CN110184258B

CN110184258B - 一种普鲁兰酶突变体

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Publication number: CN110184258B
Application number: CN201910501002.1A
Authority: CN
Inventors: 段绪果; 栾舒越; 张心怡; 沈镇炎; 朱秋雨; 赵林果; 史洁莹
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN110184258A

Abstract

本发明公开了一种普鲁兰酶突变体，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明的普鲁兰酶突变体的热稳定性和催化效率较野生型有了明显的改善，其中，F513Y在55℃下的酶活可达最适温度下酶活的81.96％，在40℃下的半衰期可达78h，K_cat/K_m可达962.91s^‑1·mg^‑1·mL，分别为野生型的2.2倍、2.6倍和1.8倍；507‑13在55℃下的酶活可达最适温度下酶活的84.60％，在40℃下的半衰期可达65h，K_cat/K_m可达639.37s^‑1·mg^‑1·mL，分别为野生型的2.3倍、2.2倍和1.2倍；507‑11的K_cat/K_m可达617.85s^‑1·mg^‑1·mL，是野生型的1.2倍。

Description

一种普鲁兰酶突变体

技术领域

本发明涉及一种普鲁兰酶突变体，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

淀粉是植物体中贮存的养分，主要贮存在植物种子和块茎中，储量十分丰富。除食用外，淀粉主要被用于糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的制备，应用十分广泛。在利用淀粉制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的过程中，高效水解淀粉中存在的α-1,4-葡萄糖苷键以及α-1,6-葡萄糖苷键十分重要。其中，α-1,6葡萄糖苷键的含量虽然较低，只有6％左右，但是，α-1,6-葡萄糖苷键会使得淀粉形成分支结构，并且，大部分的如α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶等的淀粉加工用酶都是α-1,4-葡萄糖苷键水解酶，不具有α-1,6-糖苷键水解活力或水解活力极低，这大大降低了淀粉的利用率、增加了淀粉的转化时间，导致利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产效率低下。

普鲁兰酶，又名普鲁兰多糖-6-葡聚糖水解酶(pullulan-6-glucanohydrolase)，它可以专一性切割支链糊精中的α-1,6葡萄糖苷键，若在利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的过程中将普鲁兰酶与α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶等淀粉加工用酶联用，无疑可以大大提高淀粉的利用率，缩短淀粉的转化时间，为提高利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产效率提供更多可能。

但是，现有的普鲁兰酶仍然存在很多缺陷，缺陷如下：

第一，现有的普鲁兰酶热稳定性差，例如，来源于Shewanella arctica的普鲁兰酶，其在40℃下的半衰期仅有20min；来源于Bacillus megaterium的普鲁兰酶，其在40℃下处理后，只能残余40％的酶活，而淀粉水解的过程常需要一定的温度(40℃左右)；

第二，现有的普鲁兰酶催化效率低，例如，来源于Bacillus megaterium的普鲁兰酶，其催化效率仅有0.14s^-1·mg^-1·mL；来源于Bacillus flexus的普鲁兰酶，其催化效率仅有117.9s^-1·mg^-1·mL，而实际生产要求较高的催化效率。

上述缺陷均使得现有的普鲁兰酶无法很好的用于淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产过程。因此，急需找到一种热稳定性好且催化效率高的普鲁兰酶。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是得到一种热稳定性好且催化效率高的普鲁兰酶。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种普鲁兰酶突变体，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第513位氨基酸进行突变得到的；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第507位至第513位氨基酸进行突变得到的；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第507位至第511位氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第513位由苯丙氨酸突变成酪氨酸得到的，命名为F513Y；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第507位至第513位由依次为赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺以及苯丙氨酸的氨基酸序列突变成依次为天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺以及酪氨酸的氨基酸序列得到的，命名为507-13；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第507位至第511位由依次为赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸以及脯氨酸的氨基酸序列突变成依次为天冬氨酸、脯氨酸以及苏氨酸的氨基酸序列得到的，命名为507-11。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶来源于阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)GEL-09；所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GEL-09已于2017年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2017320，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GEL-09已经记载于公开号为CN107760623A的专利申请文本中。

在本发明的一种实施方式中，编码所述普鲁兰酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了编码上述普鲁兰酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-20b(+)载体。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了上述普鲁兰酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的发酵上清液中分离上述普鲁兰酶突变体。

本发明还提供了应用上述方法制备得到的普鲁兰酶突变体。

本发明还提供了上述普鲁兰酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法或上述制备得到的普鲁兰酶突变体在水解淀粉方面的应用。

本发明还提供了一种水解淀粉的方法，所述方法为将上述普鲁兰酶突变体或上述宿主细胞与其他淀粉酶同时加入淀粉中进行酶解；所述其他淀粉酶为糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和/或淀粉葡萄糖苷酶。

[有益效果]

(1)本发明的普鲁兰酶突变体的热稳定性较野生型有了明显的改善，其中，F513Y在55℃下的酶活可达最适温度下酶活的81.96％，在40℃下的半衰期可达78h，分别为野生型的2.2倍和2.6倍；507-13在55℃下的酶活可达最适温度下酶活的84.60％，在40℃下的半衰期可达65h，分别为野生型的2.3倍和2.2倍；

(2)本发明的普鲁兰酶突变体的催化效率较野生型有了明显的改善，其中，F513Y的K_cat/K_m可达962.91s^-1·mg^-1·mL，是野生型的1.8倍；507-13的K_cat/K_m可达639.37s^-1·mg^-1·mL，是野生型的1.2倍；507-11的K_cat/K_m可达617.85s^-1·mg^-1·mL，是野生型的1.2倍；

(3)本发明的普鲁兰酶突变体的比酶活较野生型有了明显的改善，其中，F513Y的比酶活可达477.49U·mg^-1，是野生型的1.32倍；507-11的比酶活可达378.53U·mg^-1，是野生型的1.05倍。

附图说明

图1：含有编码不同普鲁兰酶基因的重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果；

其中，M为蛋白分子量标准；1为含有编码PulBa的基因的重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果；2为含有编码116-9的基因的重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果；3为含有编码312-5的基因的重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果；4为含有编码507-11的基因的重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果；5为含有编码F513Y的基因的重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果；6为含有编码507-13的基因的重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果；7为含有编码726-31的基因的重组菌的发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果。

图2：PulBa、507-11、F513Y以及507-13在不同pH下的相对酶活。

图3：PulBa、507-11、F513Y以及507-13在不同pH下保存24h后的残留酶活。

图4：PulBa、507-11、F513Y以及507-13在不同温度下的相对酶活。

图5：PulBa、507-11、F513Y以及507-13在不同40℃下保存不同时间后的残留酶活。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109以及大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，阿氏芽孢杆菌CCTCC No:M 2017320购自中国典型培养物保藏中心，pET-20b(+)载体购自Novagen公司。(上述菌株大肠杆菌JM109、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、阿氏芽孢杆菌CCTCC No:M 2017320均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、氨苄青霉素100μg·mL^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉15g/L、氨苄霉素30μg·mL^-1。

TB培养基：甘油5.0g·L^-1、胰蛋白胨12.0g·L^-1、酵母粉24.0g·L^-1、K₂HPO₄·3H₂O16.4g·L^-1、KH₂PO₄ 2.3g·L^-1、甘氨酸7.5g·L^-1、氨苄青霉素100μg·mL^-1。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

普鲁兰酶酶活的测定方法：

分别取1mL的底物(1.0％普鲁兰溶液)和0.9mL的浓度为50mmol·L^-1、pH为6.5的磷酸缓冲液于试管中，50℃水浴预热10min左右；加入0.1mL稀释的酶液样品，震荡混匀，50℃孵育10min，加入3mL DNS终止反应，沸水浴7min，冰水浴中冷却；向上述反应体系中加入10mL的蒸馏水，颠倒混匀，在540nm下测量其吸光值，同样条件下用以灭活的酶液作为酶液样品的反应体系作为空白。

酶活的(U)定义为：在上述分析测定条件下，每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖还原力的酶量定义为一个活力单位(1U)。

普鲁兰酶比酶活的测定方法：

测定纯化后的普鲁兰酶的酶活(U/mL)，并且，采用Bradford法测定纯化后的普鲁兰酶的蛋白含量(mg/mL)，以计算普鲁兰酶的比酶活；

其中，普鲁兰酶比酶活的计算公式如下：

普鲁兰酶比酶活(U/mg)＝纯化后的普鲁兰酶的酶活(U/mL)/纯化后的普鲁兰酶的蛋白含量(mg/mL)。(Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.(1976)A rapid andsensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry,72,248-254.”中)

实施例1：野生型普鲁兰酶的表达

具体步骤如下：

(1)阿氏芽孢杆菌CCTCC No:M 2017320基因组DNA的提取

挑取阿氏芽孢杆菌CCTCC No:M 2017320单菌落接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下振荡培养12h后，于12000rpm的条件下离心2分钟，收集菌体；用去离子水洗涤菌体后，再次离心并收集菌体并将收集的菌体悬浮于200μL Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液中，得到重悬液；在重悬液中先加入20μL溶菌酶，于37℃下保温30min，然后加入5μL RNA酶，于37℃下保温30min，再加入30μL 10％的SDS(十二烷基硫酸钠)和15μL蛋白酶K，于37℃下保温60min，最后加入100μL NaCl(5M)和80μL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，于65℃下保温20min，得到反应液；将反应液用700μL的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)进行抽提后，于12000rpm的条件下离心，得到上清液；将上清液用700μL的氯仿：异戊醇(24：1)抽提后，于12000rpm离心，再次得到上清液；将再次得到的上清液与1400μL体积的冰异戊醇混合后，于-20℃沉淀30min，并于12000rpm离心，得到沉淀；将沉淀用200μL70％的乙醇清洗后，于12000rpm离心，再次得到沉淀；将再次得到的沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即得阿氏芽孢杆菌基因组DNA；

(2)编码野生型普鲁兰酶的基因的提取

利用引物，以提取的阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai CCTCC No:M 2017320基因组为模板，PCR扩增阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai CCTCC No:M 2017320来源的编码野生型普鲁兰酶的基因(编码普鲁兰酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)；

其中，扩增引物如下：

PulBa-F：5’-CCGGCGATGGCCATGGCGGATACCACAAAACTCACG-3’(SEQ ID No.3)；

PulBa-R：5’-GTGCGGCCGCAAGCTTATCTTACTAGTACAAATGTCG-3’(SEQ ID No.4)；

PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为94℃预热4min变性，随后进入循环，于94℃加热变性30s后于56℃降温退火30s，然后升温至72℃延伸3min，一共循环30次；随后72℃保存10min后置于12℃保存；

将扩增得到的大小为2814bp的PCR片段割胶回收，将回收产物与pET20b(+)载体经双酶切(Nco I和Hind III)后进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含30μg·mL^-1氨苄霉素的LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入含有30μg·mL^-1氨苄霉素的LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，结果表明编码此野生型普鲁兰酶的基因全长为2814bp个核苷酸，编码937个氨基酸。

(3)编码野生型普鲁兰酶的基因的验证

将测序正确的重组质粒PulBa-pET20b(+)热激转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，于含30μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养8～10h，挑选转化子；将挑选得到的转化子在LB液体培养基中于37℃培养8～10h，然后接入TB培养基中于37℃培养4h，再用0.4mM异丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)于30℃诱导培养44h，得到含有野生型普鲁兰酶的发酵液，将发酵液离心取上清，得到含有野生型普鲁兰酶的发酵上清液。

将得到的发酵上清液作为酶液样品进行普鲁兰酶活力测定，检测结果为：酶液样品中普鲁兰酶酶活力为175.0U·mL^-1，此结果表明，野生型普鲁兰酶(普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)表达成功，且具有普鲁兰酶活力。

实施例2：普鲁兰酶突变体的制备及表达

具体步骤如下：

利用全质粒PCR技术，以实施例1获得的重组质粒PulBa-pET20b(+)为模板进行定点突变，获得突变体116-9、312-5、507-11、F513Y、507-13以及726-31；

其中，突变体116-9是通过将野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的^116-NYHR^-119删除得到的，所用引物如下：

116-9-For：5’-GTAAACGTTACCTTATACGATGGAGATTATAGCGGG-3’(SEQ ID No.5)；

116-9-Rev：5’-CCCGCTATAATCTCCATCGTATAAGGTAACGTTTAC-3’(SEQ ID No.6)；

突变体312-5是通过将野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的^312-KEFD^-315删除得到的，所用引物如下：

312-5-Fro：5’-AGTGTCGTGCGTACGGAAAAGTATGCATATAGCGGAAAC-3’(SEQ ID No.7)；

312-5-Rev：5’-ATATGCATACTTTTCCGTACGCACGACACTTCCATTG-3’(SEQ ID No.8)；

突变体507-11是通过将野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的^507-KLNEP^-511突变为^507-DPT^-511得到的，所用引物如下：

507-11-For：5’-GATCCGACCCAGTTTAACTGGGGATATGATCCG-3’(SEQ ID No.9)；

507-11-Rev：5’-CGTACGGTGGATGAAACGGATCCGACCCAGTTT-3’(SEQ ID No.10)；

突变体F513Y是通过将野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的第513位由苯丙氨酸突变成酪氨酸得到的，所用引物如下：

F513Y-For：5’-CGAGCCGCAGTATAACTGGGGATATG-3’(SEQ ID No.11)；

F513Y-Rev：5’-CATATCCCCAGTTATACTGCGGCTCG-3’(SEQ ID No.12)；

突变体507-13是通过将野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的^507-KLNEPQF^-513突变为^507-DPTQY^-513得到的，所用引物如下：

507-13-For：5’-GATCCGACCCAGTATAACTGGGGATATGATCCG-3’(SEQ ID No.13)；

507-13-Rev：5’-ATACTGGGTCGGATCCGTTTCATCCACCGTACGATAATC-3’(SEQ IDNo.14)；

突变体726-31是通过将野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的^726-GIDUD^-731删除得到的，所用引物如下：

726-31-For：5’-CAAAGTATAGCAGCTTCAACTGCCACGTATGAAGATC-3’(SEQ ID No.15)；

726-31-Rev：5’-ATACGTGGCAGTTGAAGCTGCTATACTTTGCTGTATG-3’(SEQ ID No.16)；

PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为94℃预变性4min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸8min；最后72℃延伸10min，4℃保温。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将Dpn I处理后的扩增产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含30μg·mL^-1氨苄霉素的LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入含有30μg·mL^-1氨苄霉素的LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，测序正确的重组质粒PulBa-pET20b(+)热激转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，于含30μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养8～10h，挑选转化子，此转化子即为含有编码突变体116-9、312-5、507-11、F513Y、507-13或726-31的基因的重组菌。

将含有编码突变体116-9、312-5、507-11、F513Y、507-13或726-31的基因的重组菌分别在LB液体培养基中于37℃培养8～10h，然后接入TB培养基中于37℃培养4h，再用0.4mM异丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)于30℃诱导培养44h，得到发酵液，将发酵液离心，得到发酵上清液和沉淀，将沉淀经超声波破碎，得到细胞破碎液。

将利用含有编码突变体116-9、312-5、507-11、F513Y、507-13或726-31的基因的重组菌发酵得到的发酵上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，分析结果见图1。

由图1可知，利用含有编码突变体116-9、312-5或726-31的基因的重组菌发酵得到的发酵上清中没有可溶性目的蛋白出现；利用含有编码突变体507-11、F513Y和507-13的基因的重组菌发酵得到的发酵上清中有可溶性目的蛋白出现，突变体507-11、F513Y和507-13表达情况正常。

将利用含有编码突变体116-9、312-5或726-31的基因的重组菌发酵得到的细胞破碎液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

结果表明，利用含有编码突变体116-9、312-5或726-31的基因的重组菌发酵得到的细胞破碎液中也没有可溶性目的蛋白出现，突变体116-9、312-5或726-31无法表达。

将含有突变体507-11、F513Y或507-13的发酵上清液作为酶液样品进行普鲁兰酶活力测定，检测结果为：含有突变体507-11、F513Y或507-13的发酵上清液中普鲁兰酶酶活力分别为161.51U·mL^-1、212.16U·mL^-1和244.53U·mL^-1，此结果进一步表明，突变体507-11、F513Y和507-13表达成功，且具有普鲁兰酶活力。

实施例3：不同普鲁兰酶的的分离纯化

具体步骤如下：

将实施例1获得的含有野生型普鲁兰酶的发酵上清液以及实施例2获得的分别含有突变体507-11、F513Y和507-13的发酵上清液分别采用70％的(NH₄)₂SO₄进行盐析，离心收集沉淀；将沉淀复溶于pH 6.8、50mmol·L^-1的磷酸缓冲液中透析20h，中间更换一次缓冲液，得到样品；将样品经过0.45μm膜过滤后制成上样样品；将上样样品经DEAE阴离子交换色谱柱进行纯化，280nm紫外在线监测收集目的组分，分部收集含普鲁兰酶酶活的洗脱液，得到纯化后的野生型普鲁兰酶以及突变体507-11、F513Y和507-13，分别命名为野生型、507-11、F513Y和507-13。

实施例4：不同普鲁兰酶的的酶学性质研究

具体步骤如下：

(1)不同普鲁兰酶的比酶活

对实施例3获得的野生型、507-11、F513Y和507-13进行比酶活的检测，检测结果为：野生型的比酶活为361.26U·mg^-1，507-11的比酶活为378.53U·mg^-1，F513Y的比酶活为477.49U·mg^-1，507-13的比酶活为313.65U·mg^-1，可见，507-11和F513Y的比酶活较野生型有了明显的改善。

(2)不同普鲁兰酶的最适pH及pH稳定性

配制pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸缓冲液代替普鲁兰酶活力测定方法中的缓冲液，在50℃下测定实施例3获得的野生型、507-11、F513Y和507-13的普鲁兰酶活力，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察野生型、507-11、F513Y和507-13的最适作用pH(检测结果见图2)；

配制pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸缓冲液代替普鲁兰酶活力测定方法中的缓冲液，将实施例3获得的野生型、507-11、F513Y和507-13分别在上述缓冲体系下于25℃保存24h后，在50℃下测定野生型、507-11、F513Y和507-13的普鲁兰酶活力，以初始酶活为100％，保存后酶活与之相比计算残留酶活，以考察野生型、507-11、F513Y和507-13的pH稳定性(检测结果见图3)。

由图2可知，F513Y、507-13的最适pH和野生型相同，都是6.5；507-11的最适pH为7.0，与野生型差异较小。

由图3可知，F513Y、507-13和507-11在不同pH下的酶活保存率与野生型较为接近，可见，F513Y、507-13和507-11的pH稳定性与野生型相差不大。

(3)不同普鲁兰酶的最适温度及温度稳定性

分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的条件下测定实施例3获得的野生型、507-11、F513Y和507-13的普鲁兰酶酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察野生型、507-11、F513Y和507-13的最适作用温度(检测结果见图4)；

将实施例3获得的野生型、507-11、F513Y和507-13分别在40℃的条件下保温，每隔一段时间后将部分酶液取出，迅速冷却，测定其普鲁兰酶活力，以初始酶活为100％，保温后酶活与之相比计算残留酶活，以考察野生型、507-11、F513Y和507-13的温度稳定性(检测结果见图5)。

由图4可知，507-11、F513Y和507-13的最适温度都是50℃，与野生型的最适温度相同，其中，F513Y和507-13在55℃条件下的可保留81.96％和84.60％的活性，而野生型只能够保留36.97％的活性，可见，F513Y和507-13在较高温度下仍然具有较高的普鲁兰酶催化活力，其作用温度范围相比于野生型更宽。

由图5可知，F513Y在40℃下的半衰期可达78h，为野生型的2.6倍；507-13在40℃下的半衰期可达65h，为野生型的2.2倍，可见，F513Y和507-13的热稳定性较野生型有了明显的改善。

(4)不同普鲁兰酶的动力学参数

分别以浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0mg/mL的普鲁兰多糖溶液为底物，在50℃、pH 6.5条件下测定实施例3获得的野生型、507-11、F513Y和507-13的初始水解活力，采用Graph Pad Prism 7.0软件中的非线性回归方法对数据进行拟合，分别得到米氏(Michaelis-Menten)方程的K_m和V_max值，再计算得到K_cat和K_cat/K_m值，计算结果见表1；

其中，K_cat值的计算公式为：K_cat＝V_max/M/106124.74/60；其中，M为反应中加入的酶的质量，单位为mg。

表1野生型、507-11、F513Y和507-13的动力学参数

组别	K<sub>cat</sub>(s<sup>-1</sup>)	K<sub>m</sub>(mg·mL<sup>-1</sup>)	K<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>(mL·mg<sup>-1</sup>·s<sup>-1</sup>)
				野生型	734.62	1.373	535.05
507-11	827.30	1.339	617.85
				F513Y	1072.68	1.114	962.91
507-13	646.40	1.011	639.37

由表1可知，F513Y的K_cat/K_m可达962.91s^-1·mg^-1·mL，是野生型的1.8倍；507-13的K_cat/K_m可达639.37s^-1·mg^-1·mL，是野生型的1.2倍；507-11的K_cat/K_m可达617.85s^-1·mg^-1·mL，是野生型的1.2倍，可见，507-11、F513Y和507-13的催化效率较野生型有了明显的改善。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种普鲁兰酶突变体

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 937

<212> PRT

<213> Bacillus aryabhattai

<400> 1

Ala Asp Thr Thr Lys Leu Thr Ile His Tyr Gln Pro Ala Ser Asn Asp

1 5 10 15

Thr Lys Glu Trp Gly Leu Trp Val Phe Pro Glu Gly Gly Glu Gly Lys

20 25 30

Pro Tyr Ala Phe Thr Gly Glu Asp Gln Phe Gly Lys Val Ala Glu Val

35 40 45

Glu Leu Pro Gly Thr Tyr Asp Lys Val Gly Phe Ile Val Arg Thr Glu

50 55 60

Ser Trp Glu Lys Asp Gly Gly Asp Arg Phe Val Ser Val Glu Asn Gly

65 70 75 80

Glu Gly Glu Val Trp Val Lys Ser Gly Asp Glu His Thr Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Pro Asp Gly Glu Tyr Arg Asp Leu Pro Glu Phe Asp Lys Val Asn

100 105 110

Val Thr Leu Asn Tyr His Arg Tyr Asp Gly Asp Tyr Ser Gly Trp Asn

115 120 125

Ile Trp Thr Trp Pro Gly Asp Glu Lys Glu Gly Lys Gln Ile Glu Phe

130 135 140

Thr Glu Asp Thr Asn Phe Gly Lys Lys Ala Thr Tyr Thr Ile Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Gly Asn Leu Phe Asp Lys Ile Gly Phe Ile Val Arg His Ser

165 170 175

Thr Ser Asp Ser Asp Trp Glu Asn Lys Asp Gly Gly Asn Arg Phe Ile

180 185 190

Thr Lys Val Gly Lys Asp Gly Asn Val Glu Val Trp Ile Val Gln Gly

195 200 205

Gln Asn Arg Ile Tyr Tyr Asp Arg Ala Gly Val Asp Leu Thr Arg Lys

210 215 220

Ile Met Lys Ala Thr Met Asp Thr Phe Asn Gln Ile Thr Leu Glu Thr

225 230 235 240

Asn Val Pro Phe Asp Ser Ser Lys Ser Leu Gly Asp Ile Glu Ile Asp

245 250 255

Gly Ala Gln Ile Glu Lys Val Thr Pro Tyr Lys Glu Gly Gly Asp Ala

260 265 270

Val Thr Thr Lys Ile Lys Ile Ile Thr Lys Arg Pro Leu Asp Val Thr

275 280 285

Gln Thr Tyr Arg Val Lys Gln Gln Gly Tyr Gly Ser Ala Asp Val Val

290 295 300

Asn Gly Asn Val Val Arg Thr Lys Glu Phe Asp Glu Lys Tyr Ala Tyr

305 310 315 320

Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Ser Lys Lys Gln Thr Asn Phe

325 330 335

Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Glu Ala Lys Leu Val Thr Tyr Ser

340 345 350

Ser Trp Asn Ser Lys Ala Leu Lys Glu Ile Ser Met Thr Lys Ser Glu

355 360 365

Lys Gly Thr Trp Lys Ala Glu Leu Lys Gly Asn Gln Asp Glu Leu Ile

370 375 380

Tyr Thr Tyr Lys Val Lys Ile Gly Asn Val Trp Asn Glu Ala Val Asp

385 390 395 400

Pro Tyr Val Arg Ala Thr Thr Val Asn Gly Asp Arg Gly Val Val Val

405 410 415

Asp Leu Ala Lys Thr Asn Pro Lys Lys Trp Ser Thr Asn Lys Pro Lys

420 425 430

Phe Lys Asn Pro Glu Asp Ala Ile Ile Tyr Glu Leu His Val Arg Asp

435 440 445

Leu Ser Ser Gln Lys Glu Ser Gly Ile Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu

450 455 460

Gly Val Ala Glu Trp Asn Thr Lys Gly Pro Asn Gly Val Lys Thr Gly

465 470 475 480

Leu Ser His Ile Lys Asp Leu Gly Val Thr His Val Gln Phe Leu Pro

485 490 495

Ile Tyr Asp Tyr Arg Thr Val Asp Glu Thr Lys Leu Asn Glu Pro Gln

500 505 510

Phe Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Lys Asn Tyr Asn Val Pro Glu Gly Ser

515 520 525

Tyr Ser Thr Asn Pro Tyr Asn Pro Lys Thr Arg Ile Ile Glu Leu Lys

530 535 540

Gln Met Ile Gln Thr Leu His Asp Lys Gln Leu Arg Met Val Met Asp

545 550 555 560

Val Val Tyr Asn His Val Tyr Ala Val Ser Glu His Ser Phe Asp Lys

565 570 575

Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Phe Arg Tyr Lys Glu Asp Gly Thr Leu Ser

580 585 590

Asn Gly Thr Gly Val Gly Asn Asp Thr Ala Ser Glu Arg Lys Met Val

595 600 605

Arg Lys Phe Ile Val Asp Ser Val Ala Tyr Trp Ala Lys Glu Tyr His

610 615 620

Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Ile His Asp Thr Lys Thr

625 630 635 640

Met Asn Glu Val Arg Lys Lys Leu Asp Glu Leu Asp Pro Ser Ile Ile

645 650 655

Val Leu Gly Glu Gly Trp Asp Leu Gly Thr Glu Leu Asp Ala Lys Leu

660 665 670

Lys Ala Asn Gln Lys Asn Ala Gln Asp Met Lys Arg Ile Ala His Phe

675 680 685

Asn Asp Gly Met Arg Asp Gly Leu Lys Gly Ser Val Phe Phe Asp His

690 695 700

Asp Asn Gly Phe Val Asn Gly Lys Gln Gly Gln Glu Lys Leu Ile Gln

705 710 715 720

Gln Ser Ile Ala Ala Gly Ile Asp Tyr Asp Arg Ser Thr Ala Thr Tyr

725 730 735

Glu Asp Pro Asp Gln Val Val Thr Tyr Val Glu Ala His Asp Asn His

740 745 750

Thr Leu Trp Asp Lys Leu Gln Leu Thr Asn Pro Ala Asp Thr Glu Gln

755 760 765

Thr Lys Lys Gln Met His Lys Leu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Thr Ser

770 775 780

Gln Gly Met Asn Phe Ile His Ala Gly Gln Glu Phe Met Arg Thr Lys

785 790 795 800

Gly Gly Asp His Asn Ser Tyr Gln Ser Pro Asp Ser Val Asn Gln Leu

805 810 815

Asp Trp Lys Arg Arg Ala Ala Phe Arg Gln Glu Val Asn Tyr Met Lys

820 825 830

Gly Leu Ile Ala Leu Arg Lys Gln Tyr Ser Ser Phe Arg Met Thr Ser

835 840 845

Ala Gln Ala Ile His Gln Asn Leu Arg Phe Val Asp Ala Pro Ala Asn

850 855 860

Val Val Gly Tyr Thr Leu Asn Ala Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn

865 870 875 880

Glu Ile Met Val Ile His Asn Ala Asn Lys Gln Ala Gln Thr Val His

885 890 895

Leu Pro Ser Asn Arg Thr Trp Arg Leu Leu Val Asp Gly Glu Arg Ala

900 905 910

Gly Thr Lys Thr Leu Arg Thr Val Lys Gly Asn Thr Ile Asn Val Ser

915 920 925

Pro Leu Ser Thr Phe Val Leu Val Arg

930 935

<210> 2

<211> 2814

<212> DNA

<213> Bacillus aryabhattai

<400> 2

gcggatacca caaaactcac gattcactat cagcctgctt caaacgatac aaaagaatgg 60

ggattatggg tttttcctga aggaggagaa gggaagcctt acgcatttac aggggaagat 120

caatttggaa aagtagcgga agttgaacta cccggtactt atgacaaagt aggttttatt 180

gtacgaacag agtcgtggga aaaagatgga ggagaccgct tcgtttcagt ggagaacggt 240

gaaggagaag tatgggtaaa aagtggagat gaacatacat atacgtctcc tcctgacggt 300

gaatatcgag atttaccgga atttgataaa gtaaatgtta ccttaaacta tcatcggtac 360

gatggagatt atagcgggtg gaacatttgg acatggccag gtgatgaaaa agaaggcaag 420

caaatcgaat ttacggaaga cacgaatttt gggaagaaag caacttacac aattaacagt 480

ggaagtggta atttatttga caaaattggt tttattgtac gccattctac tagtgacagc 540

gattgggaaa ataaagacgg aggaaaccgc tttattacca aggttggtaa agatgggaat 600

gtagaagtat ggattgttca agggcaaaat cgaatttatt acgatagagc tggagtagat 660

ctcactcgga aaatcatgaa ggcgacgatg gatacattta atcaaatcac cttagaaaca 720

aacgtgccgt ttgactcttc taagagttta ggagacattg aaattgacgg agctcaaatt 780

gagaaagtga caccttataa agagggagga gacgctgtta ctactaaaat taaaatcata 840

acaaaacggc ctttggacgt tacacaaacg tatagagtta agcaacaagg atacggatca 900

gctgatgtag tcaatggaaa tgtcgtgcgt acgaaagaat ttgacgaaaa gtatgcatat 960

agcggaaacg atttaggaaa cacatattct aagaaacaaa caaattttcg cgtatgggct 1020

ccaactgcaa gcgaagccaa gctagtgact tattcgtcat ggaactcgaa agctttaaaa 1080

gaaatttcta tgactaaaag tgaaaaagga acgtggaaag cggagttaaa aggaaatcaa 1140

gatgaactaa tttatacgta caaagtaaaa attgggaacg tctggaatga agcggttgat 1200

ccatatgtac gagcaacaac ggtcaatgga gatcgcggag tcgtcgtaga tttggctaaa 1260

acaaatccga aaaagtggag tacaaataag ccgaaattta aaaatccaga agatgccatt 1320

atctatgaac tgcacgtacg agatttatcg tctcaaaaag agagcggtat caaaaacaaa 1380

ggaaaatatt taggcgtagc ggagtggaat acgaaaggac caaatggagt aaaaacagga 1440

ctcagtcata ttaaagattt aggtgtaacg cacgtccagt tcctgcctat ttacgattat 1500

cgtacggtgg atgaaacgaa attaaacgag ccgcagttta actggggata tgatccgaaa 1560

aattataacg tcccagaagg ctcctattca acaaacccat ataatcctaa gactagaatt 1620

attgagctca aacaaatgat tcaaacgctt catgacaagc agcttcgcat ggtaatggac 1680

gttgtttata atcacgtgta tgcagtgagt gagcatagtt ttgataaact agttccaggc 1740

tactacttcc gttataaaga agatggaact ctatccaacg gaacaggtgt tggaaacgac 1800

acggcgtctg aacggaaaat ggttcggaag tttatcgtag attctgttgc gtattgggca 1860

aaagagtacc acattgacgg gtttcggttt gatttaatgg ggattcacga tacaaagaca 1920

atgaatgaag tgagaaagaa gttagatgaa cttgatcctt ccattatcgt cttaggagag 1980

ggctgggatc taggaaccga gcttgacgct aagctcaaag ctaaccagaa aaacgctcag 2040

gatatgaagc gcatcgctca ctttaatgac ggtatgcggg atggtcttaa aggcagcgta 2100

ttttttgatc atgacaacgg atttgtgaat ggaaagcaag gacaagaaaa gctcatacag 2160

caaagtatag cagctggaat tgattatgat cgttcaactg ccacgtatga agatccagat 2220

caagttgtta cgtatgtaga agcgcacgat aaccatacgt tatgggataa gcttcagctg 2280

acgaaccctg ctgacaccga gcaaacgaaa aagcaaatgc acaagcttgc ttcttctatt 2340

attttaacat ctcaaggaat gaactttata catgcaggtc aagagtttat gagaacaaaa 2400

ggcggagacc ataacagcta tcagtcaccc gattctgtca atcagctaga ttggaagcgc 2460

cgagcagctt tcagacaaga agtaaattac atgaagggac ttattgcgct tcgaaagcaa 2520

tattcgtcat ttagaatgac gagtgcacag gctattcatc aaaatttacg ctttgttgat 2580

gcaccagcaa acgtagtagg ttatacgtta aatgctaaag ctaataaaga taaagcaaac 2640

gaaataatgg tgattcataa tgcaaataaa caagctcaaa cggttcattt gccttctaac 2700

agaacgtgga gattacttgt tgacggcgag cgggccggaa caaaaacact ccgtacggtg 2760

aaaggaaata caataaacgt ttcgcctctt tcgacatttg tactagtaag ataa 2814

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggcgatgg ccatggcgga taccacaaaa ctcacg 36

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgcggccgc aagcttatct tactagtaca aatgtcg 37

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtaaacgtta ccttatacga tggagattat agcggg 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccgctataa tctccatcgt ataaggtaac gtttac 36

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agtgtcgtgc gtacggaaaa gtatgcatat agcggaaac 39

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atatgcatac ttttccgtac gcacgacact tccattg 37

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatccgaccc agtttaactg gggatatgat ccg 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgtacggtgg atgaaacgga tccgacccag ttt 33

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgagccgcag tataactggg gatatg 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

catatcccca gttatactgc ggctcg 26

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gatccgaccc agtataactg gggatatgat ccg 33

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atactgggtc ggatccgttt catccaccgt acgataatc 39

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caaagtatag cagcttcaac tgccacgtat gaagatc 37

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atacgtggca gttgaagctg ctatactttg ctgtatg 37

Claims

1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第513位由苯丙氨酸突变成酪氨酸得到的；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第507位至第513位由依次为赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺以及苯丙氨酸的氨基酸序列突变成依次为天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺以及酪氨酸的氨基酸序列得到的；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第507位至第511位由依次为赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸以及脯氨酸的氨基酸序列突变成依次为天冬氨酸、脯氨酸以及苏氨酸的氨基酸序列得到的。

2.编码权利要求1所述普鲁兰酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。

4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。

5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌。

7.权利要求1所述普鲁兰酶突变体的制备方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的发酵上清液中分离权利要求1所述的普鲁兰酶突变体。

8.权利要求1所述普鲁兰酶突变体或权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组质粒或权利要求5或6所述宿主细胞或权利要求7所述制备方法在水解淀粉方面的应用。

9.一种水解淀粉的方法，其特征在于，将权利要求1所述普鲁兰酶突变体或权利要求5或6所述宿主细胞与其他淀粉酶同时加入淀粉中进行酶解；所述其他淀粉酶为糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和/或淀粉葡萄糖苷酶。