JP2010501181A - 増加した生産力を伴うプルラナーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

本発明は酵素的ペプチドプルラナーゼの新規変異体、該新規ペプチドをコードする遺伝子配列、それらの遺伝子配列を含む発現ベクター及び新規プルラナーゼ変異体を発現する微生物に関する。本発明の新規プルラナーゼ変異体はコドン最適化の手法、「野生型」分子の選択的切断及び選択されたアミノ酸残基の置換により実験的に得られた。さらに、本発明は繊維製品、発酵、食物、他の産業における新規プルラナーゼペプチドの使用に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は酵素的ペプチドプルラナーゼの新規変異体、該新規ペプチドをコードする遺伝子配列、それらの遺伝子配列を含む発現ベクター及び新規プルラナーゼ変異体を発現する微生物に関する。さらに、本発明は繊維製品、発酵、食物、他の産業における新規プルラナーゼペプチドの使用に関する。

関連出願の参照
先の出願アメリカ２００７年２月２３日出願ＵＳ６０／９０３，２４７及び２００６年８月２３日出願ＵＳ ６０／８３９、７３５について本出願は優先権を主張する。よって、本明細書にかかる各々についてはその全体が引用によって組み込まれる。

プルラナーゼは多くの産業上の利用、特に食物、飲料の産業分野において有用な酵素である。プルラナーゼは澱粉の脱分岐酵素であり、澱粉加水分解物の脱分岐（パン生地の調整に有用な）、ベータ限定デキストランの脱分岐（ビール及びエールの造醸に有用な）及び例えばトウモロコシ、ジャガイモ、小麦粉、マニオク、米などからの糖シロップの生産に効果的である。プルラナーゼはＥＣ３．２.１．４１に分類される酵素であり、そのような酵素は例えばアミロペクチンとプルランのようなα−１、６グリコシド結合を加水分解する能力によって特徴付けられる。

プルラナーゼはバクテリア、特にバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌（バクテリア）による生産物である。産業上利用されるプルラナーゼの生産量は、問題がないわけではない。プルラナーゼは、同様にバクテリアによって生産される種々のプロテアーゼによってすぐに分解され、それによってプルラナーゼの大量生産は非効率で高価なものとなっている。この分野の多くの人々は培養中のプルラナーゼの分解を制限することによって生産量を増加するための方法を発明してきた。例えば、プルラナーゼ生産菌株からＡｐｒＬ及びＭｐｒ遺伝子（プロテアーゼを発現する）の欠損が活性化プルラナーゼの経済的発現に必要であることを本発明者等は以前示した。プルラナーゼ生産物の蛋白質分解及び活性喪失に歯止めをかけるために、まだ発酵時間は５１から６０時間に制限される。Ｓｖｅｎｄｓｅｎは酵素の熱安定性を上げるために、又は酵素がその基質を分解する仕方を変更するために酵素の三次元構造を改良したプルラナーゼ変異体を設計した（米国出願第２００４／００８２０２８同様、米国特許第６、３５０、５９９及び６、８３９、２５７を参照）。

つい最近我々はプルラナーゼの分解のタイミングが以下のように決定されることを示した。３０及び５０時間の間完全長プルラナーゼ分子の部分的切断によりそれぞれＮ末端９８及び１０２のアミノ酸を欠いた切断分子が生成することが見られた。切断はグルタミン残基Ｅ９９とＥ１０３のＮ末端でそれぞれ起こり、切断はＨＰＬＣで観察された。驚くことに1から９８及び１から１０２の切断プルラナーゼ分子はプルラナーゼ活性を維持しており、さらに驚くことに、この活性は完全長プルラナーゼの活性より高いことが明らかとなった。５１時間後ではプルラナーゼ分子のさらなる分解がその活性が降下させ、最後にはすべての活性が消失した。

まだプルラナーゼペプチドとそれらをコードするヌクレオチド配列のデザインを改良する余地がある。それゆえ、必要とされていることは例えば、蛋白分解の歯止め、発酵力価の増加又はプルラナーゼ活性の増加によって、プルラナーゼのより効率的な生産のための化合物と方法である。

本発明はプルラナーゼ、ペプチド酵素の新規で進歩性のある形態に関連するものである。本発明プルラナーゼは発酵力価及び／又は分解（例えばプロテアーゼによる酵素分解）に対する抵抗に関して優れた能力をもたらし及び／又は標的基質の分解おいて親（「野生型」）ペプチドよりさらに活性のある新規の改変体を含む。

この点において、本発明は、それぞれ図７Ｂ、図８Ｂ及び図９Ｂに示す配列番号２、配列番号４及び配列番号６のペプチドプルラナーゼに関する。また、本発明はそれぞれ配列番号２、 ４及び６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に関する。また、それぞれのヌクレオチド配列は各々配列番号１、３及び５として図７Ａ、図８Ａ及び図９Ａに示す。従来技術によく知られているように、遺伝子コードは同じアミノ酸をコードする多様なヌクレオチドコドンに富んでいる。すなわち、本発明は加えて配列番号２、４及び６のペプチドをコードするいずれの代替ヌクレオチド配列にも関する。当業者は明細書の開示及び従来技術に基づいて本発明のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を決定することができる。

本発明は本発明のペプチドをコードする発現構築体に関する。本発明のペプチドが発現をする限りは特にいずれかの発現構築体に限定するものではない。この点において、図４から６に図式的に現している適切な発現構築体の実施例に限定するものではない。

本明細書の詳細な説明及び実施例の部分にてより詳しく説明するように、ひとつの実施態様において、野生型（例、親）プルラナーゼアミノ酸配列（配列番号２）の複製をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１）を生産するために、親プルラナーゼペプチド（バチルス デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）由来）をコードする配列はコドン最適化方法によって修飾された。アミノ酸配列（配列番号２）をコードしているヌクレオチド配列は発現構築体のＯｒｉ１(ｐＩＣａｔＨ‐ＰＵＬ‐Ｏｒｉ１)及びＯｒｉ２(ｐＩＣａｔＨ‐ＰＵＬ‐Ｏｒｉ２)バージョンを創るバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）組み込みベクターｐＩＣａｔＨのＸｈｏＩ部位へ二つの配向にてクローン化された。

他の実施態様においては、親プルラナーゼペプチドをコードしている配列はＮ末端１０４アミノ酸を欠損させたプルラナーゼペプチドを生産するために修飾された。またある実施態様において、この新規プルラナーゼをコードしているヌクレオチド配列は、コドン最適化されている（配列番号３）。この構築体によって発現されたペプチド、ＰＵＬｍ１０４は配列番号４に示す（図８（ｂ）を参照）。
配列番号４をコードしているヌクレオチド配列は発現構築体のＯｒｉ１（ｐＩＣａｔＨ−ＰＵＬｍ１０４−Ｏｒｉ１）及びＯｒｉ２(ｐＩＣａｔＨ‐ＰＵＬｍ１０４−Ｏｒｉ２)バージョンを創るバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）組み込みベクターｐＩＣａｔＨのＸｈｏＩ部位へ二つの配向にてクローン化された。

他の実施例において、結果物のペプチドが９９及び１０３位の位置での蛋白質分解に対してより抵抗を有するために、親プルラナーゼペプチドをコードする配列は９９及び１０３位のアミン酸残基をグルタミン酸（Ｅ）からグルタミン（Ｑ）に置換する改変がされた。またある実施態様において、この新規プルラナーゼコードするヌクレオチド配列はコドン最適化された（配列番号５）。このヌクレオチド配列によって発現されたペプチド、ＰＵＬ Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑは配列番号６に示す。配列番号６をコードしているヌクレオチド配列は発現構築体のＯｒｉ１(ｐＩＣａｔＨ‐ＰＵＬ Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑ―Ｏｒｉ１)及びＯｒｉ２(ｐＩＣａｔＨ‐ＰＵＬ Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑ−Ｏｒｉ２)バージョンを創るバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）組み込みベクターｐＩＣａｔＨのＸｈｏＩ部位へ二つの配向にてクローン化された。

また本発明は、本発明の発現構築体の適切な宿主生物へのトランスフェクションに関する。本発明においてはいずれかの宿主生物に限定されるものではない。例えば宿主生物は微生物、真核細胞又はその組織培養、植物細胞又はその組織培養、真菌細胞又はその組織培養でもよい。好ましい実施態様においては微生物を宿主生物とする。好ましい宿主生物はバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）（特にバチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバチルス デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又はアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を含むが、これらに限定されない。もっとも好ましい実施態様は宿主生物がバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。

本発明は本発明の宿主生物が培養されている培地から本発明のペプチドを単離し精製することに関する。この点において、本発明は最小１０％純度が得られる限りいずれの特定の単離精製の方法にも制限されない。より好ましい実施態様は単離精製ペプチドの最小純度が２５％、さらに好ましい実施態様は単離精製ペプチドの最小純度が５０％である。よりさらに好ましい実施態様は単離精製ペプチドの最小純度が７５％である。もっとも好ましい実施態様は単離精製ペプチドの最小純度が９０％である。最小純度はトータル乾燥重量のパーセントによって測定されてもよく、従来技術で知られている他の適切な方法でもよい

本発明は本発明のペプチドの単離精製のいずれの特別な精製方法にも制限されない。従来技術より知られているペプチド精製方法はいずれも適している。適した精製手段はアフィニティークロマトグラフィー、沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、電気泳動、サイズろ過等を含むが、これらに限定されない。

本発明においては完全長の配列又はそれと同等の構成を有するプルラナーゼの代わりに生物学的に活性のある本発明プルラナーゼのフラグメントを用いてもよいことは当業者の容易に理解し得るところである。
「生物学的に活性のあるフラグメント」とは本発明の配列のいずれの類似、模倣、切断、欠損及び／又は置換をも抱合することを意図する。プルラナーゼのペプチド模倣体及び本発明のプルラナーゼの活性領域は周知である構造データーを用いて、コンピューター的に設計されてよい。加えて、本発明のある実施態様において、本発明プルラナーゼのヌクレオチド配列の類似体及び変異体が定方向分子進化によって生じてもよいと予期される。定方向分子進化の方法は当技術分野で周知である（例えば、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０５，７９３ ｔｏ Ｓｔｅｍｍｅｒ, ｅｔ ａｌ.又は米国特許第６，５３７，７７６ ｔｏ Ｓｈｏｒｔを参照）。
定方向分子進化によって生じた蛋白質は本発明のペプチドと比較してより小さい、より大きい又は同等のプルラナーゼ作用機能を有する。

本発明の他の実施態様において、本発明のペプチドは例えば他の構造性又は機能性ペプチド領域をもつ融合蛋白として用いる。そのような領域は融合蛋白に他の酵素的能力を与え、又は表面にペプチドを結合させてもよい。

また本発明のペプチドは同義遺伝子、選択的転写現象、選択的ＲＮＡスプライシング現象及び選択的翻訳と翻訳後の現象の存在の結果として生じるものを含む。ポリペプチドは、例えば培養細胞のような、発現プルラナーゼが天然型細胞に発現されるときと、実質的に同じ翻訳後修飾の存在を生じるシステムで発現され、又は天然型細胞に発現されたときに生じる翻訳後修飾の省略を生じるようなシステムで発現される。

また本発明中には一以上のプルラナーゼペプチド（又はそれをコードする核酸）及び例えばキャリアー、希釈剤、溶媒のような一以上の追加的な成分を含有する組成物も含まれる。追加的成分は、組成物をインビトロ、インビボ、製薬学的、又は獣医用の使用に役立つようにする成分である。

他の見地から、本発明はポリペプチド、本発明のプルラナーゼペプチド配列を含むアミノ酸配列又は本発明のプルラナーゼペプチド配列であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する又は含む実質的に純粋な核酸を提供する。

好ましい実施態様において対象となるプルラナーゼ核酸は例えば転写プロモーター又は転写エンハンサー配列の少なくともひとつの転写調整配列、又は例えばプルラナーゼ遺伝子を発現ベクターとしての使用に適するようにするような作動的に連結するプルラナーゼ遺伝子配列を含む。

他の好ましい実施態様では、本発明のプルラナーゼペプチドをコードする核酸は配列番号１、３又は５から少なくとも１２個の連続したヌクレオチドと、より好ましくは、配列番号１、３又は５から少なくとも２０個の連続したヌクレオチドに相当する核酸プローブと、ストリンジェントな条件下ハイブリッドを形成する。

本発明の他の好ましい実施態様は種々の産業上の環境において本明細書で記載するプルラナーゼの適用を提供する。例えば、本発明は食品材料（種々のパン生地及びシロップを含むがこれらに限定されない）、飲料水（種々の醸造飲料、例えばビール及びエールを含むがこれらに限定されない）、バイオエタノール及び当業者の知る範囲での多くの他の生産物の生産における新規プルラナーゼ変異体の使用に関する。

図１は本プルラナーゼのプロセス及び本プロジェクトにて設計されたプルラナーゼ変異体の略図を示す。 図２はＢＭＰ１３９菌株中のプルラナーゼ発現構築体と比較して示される、本発明で作成されたプルラナーゼ発現菌株中存在する構築体の分子構造を示す。 図３はｐＩＣａｔＨベクターの図を示す。ｐＩＣａｔＨベクターは温度感受性複製開始点（ｏｒｉ ｐＥ１９４、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製用）、ｏｒｉ ｐＢＲ３２２（大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）での増幅用）選別のためにネオマイシン耐性遺伝子及び選別、染色体の組み込み及び増幅カセットを反復する手段で天然バチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を含んでいる。 図４はｐＩＣａｔＨ‐ＰＵＬＯｒｉ１構築体の図を示す。 図５はｐＩＣａｔＨ‐ＰＵＬｍ１０４Ｏｒｉ１構築体の図を示す。 図６はｐＩＣａｔＨ‐ＰＵＬ Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３ＱＯｒｉ１構築体の図を示す。 図７Ａはコドン最適化「野生型」プルラナーゼ（ＰＵＬ）の核酸配列（配列番号１）を示す。 図７Ｂはコドン最適化「野生型」プルラナーゼ（ＰＵＬ）のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図８ＡはＰＵＬｍ１０４プルラナーゼの核酸配列（配列番号３）を示す。 図８ＢはＰＵＬｍ１０４プルラナーゼのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。 図９ＡはＰＵＬ Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑプルラナーゼの核酸配列（配列番号５）を示す。 図９ＢはＰＵＬ Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑプルラナーゼのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。

定義
本明細書と添付請求の範囲に使用している、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象であることを含む。すなわち、例えば、「化合物」（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を含む組成物の意味は一以上の化合物の混合物を含む。また、「又は」という用語は内容が明らかに他の事を指し示していない限り、「及び／又は」を含む意味で一般的に用いることを意味する。

「プルラナーゼ」（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）という用語は、プルランを分解する澱粉分解細胞内酵素、グルカナーゼの特定の種類をいう。例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ） 属のグラム陰性菌によって、細胞外、細胞表面に固定されたリポプロテインとして生産される。しかしながら、グラム陽性菌は分泌蛋白質としてプルラナーゼを生産する。I型プルラナーゼはα―１，６結合を特異的に攻撃し、一方ＩＩ型プルラナーゼはまたα―１，４結合を加水分解することもできる。またそれは他の細菌及び古細菌によって生産される。プルラナーゼはバイオテクノロジーにおいて洗浄剤として使用される。またプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）はプルラン−６−グルカンハイドロラーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎ‐６‐ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏＩａｓｅ）（枝きり酵素）としてもまた知られている。プルランはアルファ−１，６グルコシド結合によって連結したマルトトリオース（ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ）単位の鎖とみなされる。プルラナーゼはプルラン（α―グルカン多糖）を加水分解的に切断する。

「コドン最適化」（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）という用語は、同じアミノ酸をコードするコドンであるが宿主生物によってより効率的に処理されるコドンで、コード配列におけるヌクレオチドコドンを置換することによって発現レベルを高めるための方法をいう。異なる種の間でのコドンの選好性は著しく異なる。特定の発現系（細菌、菌類、酵母、昆虫、植物及び哺乳類細胞）で外来蛋白質の発現レベルを高めるために、外来蛋白質のコドン頻度を宿主発現系のコドン頻度に適合させる調整は大変重要である。あるよく知られた例は哺乳類細胞における発現の高いレベルを達成するために最適化されたＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）である。すなわち、コドン最適化は、仮にそのような配列が充分効率的に発現しなかったとしても、多種多様の宿主生物における本発明の蛋白質を発現するために用いてよい。

本明細書で用いる「発現ベクター」（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）という用語は特定の宿主生物において作動的に連結しているコード配列の発現に必要な所望のコード配列及び適切な核酸配列を含んでいる組換えＤＮＡ分子をいう。原核生物における発現に必要な核酸配列はプロモーター、任意的なオペレーター配列、リボゾーム結合部位及び可能な他の配列を含んでいる。

本明細書で用いる「異種プロモーター」（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は遺伝子又は精製核酸に自然には結合しないプロモーターである。本明細書で用いる「プロモーター」（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、「プロモーター要素」（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）又は「プロモーター配列」（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、関心の対象であるヌクレオチド配列に連結する場合ｍＲＮＡに関心の対象であるヌクレオチド配列の転写を制御することのできるＤＮＡ配列をいう。典型的にプロモーターは、必ずしもそうではないけれども、プロモーターが制御するｍＲＮＡに転写される関心の対象のヌクレオチド配列の５´（すなわち、上流）に位置し、転写開始のために他の転写因子とＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合する部位を提供する。

調節エレメントに適用される「細胞型特異的」（ｃｅｌｌ‐ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）又「宿主生物特異的」（ｈｏｓｔ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）という用語又はこれと同等の用語は、同じ組織内で細胞又は生物の異なる型において関心の対象である同じヌクレオチド配列を相対的に発現させず、細胞又は生物の特異的型においてのみ関心の対象であるヌクレオチド配列の選択的発現を指示することのできる調節エレメントをいう。調節エレメントに適用される「細胞型特異的」（ｃｅｌｌ‐ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）又「宿主生物特異的」（ｈｏｓｔ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）という用語は、それぞれ、ひとつの組織又は生物内での領域において関心の対象であるヌクレオチド配列の選択的発現を促進することのできる調節エレメントをも意味する。

本明細書で用いるポリペプチドの「単離」（ｉｓｏｌａｔｅｄ）、「精製調整液」（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）又は「実質的に純粋な調整液」（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は自然の状態又は実際の原料において通常結合している少なくともひとつの不純物から分離され及び同定されたポリペプチドを意味する。少なくとも他のひとつの不純物とは例えば自然発生的な他の蛋白質、脂質及び核酸である。好ましくは、ポリペプチドは、精製の際使用される例えばポリアクリルアミドであるゲル複合体また例えば抗体のような物質から分離される。好ましくはポリペプチドは少なくとも精製調整液の１０、２０、５０、７０、８０、又は９５％乾燥質量を構成している。好ましくは、調整液は蛋白配列分析をするのに十分なポリペプチドを含んでいる。少なくとも１、１０又は１００ｍｇのポリペプチドである。

本明細書で用いる「細胞の精製調整液」（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ）は、植物又は動物細胞の場合、インビトロの細胞調整液を指し、無傷植物又は動物全体を指すものではない。培養細胞又は微生物の細胞の場合、対象細胞の少なくとも１０％の調整液、より好ましくは対象細胞の５０％の調整液からなる。

例えば、実質的に純粋なＤＮＡのような「実質的に純粋な核酸」（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）とはその核酸の由来する生物の自然発生的な遺伝子の場合、これに直接連結する（例えばひとつは５´末端及びひとつは３´末端）配列、例えばコード配列のいずれか一端又は両端、に直接連結しないその一方又は両方である核酸である。又はその核酸の由来する生物の場合に発生する核酸配列が実質的にない核酸である。その用語は、ベクターへ組み込まれた組み換えＤＮＡ、例えば、自己複製されたプラスミドまたはウイルス、又は原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡへ組み込まれた組み換えＤＮＡ又は他のＤＮＡ配列から独立して分離した分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレオチドレアーゼ処理により生産されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組み換えＤＮＡを含む。さらに、「単離核酸配列」（ａｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のように、核酸との関係で用いる「単離」（ｉｓｏｌａｔｅｄ）は、実際の原料から得られ又は自然の状態で通常結合している少なくともひとつの不純物核酸から分離され及び同定された核酸配列をいう。単離核酸は自然にみられる形と異なる形又は状況で存在する核酸である。対照的に、単離されていない核酸はそれらが自然に存在する状態でみられるＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸である。例えば、あるＤＮＡ（例えば遺伝子）は隣接する遺伝子に接近して宿主細胞の染色体にみられる。特異的蛋白質をコードしている特異的ｍＲＮＡのようなＲＮＡ配列が多数の蛋白質をコードしている多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞に見られる。しかしながら、一例として、例えば配列番号１を含む単離核酸配列は、核酸配列が自然細胞とは異なる染色体内又は染色体外に局在する、又はさもなければ自然に見られる核酸配列とは異なる核酸配列に隣接する配列番号１を通常含む細胞におけるそのような核酸配列である。単離核酸配列は一本鎖又は二本鎖の形で存在してもよい。単離核酸配列が蛋白質発現に利用されるとき、核酸配列はセンス鎖又はコード鎖（例えば核酸配列は一本鎖でよい）の少なくとも一部分を（最小限）含む。あるいは、それは、センス鎖とアンチセンス鎖両方を含んでよい（例えば核酸配列は二本鎖でよい）。

本明細書で用いる「相同性」（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）は二つのポリペプチド分子の間で又は二つの核酸分子の間での配列相同性をいう。二つの比較された配列両方の位置が同じ塩基又はアミノ酸のモノマーサブユニットによって占有されているとき、例えば、もし二つのＤＮＡ配列のそれぞれの位置がアデニンによって占有されているならば、それらの分子はその位置において相同性がある。二つの配列間の相同性のパーセントは二つの配列において一致し又は相同性のある数を比較した位置の数で割り、１００倍して得る関数である。例えば、二つの配列において一致し又は相同性のある場所がもし、１０のうち６であれば、二つの配列は６０％の相同性である。一例としてＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を有している。一般的に最大の相同性を得るように二つの配列を整列させて比較を行う。

「ペプチド」（ｐｅｐｔｉｄｅ（ｓ））、「蛋白質」（ｐｒｏｔｅｉｎ(ｓ)）及び「ポリペプチド」（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ(ｓ)）の用語は本明細書において互換的に用いられる。

「プロテアーゼ」（ｐｒｏｔｅａｓｅ）という用語は例えば菌類、細菌など微生物由来又は植物または動物由来の蛋白質又はポリペプチドの蛋白質又はポリペプチド領域を意味する。及びプロテアーゼは蛋白質の骨格の一以上の種々の位置でペプチド結合の切断を触媒する能力を有する。

好ましくは、本発明にかかるプルラナーゼ蛋白質は単離又は精製される。精製又は単離が意味するところによればプルラナーゼ蛋白質は天然において結合成分であり、いくつかの又はすべての自然に生ずる成分から分離されることによりその自然の状態から変化する。細胞全体、細胞片、不純物、外来性蛋白質又は最終組成物で好ましくない酵素を除くための、そのような単離又は精製は、従来技術で認識されている分離方法によって確立されている。その技術とは、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿又は他の蛋白質塩による沈殿、遠心分離、サイズ排除型クロマトグラフィー、ろ過、マイクロろ過、ゲル電気泳動又は勾配分離である。追加的に利点をもたらす組成物を含むようにプルラナーゼに成分を加えることはさらに可能である。例えば 活性化剤、抗阻害剤、所望なイオン、ｐＨ制御成分、又は他の酵素などである。好ましくは本発明のプルラナーゼ蛋白質は組み替え技術より生産される。

本明細書で用いる「微生物」（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）は細菌、菌類、ウイルス、原生動物及び他の微生物又は顕微鏡的生物をいう。本発明においては、微生物は外来性ペプチドの発現のための宿主生物として用いる。

本明細書で用いる「誘導体」（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、「変異体」（ｖａｒｉａｎｔ）又は「修飾したペプチド、ポリペプチド、又は蛋白質」（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ, ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）はＣ末端及びＮ末端の両方又は片方に一以上のアミノ酸の添加によって、アミノ酸配列中一箇所又は多くの異なる位置に一以上のアミノ酸を置換によって、片方又は両方の蛋白質末端に又はアミノ酸配列中一以上の位置に一以上のアミノ酸の欠損によって、又はアミノ酸配列中一以上の位置に一以上のアミノ酸の挿入によって得られる、プリカーサー蛋白質（例えば、天然の蛋白質）に由来する蛋白質を意味する。好ましくは、プルラナーゼ誘導体の調製は天然蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を装飾し、適切な宿主へそのＤＮＡ配列を形質転換させ、修飾ＤＮＡ配列を発現させ、誘導体プルラナーゼを作成することにより達成される。本発明の「誘導体」（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）はプリカーサーアミノ酸配列（例えば野生型又は天然状態のプルラナーゼ）と比較して改変されたアミノ酸配列を含んでいるペプチドを含む。ここでペプチドはプリカーサープルラナーゼの特徴的プルラナーゼの性質を保持するが、いくつか特異的な局面において改変された特徴を有している。例えばプルラナーゼ誘導体は最適ｐＨが増加し、酵素による分解又はその他の分解に対する耐性が増加し、酵素の有効性が増加し、温度又は酸化に対する安定性が増加するが、その特徴的な酵素的に修飾された活性は保持している。同時に本発明の誘導体は、その基質結合能力を改変するために添加又は修飾される蛋白質、又は他の基質、結合領域を含んでいる。本発明の誘導体はプルラナーゼ誘導体発現の機能活性が保持されているプルラナーゼ誘導体をコードするＤＮＡフラグメントに由来することが意図されている。誘導体はさらにプルラナーゼの特徴を変える化学的修飾体を含んでいる。

通常、プルラナーゼ誘導体は少なくとも約５０％、７０％又は８５％アミノ酸配列の相同性を有しており、好ましくは、少なくとも約８５％アミノ酸配列の相同性、さらに好ましくは、少なくとも９０％アミノ酸配列の相同性、よりさらに好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列の相同性、なおいっそう好ましくは９８％のアミノ酸配列の相同性を有している。好ましくはいずれのアミノ酸置換もＬ体アミノ酸を使用した同類アミノ酸置換である。ここで、ひとつのアミノ酸は他の生物学的に同類のアミノ酸によって置換される。同類アミノ酸置換は一般的な電荷、疎水性又は親水性及び又は置換されているアミノ酸の立体的かさ高さを保存するアミノ酸置換である。同類置換の例は次のグループの間でのアミノ酸置換である。Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ、及びＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｈｒである。例えば、誘導体は僅か１から１０個のアミノ酸残基、例えば６から１０個、僅か5個、僅か４、３、２個又は1個でさえのアミノ酸残基の違いでもよい。本明細書にかかる表１は従来技術による典型的なアミノ酸置換を示す。

本明細書で用いるプルラナーゼの「天然型の配列」（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は「野生型」（ｗｉｌｄ‐ｔｙｐｅ）プルラナーゼの配列は天然親株由来プルラナーゼとして同じアミノ酸配列をもつポリペプチドを含み、又は例えば本発明のバチルス デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）（ＢＭＰ１３９）を親株として発現されたプルラナーゼのように作成された修飾又は誘導プルラナーゼからのプルラナーゼとして同じアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。そのような天然のプルラナーゼ配列は天然から単離され、又は組み換え体又は合成手段で作成される。「野生型」（ｗｉｌｄ‐ｔｙｐｅ）又は「天然型の配列」（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）プルラナーゼという用語は、ある実施態様において、本発明の変異体由来のプルラナーゼペプチドをいい、配列番号２として図７Ｂに示されている。

本明細書にて同定されたアミノ酸配列又は核酸配列に関して本明細書で用いる「配列相同性割合（％）」（ｐｅｒｃｅｎｔ(％)ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、必要であれば、最大の割合の配列相同性を達成するように、いずれの同類置換をも配列相同性の一部として考慮することなく、配列を整列し及びギャップを挿入した後、プルラナーゼ配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同定された候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドとの割合で定義される。周知である配列整列をする方法と配列相同性の決定は過度の実験をせずに行うことができ、相同性値の計算は確実に得られる。例えばＡｕｓｕｂｅｌ他編、(１９９５)Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, １９章(Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｅｌｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮｅｗＹｏｒｋ)及びＡＬＩＧＮ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ （１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５:Ｓｕｐｐｌｅ ３（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ, Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ, Ｄ.Ｃ.）を参照願いたい。多くのアルゴリズムは配列を整列させ、配列相同性を決定するのに利用可能である。例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ他のｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９７０）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.４８:４４３、スミス他のｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９８１）Ａｄｖ.Ａｐｐｌ.Ｍａｔｈ.２:４８２, Ｐｅａｒｓｏｎ他のｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ (１９８８) Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ８５:２４４４, ｔｈｅ Ｓｍｉｔｈ‐Ｗｓｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ (Ｍｅｔｈ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.７０:１７３‐１８７(１９９７)及びＢＬＡＳＴＰ, ＢＬＡＳＴＩＮ, ａｎｄ ＢＬＡＳＴＸ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ(参照Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）J.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２１５:４０３−４１０)を参照されたい。これらのアルゴニズムに使用するコンピュータープログラムは入手可能であり、以下のものを含むがこれらに限定はされない。即ち、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｎｇ(ＤＡＮＳＴＡＲ)ソフトウエア又はＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｍｅｔｈ. Ｅｎｚｙｍ., ２６６:４６０-４８０(１９９６))、又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他)上記、ＦＡＳＴＡ及びＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ (ＧＣＧ)パッケージ、バージョン８、マジソン、ウィスコン州米国にて入手可能なＴＦＡＳＴＡ及びＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｓ, Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州による ＣＬＵＳＴＡＬ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣ/Ｇｅｎｅ ｐｒｏｇｒａｍである。当業者であれば比較される配列の長さに渡って最大の配列比較を達成するために必要であるアルゴリズムを含め、整列を測定する適切なパラメーターを決定できる。好ましくは、配列相同性はプログラムによって決定されたデフォルトパラメーターを使用することにより決定される。特に、配列相同性はＳｍｉｔｈ-Ｗａｔｅｒｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ (Ｍｅｔｈ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ７０: １７３-１ ８７ (１９９７)) によって決定される。このアルゴリズムは次のサーチパラメーターで、すなわち１２のギャップ開始ペナルティ及び１のギャップ伸長ペナルティで、アファインギャップサーチを使用しているＭＳＰＲＣＨ ｐｒｏｇｒａｍ (Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ) で実行される。好ましくは対のアミノ酸の比較はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ, Ｉｎｃ., Ｍａｄｉｓｏｎ, Ｗｉｓ.の１２のギャップウエイトと２のレングスウエイトをもつＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列を使用しているＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージの使用により実行される。二つのアミノ酸配列の最適整列に関して、種々のアミノ酸配列の連続セグメントは参照アミノ酸配列に対して追加アミノ酸残基又は欠損アミノ酸残基をもってもよい。参照アミノ酸配列と比較するために使用した連続セグメントは少なくとも２０アミノ酸残基を含んでもよく、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。誘導体のアミノ酸配列中ギャップを含む関係で増加した配列相同性の補正はギャップペナルティを割り当てることにより実行できる。

本明細書で用いる「発現構築体」（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（又は「発現ベクター」（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ））は適切な宿主においてＤＮＡの発現に影響をあたえる適切な制御配列に作動的に結合されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体を意味する。そのような制御配列は転写に影響するプロモーター、転写を制御する適切なオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボゾーム結合部位をコードしている配列及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでもよい。本発明はどのような特定の発現構築体にも限定されない。好ましくは異なる細胞の型は異なる発現ベクターで使用される。例えば、バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で使用されるベクターに対する所望のプロモーターはＡｐｒｅＥプロモーター、バチルス デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）にて使用されるベクターに対する所望のプロモーターはａｍｙＬプロモーター、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）にて使用されるベクターに対する所望のプロモーターはＬａｃプロモーター、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にて使用されるベクターに対する所望のプロモーターはＰＧＫ１プロモーター、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）にて使用されるベクターに対する所望のプロモーターはｇｌａＡプロモーター及びトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）にて使用されるベクターに対する所望のプロモーターはｃｂｈＩプロモーターである。ベクターはプラスミド、ファージ粒子又は単に潜在遺伝子の挿入でもよい。

一度適切な宿主へ形質転換（又はトランスフェクション）されたら、発現構築体は複製し、宿主遺伝子から独立して機能する可能性があり、適切な条件下ではその遺伝子自身へ組み込まれる可能性がある。本明細書における「プラスミド」（ｐｌａｓｍｉｄ）、「ベクター」（ｖｅｃｔｏｒ）及び「発現構築体」（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ(ｓ)）という用語は時々互換可能に使用される。しかしながら本発明は同等の機能を果たし周知であるか又は周知になりつつある発現ベクターの他の形態を含むものである。すなわち、広範囲の宿主又は発現ベクターの組み合わせは本発明のＤＮＡ配列を発現することに使用される可能性がある。本明細書において特に言及しなければ、本発明の有用な発現ベクターは様々に知られたＳＶ４０誘導体及び様々に知られた微生物のプラスミドのような染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントからなってもよい。例えばｃｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭｂ９、ｐＵＣ１９及びそれらの誘導体を含む大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来プラスミド、より広い範囲のプラスミドでは、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばファージλの多くの誘導体、例えばＮＭ９８９、他のＤＮＡファージ、例えばＭｌ３及び糸状一本鎖ＤＮＡファージ、２νプラスミド又はそれらの誘導体のような酵母プラスミド、動物細胞に有用なベクターのような真核細胞に有用なベクター及びファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を使用するために修飾されたプラスミドのようなプラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせ由来ベクターである。

本発明の発現ベクターを使用する発現技術は周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、他 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ: Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ (１９８９) に一般的に記載されている。しばしば本発明のＤＮＡ配列を含むそのような発現ベクターは、組み替え現象を通して特定種の遺伝子へ直接的に挿入することにより、単細胞の宿主へ形質転換される（例えばＢｅｎｎｅｔｔ ＆ Ｌａｓｕｒｅ、 ＭＯＲＥ ＧＥＮＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＦＵＮＧＩ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ｐｐ． ７０-７６ (１９９１)及び菌類の宿主における標的遺伝子挿入を記載する同書に引用されている論文を参照）。

本明細書で用いる「作動的な連結」（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）、「作動的な組み合わせ」（ｉｎ ｏｐｅｒａｂｌｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）及び「作動的なオーダー」（ｉｎ ｏｐｅｒａｂｌｅ ｏｒｄｅｒ）という用語は核酸配列が意図する機能を行うような核酸配列の連結をいう。例えば、プロモーター配列を関心の対象であるヌクレオチド配列へ作動的に連結するとは、プロモーター配列が関心の対象であるヌクレオチド配列の転写及び／又は関心の対象であるヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの合成を支持することが可能であるような、いわば、関心の対象であるヌクレオチド配列とプロモーター配列の連結をいう。同様に、年齢軸遺伝子調節活性をもつ核酸配列をプロモーター配列及び関心の対象であるヌクレオチド配列へ作動的に連結するとは、年齢軸遺伝子調節活性をもつ核酸配列が関心の対象であるヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写レベルと関心の対象であるヌクレオチド配列によってコードしているポリペプチドの合成をある期間にわたって修正することができるような、いわば、年齢軸遺伝子調節活性をもつ核酸配列、プロモーター配列及び関心の対象であるヌクレオチド配列を連結することを意味する。

本明細書で用いる「宿主生物」（ｈｏｓｔ ｏｒｇａｎｉｓｍ）、「宿主菌株」（ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎ）又は「宿主細胞」（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）は本発明によるＤＮＡを含む発現ベクターに適する宿主を意味する。本発明に有用な宿主細胞は一般的に原核生物又は真核生物の宿主であり、発現が達成できるいずれの形質転換できる微生物をも含む。本明細書おいては例えば宿主株はバチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）(又は他のバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）)、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）でもよい。宿主細胞は組み換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換又はトランスフェクションされる。そのような形質転換された宿主細胞はプルラナーゼをコードしているベクター及びその誘導体又は変異体（ミュータント）を複製すること又は所望のペプチド生産物を発現すること又は複製と発現の両方できる可能性がある。

宿主生物の集合体の培養について本明細書で用いるときの「培養」（ｃｕｌｔｕｒｅ）又は「培養条件」（ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ(ｓ)）の用語は、本発明のヌクレオチド配列及びそれらの変異体でトランスフェクションされた宿主生物の場合、本発明プルラナーゼの生産及び宿主の成長に適した培養容器、培養液及び培養条件をいう。本発明は前述のことが満足される限りいずれの特定の培養又は培養条件にも限定されない。

本明細書で用いる「機能的接着」（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）又は「作動的な連結」（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）は、プロモーター、ターミネーター、分泌シグナル又はエンハンサー領域のような調節領域が構造遺伝子に接着又は連結し、その遺伝子の発現を制御することを意味する。

本明細書で用いる微生物「由来の」（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）物質（例えばポリペプチド又は蛋白質）とは、物質が微生物を原産とすることを意味する。

「トリコデルマ」（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又は「トリコデルマ属の一種」（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）は以前に「トリコデルマ」（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）として分類されたもの又は現在「トリコデルマ」（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）として分類されたもののいずれの真菌株をもいう。好ましくはトリコデルマ ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）である。本発明においてはトリコデルマ属の一種は本発明の宿主生物として用いてもよい。

本明細書に記載するように、発明のある局面は、プルラナーゼペプチド及び／又はそれと同等の核酸をコードするヌクレオチド配列を含む「実質的に純粋な」（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）（又は組み換え）核酸に特徴づけられる。本明細書で用いる核酸という用語はフラグメント及び同等なものを含む。「同等なもの」（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）という用語は機能的に同等なポリペプチド又は機能的に同等な蛋白質をコードしているヌクレオチド配列をいう。同等なヌクレオチド配列は、対立遺伝子多型のような、一以上のヌクレオチド置換、追加又は欠損によって異なる配列を含み、遺伝子コードの縮重によって、配列番号１に示したようにプルラナーゼのヌクレオチド配列と異なることとなる配列を含む。

他に示していない限り、本発明の実施例は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の当業者の能力の範囲内に属する、通常技術を用いる。本明細書で引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、すべての目的のために全体を参照することによって、本明細書に組み入れられる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ (Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ: １９８９)、 ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ II（D． N. Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５)、 Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ(Ｍ． Ｊ． Ｇａｉ ｅｄ．， １９８４); Ｍｕｌｌｉｓ 他 Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ:４，６８３，１９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ(Ｂ． D． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． J． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４)； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４)； Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７)、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＴＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６)、Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ(１９８４)、ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．)、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ (Ｊ． Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．， １９８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ)、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ． １５４ ａｎｄ １５５ (Ｗｕ，他, ｅｄｓ．)、 Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ (Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７)、 Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ-ＩＶ （Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ，， １９８６)、ＭａｎｉＰＵＬａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６)を参照願いたい。精製、発現、単離及びプロテアーゼの使用の方法に関する情報については米国特許第６，７６８，００１号を参照することもできる。なおこの特許文献全体は本明細書において引用により組み入れられる。

発明の他の特徴と利点は以下の詳細な説明と特許請求の範囲から明らかである。

発明の詳細な説明
さて、本発明は、以下の定義及び実施例を用いて、参考のためにのみの目的で、詳しく説明される。本明細書によって引用されるすべての特許及び出版物は、そのような特許、出版物内で開示されたすべての配列を含んでおり、明確に引用によってここに組み入れられる。

本明細書にて他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び特別な用語はこの発明に属する当業者によって普通に理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、 ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ２Ｄ ＥＤ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ (１９９４)及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ＮＹ (１９９１)が、当業者には本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書となる。本明細書に記載されているものと同様又は同等のいずれの方法及び材料も本発明の実施及び実験に用いられ得るが、ここには所望の方法又は材料を記載する。数値域は範囲を定義する数字を含む。他に示していない限り、それぞれ、核酸は５´から３´の方向において左から右へ記載され、アミノ酸配列はアミノ基からカルボシキル基の方向において左から右へ記載される。実施者は特にＳａｍｂｒｏｏｋ 他、１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ 他、１９９３、を技術の用語及び定義について参照されたい。本発明は特定の手順、プロトコール及び試薬に限定されるものではなく、これらが変化しうることは理解される。

数値域は範囲を定義した数字を含む。

他に示していない限り、それぞれ、核酸は５´から３´の方向において左から右へ記載され、アミノ酸配列はアミノ基からカルボシキル基の方向において左から右へ記載される。

本明細書の頭書きの記載は、発明の種々の局面又は実施例に限定するものと理解すべきではない。本発明は明細書全体を参照することによって理解される。従って、下記に定義される用語は明細書全体を参照することによりさらに十分に定義されるものである。

分子生物学
本発明のある実施態様において、ａｍｙＬプロモター制御下異種遺伝子の発現を提供する。それゆえ、本発明は組み換え遺伝子分野の通例技術に依存する。本発明に使用する一般的方法を開示している基本的教科書はＳａｍｂｒｏｏｋ、他、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ. １９８９）； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ, Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９０）及び Ａｕｓｕｂｅｌ, 他、ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４））である。

糸状菌のセルラーゼ遺伝子プロモーター配列を含む異種遺伝子は複製及び／又は発現するために「トリコデルマ」（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）へ形質転換する前に中間ベクターへ通常クローン化される。これらの中間ベクターは例えばプラスミド又はシャトルベクターのような典型的な原核生物のベクターである。

クローン化された遺伝子の高いレベルの発現を得るために、好ましくは、異種遺伝子は、自然発生的セルラーゼ遺伝子のように、プロモーターから同じ距離に配置される。しかしながら、周知のように、この距離におけるいくつかの変動はプロモーター機能の消失を伴わずに生じうる。

天然のプロモーターがプロモーターの機能を変化することなく一以上のヌクレオチドの交換、置換、追加、欠損によって修飾されることを当業者は知っている。
発明の実施はそのようなプロモーターの改変を含み、それによって拘束されない。

典型的な発現ベクター／構築体は異種遺伝子の発現に必要なすべての追加的要素を含む転写ユニット又は発現カセットを含む。すなわち、典型的な発現カセットは、異種核酸配列に作動的に連結するプロモーターと転写、リボソーム結合部位及び翻訳停止の効率的なポリアデニル化を必要とするシグナルを含む。カセットの追加的要素はエンハンサー及びもし遺伝子ＤＮＡを構造遺伝子として用いるならば、機能的なスプライス供与部位及び受容部位を備えたイントロンを含んでもよい。

発明の実施例は遺伝子構築体プロモーターの選択によって制限されない。しかしながら、代表的なプロモーターはトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｇｌ、ｅｇ２、ｅｇ３、ｅｇ５、ｘｌｎｌ及びｘｌｎ２プロモーターである。

プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた効率的停止を実現するために構造遺伝子の下流に転写停止領域を含むべきである。停止領域はプロモーター配列として同じ遺伝子から得られ及び異なる遺伝子から得られてもよい。

本発明におけるいずれの真菌のターミネーターも有用であると思われるけれども、好ましいのターミネーターは、アスペルギルス ニドゥラン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子のターミネーター（Ｙｅｌｔｏｎ, Ｍ. 他、 （１９８４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４, Ｍｕｌｌａｎｅｙ, Ｅ.Ｊ.他、 （１９８５） ＭＧＧ １９９：３７−４５）、アスペルギルス アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）又はアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子のターミネーター（Ｎｕｎｂｅｒｇ, Ｊ.Ｈ. ｅｔ ａｌ. （１９８４） Ｍｏｌ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ. ４：２３０６, Ｂｏｅｌ, Ｅ．他、（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ. ３：１５８１−１５８５）及びＭｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのカルボキシプロテアーゼ遺伝子のターミネーター(ＥＰＯ公報第０２１５ ５９４)である。

細胞へ遺伝子情報を輸送するために用いられた特定の発現ベクターは特に重要な意味を持つものではない。真核細胞又は原核細胞における発現に用いるいずれかの通常のベクターが使用されてよい。標準的細菌発現ベクターは、バクテリオファージλ及びＭＩ３の他にプラスミド例えばｐＢＲ３２２に基づくプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ及び融合発現システム例えばＭＢＰ、ＧＳＴ及びＬａｃＺを含む。例えばｃ−ｍｙｃのような抗原決定基標識もまた、便利な単離方法を提供するために組み換え蛋白質に加えることができる。

発現ベクターに典型的に含まれる要素にはまたレプリコン、組み換えプラスミドを内部にもつ細菌の選択を可能にするため抗生物質耐性をコードしている遺伝子及び異種配列を挿入させるためにプラスミドの不必要な領域に存在する独特の制限部位を含む。特定の抗生物質耐性遺伝子の選択は決定的ではなく、いずれかの多くの周知な耐性遺伝子が適している。好ましくは、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のＤＮＡの複製又は組み込みを妨げないような原核生物配列が選ばれる。

本発明の形質転換方法によって、糸状菌の遺伝子へ全部又は一部の形質転換ベクターの安定した組み換えをもたらす可能性がある。しかしながら、本発明は自己複製、染色体外形質転換ベクターを維持する結果をもたらす形質転換もまた意図している。

多くの標準的なトランスフェクションの方法は異種蛋白質を大量発現するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞株を生産するために用いることができる。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のセルラーゼ生産株へのＤＮＡ構築体を導入するためのいくつかの刊行された方法はＬｏｒｉｔｏ, Ｈａｙｅｓ, ＤｉＰｉｅｔｒｏ ａｎｄ Ｈａｒｍａｎ, １９９３, Ｃｕｒｒ. Ｇｅｎｅｔ. ２４: ３４９−３５６、Ｇｏｌｄｍａｎ, ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ ａｎｄ Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ, １９９０, Ｃｕｒｒ. Ｇｅｎｅｔ. １７：１６９−１７４、Ｐｅｎｔｔｉｌａ, Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ, Ｒａｔｔｏ, Ｓａｌｍｉｎｅｎ ａｎｄ ＩＣｎｏｗｌｅｓ, １９８７, Ｇｅｎｅ６:１５５−１６４、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）については、 Ｙｅｌｔｏｎ, Ｈａｍｅｒ ａｎｄ Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ, １９８４, Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ． Ｓｃｉ. ＵＳＡ８１: １４７０−１４７４， フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）については、Ｂａｊａｒ, Ｐｏｄｉｌａ ａｎｄ Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ, １９９１, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ８８:８２０２−８２１２,ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）については、Ｈｏｐｗｏｏｄ他, １９８５, Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ, Ｎｏｒｗｉｃｈ, ＵＫ ａｎｄ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｂｒｉｇｉｄｉ, ＤｅＲｏｓｓｉ, Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ, Ｒｉｃｃａｒｄｉ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ, １９９０, ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｌｅｔｔ.５５:１３５−１３８）に記載がある。

しかしながら、宿主細胞へ外来ヌクレオチド配列を導入するためいずれの周知の方法を用いてもよい。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、遺伝子銃、リポゾーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター及びＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来遺伝子材料を宿主細胞へ導入するいずれかの他の周知の方法を含む(例、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記参照)。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在トランスフェクション法は米国特許第６，２５５，１１５に記載がある。特定の遺伝子組み換え技術によって異種遺伝子の発現が可能である宿主細胞へ少なくともひとつの遺伝子がうまく導入できさえすればよい。

本発明は、また、微生物によって異種生産されたプルラナーゼに関連する。適切な細菌の例は、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス アルカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス ランツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）又はストレプトミセス リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、のようなグラム陽性菌又は、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性菌である。例えば、プロトプラスト形質転換により又はそれ自体知られている態様でコンピテント細胞を用いることにより、細菌の形質転換は影響されうる。

一般的に、本発明は、宿主細胞へ形質転換している発現システムに組み込まれたＤＮＡを発現することによりプルラナーゼを生産する方法を含む。本発明のＤＮＡ配列発現において、広範囲の宿主／発現ベクターの組み合わせが用いられてよい。多くの原核生物及び真核生物の発現ベクターは市販されている。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子又は単なる潜在遺伝子の挿入でもよい。一度適切な宿主へ形質転換すれば、ベクターは複製し、場合によっては宿主遺伝子から独立して機能し、ある場合にはその遺伝子自身へ組み込まれる可能性がある。プラスミドはベクターの形で最も普通に用いられているので、本明細書においてプラスミド及びベクターは時々互換可能に用いられる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす周知である、又は周知になりつつある発現ベクターの他の形を含むことをも意図する。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡのセグメント、例えばこの目的に有用な種々の知られたプラスミド及びファージを含む。さらに、いずれの広範囲の発現制御配列も一般的にこれらのベクターに用いられる。

本発明に有用な宿主細胞は、一般的な原核生物及び真核生物の宿主細胞であって、本発明によるプルラナーゼの発現が達成できるいずれの形質転換可能な微生物をも含む。宿主細胞は、組み換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換又はトランスフェクションされる。そのような形質転換宿主細胞はプルラナーゼ及びその誘導体（変異体）をコードしているベクターを複製するか、所望のプルラナーゼを発現することができる。これらの宿主は大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、種々の菌類、酵母及び動物細胞のような周知の原核生物の及び真核生物の宿主を含んでよい。好ましくは、宿主細胞は精製と下流プロセッシングを容易にするために細胞外で本発明のプルラナーゼを発現する。

ある実施態様において、宿主細胞はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の仲間であり、一方、ある実施態様において工業用バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株として関心のもたれるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株である。工業用バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の例は、バチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、 バチルス ズブチリス（Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス レンツス（Ｂ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス アミロリケファシエンス（Ｂ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ.）を含むがこれらに限定されない。さらなる実施態様において、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主株は、上述したように、バチルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属内の他の微生物同様にバチルス レンツス（Ｂ. ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス ブレビス（Ｂ. ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス ステアロテルモフィルス（Ｂ. ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス アルカロフィリス（Ｂ. ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス コアグランス（Ｂ. ｃｏａｇｕｌａｎｔ）、バチルス シルクランス（Ｂ. ｃｉｒｕｌａｎｓ）、バチルス プミルス（Ｂ. ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス ツリンギエンシス（Ｂ. ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス クラウシ（Ｂ. ｃｌａｕｓｉｉ）及びバチルス メガテリウム（Ｂ. ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される。ある実施態様において、バチルス ズブチリス（Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が用いられる。他の実施態様において、バチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が用いられる。例えば、米国特許第５，２６４，３６６及び米国特許第４，７６０，０２５（ＲＥ３４，６０６）及びＵＳ２００２/０１８２７３４(国際公開 Ｎｏ. ＷＯ ０２/１４４９０)に、本発明において使用が見られる種々のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主株が記載されているが、他の適切な株も本発明における使用に考慮される。好ましくはプロテアーゼ陰性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（遺伝子欠損、例、他の間でΔａｐｒ又はΔｎｐｒ）が用いられる。

バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の形質転換にかかる多くの方法は知られている。実際に、大腸菌の形質転換とプラスミド構築体に関するバチルスの染色体改変のための方法は周知である。多くの方法において、プラスミドは大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）から単離された後に、バチルスへ形質転換される。大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）のような微生物を介在するような使用が必ずしも必要ではなく、ある実施態様において、ＤＮＡ構築体はプロトプラスト又はコンピテント細胞形質転換を通してコンピテントバチルス宿主へ直接形質転換される。本発明にかかる変異プルラナーゼの発現と精製はそのような課程を遂行するために広く認識される技術手段を通して達成されてもよい。

発現ベクターが細胞に導入された後、プロテアーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下遺伝子発現に適した条件下、形質転換細胞は培養される。以下に示す実施例に記載するように大型バッチ式で形質転換細胞を培養することができる。最終的に、標準手段を用いて培養物から生産物は回収される。

かくて、本明細書に記載する発明は、自然発生的アミラーゼ遺伝子、融合ＤＮＡ配列及び種々の異種構築体を含む遺伝子プロモーター配列制御下で発現する所望のポリペプチドの増強された分泌及び発現を提供する。本発明はまた、そのような所望のポリペプチドの高いレベルの分泌の発現に関する過程を提供する。

蛋白質発現
本発明の蛋白質は、アミラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下で発現する遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した細胞を培養することにより生産される。特に本発明は蛋白質の細胞内及び／又は細胞外生産の増強に有用である。蛋白質は同種又は異種であってよい。本発明によって生産された蛋白質はホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン、抗体及びそれらの様なものを含むが、これらに限定されない。

酵素は、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、エステラーゼ（ｅｓｔｅｒａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、フェノールオキシダーゼ（ｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ）、パーミアーゼ（ｐｅｒｍｅａｓｅ）、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、プルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、グルコースイソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ラッカーゼ（ｌａｃｃａｓｅ）及びプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）のような加水分解酵素を含むが、これらに限定されない。

当該遺伝子発現にふさわしい条件は誘発供給組成物を培地に提供することを含む。例えばＵＳ−２００４−０１２１４４６を参照願いたい。蛋白質の生産のための最適な条件は宿主細胞の選択及び発現された蛋白質の選択に伴って変化する。そのような条件は通例の実験又は最適化を通して当業者によって容易に確認できる。

本明細書に記載するプルラナーゼのような、関心の対象となる蛋白質は発現後典型的に精製又は単離される。サンプル中に存在する成分に応じて、当業者の種々の知識に基づいて関心の対象となる蛋白質は単離又は精製されてよい。標準的な精製方法は電気泳動的、分子的、免疫学的及びクロマトグラフィック的方法を含む。これらにはイオン交換、疎水性、親和性及び逆相高速液体（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィー及び等電点電気泳動を含む。例えば、標準的な関心の対象となる蛋白質に対する抗体カラムを用いて関心の対象となる蛋白質を精製してもよい。蛋白質濃縮と組み合わせて、限外ろ過法及びダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法もまた有用である。適切な精製方法に関する一般的ガイダンスはＳｃｏｐｅｓ、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ （１９８２）を参照願いたい。関心の対象となる蛋白質の使用に応じて精製の程度の必要性は変わってくる。ある場合には精製は不必要である。

本発明のプルラナーゼ類似体
類似体は「野生型」親プルラナーゼと異なり、類似体はアミノ酸配列における自然発生的プルラナーゼとも異なり、又は配列に関与しない方法で得られる自然発生的プルラナーゼとも異なる。非配列修飾はインビボ又はインビトロにおけるプルラナーゼの化学的誘導体化を含む。非配列修飾はアセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化又はグリコシル化における変化を含む。

好ましい誘導体は、プルラナーゼ生物活性を消滅させない一以上の非同類アミノ酸置換、欠損又は挿入による又は一以上の同類アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）による天然配列と異なる又は「野生型」配列と異なる配列のプルラナーゼ（それらの生物活性フラグメント）を含む。典型的に同類置換はあるアミノ酸を同様の特徴を持つ他のアミノ酸へ置換する場合を含む。例えば次のグループ内で置換できる。即ち、バリンとグリシン内、グリシンとアラニン内、バリンとイソロイシンとロイシン内、アスパルギン酸とグルタミン酸内、アスパルギンとグルタミン内、セリンとスレオニン内、リジンとアルギニン内及びフェニルアラニンとチロシン内である。

例えば同類置換は一般的に受け入れられているベンダイアグラム（Ｖｅｎｎ ｄｉａｇｒａｍ）のアミノ酸グループを記載する下記表に従って行われてよい。

他の同類置換は下記表から行われる。

本発明中他の類似体は、ペプチド安定性を増加した修飾を伴うものである。そのような類似体は例えばペプチド配列中に一以上の非ペプチド結合（ぺプチド結合置換した）を含んでもよい。また、類似体は以下のものを含む。即ち、自然発生的Ｌアミノ酸以外の残基を含む誘導体例えばＤアミノ酸又は自然に生じないアミノ酸、又は合成アミノ酸例えばアルファ又はベータアミノ酸誘導体又は環状類似体である。

他の実施態様
本発明以下のものを含む。対立遺伝子変異、自然変異、導入変異、配列番号１のポリペプチドをコードする核酸へ高い又は低いストリンジェンシー条件下（高い又は低いストリンジェンシーについての定義はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９８９, ６．３.１ − ６．３．６を参照）ハイブリダイズしたＤＮＡによりコードされた蛋白質及びプルナラーゼに対する抗血清特にプルラナーゼの結合部位又は活性部位に対する抗血清により特異的に結合したポリペプチドである。

本発明の核酸及びポリペプチドは開示した配列決定の誤りによって本明細書に開示された配列と異なる核酸及びポリペプチドを含む。

本発明はまたフラグメント、好ましくは、生物活性フラグメント又はプルラナーゼ類似体を含む。生物活性フラグメント又はプルラナーゼ類似体は例えば本明細書に記載する一以上の生物活性のような他の自然発生的プルラナーゼの特徴又は配列番号２、４及び６に示すプルラナーゼの特徴を有するインビボ又はインビトロの活性を有するものである。特に、好ましいのは、例えば転写後プロセッシングに起因するフラグメント又は選択的スプライシングされたＲＮＡの翻訳に起因するフラグメントのようなインビボに存在するフラグメントである。フラグメントは例えばＣＨＯ細胞のような発現システムで作られたのと同様アミノ酸末端シグナル配列の除去の結果として、例えば転写後プロセッシングの結果として天然又は内因性細胞中に発現されたものを含む。特に所望のフラグメントは酵素的切断によって又は選択的スプライシングによって生じる活性フラグメントである。プルラナーゼのようなペプチドは生理学的特徴の範囲をしばしば提示するので、又そのような特徴は分子の異なる部分へ起因してもよいので、有用なプルラナーゼフラグメント又はプルラナーゼ類似体はプルラナーゼ活性についてのいずれの生物活性試験おいても生物活性を有するものである。より好ましいのはフラグメント又は類似体はいずれのインビボ又はインビトロでのプルラナーゼ試験においても、１０％、４０％、６０％、７０％、８０％又は少なくとも９０％のプルラナーゼ（配列番号２、４及び６）の活性を有する。そのようなプルラナーゼ類似体を作るある方法は、以下に述べるように、定方向分子進化によるプルラナーゼ類似体の合成を含む。

プルラナーゼのフラグメントは当業者が知っている方法で生成される。プルラナーゼの生物活性を有する対象となるフラグメントの能力は、本明細書に記載するように当業者が知っている方法で測定される。また、選択的ｍＲＮＡスプライシング又は選択的蛋白質プロセッシング現象の結果である又はペプチドの生物活性を必要としない残基を含むプルラナーゼペプチドを含む。

プルラナーゼペプチドを得るために、周知の方法によって、プルラナーゼをコードしているＤＮＡは発現ベクターに導入され、ベクターは所望の蛋白質の発現に適した細胞に導入され、ペプチドは回収され精製される。ペプチド及び蛋白質に対する抗体は、先行技術によって例えば、ウサギ又はマウスのような動物を免疫処理し、プルラナーゼ抗体を回収することにより作られる。

以下に開示された実験において、次の略語が適用される。
等量（ｅｑ（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ））、モル（Ｍ（Ｍｏｌａｒ））、マイクロモル（μＭ（ｍｉｃｒｏｍｏｉａｒ））、規定（Ｎ（ｎｏｒｍａｌ））、モル（ｍｏｌ （ｍｏｌｅｓ））、ミリモル（ｍｍｏｌ（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅｓ））、マイクロモル（μｍｏｌ（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅｓ））、ナノモル（ｎｍｏｌ（ｎａｎｏｍｏｌｅｓ））、グラム（ｇ（ｇｒａｍｓ））、ミリグラム（ｍｇ（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ））、キログラム（ｋｇ（ｋｉｌｏｇｒａｍｓ））、マイクログラム（μｇ（ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ））、リットル（Ｌ（ｌｉｔｅｒｓ））、ミリリットル（ｍｌ（ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ））、マイクロリットル（μｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ））、センチメートル（ｃｍ（ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒｓ））、ミリメートル（ｍｍ （ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ））マイクロメートル（μｍ（ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｓ））、ナノメートル（ｎｍ（ｎａｎｏｍｅｔｅｒｓ））、摂氏度（℃（ｄｅｇｒｅｅｓ Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ））、時間（ｈ（ｈｏｕｒｓ））、分（ｍｉｎ（ｍｉｎｕｔｅｓ））、秒（ｓｅｃ（ｓｅｃｏｎｄｓ））、ミリセコンド（ｍｓｅｃ（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄｓ））、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））、ヌクレオチド（ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ））、グルタミン（Ｑ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ））、グルタミン酸（Ｅ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ））、クロラムフェニコール（ＣＡＰ（ｃｈｏｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ））。

本発明はさらに以下の実施例においてさらに詳しく記述されるが、これらはいかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解してはならない。添付の図面は明細書及び本発明の記述の不可欠な部分として考慮されなければならない。特に、本明細書において引用されるすべての引用文献は、本明細書に記載されたすべての引用によって本明細書に組み入れられる。以下の実施例は説明のために記載されるが請求に係る発明が限定されることはない。

実施例１
プルラナーゼ誘導体のデザイン
以下のプルラナーゼ変異体がデザインされた（図１参照）。

「ＰＵＬ」これは「野生型」バチルス デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼであり、ＢＭＰ１３９によって発現された分子と同一である。遺伝子はコドン最適化がされ、ａｍｙＬ（ＬＡＴ）プロモーターにより促進され、ａｍｙＬシグナル配列を有する。この構築体とＢＭＰ１３９中の存在との間の相違点は以下に示している（図２参照）。ひとつめは、ＢＭＰ１３９中天然型コード配列に比べて新しい構築体はコドン最適化領域を有する。ふたつめは、ＢＭＰ１３９中では約８００ｎｔであるのに対して、新しい構築体は１００ｎｔというより短いａｍｙＬプロモーター領域を有する。みっつめは、ＢＭＰ１３９はバチルス デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼ停止ターミネーターを有する一方、新しい構築体はａｍｙＬターミネーターを有する。新しい構築体によって発現された分子は現在の生産物と同一であるが、コドン最適化の結果、生産力価に関して利点がある。

「ＰＵＬｍ１０４」これはＮ末端１０４個のアミノ酸が欠損しているバチルス デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼである。本構築体はａｍｙＬプロモーター、ａｍｙＬシグナル配列、コドン最適化プルラナーゼが成熟型プルラナーゼのＮ末端１０４個のアミノ酸をコードしている配列を欠損している領域のコード及びａｍｙＬターミネーターを有している。切断型ＰＵＬｍ１０４は完全長プルラナーゼＮ末端Ｅ９９及びＥ１０３の切断によって生じるＰＵＬｍ９８およびＰＵＬｍ１０２分子に似ている。ＡＳＡ-Ａのようなプルラナーゼ配列とａｍｙＬシグナル配列の間で所望のシグナルペプチダーゼ標的コンセンサス配列を得るためにプルラナーゼはアミノ酸１０４まで欠損させた。この切断型プルラナーゼ変異体の論理的根拠は完全長分子に比較してより高い特異的活性が切断したプルラナーゼ変異体に見られたという以前の驚くべき観察に従うものである。

「ＰＵＬ Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑ」これはプロテアーゼ標的モチーフＥ９９及びＥ１０３がＱ９９及びＱ１０３へ修飾されたバチルス デラミフィカンス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼであり、Ｅ９９及びＥ１０３での切断耐性を有するプルラナーゼ分子を作成することが目的である。さらに、５１時間後のプルラナーゼの分解がＥ９９及びＥ１０３での最初の切断に依存する場合、この修飾は５１時間後の活性低下及び分解を防ぐことが期待できる。

実施例２
プラスミドの構築及び形質転換
二つのコドン最適化プルラナーゼ構築体が合成され、ひとつは「野生型」プルラナーゼ蛋白質、他方はＥ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑ変異体をコードしている。

両者とも５７ヌクレオチドのａｍｙＬプロモーター（以前大腸菌中でのクローニングが可能であることが証明されており、より長いプロモーターの伸長は致命的である）、ａｍｙＬシグナル配列、コドン最適化プルラナーゼ（変異体）配列及びａｍｙＬターミネーターを有する。これらの構築体は上記３種のプルラナーゼ構築体のＰＣＲ構築体に対する鋳型として用いる。

「ＰＵＬ」以下のプライマーを合成「野生型」プルラナーゼ構築体から「野生型」プルラナーゼ構築体を増幅するために用いる。（ＸｈｏＩ部は（太字表示）下線表示）
Ｐｌａｔ５−ＸｈｏＩ＿ＦＷ:ｃｃｃｃｃｇｃｔｃｇａｇｇｃｔｔｔｔｃｔｔｔｔｇｇａａｇａａａａｔａｔａｇｇｇａａａａｔｇｇｔａｃｔｔｇｔｔａａａａａｔｔｃｇｇａａｔａｍａｔａｃａａｔａｔｃａｔａｔｇｔｔｔａｃａｔｔｇａａａｇｇｇｇ（配列番号７）。
Ｔｌａｔ−ＸｈｏＩ＿ＲＶ:ｔｇｇａａｔｃｔｃｇａｇｇｔｔｔｔａｔｃｃｍａｃｃｔｔｇｔｃｔｃｃ（配列番号８）

「ＰＵＬｍ１０４」切断型プルラナーゼの発現カセットは融合ＰＣＲによって生成される。以下の二つのフラグメントは合成「野生型」プルラナーゼ構築体から増幅され、その後融合される。

ａｍｙＬプロモーター及びａｍｙＬシグナル配列を有するフラグメント。

切断型プルラナーゼコード配列及びａｍｙＬターミネーターを有するフラグメント。

Ad A)
以下のプライマーをａｍｙＬプロモーター及びシグナル配列の増幅に用いる。
Ｐｌａｔ５―ＸｈｏＩ＿ＦＷ（配列番号７）(上記参照)。
ｓｓＬＡＴ―ＰＵＬｍｌ０４＿ＲＶ:ｇｃｇｔｔｇｃｔｇａｃｔｇｃｃｇｇｔｔｔａｇｃａｇｃｔｇｃｔｇａａｇｃｔｇｃａｇａａｔｇａｇｇｃａｇc（配列番号9）（融合プライマー、コドン１０５位から始まる逆プルラナーゼ配列を（太字表示）下線表示）

Ad B）
以下のプライマーをプルラナーゼコード配列及びａｍｙＬターミネーターの増幅に用いる。
ｓｓＬＡＴ−ＰＵＬｍｌ０４＿ＦＷ:ｇｃｔｇｃｃｔｃａｔｔｃｔｇｃａｇｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔｇｃｔａａａｃｃｇｇｃａｇｔｃａｇｃａａｃｇc （配列番号10）(融合プライマー、コドン１０５位から始まるプルラナーゼ配列を（太字表示）下線表示)
ＴＩａｔ―ＸｈｏＩ ＲＶ:（配列番号８）(上記参照)。

各融合プライマーは鋳型配列中に３１２ｎｔ（Ｎ末端１０４個のアミノ酸を表す）の間隔を置いて二つの配列を有する。Ａ)及びＢ)の下に記載した二つのＰＣＲフラグメントはＰｌａｔ５−ＸｈｏＩ ＦＷ及びＴｌａｔ−ＸｈｏＩ ＲＶのプライマーを用いてＰＣＲ反応にて融合された。

「ＰＵＬ Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑ」Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑプルラナーゼ変異体の構築は鋳型としてＥ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑ合成構築体をもつ（上記参照）「野生型」プルラナーゼの構築体の構築と同一であった。

作成されたフラグメントはベクターｐＩＣａｔＨに組み込まれたバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＸｈｏＩ部位へ二配向でクローン化された（図３）。これにより６個の構築体を得た。これらは、ｐＩＣａｔＨ−ＰＵＬ−Ｏｒｉｌ(図４)、ＰＩＣａｔＨ−ＰＵＬ−Ｏｒｉ２、ｐＩＣａｔＨ−ＰＵＬｍｌ０４−Ｏｒｉｌ（図５)、ｐＩＣａｔＨ−ＰＵＬｍ１０４−Ｏｒｉ２、 ｐＩＣａｔＨ−ＰＵＬ＿Ｅ９９Ｑ＿Ｅ１０３Ｑ−Ｏｒｉｌ(図６)及びＰＩＣａｔＨ−ＰＵＬ＿Ｅ９９Ｑ＿Ｅ１０３Ｑ−Ｏｒｉ２である。

Ｏｒｉ１及びＯｒｉ２構築体はクロラムフェニコール耐性（ｃａｔＨ）遺伝子に関連してプルラナーゼ遺伝子の反対の配向を有する。図４、５及び６は３個のＯｒｉ１構築体のプラスミドマップを示す。

すべての6個の構築体はバチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）へ形質転換された、ＡＺＣＬプルラン（メガザイム）重層（０．１％ ｉｎ １００ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ５、１％培地）中ハロー形状によってスクリーニングされた。ｐＩＣａｔＨ−ＰＵＬｍｌ０４の形質転換体は完全長プルラナーゼのどちらか一方の形質転換体より大きなハローを形成した。構築体はプロトプラスト形質転換使用バチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主菌ＢＭＬ６１２及びＢＭＬ７８０へ形質転換され及び検証された配列である。

実施例３
バチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子への組み換え
形質転換後、形質転換体は５μ／ｍｌクロラムフェニコール及び１０μ／ｍｌネオマイシンを含む最小再生培地で選別される。同じ抗生物質を含む二つのハートフュージョン寒天培地（当業者に知られている）へ形質転換体はレプリカプレートで処理された。プレートのひとつはプルラナーゼ陽性形質転換体を選択するためにＡＺＣＬプルランで重層されている。バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中の状況と似て、ＰＵＬｍｌ０４形質転換体はもっとも大きなハロー形成を示した。プラスミドはバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体のｃａｔＨ部位へ組み換えられた。すなわち、表２に記載する以下の組み換え体のセットについてさらなる切除及び増幅を続行できた。

プラスミドの切除及び増幅は以下のように行われる。外来ＤＮＡ（免疫菌株）のない菌体はベクター配列（ループアウト）切除を通して得られ、染色体に組み込まれたｃａｔＨプルラナーゼ発現カセットのみ残される。段階的に増加するクロラムフェニコール濃度（５、 ２５、 ５０、 ７５ μｇ／ｍｌ）に菌体をさらすことにより、発現カセットは増幅される。それぞれの増幅段階後ＡＺＣＬプルランをレプリカプレートに重層することにより観察される。各々菌体は四段階増幅レベルであるＣＡＰ５、ＣＡＰ２５、ＣＡＰ５０及びＣＡＰ７５にて得られる。

実施例４
バチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）プルラナーゼ菌体の評価
菌体はすべての増幅レベルで二点ずつ５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む一枚の大きなハートインフュージョン寒天培地プレートへ拾い上げられ、３７℃で終夜増殖される。プルラナーゼ生産菌であるＢＭＰ１３９が基準として含まれている。プルラナーゼ活性はＡＺＣＬプルラン培地をプレートに重層することによって目で見ることができる。その重層プレートは３７℃で8時間培養された後、室温で１６時間培養される。結果は下記表３にてまとめる。

評価から、増幅が力価及び／又は能力の増加に至ることが明らかとなる。より詳しい結論は以下の通りである。
１）Ｎ末端欠損ＰＵＬ菌体（ＰＵＬｍｌ０４）は完全長プルラナーゼ菌体以上のとても明白なパフォーマンス利益を有する。ＢＭＬ７８０ＰＵＬｍｌ０４ＣＡＰ７５菌体はＢＭＰ１３９菌体及びＢＭＬ７８０ＰＵＬＣＡＰ７５菌体ハロー形成以上の、２．５倍の増加した表面(１．５倍以上の直径)であるハローを形成する。これはより短い分子はより高い力価で生産され、又は、その活性は完全長プルラナーゼ分子と比べて増加することを示唆する。
２）ＰＵＬ＿Ｅ９９Ｑ Ｅ１０３Ｑ変異体は「野生型」ＰＵＬよりわずかな利益を有する。ＢＭＬ７８０ＰＵＬ＿Ｅ９９Ｑ＿Ｅ１０３Ｑ菌体形成ハローはＢＭＬ７８０ＰＵＬ菌体形成ハローより幾らか大きい。
３）ＢＭＰ１３９生産菌体はＣＡＰ７５増幅「野生型」ＰＵＬ菌体と等しい能力を現す。従って、プレート評価に基づいて、コドン最適化は能力増加には至らない。
４）ＢＭＬ７８０菌体は一般的にＢＭＬ６１２菌体よりよい能力を有する。この観察結果はＢＭＬ６１２基礎環境におけるプルラナーゼ分解という以前のデーターと一致する。本明細書において構築されたＢＭＬ６１２プルラナーゼ菌体がまだ適度なＡＺＣＬクリアリングを示すという事実はプレート上、ＢＭＬ６１２基礎環境においてでさえプルラナーゼが比較的安定していることを示唆する。
５）Ｏｒｉ１及びＯｒｉ２プルラナーゼ菌体の間ではっきりした能力の差は観察されない。

上記明細書に言及するすべての文献及び特許は引用により本明細書に組み入れられる。本発明の記載された方法及びシステムの種々の修飾及び変化は本発明の範囲及び精神に沿って当業者にて明らかである。本発明は特定の所望の実施態様との関係で記載されているが、特許請求の範囲にかかる発明が、そのような特定の実施態様に不当に限定すべきでないことは理解されるところである。実際に、本発明を行うために当業者とってあきらかな態様の種々の修飾は以下の特許請求の範囲内であることを意図する。

発明の産業上利用

本発明は産業上多く利用でき、本明細書にて意図するように、本明細書は典型的なものを記載するが、すべてを記載するものではない。

いくつかの実施態様において、本発明はエタノールの生産、パンの焼成、フルーツジュースの生産、発酵、蒸留、葡萄酒造り、皮、油及び脂肪、紙およびパルプ及び動物用の餌の生産における使用を意図する。

他の実施態様において、本発明は洗剤及び洗浄の製品において活性を有する「生物学的な」成分としての使用を意図する。本明細書にて、プロテアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼは蛋白質、デンプン及び脂肪の汚れを分解するために用いる。本発明の実施態様は、多様な製剤中安定性の研究及びそれらを試験することにより洗剤成分をもつ酵素の適合性を試験することを含む。

他の実施態様において、本発明は繊維産業、主に織物及び衣料品の仕上げに用いることを意図する。主な適用は、織物の湯通し、機織り後織物の糸から織物用の糊の除去（すなわち、繊維の固い要素の除去）。バイオポリッシィング、織物により滑らでより光沢のある外観を与るため及び布のけばたち傾向を減少させるための工程。バイオストーニング、使い込んだ風合いを見せるためにデニムのストーンウォッシングに用いる伝統的な軽石にかえて少量の酵素を用いる工程等である。

さらに他の実施態様において、本発明はグルコースへのデンプンの液化と糖化及びフルクトースへの異性化に対する酵素的使用を意図する。本発明はコーン及び他の穀物の大容量を高いフルクトースコーンシロップ及びマルトースシロップのような甘味料への転換に用いてもよい。

Claims (20)

1. 配列番号２、４及び６からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％配列相同性を有する単離ペプチド分子を含む組成物であって、前記単離されたペプチド分子はプルラナーゼ活性を有することを特徴とする組成物。
2. 配列番号１、３及び５からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子を含む組成物であって、前記ヌクレオチド配列がプルラナーゼをコードしていることを特徴とする組成物。
3. 配列番号２、４又は６のアミノ酸配列をもつ蛋白質をコードする単離されたＤＮＡを含む組成物。
4. 配列番号１、３及び５からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる単離ＤＮＡからなる発現構築体を含む組成物。
5. 前記発現構築体で形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動的に連結した請求項４の発現構築体。
6. 発現構築体が宿主生物にトランスフェクションされることを特徴とする、請求項５の発現構築体。
7. 前記宿主生物が、菌類、細菌類、真核細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６の宿主生物。
8. 前記宿主生物がバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、 トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）とバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７の宿主生物。
9. プルラナーゼをコードしている発現構築体を含む組成物であって、前記発現構築体は配列番号１、３及び５からなる群から選択された核酸配列を含むことを特徴とする組成物。
10. 配列番号２、４及び６からなる群から選択されたペプチドをコードしている発現構築体を含む組成物。
11. 以下の工程を含むプルラナーゼを生産する方法：
    (a)i）プルラナーゼをコードしているヌクレオチド配列を含む使用可能な条件における発現構築体であって、前記ヌクレオチド配列は配列番号１、３及び５からなる群から選択された発現構築体と；ii）宿主生物および；iii）培養手段と；を提供する工程
    (b) 前記発現構築体を前記宿主生物へトランスフェクションすることによりトランスフェクションした宿主生物を創作する工程。
    (c) プルラナーゼの生産のために充分な条件下及び時間にわたって前記培養手段における前記トランスフェクションした宿主生物を培養する工程。
12. 前記プルラナーゼが前記培養手段から単離されることを特徴とする、請求項１１の方法。
13. 前記宿主生物が菌類、細菌類、真核細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１の宿主生物。
14. 前記宿主生物がバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）、バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、 トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）とバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３の宿主生物。
15. 以下の工程を含むプルラナーゼを生産する方法：
    (a)i）発現構築体がトランスフェクションした宿主生物であって、前記発現構築体は配列番号２、４及び６からなる群から選択されたペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用可能な条件下においてコードしているものである宿主生物及びii）培養手段と；を提供する工程と、
    (b) プルラナーゼの生産のために充分な条件下及び時間にわたって前記培養手段における前記トランスフェクションした宿主生物を培養する工程。
16. 前記プルラナーゼが前記培養手段から単離されることを特徴とする、請求項１５の方法。
17. 前記宿主生物が菌類、細菌類、真核細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５の宿主生物。
18. 前記宿主生物がバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）、バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、 トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）とバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７の宿主生物。
19. 前記配列が定方向分子進化によって配列番号１、３及び５のいずれかに由来することを特徴とする、プルラナーゼをコードするヌクレオチド配列。
20. 表３に示すようにバチルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の一以上の菌株を含む組成物。

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