ES2547857T3

ES2547857T3 - Variantes de pululanasa con productividad aumentada

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Publication number: ES2547857T3
Application number: ES07837179.6T
Authority: ES
Inventors: George England; Marc Kolkman; Brian S. Miller; Casper Vroemen
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2006-08-23
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2015-10-09
Anticipated expiration: 2027-08-21
Also published as: US8354101B2; US20080108126A1; HUE025068T2; BRPI0715619A2; JP2010501181A; EA200970212A1; CN101506360B; KR20090041410A; EP2054512B1; CA2949536A1; CN103898080A; CA2663948C; HK1135137A1; US20110281326A1; WO2008024372A3; CN103898080B; WO2008024372A2; PL2054512T3; MX2009001717A; CN101506360A

Abstract

Pululanasa aislada que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6.

Description

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[0040] Las técnicas de expresión que utilizan los vectores de expresión de la presente invención son conocidas en la técnica y se describen generalmente en, por ejemplo, Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION, Cold Spring Harbor Press (1989). A menudo, tales vectores de 5 expresión entre los que se incluyen las secuencias de ADN de la invención se transforman en un huésped unicelular mediante inserción directa en el genoma de una especie específica a través de un caso de integración (véase, p. ej., Bennett & Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego, pp. 70-76 (1991) y artículos mencionados en ese documento que describen la inserción genómica dirigida en huéspedes fúngicos).

[0041] Los términos "unido de forma operativa", "en combinación operativa" y "en orden operativo" de acuerdo con el presente documento hacen referencia a la unión de las secuencias de ácido nucleico de forma que lleven a cabo la función prevista. Por ejemplo, la unión de forma operativa de una secuencia promotora a una secuencia de nucleótidos de interés hace referencia a la unión de la secuencia promotora y la secuencia de nucleótidos de interés de forma que la secuencia promotora sea capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos

15 de interés y/o la síntesis de un polipéptido codificado mediante la secuencia de nucleótidos de interés. De forma similar, la unión de forma operativa de una secuencia de ácido nucleico con actividad reguladora relacionada con la edad a una secuencia promotora y a una secuencia de nucleótidos de interés hace referencia a la unión de la secuencia de ácido nucleico con actividad reguladora relacionada con la edad, la secuencia promotora y la secuencia de nucleótidos de interés de forma que la secuencia de ácido nucleico con actividad reguladora relacionada con la edad sea capaz de modificar durante un periodo de tiempo el nivel de transcripción en el ARNm de la secuencia de nucleótidos de interés y/o la síntesis de un polipéptido codificado mediante la secuencia de nucleótidos de interés.

[0042] Los términos "organismo huésped", "cepa huésped" o "célula huésped" se refieren en el presente

25 documento a un huésped adecuado para un vector de expresión que incluye ADN de acuerdo con la presente invención. Las células huésped útiles en la presente invención son normalmente huéspedes eucariotas o procariotas, incluido cualquier microorganismo transformable en el que se pueda conseguir la expresión. En el contexto de la presente invención, por ejemplo, las cepas huésped pueden ser Bacillus subtilis, Bacillus deramificans (u otros Bacillus sp.) Escherichia coli, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae o Aspergillus niger. Las células huésped se transforman o transfectan con vectores construidos mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. Tales células huésped pueden ser capaces tanto de duplicar vectores que codifican la pululanasa y sus derivados o variantes (mutantes) como de expresar el producto péptido deseado o ambos.

[0043] El término "cultivo" o "condiciones de cultivo", cuando se emplea en el contexto de cultivar una población

35 de organismos huésped, hace referencia a un recipiente de cultivo, medio de cultivo y condiciones de cultivo que son adecuadas para el crecimiento del organismo huésped y, en el caso de organismos huésped transfectados con las secuencias de nucleótidos de la presente invención y sus variantes, para la producción de las pululanasas de la presente invención. La presente invención no está limitada a ningún cultivo ni condición de cultivo específicos siempre que lo mencionado anteriormente se cumpla.

[0044] De acuerdo con el presente documento, "sujeto de forma funcional" o "unido de forma operativa" indica que una región reguladora, tal como un promotor, terminador, señal de secreción o región potenciadora se fija o une a un gen estructural y controla la expresión de ese gen.

45 [0045] De acuerdo con el presente documento, una sustancia (p. ej., un polinucleótido o proteína) "derivado de" un microorganismo indica que la sustancia es natural del microorganismo.

[0046] "Trichoderma" o "Trichoderma sp." hace referencia a cualquier cepa fúngica que ha sido clasificada previamente como Trichoderma o que está clasificada actualmente como Trichoderma. Preferiblemente las especies son Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride. En la presente invención, Trichoderma sp. puede utilizarse como organismo huésped en la presente invención.

[0047] La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e 55 inmunología, que se encuentran dentro de la técnica. Tales técnicas se describen en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis

(M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente estadounidense nº: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu, et al., eds.), Immuno-chemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology,

65 Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor

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Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Asimismo, información con respecto a los métodos de preparación, expresión, aislamiento y uso de proteasas puede obtenerse mediante la revisión de la patente estadounidense nº 6.768.001.

5 [0048] Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Descripción detallada

[0049] La invención se describirá ahora en detalle a modo de referencia únicamente utilizando las siguientes definiciones y ejemplos.

[0050] A menos que se defina lo contrario en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento presentan el mismo significado entendido comúnmente por un experto en la 15 técnica a la que pertenece la presente invención. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2 ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente invención. Pese a que se puede utilizar cualquier método o material similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o el estudio de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente. Se dirige a los profesionales especialmente a Sambrook et al., 1989 y Ausubel FM et al., 1993, para las definiciones y términos de la técnica. Ha de entenderse que la presente invención no está

25 limitada a metodología, protocolos y reactivos específicos descritos, ya que estos pueden variar.

[0051] Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.

[0052] A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente.

[0053] Los encabezamientos proporcionados en el presente documento no limitan los diferentes aspectos o formas de realización de la invención que pueden considerarse como referencia a la memoria en general. Por consiguiente,

35 los términos definidos justo a continuación se definen de forma más completa haciendo referencia a la memoria en general.

Biología molecular

[0054] En una forma de realización, la presente invención proporciona la expresión de genes heterólogos bajo el control del promotor de amyL. Por lo tanto, la presente invención depende de las técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante. Entre los textos básicos que exponen los métodos generales de uso en la presente invención se incluyen Sambook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular

45 Biology (1994)).

[0055] Los genes heterólogos que comprenden las secuencias promotoras del gen de celulasa de hongos filamentosos se clonan normalmente en vectores intermediarios antes de la transformación en las células Trichoderma reesei para la replicación y/o expresión. Estos vectores intermediarios son normalmente vectores procariotas, p. ej., plásmidos o vectores transportadores.

[0056] Con el fin de obtener un alto nivel de expresión de un gen clonado, el gen heterólogo se coloca preferiblemente a aproximadamente la misma distancia del promotor que a la que se encuentra en el gen de celulasa que se da de forma natural. Sin embargo, tal y como se conoce en la técnica, puede realizarse cierta

55 variación en la distancia sin perder la función promotora. [0057] Los expertos en la técnica son conscientes de que un promotor natural puede modificarse mediante el reemplazo, sustitución, adición o eliminación de uno o más nucleótidos sin cambiar su función. La práctica de la invención incluye tales alteraciones al promotor y no está limitada por estas.

[0058] La construcción/vector de expresión contiene normalmente una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales necesarios para la expresión de la secuencia heteróloga. Por tanto, un casete de expresión típico contiene un promotor unido de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico heterólogo y a las señales necesarias para la poliadenilación eficaz del tránscrito, los sitios de unión ribosómicos y la finalización de la traducción. Los elementos adicionales del casete pueden incluir potenciadores 65 y, si el ADN genómico se utiliza como el gen estructural, intrones con sitios aceptores y donantes de empalme

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emplear una amplia variedad de combinaciones de vectores de expresión/huésped a la hora de expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas están disponibles comercialmente. La selección de vectores de expresión adecuados dependerá del conocimiento de los expertos en la técnica. El vector puede ser un plásmido, una partícula fágica o simplemente una inserción genómica

5 potencial. Una vez transformada en un huésped adecuado, el vector puede duplicarse y funcionar de forma independiente al genoma huésped o, puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En la presente memoria, el plásmido y el vector se utilizan a veces indistintamente ya que el plásmido es la forma más usada comúnmente actualmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión que cumplen funciones equivalentes y que son conocidas en la técnica o se harán conocidas en la técnica. Entre los vectores de expresión útiles se incluyen, por ejemplo, segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, tal como los diferentes fagos y plásmidos conocidos útiles para este fin. Además, normalmente se utiliza cualquiera de entre una amplia variedad de secuencias control de expresión en estos vectores.

15 [0069] Las células huésped en la presente invención son generalmente huéspedes eucariotas o procariotas, incluido cualquier microorganismo transformable en el que puede conseguirse la expresión de pululanasa de acuerdo con la presente invención. Las células huésped se transforman o transfectan con vectores construidos mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. Tales células huésped transformadas son capaces tanto de duplicar vectores que codifican la pululanasa y sus variantes (mutantes) como de expresar la pululanasa deseada. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucariotas y procariotas, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, diferentes hongos, levadura y células animales. Preferiblemente, el huésped expresa la pululanasa de la presente invención de forma extracelular con el fin de facilitar la purificación y el procesamiento posterior.

25 [0070] En algunas formas de realización, la célula huésped es un elemento del género Bacillus, mientras que en algunas formas de realización, la cepa Bacillus de interés es una cepa Bacillus industrial. Entre los ejemplos de cepas Bacillus industriales se incluyen, sin carácter limitativo, B. licheniformis, B. subtilis, B lentus, B amyloliquefaciens. En formas de realización adicionales, la cepa huésped Bacillus se elige del grupo consistente en B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. coagulans, B. cirulans, B. pumilus, B. thuringiensis,

B. clausii y B. megaterium, así como otros organismos dentro del género Bacillus, tal y como se ha detallado anteriormente. En algunas formas de realización, se utiliza B. subtilis. En otras formas de realización, se utiliza B. lichenformis. Por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 5.264.366 y 4.760.025 (RE34.606) y US2002/0182734 (publicación internacional nº WO 02/14490) describen diferentes huésped Bacillus que son útiles en la presente invención, aunque también se contempla el uso de otras cepas adecuadas en la presente invención.

35 Preferiblemente, se utiliza una cepa de Bacillus negativa proteasa (genes eliminados, p. ej., Δapr o Δnpr entre otros).

[0071] Se conocen diferentes métodos para la transformación de especies Bacillus. De hecho, los métodos para modificar el cromosoma de Bacillus que implican construcciones de plásmidos y la transformación de los plásmidos en E. coli son bastante conocidos. En la mayoría de los métodos, los plásmidos se aíslan posteriormente de E. coli y se transforman en Bacillus. Sin embargo, no es necesario utilizar dicho microorganismo intermedio tal como E. coli y, en algunas formas de realización, la construcción de ADN se transforma directamente en un huésped Bacillus competente mediante protoplastos o transformación celular competente. La expresión y purificación de la pululanasa mutante de la invención puede realizarse a través de medios reconocidos en la técnica para llevar a

45 cabo tales procesos.

[0072] Después de introducir el vector de expresión en las células, las células transfectadas se cultivan bajo condiciones que favorecen la expresión de genes bajo el control de secuencias promotoras del gen de proteasa. Lotes amplios de células transformadas pueden cultivarse como se describe en los ejemplos, infra. Finalmente, el producto se recupera del cultivo utilizando las técnicas convencionales.

[0073] Por lo tanto, la invención en el presente documento garantiza la expresión y la secreción mejorada de los polipéptidos deseados cuya expresión se realiza bajo control de secuencias promotoras de genes incluidos genes de amilasa que se dan de forma natural, secuencias de ADN de fusión, y diferentes construcciones heterólogas. 55 La invención también proporciona procesos para expresar y secretar altos niveles de tales polipéptidos deseados.

Expresión de proteína

[0074] Las proteínas de la presente invención se producen mediante el cultivo de células transformadas con un vector de expresión que contiene genes cuya expresión se realiza bajo el control de secuencias promotoras de genes de amilasa. La presente invención es especialmente útil para aumentar la producción intracelular y/o extracelular de proteínas. La proteína puede ser homóloga o heteróloga. Entre las proteínas que pueden producirse por la invención inmediata se incluyen, sin carácter limitativo, hormonas, enzimas, factores de crecimiento, citocinas, anticuerpos y similares.

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Plat5-XhoI_FW [SEQ ID NO:7] (véase anteriormente). ssLAT-PULm104_RV: gcgttgctgactgccggtttagcagctgctgaagctgcagaatgaggcagc [SEQ ID NO:9] (cebador de fusión; secuencia de pululanasa inversa que empieza en el codón 105 en negrita).

5 Ad B)

[0094] Se utilizaron los siguientes cebadores para la amplificación de la secuencia que codifica la pululanasa y el terminador de amyL:

10 ssLAT-PULm104_FW: gctgcctcattctgcagcttcagcagctgctaaaccggcagtcagcaacgc [SEQ ID NO:10] (cebador de fusión; secuencia de pululanasa que empieza en el codón 105 en negrita). Tlat-XboI-RV: [SEQ ID NO:8] (véase anteriormente).

[0095] Cada uno de los cebadores de fusión incluyen dos tramos de secuencias que están separados 312 nt en la 15 secuencia plantilla (que representa los 104 aminoácidos de N-terminal). Los dos fragmentos por PCR descritos bajo A) y B) se fusionaron en una reacción por PCR utilizando los cebadores Plat5-XhoI_FW and Tlat-XhoI_RV.

[0096] "PUL_E99Q_E103Q" La construcción de la variante de pululanasa E99Q_E103Q era idéntica a la de la construcción de pululanasa "de tipo silvestre" (véase, 1 anterior), con la construcción sintética E99Q_E103Q como 20 plantilla.

[0097] Los fragmentos generados se clonaron en dos orientaciones en el sitio XhoI del vector de integración de B. licheniformis pICatH (figura 3). Esto tuvo como resultado seis construcciones, pICatH-PUL-Ori1 (figura 4), pICatHPUL-Ori2, pICatH-PULm104-Ori1 (figura 5), pICatH-PULm104-Ori2, pICatH-PUL-E99Q_E103Q-Ori1 (figura 6) y

25 pICatH-PUL_E99Q_E103Q-Ori2.

[0098] Las construcciones Ori1 y Ori2 presentan orientaciones opuestas del gen de pululanasa en relación con el gen de resistencia a cloranfenicol (catH). Las figuras 4(a), 5(a) y 6(a) muestran mapas de plásmidos de las tres construcciones Ori1.

30 [0099] Las seis construcciones se transformaron en B. subtilis y se detectó la formación de halo en capas de AZCLpullulan (Megazyme) (0,1 % en 100 mM NaAc pH 5,1 % agar). Los transformantes pICatH-PULm104 produjeron halos mayores que los transformantes de cualquier pululanasa de longitud completa. Se verificó la secuencia de las construcciones y se transformaron en cepas huésped de B. licheniformis BML612 y BML780 utilizando la

35 transformación de protoplastos.

Ejemplo 3

Integración en el genoma B. licheniformis

40 [0100] Después de la transformación, se seleccionaron los transformantes sobre placas de regeneración mínima con 5 µg/ml cloranfenicol y 10 µg/ml neomicina. Los transformantes se duplicaron en las placas en dos placas de agar infusión corazón (conocido por los expertos en la técnica) con los mismos antibióticos, uno de ellos se cubrió con AZCL-pullulan para seleccionar los transformantes de pululanasa positivos. De forma análoga a la situación

45 en B. subtilis, los transformantes PULm104 mostraron halos mayores. Los plásmidos se integraron en el locus catH en el cromosoma de B. licheniformis. Por lo tanto, se buscó el siguiente conjunto de integrantes, tal y como se muestra en la tabla 2, para una mayor extirpación/amplificación:

TABLA 2

50

BML612 PUL Ori1 BML612 PUL Ori2 BML612 PULm104 Ori1 BML612 PULm104 Ori2 BML612 PUL_E99Q_E103Q Ori1 BML612 PUL_E99Q_E103Q Ori2 BML780 PUL Ori1 BML780 PUL Ori2 BML780 PULm104 Ori1 BML780 PULm104 Ori2 BML780 PUL_E99Q_E103Q Ori1 BML780 PUL_E99Q_E103Q Ori2

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Las cepas sin ADN extraño ("cepas exentas") se obtuvieron mediante la extirpación de las secuencias del vector ("bucles de salida"), dejando únicamente el casete de expresión de pululanasa catH integrado en el cromosoma. A continuación, se amplificó el casete de expresión sometiendo a las cepas a un aumento escalonado en concentración de cloranfenicol (5, 25, 50, 75 µg/ml). La producción de pululanasa se monitorizó mediante la

5 superposición de placas de reproducción con AZCL-pullulan tras cada etapa de amplificación. De cada cepa, se obtuvieron cuatro niveles de amplificación: CAP5, CAP25, CAP50 y CAP75.

Ejemplo 4:

Evaluación de cepas de pululanasa de B. licheniformis

[0102] Se recogieron cepas en duplicado en todos los niveles de amplificación en una única placa de agar infusión corazón amplia con 5 µg/ml cloranfenicol y se cultivó durante la noche a 37 °C. La cepa de producción de pululanasa BMP139 se incluyó como punto de referencia. La actividad de pululanasa se visualizó mediante la superposición de la placa con agar AZCL-pullulan. La superposición se incubó 8 h a 37 °C, seguido de una

15 incubación de 16 h a temperatura ambiente. El resultado se resume en la tabla 3 a continuación.

TABLA 3

25

35

45

Cepa: CAP5 CAP25 CAP50 CAP75

BML612 PUL Ori1: + + + ++

BML612 PUL Ori2: + + + ++

BML612 PULm 104 Ori1: + ++ ++ +++

BML612 PULm 104 Ori2: + + +++ +++

BML612 PUL_E99Q_E103Q Ori1: + + ++ ++

BML612 PUL_E99Q_E103Q Ori2: + + ++ ++

BML780 PUL Ori1: + + + ++

BML780 PUL Ori2: + + ++ ++

BML780 PULm 104 Ori1: ++ ++ +++ +++++

BML780 PULm104 Ori2: ++ ++ +++ +++++

BML612 PUL_E99Q_E103Q Ori1: ++ ++ ++ ++

BML612 PUL_E99Q_E103Q Ori2: + ++ ++ +++

BMP 139: ++

Leyenda: + = diámetro halo 7-9 mm ++ = diámetro halo 10-12 mm +++ = diámetro halo 13-15 mm ++++ = diámetro halo 16-18 mm +++++ = diámetro halo 19-21 mm

55 [0103] A partir de la evaluación, queda claro que la amplificación tiene como resultado un aumento en los títulos y/o rendimiento. Conclusiones más específicas:

1) Las cepas PUL truncadas en N-terminal (PULm104) presentan un beneficio de rendimiento muy pronunciado sobre las cepas de pululanasa de longitud completa. Las cepas BML780 PULm104 CAP75 producen halos con una superficie aumentada 2,5 veces (sobre un diámetro aumentado 1,5 veces) sobre aquellos de la cepa BMP139 y las cepas BML780 PUL CAP75. Esto sugiere que la molécula más corta se produce con títulos más altos o su actividad se aumenta en comparación con las moléculas de pululanasa de longitud completa.

65 2) La variante PUL_E99Q_E103Q puede presentar un ligero beneficio sobre la PUL "de tipo silvestre". Los

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halos producidos por las cepas BML780 PUL_E99Q_E103Q son algo más grandes que los de las cepas BML780 PUL.

3) La cepa de producción BMP 139 parece presentar el mismo rendimiento que las cepas PUL "de tipo silvestre" 5 amplificadas CAP75. Por lo tanto, según la evaluación de la placa, la optimización de codones no tiene como resultado un rendimiento aumentado.

4) Las cepas BML780 presentan generalmente mejor rendimiento que las cepas BML612. Esta información está en consonancia con los datos previos sobre degradación de pululanasa en el fondo de BML612. El hecho 10 de que las cepas de pululanasa BML612 construidas en este caso aún muestren una ausencia razonable de AZCL sugiere que, en las placas, la pululanasa es relativamente estable incluso en el fondo de BML612.

5) No se observaron diferencias de rendimiento claras entre las cepas de pululanasa Ori1 y Ori2.

Claims

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