナーゼは、酸性ｐＨで活性である。このプルラナ
ーゼは、アミロペクチンおよびプルラン中の両方に存在するα−１，６−グルコ
シド結合の加水分解を触媒することができる。このプルラナーゼは、プルランを
マルトトリオースに、アミロペクチンをアミロースに分解する。アルファ−１，
６−グルコシド結合により互いに結合されたマルトトリオース単位の重合体であ
る多糖類プルランは、Ueda等（Applied Microbiology, 11, 211-215 1963）の方
法によりオーレオバシジウムプルラン(Aureobasidium pullulans)（プラリアプ ルラン(Pullaria pullulans)）から得ることができる。
【００３４】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼはアミロペクチンを加水分解してオリ
ゴ糖類（マルトオリゴ糖類）を形成する。この加水分解中に、約13のグルコース
単位（13の重合度、この分子は「Ａ鎖」とも称される）から構成されたオリゴ糖
の形成が観察され、その後、約47のグルコース単位（47の重合度、この分子は「
Ｂ鎖」とも称される）から構成されるオリゴ糖が形成される。
ゴ糖類（マルトオリゴ糖類）を形成する。この加水分解中に、約13のグルコース
単位（13の重合度、この分子は「Ａ鎖」とも称される）から構成されたオリゴ糖
の形成が観察され、その後、約47のグルコース単位（47の重合度、この分子は「
Ｂ鎖」とも称される）から構成されるオリゴ糖が形成される。
【００３５】 Ａ鎖とＢ鎖を有するオリゴ糖は、D.J.MANNERS（"Structural Analysis of Sta
rch components by Debranching Enzymes" in "New Approaches to research on
Cereal Carbohydrates", Amsterdam, 1985, pages 45-54）およびB.E.ENEVOLDS
EN（"Aspects of the fine structure of starch" in "New Approaches to rese
arch on Cereal Carbohydrates", Amsterdam, 1985, pages 55-60）を参照して 定義される。
rch components by Debranching Enzymes" in "New Approaches to research on
Cereal Carbohydrates", Amsterdam, 1985, pages 45-54）およびB.E.ENEVOLDS
EN（"Aspects of the fine structure of starch" in "New Approaches to rese
arch on Cereal Carbohydrates", Amsterdam, 1985, pages 55-60）を参照して 定義される。
【００３６】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼはジャガイモアミロペクチンを加水分
解する。この加水分解は、プルラナーゼの最適活性の条件下で、すなわち、約60
℃の温度および約4.3のｐＨでの、プルラナーゼの存在下でのアミロペクチンの 水性懸濁液により行うことができる。
解する。この加水分解は、プルラナーゼの最適活性の条件下で、すなわち、約60
℃の温度および約4.3のｐＨでの、プルラナーゼの存在下でのアミロペクチンの 水性懸濁液により行うことができる。
【００３７】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、マルトースの縮合反応を触媒して
テトラホロシド（４つのグルコース単位を有するオリゴ糖）を形成する。
テトラホロシド（４つのグルコース単位を有するオリゴ糖）を形成する。
【００３８】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、約4.5のｐＨで緩衝された溶液中 、基質の不在下において約60℃の温度で測定された、約55時間の半減期を有する
。
。
【００３９】 半減期とは、そのプルラナーゼが、約4.5のｐＨで緩衝された溶液中、基質の 不在下において約60℃の温度での55時間のインキュベーション後に測定された、
少なくとも50％の相対酵素活性を示すことを意味する。
少なくとも50％の相対酵素活性を示すことを意味する。
【００４０】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、酸性ｐＨで熱安定性であり、約4.
5のｐＨで緩衝された溶液中、基質の不在下において約60℃の温度での40時間の インキュベーション後に測定された、少なくとも55％の相対酵素活性を示す。こ
のプルラナーゼは、これらの同一条件下での24時間のインキュベーション後に測
定された、少なくとも70％の相対酵素活性を示す。
5のｐＨで緩衝された溶液中、基質の不在下において約60℃の温度での40時間の インキュベーション後に測定された、少なくとも55％の相対酵素活性を示す。こ
のプルラナーゼは、これらの同一条件下での24時間のインキュベーション後に測
定された、少なくとも70％の相対酵素活性を示す。
【００４１】 相対酵素活性とは、所定のｐＨ、温度、基質および持続時間の条件下で行われ
た試験の過程で測定された酵素活性と、この同一の試験の過程で測定された最大
酵素活性との間の比を意味し、酵素活性はプルランの加水分解の開始から測定さ
れ、最大酵素活性は100の値に任意に固定される。
た試験の過程で測定された酵素活性と、この同一の試験の過程で測定された最大
酵素活性との間の比を意味し、酵素活性はプルランの加水分解の開始から測定さ
れ、最大酵素活性は100の値に任意に固定される。
【００４２】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、酸性ｐＨ値の広い範囲におていさ
らにより安定である。以下に記載する条件下で、このプルラナーゼは３以上のｐ
Ｈで活性である。実際に、バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、基質の不
在下で、約3.5以上のｐＨにおいて約60℃の温度での60分間のインキュベーショ ン後に測定された、少なくとも85％の相対酵素活性を示す。
らにより安定である。以下に記載する条件下で、このプルラナーゼは３以上のｐ
Ｈで活性である。実際に、バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、基質の不
在下で、約3.5以上のｐＨにおいて約60℃の温度での60分間のインキュベーショ ン後に測定された、少なくとも85％の相対酵素活性を示す。
【００４３】 以下に記載する条件下で、このプルラナーゼは７以下のｐＨで活性である。実
際に、バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、基質の不在下で、約5.8以下 のｐＨにおいて約60℃の温度での60分間のインキュベーション後に測定された、
少なくとも85％の相対酵素活性を示す。
際に、バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、基質の不在下で、約5.8以下 のｐＨにおいて約60℃の温度での60分間のインキュベーション後に測定された、
少なくとも85％の相対酵素活性を示す。
【００４４】 前記プルラナーゼは、好ましくは、これらの同一の条件下で約3.8から約５ま での間のｐＨ範囲において測定された、90％よりも大きい相対酵素活性を示す。
【００４５】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、4.0よりも大きいｐＨ範囲におい て、約60℃の温度で測定された、最適酵素活性を生じる。このバチルスデラミフ
ィカンスプルラナーゼは、4.8未満のｐＨ範囲において、60℃の温度で測定され た最適酵素活性を生じる。このバチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、好ま
しくは、4.3のｐＨにおいて、60℃の温度で測定された最適酵素活性を生じる。 さらに、このプルラナーゼは、55℃から65℃までの温度範囲で、より具体的には
60℃で、約4.3のｐＨで測定された、最適酵素活性を生じる。
ィカンスプルラナーゼは、4.8未満のｐＨ範囲において、60℃の温度で測定され た最適酵素活性を生じる。このバチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、好ま
しくは、4.3のｐＨにおいて、60℃の温度で測定された最適酵素活性を生じる。 さらに、このプルラナーゼは、55℃から65℃までの温度範囲で、より具体的には
60℃で、約4.3のｐＨで測定された、最適酵素活性を生じる。
【００４６】 バチルスデラミフィカンスプルラナーゼは、約60℃の温度において約3.8から 約4.9までの間のｐＨ範囲で最大酵素活性（最大酵素活性は、60℃の温度および4
.3のｐＨで測定された）の80％よりも大きい酵素活性を生じる。
.3のｐＨで測定された）の80％よりも大きい酵素活性を生じる。
【００４７】 菌株のバチルスデラミフィカンスＴ８９．１１７Ｄは、1993年6月21日に、LMG
P-13056の番号でブダペスト条約にしたがって、ベルジアンコーディネーテッド
コレクションズオブマイクロオーガニズム(BELGIAN CORRDINATED COLLECTIONS O
F MICROORGANISM)（ベルギー国、B-9000 GHENT, K.L.Ledeganckstraatのゲント 大学、微生物学研究所、ＬＭＧカルチャーコレクション）と称されるコレクショ
ン中に寄託されている。
P-13056の番号でブダペスト条約にしたがって、ベルジアンコーディネーテッド
コレクションズオブマイクロオーガニズム(BELGIAN CORRDINATED COLLECTIONS O
F MICROORGANISM)（ベルギー国、B-9000 GHENT, K.L.Ledeganckstraatのゲント 大学、微生物学研究所、ＬＭＧカルチャーコレクション）と称されるコレクショ
ン中に寄託されている。
【００４８】 II.発現系 本発明は、グラム陽性微生物およびグラム陰性微生物中で修飾プルラナーゼを
産生および分泌するための宿主細胞、発現方法および系を提供する。ある実施の
形態において、宿主細胞は、修飾プルラナーゼをコードする核酸を含むように遺
伝子操作される。別の実施の形態において、宿主細胞は、培養により、修飾プル
ラナーゼを産生する、全長のまたは成熟プルラナーゼをコードする核酸を含むよ
うに遺伝子操作される。好ましい実施の形態において、宿主細胞は、内因性プロ
テアーゼの突然変異誘発または欠失を有するように修飾されたバチルス属の一員
である。
産生および分泌するための宿主細胞、発現方法および系を提供する。ある実施の
形態において、宿主細胞は、修飾プルラナーゼをコードする核酸を含むように遺
伝子操作される。別の実施の形態において、宿主細胞は、培養により、修飾プル
ラナーゼを産生する、全長のまたは成熟プルラナーゼをコードする核酸を含むよ
うに遺伝子操作される。好ましい実施の形態において、宿主細胞は、内因性プロ
テアーゼの突然変異誘発または欠失を有するように修飾されたバチルス属の一員
である。
【００４９】 宿主細胞中のプロテアーゼの不活化 天然に存在するプロテアーゼを産生できない発現宿主細胞を産生するには、そ
の宿主細胞のゲノムからの天然に存在する遺伝子を置換および／または不活化す
る必要がある。好ましい実施の形態において、突然変異は非可逆突然変異である
。
の宿主細胞のゲノムからの天然に存在する遺伝子を置換および／または不活化す
る必要がある。好ましい実施の形態において、突然変異は非可逆突然変異である
。
【００５０】 プロテアーゼをコードする核酸を突然変異させる方法の１つは、該核酸または
その一部をクローンし、位置指定突然変異誘発により該核酸を修飾し、プラスミ
ド上で細胞中に突然変異された核酸を再導入することである。相同組換えにより
、突然変異された遺伝子を染色体中に導入してもよい。親宿主細胞において、そ
の結果、天然に存在する核酸および突然変異された核酸は、その染色体上で縦に
並んで位置している。二回目の組換え後、修飾された配列は、それによって親宿
主細胞の子孫のために染色体遺伝子中に突然変異が効果的に導入された染色体中
に残されている。
その一部をクローンし、位置指定突然変異誘発により該核酸を修飾し、プラスミ
ド上で細胞中に突然変異された核酸を再導入することである。相同組換えにより
、突然変異された遺伝子を染色体中に導入してもよい。親宿主細胞において、そ
の結果、天然に存在する核酸および突然変異された核酸は、その染色体上で縦に
並んで位置している。二回目の組換え後、修飾された配列は、それによって親宿
主細胞の子孫のために染色体遺伝子中に突然変異が効果的に導入された染色体中
に残されている。
【００５１】 プロテアーゼタンパク質分解活性を不活化させる別の方法は、染色体遺伝子コ
ピーを欠失させることによるものである。好ましい実施の形態において、全遺伝
子が欠失され、その欠失は、可逆を不可能にするような様式で行われる。別の好
ましい実施の形態において、染色体中に残されている核酸配列が、プラスミドコ
ード化メタロプロテアーゼ（plasmid encoded metallo-protease）遺伝子との相
同組換えにとって短すぎるとする場合に、部分的欠失が行われる。別の好ましい
実施の形態において、触媒アミノ酸残基をコードする核酸が欠失される。
ピーを欠失させることによるものである。好ましい実施の形態において、全遺伝
子が欠失され、その欠失は、可逆を不可能にするような様式で行われる。別の好
ましい実施の形態において、染色体中に残されている核酸配列が、プラスミドコ
ード化メタロプロテアーゼ（plasmid encoded metallo-protease）遺伝子との相
同組換えにとって短すぎるとする場合に、部分的欠失が行われる。別の好ましい
実施の形態において、触媒アミノ酸残基をコードする核酸が欠失される。
【００５２】 前記天然に存在する微生物プロテアーゼの欠失は以下のように行うことができ
る。その５’および３’領域を含むプロテアーゼ遺伝子を単離し、クローニング
ベクター中に挿入する。このプロテアーゼ遺伝子のコーディング領域をそのベク
ターからインビトロで欠失し、十分な量の５’および３’隣接(flanking)配列を
後に残して、前記親宿主細胞中の天然に存在する遺伝子との相同組換えを行う。
次いで、このベクターを宿主細胞中に形質転換させる。該ベクターは、隣接領域
における相同組換えにより染色体中に組み込まれる。この方法により、プロテア
ーゼ遺伝子が欠失された菌株が得られる。
る。その５’および３’領域を含むプロテアーゼ遺伝子を単離し、クローニング
ベクター中に挿入する。このプロテアーゼ遺伝子のコーディング領域をそのベク
ターからインビトロで欠失し、十分な量の５’および３’隣接(flanking)配列を
後に残して、前記親宿主細胞中の天然に存在する遺伝子との相同組換えを行う。
次いで、このベクターを宿主細胞中に形質転換させる。該ベクターは、隣接領域
における相同組換えにより染色体中に組み込まれる。この方法により、プロテア
ーゼ遺伝子が欠失された菌株が得られる。
【００５３】 組込み方法に用いられるベクターは、好ましくはプラスミドである。選択性マ
ーカを含めて、所望の組換え微生物の同定を容易にしてもよい。さらに、当業者
に認識されるように、前記ベクターは、好ましくは、染色体中に選択的に組み込
むことのできるものである。このことは、複製の誘発起源、例えば、温度感受性
起源を前記プラスミド中に導入することにより実施できる。複製の起源が感受性
である温度で形質転換体を増殖させることにより、前記プラスミドの増殖機能が
不活化され、それによって、染色体組込体(integrant)を選択する手段が提供さ れる。抗生物質のような選択性マーカが存在する状態の高温での増殖には、組込
体が選択されるであろう。組込み機構が国際出願公開第WO88/06623号に記載され
ている。
ーカを含めて、所望の組換え微生物の同定を容易にしてもよい。さらに、当業者
に認識されるように、前記ベクターは、好ましくは、染色体中に選択的に組み込
むことのできるものである。このことは、複製の誘発起源、例えば、温度感受性
起源を前記プラスミド中に導入することにより実施できる。複製の起源が感受性
である温度で形質転換体を増殖させることにより、前記プラスミドの増殖機能が
不活化され、それによって、染色体組込体(integrant)を選択する手段が提供さ れる。抗生物質のような選択性マーカが存在する状態の高温での増殖には、組込
体が選択されるであろう。組込み機構が国際出願公開第WO88/06623号に記載され
ている。
【００５４】 キャンベル型機構による組込みは、プロテアーゼ遺伝子の５’隣接領域におい
て生じることができ、プルラナーゼ座における染色体中の全プラスミドベクター
を担持するプロテアーゼ陽性菌株が得られる。非正統的組換えにより異なる結果
が得られるので、核酸配列決定または制限地図等により、完全遺伝子が欠失され
たか否かを決定する必要があるであろう。
て生じることができ、プルラナーゼ座における染色体中の全プラスミドベクター
を担持するプロテアーゼ陽性菌株が得られる。非正統的組換えにより異なる結果
が得られるので、核酸配列決定または制限地図等により、完全遺伝子が欠失され
たか否かを決定する必要があるであろう。
【００５５】 天然に存在するプロテアーゼ遺伝子を不活化させる別の方法は、ある微生物を
突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドにより形質転化することにより、染色体遺
伝子コピーを突然変異誘発することである。あるいは、染色体プロテアーゼ遺伝
子を、相同組換えにより突然変異遺伝子と置き換えても差し支えない。
突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドにより形質転化することにより、染色体遺
伝子コピーを突然変異誘発することである。あるいは、染色体プロテアーゼ遺伝
子を、相同組換えにより突然変異遺伝子と置き換えても差し支えない。
【００５６】 本発明は、ａｐｒ、ｎｐｒ、ｅｐｒ、ｍｐｒ、ｉｓｐおよび／またはｂｐｆお
よび／または当業者に知られた他のものにおける欠失または突然変異のような、
プロテアーゼ欠失または突然変異を有するバチルス属宿主細胞を包含する。グラ
ム陽性微生物のバチルス属におけるプロテアーゼの欠失に関する開示が、米国特
許第5,264,366号、同第5,585,253号、同第5,620,880号およびヨーロッパ特許公 告第EP0369827B1号に見つけることができる。
よび／または当業者に知られた他のものにおける欠失または突然変異のような、
プロテアーゼ欠失または突然変異を有するバチルス属宿主細胞を包含する。グラ
ム陽性微生物のバチルス属におけるプロテアーゼの欠失に関する開示が、米国特
許第5,264,366号、同第5,585,253号、同第5,620,880号およびヨーロッパ特許公 告第EP0369827B1号に見つけることができる。
【００５７】 突然変異体を欠失させるアッセイの１つは、プロテアーゼ基質を含有する培地
上にバチルス属宿主細胞を増殖させ、そのコロニーの周りの輪または透明な区域
の出現またはそれらのないことを測定する各工程を含む。不活性プロテアーゼを
有する宿主細胞は、コロニーの周りにほとんどまたは全く輪を示さない。
上にバチルス属宿主細胞を増殖させ、そのコロニーの周りの輪または透明な区域
の出現またはそれらのないことを測定する各工程を含む。不活性プロテアーゼを
有する宿主細胞は、コロニーの周りにほとんどまたは全く輪を示さない。
【００５８】 III．修飾プルラナーゼの産生 宿主細胞における修飾プルラナーゼの産生に関して、修飾プルラナーゼをコー
ドする核酸の少なくとも１つのコピーを含む、好ましくは、多数のコピーを含む
発現ベクターが、修飾プルラナーゼの発現に適した条件下で宿主細胞中に形質転
換される。本発明によれば、修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレオチド、
もしくは修飾プルラナーゼのアミノ酸変種（その変種がα−１，６−グルコシド
結合の加水分解を触媒する能力を維持している限り）をコードする融合タンパク
質またはポリヌクレオチド相同配列を用いて、宿主細胞中でそれらの発現を指示
する組換えＤＮＡ分子を産生してもよい。宿主細胞は、グラム陽性またはグラム
陰性細胞であってもよい。ある実施の形態において、宿主細胞はバチルス属に属
する。別の実施の形態において、バチルス属宿主細胞としては、枯草菌、バチル
スリケニフォルミス、バチルスレンタス、バチルスブレビス、バチルスステアロ
サーモフィルス、バチルスアルカロフィルス、バチルスアミロリケファシエンス
、バチルスコアギュランス、バチルスサーキュランス、バチルスラウタスおよび
バチルスサリンギエンシスが挙げられる。好ましい実施の形態において、グラム
陽性微生物細胞はバチルスリケニフォルミスである。
ドする核酸の少なくとも１つのコピーを含む、好ましくは、多数のコピーを含む
発現ベクターが、修飾プルラナーゼの発現に適した条件下で宿主細胞中に形質転
換される。本発明によれば、修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレオチド、
もしくは修飾プルラナーゼのアミノ酸変種（その変種がα−１，６−グルコシド
結合の加水分解を触媒する能力を維持している限り）をコードする融合タンパク
質またはポリヌクレオチド相同配列を用いて、宿主細胞中でそれらの発現を指示
する組換えＤＮＡ分子を産生してもよい。宿主細胞は、グラム陽性またはグラム
陰性細胞であってもよい。ある実施の形態において、宿主細胞はバチルス属に属
する。別の実施の形態において、バチルス属宿主細胞としては、枯草菌、バチル
スリケニフォルミス、バチルスレンタス、バチルスブレビス、バチルスステアロ
サーモフィルス、バチルスアルカロフィルス、バチルスアミロリケファシエンス
、バチルスコアギュランス、バチルスサーキュランス、バチルスラウタスおよび
バチルスサリンギエンシスが挙げられる。好ましい実施の形態において、グラム
陽性微生物細胞はバチルスリケニフォルミスである。
【００５９】 当業者により理解されるように、天然に存在しないコドンを有するポリヌクレ
オチド配列を産生することが有益であるかもしれない。例えば、天然に存在する
配列から産生される転写体よりも長い半減期のような望ましい特性を有する組換
えＲＮＡ転写体を産生するため、または発現の速度を増加させるために、特定の
グラム陽性宿主細胞により好まれるコドン（Murray E et al. (1989) Nuc Acids
res 17:477-508）を選択することができる。
オチド配列を産生することが有益であるかもしれない。例えば、天然に存在する
配列から産生される転写体よりも長い半減期のような望ましい特性を有する組換
えＲＮＡ転写体を産生するため、または発現の速度を増加させるために、特定の
グラム陽性宿主細胞により好まれるコドン（Murray E et al. (1989) Nuc Acids
res 17:477-508）を選択することができる。
【００６０】 本発明により用いてもよい変更されたプルラナーゼポリヌクレオチド配列は、
異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換を含んで、同一または機能的に
同等な修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレオチドが得られる。ここで用い
た「欠失」は、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在し
ないヌクレオチドまたはアミノ酸配列いずれかにおける変化として定義される。
異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換を含んで、同一または機能的に
同等な修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレオチドが得られる。ここで用い
た「欠失」は、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在し
ないヌクレオチドまたはアミノ酸配列いずれかにおける変化として定義される。
【００６１】 ここで用いた「挿入」または「付加」は、天然に存在する修飾プルラナーゼと
比較して、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が付加された
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。
比較して、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が付加された
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。
【００６２】 ここで用いた「置換」は、それぞれ、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸によ
り１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の交替により生じる。
り１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の交替により生じる。
【００６３】 コードされたタンパク質は、沈黙(silent)変化を生じ、機能的に同等な修飾プ
ルラナーゼが得られるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を示してもよい。慎
重なアミノ酸置換は、変種が分泌を変調させる能力を維持する限り、残基の極性
、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性おける類似性に基づ
いて行われるであろう。例えば、負に荷電されたアミノ酸としてはアスパラギン
酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電されたアミノ酸としては、リシンお
よびアルギニンが挙げられ；同様な親水性値を有する荷電されていない極性基を
有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニ
ン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およ
びチロシンが挙げられる。
ルラナーゼが得られるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を示してもよい。慎
重なアミノ酸置換は、変種が分泌を変調させる能力を維持する限り、残基の極性
、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性おける類似性に基づ
いて行われるであろう。例えば、負に荷電されたアミノ酸としてはアスパラギン
酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電されたアミノ酸としては、リシンお
よびアルギニンが挙げられ；同様な親水性値を有する荷電されていない極性基を
有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニ
ン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およ
びチロシンが挙げられる。
【００６４】 遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を変更するため
に、本発明の修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレオチドを操作してもよい
。例えば、新しい制限部位を挿入するため、グリコシル化パターンを変更するた
め、またはコドンの優先を変えるために、当業者に知られた技法、例えば、位置
指定突然変異誘発を用いて突然変異を導入してもよい。
に、本発明の修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレオチドを操作してもよい
。例えば、新しい制限部位を挿入するため、グリコシル化パターンを変更するた
め、またはコドンの優先を変えるために、当業者に知られた技法、例えば、位置
指定突然変異誘発を用いて突然変異を導入してもよい。
【００６５】 本発明のある実施の形態において、修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレ
オチドを異種配列にライゲーションして、融合タンパク質をコードしてもよい。
融合タンパク質を、修飾プルラナーゼヌクレオチド配列と異種タンパク質配列と
の間に位置する開裂部位を含むように操作して、修飾プルラナーゼを開裂させ、
異種融合パートナーから精製してもよい。
オチドを異種配列にライゲーションして、融合タンパク質をコードしてもよい。
融合タンパク質を、修飾プルラナーゼヌクレオチド配列と異種タンパク質配列と
の間に位置する開裂部位を含むように操作して、修飾プルラナーゼを開裂させ、
異種融合パートナーから精製してもよい。
【００６６】 IV．ベクター配列 宿主微生物中で本発明のプルラナーゼを発現するのに用いられる発現ベクター
は、修飾プルラナーゼに関連する少なくとも１つのプロモータを含み、そのプロ
モータはこの宿主細胞中で機能的である。本発明のある実施の形態において、プ
ロモータは選択されたプルラナーゼに関する野生型プロモータであり、本発明の
別の実施の形態において、プロモータはプルラナーゼに対して異種であるが、ま
だ宿主細胞中で機能的である。本発明のある実施の形態において、修飾プルラナ
ーゼをコードする核酸は、微生物ゲノム中に安定に組み込まれる。
は、修飾プルラナーゼに関連する少なくとも１つのプロモータを含み、そのプロ
モータはこの宿主細胞中で機能的である。本発明のある実施の形態において、プ
ロモータは選択されたプルラナーゼに関する野生型プロモータであり、本発明の
別の実施の形態において、プロモータはプルラナーゼに対して異種であるが、ま
だ宿主細胞中で機能的である。本発明のある実施の形態において、修飾プルラナ
ーゼをコードする核酸は、微生物ゲノム中に安定に組み込まれる。
【００６７】 好ましい実施の形態において、発現ベクターは、好ましくは、そのベクターに
特有の少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む多重クローニング部
位カセットを含んで、核酸の操作をより容易にする。好ましい実施の形態におい
て、ベクターは１つ以上の選択性マーカも含む。ここに用いたように、選択性マ
ーカという用語は、ベクターを含有する宿主微生物の選択を容易にできるそれら
宿主中において発現できる遺伝子を称する。そのような選択性マーカの例として
は、以下に限定されるものではないが、エリスロマイシン、アクチノマイシン、
クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンのような抗生物質が挙げられる。
特有の少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む多重クローニング部
位カセットを含んで、核酸の操作をより容易にする。好ましい実施の形態におい
て、ベクターは１つ以上の選択性マーカも含む。ここに用いたように、選択性マ
ーカという用語は、ベクターを含有する宿主微生物の選択を容易にできるそれら
宿主中において発現できる遺伝子を称する。そのような選択性マーカの例として
は、以下に限定されるものではないが、エリスロマイシン、アクチノマイシン、
クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンのような抗生物質が挙げられる。
【００６８】 Ｖ．形質転換 細菌、菌類、ほ乳類および昆虫細胞を含む様々な宿主細胞を、修飾プルラナー
ゼの産生に用いることができる。一般的な形質転換方法が、Current Protocols
In Moledular Biology（vol.1, edited by Ausubel et al., John Wiley & Sons
, Inc. 1987, Chapter 9）に教示されており、その例としては、ＤＥＡＥ−デキ
ストランおよび電気泳動を用いた形質転換である、リン酸カルシウム法が挙げら
れる。植物形質転換法がRodriquez（1995年5月26日に発行された国際出願公開第
WO95/14099号）に教示されている。
ゼの産生に用いることができる。一般的な形質転換方法が、Current Protocols
In Moledular Biology（vol.1, edited by Ausubel et al., John Wiley & Sons
, Inc. 1987, Chapter 9）に教示されており、その例としては、ＤＥＡＥ−デキ
ストランおよび電気泳動を用いた形質転換である、リン酸カルシウム法が挙げら
れる。植物形質転換法がRodriquez（1995年5月26日に発行された国際出願公開第
WO95/14099号）に教示されている。
【００６９】 好ましい実施の形態において、宿主細胞はグラム陽性微生物である、別の好ま
しい実施の形態において、宿主細胞はバチルス属である。さらに好ましい実施の
形態において、バチルス属宿主はバチルスリケニフォルミスである。本発明のあ
る実施の形態において、本発明の修飾プルラナーゼをコードする核酸が、バチル
ス属宿主細胞内で増幅できる発現ベクターにより宿主細胞中に導入される。バチ
ルス属に関する適切な増幅プラスミドが、ここに引用するMolecular Biological
Methods for Bacillus, Ed. Harwood and Cutting, John Wiley & Sons, 1990 に記載されている。プラスミドについての３章を参照のこと。枯草菌に関する適
切な増幅プラスミドが92頁に列記されている。
しい実施の形態において、宿主細胞はバチルス属である。さらに好ましい実施の
形態において、バチルス属宿主はバチルスリケニフォルミスである。本発明のあ
る実施の形態において、本発明の修飾プルラナーゼをコードする核酸が、バチル
ス属宿主細胞内で増幅できる発現ベクターにより宿主細胞中に導入される。バチ
ルス属に関する適切な増幅プラスミドが、ここに引用するMolecular Biological
Methods for Bacillus, Ed. Harwood and Cutting, John Wiley & Sons, 1990 に記載されている。プラスミドについての３章を参照のこと。枯草菌に関する適
切な増幅プラスミドが92頁に列記されている。
【００７０】 別の実施の形態において、本発明の修飾プルラナーゼをコードする核酸が、宿
主微生物ゲノム中に安定に組み込まれる。好ましい宿主細胞はグラム陽性宿主細
胞である。別の好ましい宿主はバチルス属である。バチルス属宿主細胞としては
、枯草菌、バチルスリケニフォルミス、バチルスレンタス、バチルスブレビス、
バチルスステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィルス、バチルスアミロ
リケファシエンス、バチルスコアギュランス、バチルスサーキュランス、バチル
スラウタスおよびバチルスサリンギエンシスが挙げられる。好ましい宿主は枯草
菌である。別の好ましい宿主はバチルスリケニフォルミスである。バチルス属中
でＤＮＡを直接クローニングするいくつかの戦略が文献に記載されてきた。プラ
スミドマーカレスキュー(rescue)形質転換には、部分的に相同なレジデントプラ
スミドを担持するコンピテント細胞による供与プラスミドの吸収が含まれる（Co
ntente et al., Plasmid 2:555-571 (1979); Haima et al., Mol.Gen.genet. 22
3:185-191 (1990); Weinrauch et al., J.Bacteriol. 154(3):1077-1087 (1983)
; and Weinrauch et al., J.Bacteriol. 169(3):1205-1211 (1987)）。入ってき
た供与プラミスドは、染色体形質転換に似たプロセスにおいて、レジデント「ヘ
ルパー」プラスミドの相同領域と再結合する。
主微生物ゲノム中に安定に組み込まれる。好ましい宿主細胞はグラム陽性宿主細
胞である。別の好ましい宿主はバチルス属である。バチルス属宿主細胞としては
、枯草菌、バチルスリケニフォルミス、バチルスレンタス、バチルスブレビス、
バチルスステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィルス、バチルスアミロ
リケファシエンス、バチルスコアギュランス、バチルスサーキュランス、バチル
スラウタスおよびバチルスサリンギエンシスが挙げられる。好ましい宿主は枯草
菌である。別の好ましい宿主はバチルスリケニフォルミスである。バチルス属中
でＤＮＡを直接クローニングするいくつかの戦略が文献に記載されてきた。プラ
スミドマーカレスキュー(rescue)形質転換には、部分的に相同なレジデントプラ
スミドを担持するコンピテント細胞による供与プラスミドの吸収が含まれる（Co
ntente et al., Plasmid 2:555-571 (1979); Haima et al., Mol.Gen.genet. 22
3:185-191 (1990); Weinrauch et al., J.Bacteriol. 154(3):1077-1087 (1983)
; and Weinrauch et al., J.Bacteriol. 169(3):1205-1211 (1987)）。入ってき
た供与プラミスドは、染色体形質転換に似たプロセスにおいて、レジデント「ヘ
ルパー」プラスミドの相同領域と再結合する。
【００７１】 プロトプラスト形質転換による形質転換が、枯草菌に関しては、Chang and Co
hen, (1979) Mol.Gen.Genet 168:111-115に；バチルスメガテリウム(B.megateri
um)に関しては、Vorobjeva et al., (1980) FEMS Mictobiol.Letters 7:261-273
に；バチルスアミロリケファシエンスに関しては、Smith et al., (1986) Appl.
and Env.Microbiol. 51:634に；バチルスサリンギエンシスに関しては、Fisher
et al., (1981) Arch.Microbiol. 139:213-217に；バチルススファエリスク(B.s
phaericus)に関しては、McDonald (1984) J.Gen.Microbiol. 130:203に；および
バチルスラーバエ(B.larvae)に関しては、Bakhiet et al., (1985, Appl.Enviro
n.Microbiol. 49:577)に記載されている。Mann et al.,（1986, Current Microb
iol. 13:131-135 report on transformation of Bacillus protoplasts and Hol
ubova, (1985) Folia Microbiol. 30:97）は、ＤＮＡ含有リポソームを用いてＤ
ＮＡをプロトプラスト中に導入する方法を開示している。
hen, (1979) Mol.Gen.Genet 168:111-115に；バチルスメガテリウム(B.megateri
um)に関しては、Vorobjeva et al., (1980) FEMS Mictobiol.Letters 7:261-273
に；バチルスアミロリケファシエンスに関しては、Smith et al., (1986) Appl.
and Env.Microbiol. 51:634に；バチルスサリンギエンシスに関しては、Fisher
et al., (1981) Arch.Microbiol. 139:213-217に；バチルススファエリスク(B.s
phaericus)に関しては、McDonald (1984) J.Gen.Microbiol. 130:203に；および
バチルスラーバエ(B.larvae)に関しては、Bakhiet et al., (1985, Appl.Enviro
n.Microbiol. 49:577)に記載されている。Mann et al.,（1986, Current Microb
iol. 13:131-135 report on transformation of Bacillus protoplasts and Hol
ubova, (1985) Folia Microbiol. 30:97）は、ＤＮＡ含有リポソームを用いてＤ
ＮＡをプロトプラスト中に導入する方法を開示している。
【００７２】 VI．形質転換体の同定 宿主細胞が、プルラナーゼ活性をコードする修飾されたまたは天然に存在する
遺伝子により形質転換されていようといなかろうと、マーカ遺伝子発現の存在／
不在の検出により、関心のある遺伝子が存在するか否かを示すことができる。し
かしながら、その発現は確認すべきである。例えば、修飾プルラナーゼをコード
する核酸がマーカ遺伝子配列内に挿入された場合、その挿入体を含有する組換え
細胞は、マーカ遺伝子機能がないことにより同定することができる。あるいは、
マーカ遺伝子を、１つのプロモータの制御下でプルラナーゼをコードする核酸と
縦列に配置しても差し支えない。誘導または選択に応答したマーカ遺伝子の発現
は通常、同様にプルラナーゼの発現を示す。
遺伝子により形質転換されていようといなかろうと、マーカ遺伝子発現の存在／
不在の検出により、関心のある遺伝子が存在するか否かを示すことができる。し
かしながら、その発現は確認すべきである。例えば、修飾プルラナーゼをコード
する核酸がマーカ遺伝子配列内に挿入された場合、その挿入体を含有する組換え
細胞は、マーカ遺伝子機能がないことにより同定することができる。あるいは、
マーカ遺伝子を、１つのプロモータの制御下でプルラナーゼをコードする核酸と
縦列に配置しても差し支えない。誘導または選択に応答したマーカ遺伝子の発現
は通常、同様にプルラナーゼの発現を示す。
【００７３】 あるいは、修飾プルラナーゼに関するコーディング配列を含み、タンパク質を
発現する宿主細胞は、当業者に知られた様々な方法により同定されてもよい。こ
れらの方法としては、以下に限定されるものではないが、核酸またはタンパク質
の検出および／または定量を行うための膜ベース、溶液ベース、またはチップベ
ースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーショ
ンおよびタンパク質生物学的検定または免疫学的検定技法が挙げられる。
発現する宿主細胞は、当業者に知られた様々な方法により同定されてもよい。こ
れらの方法としては、以下に限定されるものではないが、核酸またはタンパク質
の検出および／または定量を行うための膜ベース、溶液ベース、またはチップベ
ースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーショ
ンおよびタンパク質生物学的検定または免疫学的検定技法が挙げられる。
【００７４】 宿主微生物中のプルラナーゼポリヌクレオチド配列の存在は、プルラナーゼポ
リヌクレオチド配列の部分または断片のプローブを用いたＤＮＡ−ＤＮＡまたは
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる
。
リヌクレオチド配列の部分または断片のプローブを用いたＤＮＡ−ＤＮＡまたは
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる
。
【００７５】 VII．プルラナーゼ活性の検定 プルラナーゼ活性を検出し、測定する様々な検定が当業者に知られている。バ
チルスデラミフィカンスプルラナーゼ（ＰＵＮ）の酵素単位は、4.5のｐＨ、60 ℃の温度、およびプルランの存在下で、毎分１μＭのグルコース当量の速度で還
元糖の放出を触媒する酵素の量として定義される。
チルスデラミフィカンスプルラナーゼ（ＰＵＮ）の酵素単位は、4.5のｐＨ、60 ℃の温度、およびプルランの存在下で、毎分１μＭのグルコース当量の速度で還
元糖の放出を触媒する酵素の量として定義される。
【００７６】 プルラナーゼ活性は、基質の存在不在にかかわらずに測定することができる。
ある態様において、プルラナーゼ活性は、以下のプロトコルにしたがって基質の
存在下で測定することができる。ｐＨ4.5の50ｎＭ酢酸緩衝液中のプルランの１ ％強度溶液１ｍｌを10分間に亘り60℃でインキュベーションする。0.2から１Ｐ ＵＮ／ｍｌまでの間の活性に対応する0.1ｍｌのプルラナーゼ溶液をそこに加え る。0.4ｍｌの0.5ＭのＮａＯＨを加えることにより、15分後に反応を停止させる
。放出された還元等を、ＳＯＭＯＧＹＩ−ＮＥＬＳＯＮ［J.Biol.Chem., 153 (1
944) pages 375-380; and J.Biol.Chem., 160 (1945), pages 61-68］の方法に より分析する。
ある態様において、プルラナーゼ活性は、以下のプロトコルにしたがって基質の
存在下で測定することができる。ｐＨ4.5の50ｎＭ酢酸緩衝液中のプルランの１ ％強度溶液１ｍｌを10分間に亘り60℃でインキュベーションする。0.2から１Ｐ ＵＮ／ｍｌまでの間の活性に対応する0.1ｍｌのプルラナーゼ溶液をそこに加え る。0.4ｍｌの0.5ＭのＮａＯＨを加えることにより、15分後に反応を停止させる
。放出された還元等を、ＳＯＭＯＧＹＩ−ＮＥＬＳＯＮ［J.Biol.Chem., 153 (1
944) pages 375-380; and J.Biol.Chem., 160 (1945), pages 61-68］の方法に より分析する。
【００７７】 別の方法を用いてプルラナーゼを分析しても差し支えない。プルランの存在下
の酵素反応は、上述した試験条件にしたがって行われ、次いで、硫酸（0.1Ｎ） の添加により停止される。次いで、様々な成分を分離するために、プルランの加
水分解生成物をＨＰＬＣクロマトグラフィー（バイオラドからのHPX-87Hカラム ；移動相は10ｍＭのＨ2ＳＯ4である）にかける。形成されたマルトトリオースの
量は、得られたピークの面積の測定により判断される。
の酵素反応は、上述した試験条件にしたがって行われ、次いで、硫酸（0.1Ｎ） の添加により停止される。次いで、様々な成分を分離するために、プルランの加
水分解生成物をＨＰＬＣクロマトグラフィー（バイオラドからのHPX-87Hカラム ；移動相は10ｍＭのＨ2ＳＯ4である）にかける。形成されたマルトトリオースの
量は、得られたピークの面積の測定により判断される。
【００７８】 いわゆる宿鎖活性、すなわち、アミロペクチン中に存在するα−１，６−グル
コシド結合の加水分解は、ヨウ素の存在下でアミロペクチンからのアミロースの
放出により生じた青色の増大により定量することができる。宿鎖酵素活性は以下
のプロトコルにしたがって測定される。ｐＨ4.5の50ｍＭの酢酸緩衝液を含有す る１％強度のアミロペクチン溶液0.4ｍｌを10分間に亘り60℃でインキュベーシ ョンする。0.2ｍｌのプルラナーゼを加えることにより反応を開始し、0.3ＭのＨ
Ｃｌを0.4ｍｌ加えることにより30分後に停止させる。次いで、ヨウ素の0.0025 ％（ｖ／ｖ）強度溶液0.8ｍｌを0.2ｍｌのこの反応混合物に加え、光学濃度を56
5ｎｍで測定する。
コシド結合の加水分解は、ヨウ素の存在下でアミロペクチンからのアミロースの
放出により生じた青色の増大により定量することができる。宿鎖酵素活性は以下
のプロトコルにしたがって測定される。ｐＨ4.5の50ｍＭの酢酸緩衝液を含有す る１％強度のアミロペクチン溶液0.4ｍｌを10分間に亘り60℃でインキュベーシ ョンする。0.2ｍｌのプルラナーゼを加えることにより反応を開始し、0.3ＭのＨ
Ｃｌを0.4ｍｌ加えることにより30分後に停止させる。次いで、ヨウ素の0.0025 ％（ｖ／ｖ）強度溶液0.8ｍｌを0.2ｍｌのこの反応混合物に加え、光学濃度を56
5ｎｍで測定する。
【００７９】 好ましい方法が実施例IVに開示されており、その方法は、プルラナーゼ活性の
測定のために溶性赤プルラン基質を用いる比色法によるものである。プルラナー
ゼ酵素がその基質を加水分解するので、染色された基質の溶性断片が反応溶液中
に放出される。次いで、基質がエタノール溶液により沈殿させられ、上澄みが分
光光度計により色強度について評価される。この検定において、色強度の程度は
酵素活性に比例する。
測定のために溶性赤プルラン基質を用いる比色法によるものである。プルラナー
ゼ酵素がその基質を加水分解するので、染色された基質の溶性断片が反応溶液中
に放出される。次いで、基質がエタノール溶液により沈殿させられ、上澄みが分
光光度計により色強度について評価される。この検定において、色強度の程度は
酵素活性に比例する。
【００８０】 VIII．組換えタンパク質の分泌 宿主微生物中で修飾プルラナーゼの分泌レベルを測定し、分泌されたタンパク
質を検出する手段としては、そのタンパク質に特異的なポリクローナルまたはモ
ノクローナルいずれかの抗体を使用することが挙げられる。それらの例としては
、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）および
傾向活性化細胞分離捕集法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらと他の検定法は、
中でも、Hampton R et al. (1990, Serological Methods, a Laboratory Manual
, APS Press, St Paul NM)およびMaddox DE et al. (1983, J Exp Med 158:1211
)に記載されている。
質を検出する手段としては、そのタンパク質に特異的なポリクローナルまたはモ
ノクローナルいずれかの抗体を使用することが挙げられる。それらの例としては
、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）および
傾向活性化細胞分離捕集法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらと他の検定法は、
中でも、Hampton R et al. (1990, Serological Methods, a Laboratory Manual
, APS Press, St Paul NM)およびMaddox DE et al. (1983, J Exp Med 158:1211
)に記載されている。
【００８１】 様々なラベルおよび接合技法が当業者に知られており、様々な核酸およびアミ
ノ酸検定法において使用することができる。特定のポリヌクレオチド配列を検出
するためのラベルされたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを産生す
る手段とては、オリゴラベリング、ニックトランスレーション、末端標識または
標識付けられたヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、該ヌ
クレオチド配列、またはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの産生のために、
ベクター中にクローニングしてもよい。そのようなベクターは、当該分野におい
て知られており、市販されており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のような適切なＲＮ
Ａポリメラーゼおよび標識付けられたヌクレオチドの添加によりインビトロでＲ
ＮＡプローブを合成するために用いてもよい。
ノ酸検定法において使用することができる。特定のポリヌクレオチド配列を検出
するためのラベルされたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを産生す
る手段とては、オリゴラベリング、ニックトランスレーション、末端標識または
標識付けられたヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、該ヌ
クレオチド配列、またはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの産生のために、
ベクター中にクローニングしてもよい。そのようなベクターは、当該分野におい
て知られており、市販されており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のような適切なＲＮ
Ａポリメラーゼおよび標識付けられたヌクレオチドの添加によりインビトロでＲ
ＮＡプローブを合成するために用いてもよい。
【００８２】 ファーマシアバイオテック（ニュージャージー州、ピスキャタウェイ(Piscata
way)）、プロメガ（ウィスコンシン州、マジソン）、およびＵＳバイオケミカル
コープ（オハイオ州、クリーブランド）のような多くの会社が、これらの方法の
ためのキットおよびプロトコルを市販している。適切なレポーター(reporter)分
子またはラベルとしては、放射性核種、酵素、蛍光体、化学発光体、または色素
剤並びに基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子等が挙げられる。そのようなラベ
ルの使用を教示している特許としては、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752
号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号お
よび同第4,366,241号が挙げられる。また、ここに引用する米国特許第4,816,567
号に示されているように、組換えイムノグロブリンを産生してもよい。
way)）、プロメガ（ウィスコンシン州、マジソン）、およびＵＳバイオケミカル
コープ（オハイオ州、クリーブランド）のような多くの会社が、これらの方法の
ためのキットおよびプロトコルを市販している。適切なレポーター(reporter)分
子またはラベルとしては、放射性核種、酵素、蛍光体、化学発光体、または色素
剤並びに基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子等が挙げられる。そのようなラベ
ルの使用を教示している特許としては、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752
号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号お
よび同第4,366,241号が挙げられる。また、ここに引用する米国特許第4,816,567
号に示されているように、組換えイムノグロブリンを産生してもよい。
【００８３】 IX．タンパク質の精製 修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細
胞を、そのプルラナーゼの発現および細胞培地からの該プルラナーゼの回収に適
した条件下で培養してもよい。内因性プロテアーゼ活性の突然変異または欠失を
含む組換えグラム陽性宿主細胞が培地中に分泌されるであろう。他の組換え構築
物は、修飾プルラナーゼポリヌクレオチド配列を、溶性タンパク質の精製を促進
させるポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させるかもし
れない（Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol 12:441-53）。
胞を、そのプルラナーゼの発現および細胞培地からの該プルラナーゼの回収に適
した条件下で培養してもよい。内因性プロテアーゼ活性の突然変異または欠失を
含む組換えグラム陽性宿主細胞が培地中に分泌されるであろう。他の組換え構築
物は、修飾プルラナーゼポリヌクレオチド配列を、溶性タンパク質の精製を促進
させるポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させるかもし
れない（Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol 12:441-53）。
【００８４】 そのような精製促進ドメインとしては、以下に限定されるものではないが、固
定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール
のような金属キレート形成ペプチド（Porath J (1992) Protein Expr Purif 3:2
63-281）、固定化されたイムノグロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａ
ドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（ワシントン州、シアト
ルのイムネクスコープ(Immunex Corp)）に用いられるドメインが挙げられる。前
記精製ドメインと前記異種タンパク質との間にあるエンテロキナーゼ（カリフォ
ルニア州、サンディエゴのインビトロゲン(Invitrogen)）またはＸＡ因子のよう
な開裂可能なリンカー配列の含有を用いて、精製を促進させても差し支えない。
定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール
のような金属キレート形成ペプチド（Porath J (1992) Protein Expr Purif 3:2
63-281）、固定化されたイムノグロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａ
ドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（ワシントン州、シアト
ルのイムネクスコープ(Immunex Corp)）に用いられるドメインが挙げられる。前
記精製ドメインと前記異種タンパク質との間にあるエンテロキナーゼ（カリフォ
ルニア州、サンディエゴのインビトロゲン(Invitrogen)）またはＸＡ因子のよう
な開裂可能なリンカー配列の含有を用いて、精製を促進させても差し支えない。
【００８５】 Ｘ．本発明の使用 修飾プルラナーゼ 本発明の精製プルラナーゼには、食品産業、薬品産業および化学産業を含む様
々な産業において用途が見出されている。修飾プルラナーゼは、「抗−腐敗(sta
ling)」剤、すなわち、貯蔵中にパンが腐敗するのを防ぐ添加剤として製パンに 、または低カロリービールの製造中の醸造に使用することができる。プルラナー
ゼはまた、脂肪の代替物としてアミロースが用いられている低カロリー食品の調
製にも使用できる。例えば、フルーツジュースを澄ませるために、前記プルラナ
ーゼを使用することができる。
々な産業において用途が見出されている。修飾プルラナーゼは、「抗−腐敗(sta
ling)」剤、すなわち、貯蔵中にパンが腐敗するのを防ぐ添加剤として製パンに 、または低カロリービールの製造中の醸造に使用することができる。プルラナー
ゼはまた、脂肪の代替物としてアミロースが用いられている低カロリー食品の調
製にも使用できる。例えば、フルーツジュースを澄ませるために、前記プルラナ
ーゼを使用することができる。
【００８６】 食品用途に関して、プルラナーゼは支持体上に固定化することができる。酵素
を固定化する技法が熟練者によく知られている。
を固定化する技法が熟練者によく知られている。
【００８７】 プルラナーゼはまた、アミロペクチンを加水分解し、このアミロペクチンから
出発するオリゴ糖を形成しても差し支えない。プルラナーゼはまた、マルトース
から出発するテトラハロシドを形成しても差し支えない。
出発するオリゴ糖を形成しても差し支えない。プルラナーゼはまた、マルトース
から出発するテトラハロシドを形成しても差し支えない。
【００８８】 プルラナーゼはまた、単糖類またはオリゴ糖類を縮合させて、アルファ−１，
６型の結合を生じさせても差し支えない。プルラナーゼはデンプンの液化に用い
ることもできる。
６型の結合を生じさせても差し支えない。プルラナーゼはデンプンの液化に用い
ることもできる。
【００８９】 修飾プルラナーゼは、それぞれの未修飾形態と同じ様式で用いることができる
。未修飾形態においてアルカリ性条件下の活性を有する修飾プルラナーゼは、ア
ルカリ性条件下で活性を維持する。未修飾形態において酸性条件下の活性を有す
る修飾プルラナーゼは、酸性条件下で活性を維持する。意図する用途にしたがっ
て、特定の修飾プルラナーゼを配合する。修飾プルラナーゼを含む酵素組成物に
、安定剤または防腐剤を加えても差し支えない。例えば、修飾プルラナーゼは、
プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、デンプン、プルラ
ン、グルコースまたはソルビトールのような砂糖、塩化ナトリウム、塩化カルシ
ウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウムのような塩、もしくはこれらの
物質の内２つ以上の混合物を加えることにより安定化させることができる。本発
明による酵素組成物は、１つ以上の他の酵素を含んでも差し支えない。そのよう
な酵素としては、以下に限定されるものではないが、グルコアミラーゼ、α−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、シクロマル
トデキストリン、グルコトランスフェラーゼ、β−グルカナーゼ、グルコースイ
ソメラーゼ、糖化酵素、およびグルコシド結合を開裂する酵素またはこれらの内
２つ以上の混合物が挙げられる。好ましい実施の形態において、酵素組成物は、
本発明の修飾プルラナーゼを80％およびグルコアミラーゼを20％含む。
。未修飾形態においてアルカリ性条件下の活性を有する修飾プルラナーゼは、ア
ルカリ性条件下で活性を維持する。未修飾形態において酸性条件下の活性を有す
る修飾プルラナーゼは、酸性条件下で活性を維持する。意図する用途にしたがっ
て、特定の修飾プルラナーゼを配合する。修飾プルラナーゼを含む酵素組成物に
、安定剤または防腐剤を加えても差し支えない。例えば、修飾プルラナーゼは、
プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、デンプン、プルラ
ン、グルコースまたはソルビトールのような砂糖、塩化ナトリウム、塩化カルシ
ウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウムのような塩、もしくはこれらの
物質の内２つ以上の混合物を加えることにより安定化させることができる。本発
明による酵素組成物は、１つ以上の他の酵素を含んでも差し支えない。そのよう
な酵素としては、以下に限定されるものではないが、グルコアミラーゼ、α−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、シクロマル
トデキストリン、グルコトランスフェラーゼ、β−グルカナーゼ、グルコースイ
ソメラーゼ、糖化酵素、およびグルコシド結合を開裂する酵素またはこれらの内
２つ以上の混合物が挙げられる。好ましい実施の形態において、酵素組成物は、
本発明の修飾プルラナーゼを80％およびグルコアミラーゼを20％含む。
【００９０】 本発明を実施する様式および方法は、以下の実施例を参照して、当業者により
一層十分に理解されるであろう。それらの実施例は、本発明の範囲またはそれに
向けられた請求項の範囲を制限するようにはいかようにも意図したものではない
。
一層十分に理解されるであろう。それらの実施例は、本発明の範囲またはそれに
向けられた請求項の範囲を制限するようにはいかようにも意図したものではない
。
【００９１】実施例 実施例Ｉ： 実施例Ｉは、ここに記載した修飾プルラナーゼの産生を示す。プルラナーゼを
コードする核酸配列は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの標準ＰＣＲ
プライマー指定酵素増幅（Saiki, R.K., et al., 1988, Science 239:487-491）
およびＰＣＲ融合技法（Fleming,A.B., et al. Appl.Environ.Microbiol. 61, 3
775-3780）のような組換えＤＮＡ技法により修飾する。所望の修飾プルラナーゼ
をコードするＤＮＡを、シグナル配列、好ましくは宿主微生物のシグナル配列の
Ｃ末端に融合させる。この構築物を、クローニングし、枯草菌またはバチルスリ
ケニフォルミスのような宿主細胞中に形質転換させ、標準発酵条件下で培養させ
る。修飾プルラナーゼを、発酵ブロスから精製し、活性について検定する。
コードする核酸配列は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの標準ＰＣＲ
プライマー指定酵素増幅（Saiki, R.K., et al., 1988, Science 239:487-491）
およびＰＣＲ融合技法（Fleming,A.B., et al. Appl.Environ.Microbiol. 61, 3
775-3780）のような組換えＤＮＡ技法により修飾する。所望の修飾プルラナーゼ
をコードするＤＮＡを、シグナル配列、好ましくは宿主微生物のシグナル配列の
Ｃ末端に融合させる。この構築物を、クローニングし、枯草菌またはバチルスリ
ケニフォルミスのような宿主細胞中に形質転換させ、標準発酵条件下で培養させ
る。修飾プルラナーゼを、発酵ブロスから精製し、活性について検定する。
【００９２】実施例II： 実施例IIには、成熟バチルスデラミフィカンスプルラナーゼをコードする核酸
を含む組換えバチルスリケニフォルミス宿主細胞であって、カールスバーグおよ
びｅｎｄ ＧｌｕＣプロテアーゼが欠失された宿主細胞を培養する際に得られた
プルラナーゼの修飾形態が記載されている。バチルスリケニフォルミスを、天然
培地中において標準発酵条件下で培養した。発酵ブロスに標準ＨＰＬＣ分析を行
った。その結果が、発酵プロセス中に形成された様々な種の修飾プルラナーゼの
時間経過を示す図１０に示されている。ピーク１は、105ｋＤの分子量を有する 成熟バチルスデラミフィカンスプルラナーゼを示し；ピーク２は、成熟バチルス
デラミフィカンスプルラナーゼのアミノ末端から102のアミノ酸が欠失された修 飾プルラナーゼを示し；ピーク３は、前記アミノ末端から98のアミノ酸が欠失さ
れた修飾プルラナーゼを示す。それらはいずれも標準ＨＰＬＣ分析により測定さ
れた。成熟配列にアミノ酸が付加された修飾プルラナーゼ種は、ＨＰＬＣ分析に
より検出できないが、核酸配列決定により検出された。図１０は、発酵時間に亘
り、成熟バチルスデラミフィカンスプルラナーゼに対応するピーク１が減少し、
一方でピーク２と３が増加することを示している。図１１および１２は、カール
スバーグおよびｅｎｄ ＧｌｕＣプロテアーゼが欠失されたバチルスリケニフォ
ルミスの発酵の際に産生された修飾プルラナーゼの安定性を示している。成熟バ
チルスデラミフィカンスをコードする核酸を含むバチルスリケニフォルミスを、
修飾プルラナーゼの発現および分泌に適した条件下で培養し、その発酵ブロスを
室温で、4.5、5.5および6.5のｐＨに調節した。修飾プルラナーゼは、4.5のｐＨ
で最も安定であった。
を含む組換えバチルスリケニフォルミス宿主細胞であって、カールスバーグおよ
びｅｎｄ ＧｌｕＣプロテアーゼが欠失された宿主細胞を培養する際に得られた
プルラナーゼの修飾形態が記載されている。バチルスリケニフォルミスを、天然
培地中において標準発酵条件下で培養した。発酵ブロスに標準ＨＰＬＣ分析を行
った。その結果が、発酵プロセス中に形成された様々な種の修飾プルラナーゼの
時間経過を示す図１０に示されている。ピーク１は、105ｋＤの分子量を有する 成熟バチルスデラミフィカンスプルラナーゼを示し；ピーク２は、成熟バチルス
デラミフィカンスプルラナーゼのアミノ末端から102のアミノ酸が欠失された修 飾プルラナーゼを示し；ピーク３は、前記アミノ末端から98のアミノ酸が欠失さ
れた修飾プルラナーゼを示す。それらはいずれも標準ＨＰＬＣ分析により測定さ
れた。成熟配列にアミノ酸が付加された修飾プルラナーゼ種は、ＨＰＬＣ分析に
より検出できないが、核酸配列決定により検出された。図１０は、発酵時間に亘
り、成熟バチルスデラミフィカンスプルラナーゼに対応するピーク１が減少し、
一方でピーク２と３が増加することを示している。図１１および１２は、カール
スバーグおよびｅｎｄ ＧｌｕＣプロテアーゼが欠失されたバチルスリケニフォ
ルミスの発酵の際に産生された修飾プルラナーゼの安定性を示している。成熟バ
チルスデラミフィカンスをコードする核酸を含むバチルスリケニフォルミスを、
修飾プルラナーゼの発現および分泌に適した条件下で培養し、その発酵ブロスを
室温で、4.5、5.5および6.5のｐＨに調節した。修飾プルラナーゼは、4.5のｐＨ
で最も安定であった。
【００９３】実施例III： 実施例IIIは、異なる百分率でプルラナーゼを含む酵素組成物を比較する糖化 プロセスを示す。20％のグルコアミラーゼ：80％の修飾プルラナーゼ（20:80） 活性または75％のグルコアミラーゼ：25％の修飾プルラナーゼ活性（75:25）の いずれかを含む酵素組成物を、溶解固体のメートルトン毎の0.550、0.635および
0.718リットルの濃度の酵素組成物で糖化プロセスにおいて試験した。図１３に 示したように、20％のグルコアミラーゼ：80％のプルラナーゼ活性を含む酵素組
成物は、望ましくない二糖類の形成を増加させずに、最終的なグルコースの収率
を増加させることができる。さらに、20:80の酵素組成物の絶対濃度は、75:25の
酵素組成物またはグルコアミラーゼ単独の場合に見られた二糖類の形成における
望ましくない増加なくして、増大させることができる。
0.718リットルの濃度の酵素組成物で糖化プロセスにおいて試験した。図１３に 示したように、20％のグルコアミラーゼ：80％のプルラナーゼ活性を含む酵素組
成物は、望ましくない二糖類の形成を増加させずに、最終的なグルコースの収率
を増加させることができる。さらに、20:80の酵素組成物の絶対濃度は、75:25の
酵素組成物またはグルコアミラーゼ単独の場合に見られた二糖類の形成における
望ましくない増加なくして、増大させることができる。
【００９４】実施例IV： 実施例IVは、本発明の修飾プルラナーゼの活性を測定する検定を示す。この検
定は、プルラナーゼ活性を測定するための溶性赤−プルラン基質を用いた比色法
に基づく。
定は、プルラナーゼ活性を測定するための溶性赤−プルラン基質を用いた比色法
に基づく。
【００９５】 試薬の調製 16.406ｇの無水酢酸ナトリウムまたは27.21ｇの酢酸ナトリウム三水和物を秤 量し、これを磁石かき混ぜ棒で撹拌しながら１Ｌの目盛り付きシリンダ中の900 ｍｌの脱イオン水（ＤＩ）中に溶解させることにより、200ｍＭの酢酸ナトリウ ム緩衝液ｐＨ5.0ｗ／アカルボース(Acarbose)（密度約1.010）を調製した。ｐＨ
を氷酢酸により5.0に調節した。0.300ｇのアカルボースをこの溶液に加え、溶解
させた。脱イオン水で容積を1000ｍＬにし、混合した。
を氷酢酸により5.0に調節した。0.300ｇのアカルボースをこの溶液に加え、溶解
させた。脱イオン水で容積を1000ｍＬにし、混合した。
【００９６】 ２％の赤プルラン基質の調製 1.00ｇの赤プルラン基質を秤量し、約20-30分間に亘り磁石かき混ぜ棒で撹拌 することにより、50ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液中に溶解させた。この溶液は、
４℃で貯蔵する２週間に亘り安定である。
４℃で貯蔵する２週間に亘り安定である。
【００９７】 標準試薬の調製 容積形ピペットを用いて、プルラナーゼ標準物の1:10希釈液を調製した。標準
物の指定(assigned)活性は、195.9ＡＳＰＵ／ｍｌであった。以下の標準試薬は 、1:10の保存希釈液より標準物から調製した。
物の指定(assigned)活性は、195.9ＡＳＰＵ／ｍｌであった。以下の標準試薬は 、1:10の保存希釈液より標準物から調製した。
【００９８】 試料の調製 対照については、ジェネンカーインターナショナルから得られるOptimax L-30
0 MA7EC191 PU B1 3-19Aを用いた。この対照を酢酸ナトリウム緩衝液中で1:1000
に希釈した。全ての試料を酢酸ナトリウム緩衝液中で希釈して、標準曲線上に乗
る最終反応吸光度を得た。試料を室温にした。最初の希釈には、最小の100ｕｌ の試料を用いた。
0 MA7EC191 PU B1 3-19Aを用いた。この対照を酢酸ナトリウム緩衝液中で1:1000
に希釈した。全ての試料を酢酸ナトリウム緩衝液中で希釈して、標準曲線上に乗
る最終反応吸光度を得た。試料を室温にした。最初の希釈には、最小の100ｕｌ の試料を用いた。
【００９９】 検定方法 250ｕｌの各々の標準試薬濃度の対照および試料を２つの適切な標識付けられ た微量遠心分離管中に入れた。各々の管に、リピータ(repeater)ピペットおよび
１にセットされた12.5ｍｌのコンビチップ(Combitip)により250ｕｌの２％の基 質溶液を加えた。この試料を３秒間に亘り渦を生じさせ、20分間に亘り40℃でイ
ンキュベーションした。この試料を水浴から取り出し、上述したのと同じ順番で
直ちに1.0ｍｌの95％のＥｔＯＨをこの試料に加えた。リピータピペットおよび １または４セットされた12.5ｍｌまたは50ｍｌのコンビチップを用いた。試料を
３秒間に亘り渦を生じさせた。これらの試料を5-10分間に亘り室温でインキュベ
ーションし、次いで、ベンチトップ遠心分離機中で10分間に亘り遠心分離した。
標準および試料の上澄みを、1.5ｍＬのキュベットを用いて510ｎｍで分光光度計
で読みとった。（この分光光度計は、95％のＥｔＯＨでゼロに設定した） 計算 標準濃度および相関吸光度（ブランクの吸光度を引く）を用いて、校正曲線を
、コンピュータのスプレッドシート、プログラムできる計算機、またはグラフ用
紙により作成する。この曲線は、0.998以上の相関係数で標準濃度の範囲に亘り 直線であるべきである。この検定の精度は、5-10％ＣＶの間に入るべきである。
液体に関して：ｕ／ｍｌ＝（標準曲線からのｕ／ｍｌ）＊（試料希釈液）
１にセットされた12.5ｍｌのコンビチップ(Combitip)により250ｕｌの２％の基 質溶液を加えた。この試料を３秒間に亘り渦を生じさせ、20分間に亘り40℃でイ
ンキュベーションした。この試料を水浴から取り出し、上述したのと同じ順番で
直ちに1.0ｍｌの95％のＥｔＯＨをこの試料に加えた。リピータピペットおよび １または４セットされた12.5ｍｌまたは50ｍｌのコンビチップを用いた。試料を
３秒間に亘り渦を生じさせた。これらの試料を5-10分間に亘り室温でインキュベ
ーションし、次いで、ベンチトップ遠心分離機中で10分間に亘り遠心分離した。
標準および試料の上澄みを、1.5ｍＬのキュベットを用いて510ｎｍで分光光度計
で読みとった。（この分光光度計は、95％のＥｔＯＨでゼロに設定した） 計算 標準濃度および相関吸光度（ブランクの吸光度を引く）を用いて、校正曲線を
、コンピュータのスプレッドシート、プログラムできる計算機、またはグラフ用
紙により作成する。この曲線は、0.998以上の相関係数で標準濃度の範囲に亘り 直線であるべきである。この検定の精度は、5-10％ＣＶの間に入るべきである。
液体に関して：ｕ／ｍｌ＝（標準曲線からのｕ／ｍｌ）＊（試料希釈液）
【図１】 図１はバチルスデラミフィカンスから得られるプルラナーゼの成熟アミノ酸（
配列番号２）配列をコードする核酸（配列番号１）を示す
配列番号２）配列をコードする核酸（配列番号１）を示す
【図２】 図２は図１の続きを示す
【図３】 図３は図２の続きを示す
【図４】 図４は図３の続きを示す
【図５】 図５は図４の続きを示す
【図６】 図６は、バチルスデラミフィカンス（pullseqsig.seq.PROと表す）、枯草菌（
subpull.seq.proと表す）、および肺炎桿菌（kebpnseqsig.seq.proと表す）から
得られるプルラナーゼのアミノ末端の保存ドメインおよび変異性、並びにそれぞ
れのプルラナーゼのシグナル配列を示す、これらのプルラナーゼのアミノ酸配列
の整合である。
subpull.seq.proと表す）、および肺炎桿菌（kebpnseqsig.seq.proと表す）から
得られるプルラナーゼのアミノ末端の保存ドメインおよび変異性、並びにそれぞ
れのプルラナーゼのシグナル配列を示す、これらのプルラナーゼのアミノ酸配列
の整合である。
【図７】 図７は図６の続きを示す
【図８】 図８は図７の続きを示す
【図９】 図９は図８の続きを示す
【図１０】 図１０は発酵の時間経過および発酵中に形成された修飾プルラナーゼの様々な
種を示す
種を示す
【図１１】 図１１は、標準ＨＰＬＣ分析により測定した、ｐＨの関数としての修飾プルラ
ナーゼ種の安定性を示す。
ナーゼ種の安定性を示す。
【図１２】 図１２は、標準ＨＰＬＣ分析により測定した、ｐＨの関数としての修飾プルラ
ナーゼ種の安定性を示す。
ナーゼ種の安定性を示す。
【図１３】 図１３は、様々なプルラナーゼおよびグルコアミラーゼ濃度を含む酵素組成物
の、糖化時間に亘る最終的なグルコース収率および二糖類の形成への影響を示す
。
の、糖化時間に亘る最終的なグルコース収率および二糖類の形成への影響を示す
。
【図１４】 図１４は、溶解固体のメートルトン当たり0.55リットルの酵素における、20:8
0、75:25、および100％のグルコアミラーゼを含む酵素組成物を用いた液化デン プンの糖化中の溶解固体（％ｗ／ｗ）（Ｙ軸）の最終的なグルコース収率への影
響を示す。
0、75:25、および100％のグルコアミラーゼを含む酵素組成物を用いた液化デン プンの糖化中の溶解固体（％ｗ／ｗ）（Ｙ軸）の最終的なグルコース収率への影
響を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:10） Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 9/44 (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:07 Ｃ１２Ｒ 1:07 1:22） 1:22） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，Ｈ Ｒ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シェティー，ジャヤラマ ケー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94566 プレザントン ブラックストン プレイス 4806 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA12 CA06 CA20 DA07 FA18 GA11 GA25 4B050 CC04 DD02 EE01 LL01 LL02 LL03 LL05 4B064 AF02 AF03 AF04 CA22 CB07 CC01 CC24 CD19 DA01 DA10 DA13 4B065 AA15X AA15Y AA29Y AB01 AC14 AC15 BA01 BA16 CA31 CA41 CA43 CA44 CA46
Claims (51)
- 【請求項１】 アルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒できる
修飾プルラナーゼ。 - 【請求項２】 前記プルラナーゼが、グラム陽性またはグラム陰性の微生物
から得られるプルラナーゼの修飾物であることを特徴とする請求項１記載の修飾
プルラナーゼ。 - 【請求項３】 前記グラム陽性微生物が、枯草菌(B.subtilis)、バチルスデ
ラミフィカンス(B.deramificans)、バチルスステアロサーモフィルス(B.stearot
hermophilus)、バチルスナガノエンシス(B.naganoensis)、バチルスフラボカル ダリウス(B.flavocaldarius)、バチルスアシドブルリティクス(B.acidopullulyt
icus)、バチルスsp APC-9603、バチルスセクトルラムス(B.sectorramus)、バチ ルスセレウス(B.cereus)、およびバチルスファームス(B.fermus)を含むことを特
徴とする請求項２記載の修飾プルラナーゼ。 - 【請求項４】 前記グラム陰性微生物が、肺炎桿菌およびクレブシエラアエ
ロゲネス(Klebsiella aerogenes)を含むことを特徴とする請求項２記載の修飾プ
ルラナーゼ。 - 【請求項５】 前記バチルスデラミフィカンスプルラナーゼが、ＬＭＧカル
チャーコレクションにおいて名称T89.117Dを有することを特徴とする請求項３記
載の修飾プルラナーゼ。 - 【請求項６】 前記修飾が、アミノ末端から約100のアミノ酸の欠失である ことを特徴とする請求項１記載の修飾プルラナーゼ。
- 【請求項７】 前記修飾が、アミノ末端から約200のアミノ酸の欠失である ことを特徴とする請求項１記載の修飾プルラナーゼ。
- 【請求項８】 前記修飾が、アミノ末端から約300のアミノ酸の欠失である ことを特徴とする請求項１記載の修飾プルラナーゼ。
- 【請求項９】 前記欠失が、バチルスデラミフィカンスプルラナーゼのアミ
ノ末端から98のアミノ酸であることを特徴とする請求項６記載の修飾プルラナー
ゼ。 - 【請求項１０】 前記欠失が、バチルスデラミフィカンスプルラナーゼのア
ミノ末端から102のアミノ酸であることを特徴とする請求項６記載の修飾プルラ ナーゼ。 - 【請求項１１】 前記修飾が、成熟プルラナーゼアミノ酸配列のアミノ末端
への少なくとも１つのアミノ酸の付加であることを特徴とする請求項１記載の修
飾プルラナーゼ。 - 【請求項１２】 前記プルラナーゼがバチルスデラミフィカンスから得られ
、前記アミノ末端で付加されたアミノ酸がアラニンであることを特徴とする請求
項１１記載の修飾プルラナーゼ。 - 【請求項１３】 成熟プルラナーゼをコードする核酸を含む組換え宿主細胞
を得、該宿主細胞を修飾プルラナーゼの産生に適した条件下で培養し、該修飾プ
ルラナーゼを必要に応じて回収する各工程を含む方法により産生されることを特
徴とする修飾プルラナーゼ。 - 【請求項１４】 前記成熟プルラナーゼをコードする核酸が、配列番号１に
示したポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70％の同一性を有することを特
徴とする請求項１３記載の修飾プルラナーゼ。 - 【請求項１５】 前記宿主細胞が、カールスバーグプロテアーゼをコードす
る第１の遺伝子およびｅｎｄ ＧｌｕＣプロテアーゼをコードする第２の遺伝子
を含むバチルスリケニフォルミスであり、該第１および／または第２の遺伝子が
、前記プロテアーゼ活性が実質的に除去されるように変更されたプロテアーゼを
コードすることを特徴とする請求項１３記載の修飾プルラナーゼ。 - 【請求項１６】 請求項１記載の修飾プルラナーゼをコードするポリヌクレ
オチドを含むことを特徴とする核酸。 - 【請求項１７】 配列番号１に示したポリヌクレオチド配列に対して少なく
とも70％の同一性を有することを特徴とする請求項１６記載の核酸。 - 【請求項１８】 配列番号１に示した前記ポリヌクレオチド配列を有するこ
とを特徴とする請求項１６記載の核酸。 - 【請求項１９】 請求項１６記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクタ
ー。 - 【請求項２０】 請求項１９記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿
主微生物。 - 【請求項２１】 前記微生物がバチルス属であることを特徴とする請求項２
０記載の宿主微生物。 - 【請求項２２】 前記バチルス属が、枯草菌(B.subtilis)、バチルスリケニ
フォルミス(B.licheniformis)、バチルスレンタス(B.lentus)、バチルスブレビ ス(B.brevis)、バチルスステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)、バチ
ルスアルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルスアミロリケファシエンス(B.a
myloliquefaciens)、バチルスコアギュランス(B.coagulans)、バチルスサーキュ
ランス(B.circulans)、バチルスラウタス(B.lautus)およびバチルススリンギエ ンシス(B.thuringiensis)を含むことを特徴とする請求項２１記載の宿主微生物 。 - 【請求項２３】 宿主細胞中で修飾プルラナーゼを産生する方法であって、 ａ） 修飾プルラナーゼをコードする核酸を含む組換え宿主細胞を得、 ｂ） 該宿主細胞を前記修飾プルラナーゼの産生に適した条件下で培養する、
各工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２４】 ｃ） 前記修飾プルラナーゼを回収する工程を含むことを
特徴とする請求項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 前記宿主細胞が、枯草菌(B.subtilis)、バチルスリケニフ
ォルミス(B.licheniformis)、バチルスレンタス(B.lentus)、バチルスブレビス(
B.brevis)、バチルスステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)、バチル スアルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルスアミロリケファシエンス(B.amy
loliquefaciens)、バチルスコアギュランス(B.coagulans)、バチルスサーキュラ
ンス(B.circulans)、バチルスラウタス(B.lautus)およびバチルススリンギエン シス(B.thuringiensis)を含むバチルス属であることを特徴とする請求項２３記 載の方法。 - 【請求項２６】 前記バチルス属宿主細胞がバチルスリケニフォルミスであ
ることを特徴とする請求項２５記載の方法。 - 【請求項２７】 修飾プルラナーゼを含むことを特徴とする酵素組成物。
- 【請求項２８】 前記修飾プルラナーゼが、アミノ末端から約100のアミノ 酸が欠失されていることを特徴とする請求項２７記載の酵素組成物。
- 【請求項２９】 前記修飾プルラナーゼが、アミノ末端から約200のアミノ 酸が欠失されていることを特徴とする請求項２７記載の酵素組成物。
- 【請求項３０】 前記修飾プルラナーゼが、アミノ末端から約300のアミノ 酸が欠失されていることを特徴とする請求項２７記載の酵素組成物。
- 【請求項３１】 前記修飾プルラナーゼが、アミノ酸残基99のグルタミン酸
で始まる、配列番号２に示したアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２
７記載の組成物。 - 【請求項３２】 前記修飾プルラナーゼが、アミノ酸残基103のグルタミン 酸で始まる、配列番号２に示したアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
２７記載の組成物。 - 【請求項３３】 グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α
−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、シクロマルトデキストリン、グルコトラン
スフェラーゼ、β−グルカナーゼ、グルコースイソメラーゼ、糖化酵素、および
／またはグルコシド結合を開裂する酵素からなる群より選択される酵素を含むこ
とを特徴とする請求項２７記載の組成物。 - 【請求項３４】 グルコアミラーゼを含むことを特徴とする請求項２７記載
の組成物。 - 【請求項３５】 前記グルコアミラーゼがアスペルギルス菌株から得られる
ことを特徴とする請求項３４記載の組成物。 - 【請求項３６】 前記アスペルギルス菌株が、黒色アスペルギルス(Aspergi
llus niger)、アスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori)およびアスペルギ
ルスフォエチダス(Aspergillus foetidus)を含むことを特徴とする請求項３５記
載の組成物。 - 【請求項３７】 前記組成物が固体状態にあることを特徴とする請求項２７
記載の組成物。 - 【請求項３８】 前記組成物が液体状態にあることを特徴とする請求項２７
記載の組成物。 - 【請求項３９】 少なくとも60％の修飾プルラナーゼを含むことを特徴とす
る請求項２７記載の組成物。 - 【請求項４０】 少なくとも80％の修飾プルラナーゼを含むことを特徴とす
る請求項２７記載の組成物。 - 【請求項４１】 デンプンを糖化する方法であって、該方法により糖化副生
成物の濃度を減少させることができ、水性液化デンプンを、修飾プルラナーゼを
含む酵素組成物に接触させる工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項４２】 前記修飾プルラナーゼが、グラム陰性またはグラム陽性微
生物から得られるプルラナーゼのアミノ末端から約100までのアミノ酸、約200ま
でのアミノ酸、または約300までのアミノ酸が欠失されていることを特徴とする 請求項４１記載の方法。 - 【請求項４３】 前記液化デンプンを加熱し、必要に応じて生成物を回収す
る各工程を含むことを特徴とする請求項４１記載の方法。 - 【請求項４４】 前記酵素組成物がグルコアミラーゼを含むことを特徴とす
る請求項４１記載の方法。 - 【請求項４５】 前記酵素組成物が少なくとも80％の修飾プルラナーゼを含
むことを特徴とする請求項４１記載の方法。 - 【請求項４６】 前記接触が、約7.0以下かつ約３以上のｐＨで行われるこ とを特徴とする請求項４１記載の方法。
- 【請求項４７】 前記ｐＨが約4.2であることを特徴とする請求項４６記載 の方法。
- 【請求項４８】 前記加熱が55℃から65℃までの間の温度範囲であることを
特徴とする請求項４１記載の方法。 - 【請求項４９】 前記温度が約60℃であることを特徴とする請求項４８記載
の方法。 - 【請求項５０】 修飾プルラナーゼをコードする核酸を含むバチルスリケニ
フォルミスであって、該バチルスリケニフォルミスが、カールスバーグプロテア
ーゼをコードする第１の遺伝子およびｅｎｄ ＧｌｕＣプロテアーゼをコードす
る第２の遺伝子を含み、該第１および／または第２の遺伝子が、プロテアーゼの
活性が実質的に除去されるように変更されているプロテアーゼをコードすること
を特徴とするバチルスリケニフォルミス。 - 【請求項５１】 成熟プルラナーゼをコードする核酸を含むバチルスリケニ
フォルミスであって、該バチルスリケニフォルミスが、カールスバーグプロテア
ーゼをコードする第１の遺伝子およびｅｎｄ ＧｌｕＣプロテアーゼをコードす
る第２の遺伝子を含み、該第１および／または第２の遺伝子が、プロテアーゼの
活性が実質的に除去されるように変更されているプロテアーゼをコードすること
を特徴とするバチルスリケニフォルミス。
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