EA018840B1 - Рекомбинантная клетка-хозяин для получения соединения, представляющего интерес - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину для получения представляющего интерес соединения. Настоящее изобретение также относится к изолированным грибковым промоторным последовательностям ДНК, к конструкциям ДНК, векторам и грибковым клеткам-хозяевам, содержащим эти промоторы в функциональной взаимосвязи с кодирующими последовательностями, кодирующими представляющее интерес соединение. Настоящее изобретение также относится к способу экспрессии гена, представляющего интерес, и/или продукции соединений, представляющих интерес, с использованием промотора изобретения.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину для получения представляющего интерес соединения. Настоящее изобретение также относится к изолированным грибковым промоторным последовательностям ДНК, к конструкциям ДНК, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим эти промоторы, находящиеся в функциональной взаимосвязи с кодирующими последовательностями, кодирующие представляющие интерес соединения. Настоящее изобретение также относится к способам экспрессии гена, представляющего интерес, и/или получения соединений, представляющих интерес, при использовании промотора изобретения.

Сведения о предшествующем уровне техники

Продукция рекомбинантного полипептида в клетке-хозяине обычно достигается конструированием экспрессионной кассеты, в которой ДНК, кодирующая полипептид, помещается под экспрессионный контроль промотора, подходящего для клетки-хозяина. Экспрессионная кассета может быть введена в клетку-хозяина посредством трансформации, опосредованной плазмидой или вектором. Продукция полипептида может достигаться культивированием трансформированной клетки-хозяина при стимулирующих условиях, необходимых для надлежащего функционирования промотора, содержащегося в экспрессионной кассете.

Для каждой клетки-хозяина, экспрессия кодирующей последовательности, которая вводится в хозяина посредством трансформации, и продукция рекомбинантных полипептидов, кодированных этой кодирующей последовательностью, требует наличия функциональных промоторов. Различные промоторы уже известны, как функциональные в клетках-хозяевах, например, из грибковых клеток-хозяев. Примером межвидового применения промоторов является: промотор ЛхрсщШщ шййапк (А. шййапк дрйА депе 18 кпо\\п 1о Ье £ипсйопа1 ш АкретдШик шдет (А. шдет) (1 Вю1есйпок 1991 1ап; 17 (1):19-33. 1п1гасе11и1ат апй ех1тасе11и1аг ртойисйоп о£ ргоЮиъ ш АкретдШщ иийег !йе соп!то1 о£ ехрге55юп 81дпа18 о£ 1йе ЫдЫу ехрге55ей А. шйгйащ дрйА депе. Рип! Р1, 2едет8 ΝΏ, Ви88сйег М, Роите18 РН, гап йеп Нопйе1 СА.). Другим примером является промотор бета-ксилозидазы х1пО А. шдет, использующийся в А. шдет и А. шйикнъ (Тгап8спр1юпа1 ^еди1аΐ^ои о£ 1йе хукто1уйс епхуте 5У51ет о£ АкрегдШик, уап Реу, ΝΝΜΕ, РйП-1йе818 ЬапйЬог1\\т1шуег8йей ^адеп^е^ !йе АШегктй^ Ι8ΒΝ 90-5808-154-0) и экспрессия гена бета-глюкуронидазы ЕксйепсШа сой в А. шдет, А. шйикнъ и С1айо8ротшт £и1уит, как описано в Сигг Сепе!. 1989 Маг; 15(3): 177-80: РоЬегЦ ΙΝ, Ойуег ЯР. Рип! Р1, уап йеп Нопйе1 СА. Εxр^е88^ои о£ !йе ЕксйепсШа сой Ье!ад1исигоп1йа8е депе ш шйи81па1 апй рйу!ора1йодешс Шатейош Ггтд|.

Однако существует необходимость для усовершенствования рекомбинантной экспрессии и продукции соединений, представляющих интерес. Например, известная проблема, связанная с продукцией представляющего интерес соединения в грибковой клетке-хозяине, заключается в том, что только часть мицелия вовлечена в продукцию соединения. Этот также касается других клеток-хозяев, в которых экспрессия не постоянна во всех фазах клеточного цикла. Следовательно, целью изобретения является обеспечение повышенной экспрессии и систем продукции.

Перечень фигур

Фиг. 1 описывает карту плазмиды рСВТОРСЬА, которая представляет собой интегративный экспрессионный вектор глюкоамилазы.

Фиг. 2 описывает карту плазмиды рСВТОРСЬА-2, которая представляет собой интегративный экспрессионный вектор глюкоамилазы с множественными сайтами клонирования.

Фиг. 3 описывает карту плазмиды рСВТОРСЬА-16, которая представляет собой интегративный экспрессионный вектор, содержащий промотор изобретения в функциональной взаимосвязи с кодирующей последовательностью глюкоамилазы.

Фиг. 4 описывает активность глюкоамилазы в культуральном бульоне для штаммов А. шдет, экспрессирующих конструкции д1аА, все под контролем различных промоторов. Конструкция описана в табл. 2. Активности глюкоамилазы представлены в соответствующих единицах, со средним значением для культур \УТ1 на 4 день, принятое за 100%. Два трансформанта на указанный тип являлись независимо изолированными и культивированными трансформантами.

Фиг. 5 описывает карту плазмиды рСВПЕЬ-РСЬАА, которая является замещающим вектором.

Фиг. 6 описывает схематическое представление промоторного замещения.

Фиг. 7 описывает схематическое представление интегрирования посредством гомологичной рекомбинации.

Фиг. 8 описывает пространственную активность лакказы на 6 день (верхняя панель) и на 10 день (нижняя панель) старых наслоенных колоний рекомбинантных штаммов Р. с1ппаЬатти8 С13 (А), 81 (В) и Ь12-8 (С) (см. табл. 4 для пояснения штаммов). Активность лакказы определяется как серое или черное окрашивание. Черная стрелка указывает на край колонии.

Фиг. 9 описывает активность лакказы из штамма С88 (А) и родительского штамма С14 (В). Активность лакказы определяется как серое или черное окрашивание. В С-88 наибольшую часть мицелия занимает секреция.

Сущность изобретения

Целью изобретения является обеспечение усовершенствованных экспрессионных систем, основан

- 1 018840 ных на рекомбинантных клетках-хозяевах, содержащих множество различных промоторных последовательностей. Эти промоторы могут, например, проявлять различную активность в течение разных фаз клеточного цикла или в различных частях грибковой клетки или грибкового мицелия. Они могут также быть получены путем индукции специфичного пригодного субстрата или соединения. Некоторые различные функциональные промоторы также являются подходящими, если они представляют одновременную сверхэкспрессию различных генов в одном хозяине. Для предотвращения подавления (титрование специфичных факторов транскрипции), предпочтительно использовать множество различных промоторов, например один специфичный промотор для каждого экспрессирующего гена.

Соответственно, настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей, по меньшей мере две ДНК конструкции, причем каждая ДНК конструкция содержит кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК, где по меньшей мере две ДНК конструкции содержат по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК и где кодирующие последовательности, содержащиеся в указанных ДНК конструкциях, кодируют соответствующие полипептиды. Указанная рекомбинантная клетка-хозяин будет здесь упоминаться как рекомбинантная клетка-хозяин изобретения. Рекомбинантная клетка-хозяин изобретения преимущественно применяется для рекомбинантного получения по меньшей мере одного соединения, представляющего интерес. Необязательно, указанные две ДНК конструкции содержатся в одной конструкции. Согласно аспекту изобретения, рекомбинантный хозяин содержит по меньшей мере одну ДНК конструкцию, которая вводится в клетку-хозяина с помощью рекомбинантных способов, т.е. родительский хозяин, из которого получен рекомбинантный хозяин, может уже содержать нативную ДНК конструкцию, содержащую кодирующую последовательность, которая кодирует представляющее интерес соединение.

Представляющим интерес соединением может быть, например, РНК, полипептид, метаболит, или может быть вся клетка-хозяин или ее часть (т.е. биомасса или обработанная биомасса, например экстракт биомассы).

Термин различные промоторные последовательности ДНК здесь относится к промоторным последовательностям ДНК, которые получены не из одного гена. Различные промоторные последовательности ДНК будут относиться к промоторным последовательностям изобретения. Согласно изобретению промоторная последовательность ДНК может быть нативной или чужеродной к кодирующей последовательности и промоторная последовательность ДНК может быть нативной или чужеродной к клеткехозяину.

Термин взаимосвязанные полипептиды охватывает полипептиды, вовлеченные в продукцию одного соединения, представляющего интерес. Один или более полипептиды могут являться активными соединениями, представляющими интерес; другой полипептид может, необязательно, быть регулятором, например, активатором транскрипции полипептида, представляющего интерес. Если представляющее интерес соединение является метаболитом, то взаимосвязанные полипептиды могут представлять собой ферменты, вовлеченные в продукцию метаболита.

В других случаях взаимосвязанные полипептиды могут иметь значительный процент совпадения. Согласно воплощению изобретения взаимосвязанные полипептиды имеют процент совпадения, составляющий по меньшей мере 50%. Более предпочтительно взаимосвязанные полипептиды имеют процент совпадения по меньшей мере 60%, даже более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 99%. Наиболее предпочтительно взаимосвязанные полипептиды являются идентичными полипептидами.

Для целей настоящего изобретения степень идентичности, т.е. процент совпадения между двумя полипептидами, соответственно двумя последовательностями нуклеиновых кислот, предпочтительно определяют с использованием С1и51а1^. как определено в ТЬошрюп ГО, Шддтк ΌΟ, апб Οίϋδοη Т1 (1994). С1и51а1\У: тртоутд 111с κοηκίΐίνίΐν οί ргодгс^Кс тиШр1е 5сс.|испес айдптсп! НтгоидН 5сс.|испес тешдЫтд, рокйюпк-крссШс дар рспаШск апб \хс1д111 та!пх сЬо1ес. Νιιοίάο Лабк КсксагсЬ 22:4673-4680.

Согласно предпочтительному воплощению по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК обладают различными экспрессионными характеристиками.

Согласно другому предпочтительному воплощению по меньшей мере одна из по меньшей мере двух промоторных последовательностей ДНК выбирается из группы, состоящей из:

(a) последовательности ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы: 8ЕО ГО N0:1 -4и13-55и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, (b) последовательности ДНК, способной гибридизоваться с последовательностью ДНК из (а), (c) последовательности ДНК, разделяющей по меньшей мере 80% гомологии с последовательностью ДНК из (а), (б) вариант любой последовательности ДНК из (а)-(с), и (с) субпоследовательности любой последовательности ДНК из (а)-(б), где предпочтительно по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК обладают различными экспрессионными характеристиками.

- 2 018840

Промоторные последовательности ДНК генов, приведенных в табл. 1, для цели изобретения представлены как нуклеотидные последовательности с 1500 п.о., непосредственно в обратном направлении от старт-кодона (АТС) соответствующего гена. Согласно более предпочтительному воплощению изобретения по меньшей мере одна из по меньшей мере двух различных промоторных последовательностей ДНК выбирается из промоторных последовательностей ДНК генов, приведенных в табл. 1, где предпочтительно по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК обладают различными экспрессионными характеристиками, т.е. выбираются из разных колонок (например, промоторная последовательность ДНК гена, указанного в колонке I комбинируется с промоторной последовательностью ДНК гена, указанного в колонке II табл. 1).

Предпочтительные промоторные комбинации представляют: промоторная последовательность ДНК из Ап03д06550 (например, промотор д1аА с оптимизированным сайтом инициации трансляции, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 16) комбинируется по меньшей мере с одной промоторной последовательностью ДНК из Ап12д06930 или Ап05д02100 (например, промоторы атуВ, как указано в \У0 2006/092396, с оптимизированным сайтом инициации трансляции (как подробно описано в \У0 2006/077258); 8ЕС ΙΌ N0: 17 представляет промоторную последовательность ДНК Ап12д06930 с оптимизированным сайтом инициации трансляции).

Другие предпочтительные промоторные комбинации представляют собой: по меньшей мере, одну из промоторных последовательностей ДНК набора генов Ап03д06550 (например, промотор д1аА с оптимизированным сайтом инициации трансляции, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 16), Ап12д06930 и/или Ап05д02100 (например, промоторы атуВ, как указано в \У0 2006/092396; 8ЕД ΙΌ N0: 17 представляет промоторную последовательность ДНК Ап12д06930 с оптимизированным сайтом инициации трансляции) комбинируется с по меньшей мере одной из промоторных последовательностей ДНК из Ап16д01830 (промотор дрбА, как представлено в 8ЕД ΙΌ N0: 18), промоторы, как указано в \У0 2005/100573 (например, промоторы, которые обеспечиваются в 8ЕС ΙΌ N0: 13, 14, 15, 19 или 20).

Другие предпочтительные промоторные комбинации представляют собой по меньшей мере одну из промоторных последовательностей ДНК набора генов Ап03д06550 (например, промотор д1аА с оптимизированным сайтом инициации трансляции, как представлено в 8ЕС ΙΌ N0: 16), Ап12д06930 и/или Ап05д02100 (например, промоторы атуВ, как указано в \У0 2006/092396; 8ЕД ΙΌ N0: 17 представляет промоторную последовательность ДНК Ап12д06930 с оптимизированным сайтом инициации трансляции), Ап16д01830 (промотор дрбА, как представлено в 8ЕД ΙΌ N0: 18), промоторы, которые указаны в \У0 2005/100573 (например, промоторы, обеспечивающиеся в 8ЕД ΙΌ N0: 13, 14, 15, 19 или 20), комбинируются по меньшей мере с одной из промоторных последовательностей ДНК генов, указанных в колонке ΙΙ табл. 1.

Таблица 1. Генные последовательности АкретдШик пщсг. Колонки Ι, ΙΙ и ΙΙΙ представляют дифференциально экспрессирующиеся гены, т.е. различные экспрессионные характеристики промотора гена, где различные экспрессионные характеристики являются такими, которые представлены ниже. Генные числа относятся к последовательностям, опубликованным в Ре1 е1 а1. Сепоте кес.|иепстд апб апа1ук1к оГ 111е уеткай1е се11 ГасЮгу АкретдШик шдет СВ8 513.88, №11иге Вю1ес1шо1оду 25, 221 - 231 (2007), указанные последовательности здесь приводятся посредством ссылки. Аннотированный геном АкретДНик шдет СВ8513.88 помещен в базу данных ЕМВЬ.

1	II	Ш
Ап03§06550	Ап15§01590	Ап15§07090
Αηΐ5§07700	Ап14§00420	Ап04§065Ю
Ап11§01630	Ап01§03090	Ап14§03080
Лп08§05640	Ап02 §07020	АпИ§10490
Ап02§10320	Ап04§08150	Ап08§03490
Ап01§06860	Ап16§09070	Ап18§05640
Ап04§08190	Ап07§00070	Ап01§03480
Ап04§06380	Ап04§09490	Ап08§01960
Ап15§03940	Ап18§03380	Ап09§06790
Ап04§03360	Ап15§01580	Ап07§03880
Ап04§00990	Ап08§09880	Ап14§00010
Αηΐΐ§03340	Ап03§02400	Ап08§10060
Ап04§06920	Ап03§02360	Ап01§05960

- 3 018840

Ап16§03330	Ап01811660	Ап12804870
Ап16з07110	Ап01801950	Ап04802260
Ап11801660	Ап17§00230	АпОб801550
Ап01д07140	Ап088083 70	Ап08806960
Ап16§02930	Ап18805480	Ап15801700
Ап12я00710	Ап02814590	АпО 1802900
Ап16§05930	Ап12809270	Ап16§05920
Ап16805920	Ап16801880	Ап08§07290
Ап13800320	Ап11802540	Ап07ё09990
АП12806930	Ап02в00090	Ап17800550
Ап05§02100	Ап09800840	Ап1б801830
	Ап01810930	Ап 18804840
		Ап18§04220

Термин клетка-хозяин охватывает все пригодные эукариотические и прокариотические клеткихозяева. Выбор клетки-хозяина будет в большей степени зависеть от гена, кодирующего представляющее интерес соединение и его источник. Специалист знает, как выбрать соответствующую клетку-хозяина. Согласно одному воплощению рекомбинантная клетка-хозяин изобретения используется для получения полипептида.

Согласно другому воплощению рекомбинантная клетка-хозяин изобретения используется для получения специфичных первичных или вторичных метаболитов, при этом указанные метаболиты являются представляющими интерес соединениями, такими как (бета-лактамовые) антибиотики, витамины или каротиноиды.

Термин конструкция ДНК определяется здесь как молекула нуклеиновой кислоты, либо одно- либо двухцепочечная, которая выделена из природного гена или которая модифицирована с включением сегментов нуклеиновой кислоты, комбинированных и соединенных таким образом, что не будут встречаться в природе.

Термин кодирующая последовательность определяется здесь как последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибирована в мРНК, которая транслирована в полипептид при введении под контролем соответствующих контрольных последовательностей. Пределы кодирующей последовательности обычно определяются старт-кодоном АТС, который обычно является началом открытой рамки считывания на 5'-конце мРНК, и терминаторной последовательностью для транскрипции, расположенной непосредственно в прямом направлении от открытой рамки считывания на З'-конце мРНК. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничиваясь, геномную ДНК, кДНК, полусинтетические, синтетические и рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот.

В контексте данного изобретения промоторная последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК, которая способна контролировать экспрессию кодирующей последовательности, если эта промоторная последовательность ДНК находится в функциональной взаимосвязи с этой кодирующей последовательностью. Промоторная последовательность ДНК может включать, но не ограничиваясь, геномные ДНК, полусинтетические, синтетические и рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот.

Термин промотор или промоторная последовательность, где термины используются как взаимозаменяющие, определяется здесь как последовательность ДНК, которая связывает РНК полимеразу и направляет полимеразу к соответствующему сайту начала транскрипции кодирующей последовательности для запуска транскрипции. РНК полимераза эффективно катализирует совокупность информационной РНК, комплементарной соответствующей цепи ДНК кодирующей области. Термин промотор'' или промоторная последовательность'' будет также подразумевать включение 5'-некодирующей области (между промотором и началом трансляции) для трансляции после транскрипции в мРНК, цисдействующие регуляторные элементы для транскрипции, такие как энхансеры, и другие нуклеотидные последовательности способны взаимодействовать с факторами транскрипции.

Термин в функциональной взаимосвязи определяется здесь как конфигурация, в которой промоторная последовательность ДНК соответствующим образом расположена в положении относительно кодирующей последовательности, так что промоторная последовательность ДНК направляет продукцию полипептида, кодируемого кодирующей последовательностью.

Термин различные экспрессионные характеристики здесь определяется как различие в уровне экспрессии между, по меньшей мере, двумя промоторами при проведении анализа в аналогичных условиях, при этом различие появляется по меньшей мере в одном случае. Примеры таких случаев перечислены ниже, однако приведены в целях иллюстрирования и не истолковываются как исчерпывающий список.

Различные экспрессионные характеристики включают различия в экспрессии, которые являются результатом клеточной дифференциации. Клеточная дифференциация относится к понятию из биологии развития, описывающей процесс, при котором клетки приобретают тип. Генетический материал клетки или организма остается таким же, с некоторыми исключениями, но, например, морфология может изме

- 4 018840 няться значительно в течение дифференциации. Дифференциация может включать изменения в различных аспектах клеточной физиологии; размер, форма, полярность, метаболическая активность, отвечаемость на сигналы или профили генной экспрессии могут все изменяться во время дифференцировки. Фактически, грибы могут быть дифференцированы между различными частями гифа (например, верхушка гифа против субапикальной части гифа) или между различными частями мицелия (например, между центром и периферией вегетативного мицелия, или между вегетативным мицелием и репродуктивной структурой, такой как плодовое тело или конидиофор).

Дифференциация может происходить, например, в результате возраста, условия роста, композиции питательных веществ, стресса (условия окружающей среды), температуры, облучения, давления, морфологии, света, скорости роста, типа ферментации (непрерывная, периодическая, в условиях непрерывного роста, погруженная, поверхностная или твердофазная). Примером дифференциации, опосредованной композицией питательных веществ, является индукция фактора транскрипции Х1пК в АкрегдШик питательным веществом - ксилозой. Фактор транскрипции ΧΙηΚ индуцирует транскрипцию различных генов, кодирующих внеклеточные ферменты, при этом транскрипция других генов не происходит (бе Упек апб У1ккег, М1сгоЬ. Μοί. ΒίοΙ. Веу. 65: 497-522).

Дифференциация, которая может включать изменения в различных аспектах клеточной физиологии, может происходить при транскрипции, трансляции, экспрессии протеина или уровне активности фермента. Дифференциация может начинаться при активности ДНК, РНК, мРНК, протеина или фермента или уровнях метаболитов. Дифференциация и, следовательно, различные экспрессионные характеристики могут быть определены с помощью измерения и сравнения активности ДНК, РНК, мРНК, протеина или фермента или уровней метаболитов между (возможно) дифференцированными клетками. Определяемые различия (метаболические, по белку или РНК) могут быть связаны с вовлеченными генами. Эти гены являются кандидатными генами, которые обладают различными экспрессионными характеристиками. Профиль экспрессии и возможные различные характеристики экспрессии могут изучаться посредством измерения уровней мРНК генов между (возможно) дифференцированными клетками при исследовании. Дифференциально экспрессирующиеся гены содержат промотор с различными экспрессионными характеристиками. Дифференциально экспрессирующиеся гены отличаются предпочтительно по меньшей мере 2-кратно по уровню экспрессии, более предпочтительно по меньшей мере 3-кратно, еще более предпочтительно по меньшей мере 5-кратно, еще более предпочтительно по меньшей мере 10-кратно, еще более предпочтительно по меньшей мере 20-кратно, еще более предпочтительно по меньшей мере 50-кратно и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100-кратно. Предпочтительно один промотор приводит к недетектируемой экспрессии по сравнению с другим промотором, приводящим к высокому уровню экспрессии при исследовании при аналогичных условиях.

Для применения промоторных последовательностей ДНК, обладающих различными экспрессионными характеристиками, различные экспрессионные характеристики могут относиться к промышленным условиям и процессам. Эти условия дифференциации относятся, но не ограничиваются, к пространственным, временным, средовым или питательным различиям между клетками, происходящими в процессе промышленного роста и получения биомассы и продукта.

Различные экспрессионные характеристики могут проявляться в течение различных фаз клеточного цикла или в различных частях клетки.

Рекомбинантные клетки-хозяева

Согласно изобретению рекомбинантной клеткой-хозяином изобретения может являться любая подходящая эукариотическая и прокариотическая клетка-хозяин.

Согласно воплощению рекомбинантной клеткой-хозяином является прокариотическая клетка. Прокариотической клеткой-хозяином может быть любая прокариотическая клетка-хозяин, пригодная для применения в способах изобретения. Предпочтительно, прокариотическая клетка-хозяин является бактериальной клеткой. Термин бактериальная клетка включает как грамотрицательные, так и грамположительные микроорганизмы. Пригодные бактерии могут выбираться из, например, ЕкскепсЫа, АпаЬаепа, Саи1оЬас1ег. С1исопоЬас1ег, К1юбоЬас1ег Ркеиботопак, Рагасоссик, ВасШик, ВгеуФайегшт, СогупеЬас1епит, ВЫхоЬшт (ЗтогЫ/оЬшт), Е1ауоЬас1егшт, К1еЬк1е11а, Еп1егоЬас1ег, ЬайоЬасШик, Ьайососсик, Ме1Ь.у1оЬас1епит, РгорюшЬайегшт, 81арку1ососсик или 81гер1отусек. Предпочтительно, бактериальная клетка выбирается из группы, состоящей из В. киЫШк, В. ату1ойдиеГас1епк, В. НсНеп1Гогт1к, В. рипйк, В. теда1егшт, В. Ба1обигапк, В. ритПик, С. охубапк, СайоЬайей сгексейик СВ 15, Ме111у1оЬас1епит ехЮгциепк, В1юбоЬас1ег крБаего1бек, Ркеиботопак /еахайЫшГааепк, Рагасоссик беййгГюапк, Е. со11, С. д1и1атюит, 81арку1ососсик сагпокик, 81гер1отусек 1Мбап8, 8тог1пхоЬшт те1юй и ВЫхоЬшт габюЬайег.

Согласно воплощению рекомбинантные клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. Эукариотическая клетка-хозяин может быть любой эукариотической клеткой-хозяином, пригодной для применения в способах настоящего изобретения. Предпочтительно, эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, насекомого, растения, грибка или водорослей. Предпочтительные клетки млекопитающего включают, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки СО8, клетки 293, клетки РегС6 и гибридомы. Предпочтительные клетки насекомого включают, например, клетки 8Г9 и 8Г21 и их производные. Более предпочтительно рекомбинантной клеткой-хозяином является грибковая

- 5 018840 клетка-хозяин. Грибковая клетка-хозяин может быть любой грибковой клеткой, пригодной для применения в способах настоящего изобретения. Грибок, в используемом здесь значении, включает тип Аксошусо1а. Вак1бюшусо!а, Сйу1пбютусо1а и 2удошусо!а (как определено в На\\'кк\\-оПй е! а1., Ιη, Ашк^ойй аиб В1кЬу'к Бкбопагу о! Тйе Грибки, 8!й ебШоп, 1995, САВ 1п1егпа1юпа1, Ишуегкйу Ргекк, СашЬпбде, НК), а также Оотусо!а (как указано в На\\'кк\\-оПй е! а1., там же) и все митоспоровые грибки (На\\'кк\\-оПй е! а1., там же).

Согласно предпочтительному воплощению грибковая клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. Термин дрожжи, в используемом здесь значении, включает аскоспорогенные дрожжи (Еибошусе!а1ек), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к грибкам 1трегГесб (В1ак!ошусе!ек). Поскольку классификация дрожжей может изменяться со временем, в рамках данного изобретения, дрожжи должны быть определены как описывается в Вю1оду аиб Асйуйу оГ Уеак! (8кшпет Т. А., Раккшоге 8. М. апб Бауепрой В. В., ебк, 8ос. Арр. Вас!етю1. 8ушрокшш 8епек Ыо. 9, 1980).

Согласно более предпочтительному воплощению дрожжевая клетка-хозяин является клеткой Сапб1ба, Напкепи1а, К1иууегошусек, РюЫа, 8ассйагошусек, 8сй17окассйагошусек или УатгоМа.

Согласно еще более предпочтительному воплощению, дрожжевая клетка-хозяин является клеткой 8ассйагошусек сайкЬегдепйк, 8ассйагошусек сетеу^ае, 8ассйагошусек б1ак!айсик, 8ассйагошусек боид1акп, 8ассйагошусек Ниууей, 8ассйагошусек погйепйк или 8ассйагошусек оуйоттщ. Согласно другому еще более предпочтительному воплощению, дрожжевая клетка-хозяин является клеткой К1иууетошусек 1асйк. Согласно еще другому наиболее предпочтительному воплощению дрожжевая клетка-хозяин является клеткой УатгоМа йро1уйса.

Согласно другому предпочтительному воплощению грибковой клеткой-хозяином является мицелиальная грибковая клетка. Мицелиальные грибки включают все мицелиальные формы подгруппы Еишусо!а и Оотусо!а (как определено в На\\'кк\\-ог1й е! а1., 1995, см. выше). Мицелиальные грибки характеризуются мицелиальной стенкой, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других комплексных полисахаридов. Вегетативный рост происходит посредством гифального удлинения, и углеродный катаболизм, является, главным образом, облигатно аэробным. В отличие от этого, вегетативный рост у дрожжей, таких как 8ассйагошусек сетеуЩае, происходит за счет почкования одноклеточного таллома, и углеродный катаболизм может быть ферментативным.

Согласно более предпочтительному воплощению мицелиальная грибковая клетка-хозяин является клеткой следующих типов, но не ограничиваясь, Астешошиш, Адгапсик, АкретдШик, АитеоЬайбшш, Сйгукокрогиш, Сорйпик, Сгур!ососсик, ТШЬайбшш, Иашшийпа, Тикайиш, Ниш1со1а, Мадпароййе, Мисог, Мусе1юрйШога, ЫеосаШшакйх, Ыеигокрога, Раесйошусек, РешсШшш, Рйапегосйае!е, Риошусек, Р1еиго!ик, 8сй17орйу11ит, 8йШаке, Та1агошусек, Тйегшоаксик, Тй1е1ау1а, То1урос1абшш, Тташе!ек или штамма Тпсйобегта.

Согласно еще более предпочтительному воплощению мицелиальная грибковая клетка-хозяин является клеткой АкретдШик анашой, АкретдШик аси1еа!ик, АкретдШик Гоейбик, АкретдШик _)арошсик, А. шби1ап8, АкртдШик шдет, АкретдШик ко_)ае, АкретдШик ШЫдешк, АкретдШик уабепк1к или АкретдШик оту/ае. Согласно другому еще более предпочтительному воплощению мицелиальная грибковая клетка-хозяин представляет собой клетку Тиканию Ьас(г1б1о1бек, Тиканию сетеайк, Тиканию стооктеПепке, Тиканию си1шотиш, Тиканию дгашзпеатиш, Тикайиш дташшиш, Тикайиш йе!егокрогиш, Тикайиш педнпбк Тикайиш охукрогиш, Тиканит тейси1а!ип, Тиканит гокеит, Тиканит кашЬисшиш, Тиканит кагсосйгоит, Тиканит крого!йсйю1бек, Тиканит ки1рйигеиш, Тиканит !оги1окиш, Тиканит 1г1сПо(Пес1о1бек или Тиканит уепепаШт. Согласно другому еще более предпочтительному воплощению мицелиальная грибковая клеткахозяин является клеткой Адтайсик Ыкртотик, Сйтукокройиш 1искηо\νеηке. Ниш1со1а шко1епк, Нишюо1а 1апидшока, Мисог ш1ейе1, Мусе1юрйШота Шетшорййа, Ыеигокрога сгакка, РешсШшш ригригодепиш, РешсПЙиш сйгукодепиш, Руспорогик сшпаЬайпик, Тй1е1ау1а !етгек1йк, Тйсйобетша йагаапиш, Тнсйобегта кошпдл, Тйсйобетша 1опд1Ьгасй1а!иш, Тйсйобетша гееке1 или Тйсйобетша ушбе.

Некоторые штаммы мицелиальных грибков являются общедоступными из многих коллекций культур, таких как Атенса! Туре СиЙите Сойесйоп (АТСС), БеШксйе 8ашш1ипд уоп М1кгоогдашктеп ипб 2е11кийигеп СшЬН (Б8М), Сеп1гаа1Ьигеаи Уоот 8сй1шше1сийигек (СВ8), Вапсще бе Векоигсек Топдкщек бе МаткеШе, Тгапсе, и Адпсийига1 Векеагсй 8ету1се Ра1еп1 СиЙите Сойесйоп, Ыоййетп Ведюпа1 Векеагсй Сеп!ег (ЫВВЬ), АкретдШик шдет СВ8 513.88, АкретдШик оп/ае АТСС 20423, 1ТО 4177, АТСС 1011, АТСС 9576, АТСС14488-14491, АТСС 11601, АТСС12892, Р. сйгукодепиш СВ8 455.95, РешсШшш сйппиш АТСС 38065, РешсШшш сйгукодепиш Р2, Астешопшш сйгукодепиш АТСС 36225 или АТСС 48272, Тйсйобетша гееке1 АТСС 26921 или АТСС 56765 или АТСС 26921, АкретдШик ко)ае АТСС11906, Сйгукокрогшт й.1скпо\\'епке АТСС44006, Руспорогик сшпайанпик ВВТМ44 и их производные.

Необязательно, мицелиальная грибковая клетка-хозяин имеет повышенный отклик неструктурированных белков (ИРВ) по сравнению с клеткой дикого типа для усиления способности продуцировать соединение, представляющее интерес. ИРВ может усиливаться способами, описанными в И8 2004/0186070 А1 и/или И8 2001/0034045 А1 и/или АО 01/72783А2. Более специфично, уровень белка НАС1 и/или 1ВЕ1 и/или РТС2 регулируется с целью получения клетки-хозяина, имеющей повышенный ИРВ.

- 6 018840

Альтернативно или в сочетании с повышенным ИРК, мицелиальная грибковая клетка-хозяин может содержать специфичную одностороннюю мутацию канала транслокации кес6 1 между ЕК и цитоплазмой, как описано в ν0 2005/123763. Такая мутация придает фенотип, где вновь синтезированные полипептиды могут входить в ЕК через 5ееб>1. однако ретроградный транспорт через кес61 нарушается при такой односторонней мутации.

Альтернативно или в сочетании с повышенным ИРК и/или односторонней мутацией канала транслокации §ес61, мицелиальная грибковая клетка-хозяин является генетически модифицированной с получением фенотипа, проявляющего пониженную экспрессию протеаз и/или секрецию протеаз по сравнению с клеткой дикого типа, для усиления способности продуцировать соединение, представляющее интерес. Такой фенотип может быть получен посредством делеции и/или модификации и/или инактивации регулятора транскрипции экспрессии протеаз. Таким регулятором транскрипции является, например, ρτίΤ. Снижение экспрессии протеаз посредством модуляции ρτίΤ предпочтительно осуществляют с помощью способов, описанных в И8 2004/0191864 А1, νθ 2006/04312 и νθ 2007/062936.

Альтернативно или в сочетании с повышенным ИРК и/или односторонней мутацией канала транслокации §ес61, фенотипом, проявляющим более низкую экспрессию протеаз и/или секрецию протеаз, мицелиальная грибковая клетка-хозяин проявляет лишенный оксалатов фенотип с повышенным выходом представляющего интерес соединения. Лишенный оксалатов фенотип предпочтительно получают с помощью способа, описанного в νθ 2004/070022, который приведен здесь посредством ссылки.

Альтернативно или в сочетании с повышенным ИРК и/или односторонней мутацией канала транслокации §ес61, фенотипом, проявляющим более низкую экспрессию протеаз и/или секрецию протеаз и/или дефицит оксолатов, мицелиальная грибковая клетка-хозяин проявляет совокупность фенотипических различий по сравнению с клеткой дикого типа с повышенным выходом представляющего интерес соединения. Эти различия могут включать, но не ограничивать, пониженную экспрессию глюкоамилазы и/или нейтральной альфа-амилазы А и/или нейтральной альфа-амилазы В, протеазы и гидролазы щавелевой кислоты. Указанные фенотипические различия, проявляемые мицелиальной грибковой клеткойхозяином, могут быть получены посредством генетической модификации в соответствие со способами, описанными в И8 2004/0191864 А1.

Промоторные последовательности ДНК

Активность промотора предпочтительно определяют с использованием измерения концентрации протеина(ов), кодируемого кодирующей последовательностью(ями), которая находится(ятся) в функциональной взаимосвязи с промотором. Альтернативно активность промотора определяют посредством измерения ферментативной активности протеина(ов), кодируемого кодирующей последовательностью(ями), которая находится(ятся) в функциональной взаимосвязи с промотором. Наиболее предпочтительно, активность промотора (и его концентрацию) определяют посредством измерения экспрессии кодирующей последовательности репортерного гена 1ас2 (Ьио (Сепе 163 (1995) 127-131). Согласно другому предпочтительному способу активность промотора определяют с использованием зеленого флуоресцентного белка в качестве кодирующей последовательности (М1стоЬю1оду. 1999 Маг; 145 (Р! 3):729-34. 8ап!егге Неипккеп АЬ, Еуеп 8, Ми11ег С, Рип! Р1, уап беп Нопбе1 СА, №е1кеп 1. 81ибу).

Дополнительно, активность промотора может быть определена путем измерения уровней мРНК транскрипта, образованного под контролем промотора. Уровни мРНК могут, например, быть измерены с помощью нозерн-блоттинга или количественной ПЦР в реальном времени (1. 8атЬгоок, 2000, Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога1огу Мапиа1, 3б ебйюп, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ.).

Согласно аспекту изобретения промоторная последовательность ДНК изобретения представляет собой последовательность ДНК, способную гибридизироваться с последовательностью ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: 8ЕЦ ГО N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1. Согласно предпочтительному воплощению промоторная последовательность ДНК изобретения представляет собой последовательность ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: 8ЕЦ ГО N0:1-4 и 13-55 промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1. Настоящее изобретение охватывает (изолированные) промоторные последовательности ДНК, которые сохраняют активность промотора и гибридизуются при условиях очень низкой строгости, предпочтительно в условиях низкой строгости, более предпочтительно в условиях умеренной строгости, более предпочтительно при условиях умеренно-высокой строгости, еще более предпочтительно при условиях высокой строгости, и наиболее предпочтительно при условиях очень высокой строгости к зонду из нуклеиновых кислот, который соответствует:

(ί) нуклеотидам от 1 до 1500 из: последовательности, выбранной из группы 8ЕЦ ГО N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, предпочтительно нуклеотидам от 100 до 1490, более предпочтительно от 200 до 1480, еще более предпочтительно от 300 до 1470, еще более предпочтительно от 350 до 1450 и наиболее предпочтительно от 360 до 1400 (й) является субпоследовательностью (ί) или (ΐϊϊ) является комплементарной цепью (ί), (ίί) (1. 8атЬгоок е! а1., выше).

Субпоследовательность последовательности, выбранной из группы 8ЕЦ ГО N0:1-4 и 13-55 и про

- 7 018840 моторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, может состоять из по меньшей мере 100 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 300 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 400 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 500 нуклеотидов. Условия гибридизации соответствуют тем, которые определены далее в описании.

Последовательность нуклеиновой кислоты из последовательности, выбранной из группы 8ЕО Ш N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, или ее субпоследовательность может использоваться для создания нуклеиновой кислоты-зонда для определения и клонирования промоторов ДНК из штаммов различных видов или типов в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. В частности, такие зонды могут применяться для гибридизации с геномной или кДНК видов или типов, представляющих интерес, с последующим проведением процедур Саузерн-блоттинга, для определения и изолирования соответствующего гена. Такие зонды могут быть относительно короче, чем полная последовательность, но должны содержать по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25 и более предпочтительно по меньшей мере 35 нуклеотидов в длину. Дополнительно такие зонды могут использоваться для амплификации промоторов ДНК с помощью ПЦР. Более длинные зонды также могут использоваться. Могут использоваться зонды из ДНК, РНК и пептидонуклеиновых кислот (ΡΝΑ). Зонды обычно метят для определения соответствующего гена (например, 32Р, 33Р, 3Н, 358, биотином или авидином или флуоресцентным маркером). Такие зонды также охватываются настоящим изобретением.

Таким образом, библиотека геномных ДНК или кДНК, полученная из других организмов, может быть скринирована на ДНК, которая гибридизируется с зондами, описанными выше, и которая кодирует полипептид. Г еномная или другая ДНК от таких других организмов может быть выделена посредством электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, или других способов разделения. ДНК из библиотек или выделенная ДНК может быть перемещена в или иммобилизована на нитроцеллюлозе или другом пригодном носителе. Для определения клона или ДНК, которая разделяет гомологию с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО Ш N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, или их субпоследовательностей, может быть использован носитель в анализе Саутерн-блот.

Для целей настоящего изобретения, гибридизация показывает, что последовательность нуклеиновой кислоты гибридизуется с меченной нуклеиновой кислотой-зондом, соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы 8ЕО Ш N0:1-4 и 13-55, комплементарной цепи или их субпоследовательности или соответствующей промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1, комплементарной цепи или их субпоследовательности, при условиях от очень низкой до очень высокой строгости. Молекулы, с которыми нуклеиновая кислота-зонд гибридизуется при таких условиях, определяют с использованием, например, рентгеновской пленки. Другие способы гибридизации также могут быть использованы, например, способы с использованием флуоресценции для определения и стеклянных частей и/или ДНК-микрочипов в качестве подложки. Пример определения гибридизации с помощью ДНК-микрочипа представлен в РЕМ8 Уеак1 Век. 2003 Эес: 4(3): 259-69 (Пагап-Ьари)абе Ρ., Эагап РМ., КоВет Ρ., РеШ Т., Р1рег Μ.Ό., Ргопк РТ. СотратаВуе депоВрйщ о£ 111е 8ассйатотусек сегеуыае 1аЬота1оту кВашк 8288С апб СЕКРК1 13-7Ό икшд о1щопис1еоббе шютоаттаук). Дополнительно, применение ΡΝΑ-микрочипов для гибридизации описано в М.1с1ею Ас1бк Век. 2003 0с1 1; 31 (19): 119 (Втапб! 0., Ре1бпет 1., 81ерйап А., 8сйтобег М., 8с1шо1хег М., АтБпдйаик Н.Р., НоЕе1ке1 ΡΌ., 1асоЬ Α. ΡΝΑ шютоаттаук £от ВуЬпб1каБоп о£ ип1аЬе11еб ΌΝΑ катр1ек).

Предпочтительно нуклеиновая кислота-зонд представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 1-4 и 13-55 или из промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1. Более предпочтительно, нуклеиновая кислотазонд представляет собой последовательность, содержащую от 20 до 1480 нуклеотидов из последовательности, выбранной из группы 8Е0 Ш N0:1-4 и 13-55 или из промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1, более предпочтительно от 500 до 1450 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 800 до 1420 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно от 900 до 1400 нуклеотидов из последовательности, выбранной из группы 8Е0 Ш N0:1-4 и 13-55 или из промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1. Другой предпочтительный зонд является частью последовательности ДНК, расположенной в обратном направлении от сайта начала транскрипции.

Для длинных зондов из по меньшей мере 100 нуклеотидов в длину, условия от очень низкой до очень высокой строгости определяются, как прегибридизация и гибридизация при 42°С в 5 х 88ΡΕ, 0,3% 8Ό8, 200 мкг/мл фрагментированной и денатурированной ДНК из молок лососевых, и либо 25% формамид для очень низкой и низкой строгости, 35% формамид для умеренной и умеренно-высокой строгости или 50% формамид для высокой и очень высокой строгости, с последующим выполнением стандартной процедуры Саузерн-блоттинга.

Для длинных зондов из по меньшей мере 100 нуклеотидов в длину носитель в итоге трижды промывается в течение 15 мин при каждой промывке с использованием 2 х 88С, 0,2% 8Ό8 предпочтительно

- 8 018840 по меньшей мере при 42°С для очень низкой строгости, более предпочтительно по меньшей мере при 50°С для низкой строгости, более предпочтительно по меньшей мере при 55°С для умеренной строгости, более предпочтительно по меньшей мере при 60°С для умеренно-высокой строгости, еще более предпочтительно по меньшей мере при 65°С для высокой строгости и наиболее предпочтительно по меньшей мере при 70°С для очень высокой строгости.

Для коротких зондов, которые состоят из от около 15 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов в длину, условия строгости определяются, как предгибридизация, гибридизация и промывка после гибридизации при температуре от 5 до 10°С ниже рассчитанной Т.пл., используя расчет в соответствии с Βοϊΐοη апб МсСагЛу (1962, Ргосеебшдк οί Ле Ыабопа1 Асабету οί 8с1епее5 И8А 48:1390) в 0,9 М ЫаС1, 0,09 М ТЛНС1 рН 7,6, 6 ММ БЭТА, 0,5% ΝΡ-40, 1 х растворе Денхардта, 1 мМ пирофосфате натрия, 1 мМ первичном кислом фосфате натрия, 0,1 мМ АТР и 0,2 мг дрожжевой РНК на мл, с последующим выполнением стандартной процедуры Саузерн-блоттинга.

Для коротких зондов, которые состоят из от около 15 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов в длину, носитель промывается один раз в 6 х 8СС плюс 0,1 % 8Ό8 в течение 15 мин и дважды, каждый раз в течение 15 мин, используя 6 х 88С при температуре от 5 до 10°С ниже рассчитанной Т.пл.

Согласно другому воплощению последовательность, выбранная из группы 8ЕО Ш N0:1-4 и 13-55 или промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1, сначала используется для клонирования нативного гена, кодирующей последовательности указанного нативного гена или его части, которая функционально связана с последовательностью, выбранной из группы 8ЕО Ш N0:1-4 и 13-55 или промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1. Это может быть сделано, начиная либо с последовательности, выбранной из группы 8Е0 Ш N0:1-4 и 13-55, промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1, либо с их субпоследовательности, как ранее указывалось, и используя эту последовательность в качестве зонда. Зонд гибридизуется с кДНК или геномной библиотекой заданного хозяина, либо АкрегдШик шдег либо любого другого грибкового хозяина, как определено в этой заявке. Как только нативный ген или его часть клонирована, он может потом использоваться сам по себе в качестве зонда для клонирования генов, которые обладают гомологией с нативный геном, полученным из других грибков с помощью экспериментов по гибридизации, как описано выше. Предпочтительно ген имеет по меньшей мере 55% гомологию с нативным геном, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 75%, предпочтительно около 80%, более предпочтительно около 90%, еще более предпочтительно около 95% и наиболее предпочтительно около 97% гомологию с нативным геном. Последовательность, расположенная против хода транскрипции (ирйгеат) от кодирующей последовательности гена, имеющего гомологию с нативным геном, является промотором, который охватывается настоящим изобретением.

Альтернативно, последовательность нативного гена, кодирующая последовательность или ее часть, которая функционально связана с промотором изобретения, может быть определена с использованием последовательности, выбранной из группы 8Е0 Ш N0:1-4 и 13-55 или их субпоследовательности, как определено выше, или последовательности генов, перечисленных в табл. 1, или ее субпоследовательности, для поиска по геномным базам данных, используя, например, выравнивание или алгоритм ВЬА8Т, как здесь описано. Эта полученная последовательность может затем использоваться для определения ортологичных или гомологичных генов в любом другом грибковом хозяине, как определено в этой заявке. Последовательность, расположенная против хода транскрипции от кодирующей последовательности идентифицированного ортологичного или гомологичного гена, представляет собой промотор, охватываемый настоящим изобретением.

Согласно еще другому воплощению промоторная последовательность ДНК изобретения является (изолированной) последовательностью ДНК, которая имеет по меньшей мере 80% гомологии (идентичности) с последовательностью, выбранной из группы 8Е0 Ш N0:1-4 и 13-55 или промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1. Предпочтительно, последовательность ДНК имеет, по меньшей мере, предпочтительно около 85%, более предпочтительно около 90%, еще более предпочтительно около 95% и наиболее предпочтительно около 97% гомологии с последовательностью, выбранной из группы 8Е0 Ш N0:1-4 и 13-55 или с промоторной последовательностью ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1.

Для целей изобретения термины гомология и идентичность используются взаимозаменяемо.

Степень гомологии (идентичности) между двумя последовательностями нуклеиновых кислот предпочтительно определяют с помощью программы ВЬА8Т. Программное обеспечение для выполнения анализов ВЬА8Т доступно для публичного использования через Национальный центр биотехнологической информации (Ηΐρ://\ν\ν\ν.ηΛί.ηΛι.ηί1ι.8ον/). Параметры алгоритма ВБА8Т ЭД, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа ВЬА8Т использует в качестве параметров по умолчанию длину слов (ЭД) из 11, матрицу для подсчетов ВЬ08иМ62 (см., ^ηίΕοΓΓ & ^ηίΕοίΤ. Ргос. №Л Асаб. 8сЕ И8А 89: 10915 (1989)), выравнивания (В) из 50, ожидание (Е) из 10, М=5, N=-4, и сравнение по обеим цепям.

- 9 018840

Согласно еще другому воплощению изобретения промоторная последовательность ДНК является вариантом последовательности, выбранной из группы 8ЕО Ш N0:1-4 и 13-55 или промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1.

Термин вариант или вариантный промотор определяется здесь как промотор, имеющий нуклеотидную последовательность, содержащую замещение, делецию и/или вставку из одного или более нуклеотидов родительского промотора, где вариантный промотор обладает более или менее активностью промотора, по сравнению с соответствующим родительским промотором. Термин вариантный промотор будет охватывать природные варианты и ίη νίίτο образованные варианты, полученные с использованием способов, хорошо известных из уровня техники, таких как классический мутагенез, сайтнаправленный мутагенез и перетасовка ДНК. Вариантный промотор может иметь одну или более мутаций. Каждая мутация является независимым замещением, делецией и/или вставкой нуклеотида.

Согласно предпочтительному воплощению вариантный промотор представляет собой промотор, который имеет, по меньшей мере, модифицированный регуляторный сайт, который, по сравнению с промоторной последовательностью, определяется первым (например, последовательность, выбранная из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 1-4 и 13-55, или промоторная последовательность ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1). Такой регуляторный сайт может быть удален полностью или специфично мутирован, как показано выше. Регуляция такого промоторного варианта модифицируется таким образом, что, например, он больше не индуцируется глюкозой. Примеры таких промоторных вариантов и способов их получения приведены в ЕР 673 429 или в АО 94/04673.

Промоторный вариант может быть аллельным вариантом. Аллельный вариант показывает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающего аналогичный участок в хромосоме. Аллельное разнообразие возникает естественным путем посредством мутации и может приводить к полиморфизму в популяциях. Вариантный промотор может быть получен путем (а) гибридизации ДНК при условиях очень низкой, низкой, умеренной, умеренно-высокой, высокой или очень высокой строгости с (ί) последовательностью, выбранной из группы 8Е0 Ш N0:1-4 и 13-55 или промоторной последовательностью ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1, (ίί) субпоследовательностью (ί) или (ш), комплементарными цепями (ί), (ίί) и (Ь) выделения вариантного промотора из ДНК. Условия строгости и отмывки определены здесь.

Согласно еще другому воплощению, промотор представляет собой субпоследовательность последовательности, выбранной из группы 8Е0 Ш N0: 1-4 и 13-55, или промоторной последовательности ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1, причем указанная субпоследовательность все еще сохраняет промоторную активность. Субпоследовательность предпочтительно содержит по меньшей мере около 100 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере около 200 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 300 нуклеотидов.

Согласно другому предпочтительному воплощению субпоследовательность представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая охватывается последовательностью, выбранной из группы 8Е0 Ш N0:1-4 и 13-55, или промоторной последовательностью ДНК одного из генов, перечисленных в табл. 1, где один или более нуклеотидов из 5' и/или 3' конца удалены, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты все еще сохраняет промоторную активность.

Согласно другому предпочтительному воплощению, промоторная субпоследовательность является 'усеченной' промоторной последовательностью, т.е. фрагментом последовательности, которая находится против хода от начала трансляции и/или от начала транскрипции. Пример усечения промотора и функционального анализа описаны в Оепе. 1994 Аид 5; 145(2): 179-87: 1Пс сГГсс! οί ти1бр1е сор!С5 οί 111е ирйгеат гедюп оп ехргекыоп οί 111е АхрегдШнх шдег д1исоату1а8е-епсобтд депе. Уегбоек 1С, Рип! Р1, 81ои111атег АН, νаη беп Нопбе1 СА).

Промотор согласно изобретению может быть промотором, чья последовательность может обеспечиваться с линкерами для цели введения специфичных сайтов рестрикции, способствующих легированию промоторной последовательности с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид.

Если не указано другое, все нуклеотидные последовательности, определенные секвенированием молекулы ДНК, определяют с использованием автоматического секвенатора ДНК. Следовательно, как известно из уровня техники для любой последовательности ДНК, определенной с помощью такого автоматического устройства, любая нуклеотидная последовательность, определенная здесь, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные посредством автоматики, обычно по меньшей мере на около 90% идентичны, более характерно по меньшей мере на от около 95% по меньшей мере до около 99,9% идентичны полноразмерной нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Полноразмерная последовательность может быть более точно определена другими способами, включая способы неавтоматизированного секвенирования ДНК, хорошо известные из уровня техники.

Специалист в данной области техники способен идентифицировать такие ошибочно определенные основания и знает, как откорректировать такие ошибки.

Информация о последовательностях, которые здесь обеспечиваются, не должна в связи с этим узко

- 10 018840 истолковываться как требование включения ошибочно определенных оснований. Специфичные последовательности, здесь описываемые, могут без труда использоваться для выделения первоначальной последовательности ДНК, например, из мицелиальных грибов, в частности АкрсгдШик шдсг, и подвергаться дальнейшему анализу последовательностей, тем самым определяя ошибки последовательностей.

Настоящее изобретение охватывает эквиваленты функционального промотора, обычно содержащие мутации, которые не изменяют биологическую функцию промотора, которого касается. Термин функциональные эквиваленты также охватывает ортологи последовательностей ДНК А. шдсг. Ортологи последовательностей ДНК А. шдсг представляют собой последовательности ДНК, которые могут быть изолированы из других штаммов или видов и обладают схожей или идентичной биологической активностью.

Промоторные последовательности настоящего изобретения могут быть получены из микроорганизмов любых видов. Для целей настоящего изобретения термин получены из в используемом здесь значении относительно заданного источника должен означать, что полипептид получен из источника или клетки, в которую ген из источника был введен.

Согласно воплощению изобретения, промоторные последовательности получают из прокариотического источника, предпочтительно из видов ЕксЬспсЫа, АпаЬаспа, Саи1оЬас1сг1, 61исопоЬас!сг, ВЬобоЬас1сг, Рксиботопак, Рагасоссик, ВасШик, Вгет1Ьас!спит, СогупсЬас!спит, ЯЫ/оЬшт (8|погЬ|/оЬ|ит), Е1а\^гоЬас!спит, К1сЬк1с11а, Еп!сгоЬас!сг, Ьас!оЬасШик, Ьас!ососсик, МсШу1оЬас!спит, РгорюпЬас!спит, 8!арЬу1ососсик или 8!гср!отусск. Более предпочтительно, промоторные последовательности получают из В. киЫШк, В. ату1о1|цисГас1спк, В. 11сЬсп|Гогт1к, В. рипПк, В. тсда!спит, В. Ьа1обигапк, В. ритПик, 6. охубапк, Саи1оЬас!сп сгскссйик СВ 15, МсШу1оЬас!спит схЮгциспк, ВЬобоЬас!сг крЬасго1бск, Рксиботопак 7сахап!Ь1шГас1сп8, Рагасоссик бспйпйсапк, Е. сой, С д1и!ат1сит, 8!арЬу1ососсик сагпокик, 8!гср!отусск Нт1бапк, 8тог1п/оЬцип тс1юй или РЫ/оШит габюЬас!сг.

Согласно другому воплощению промоторные последовательности получают из грибкового источника, предпочтительно из дрожжевого штамма, такого как Сапб1ба, Напкспи1а, К1и^сготусск, РюЫа, 8ассЬаготусск, 8с1пхокасс11аготусск или штамма УаноМа, более предпочтительно из 8ассЬаготусск сагкЬсгдспЦк, 8ассЬаготусск ссгсх-эМас, 8ассЬаготусск б1ак!айсик, 8ассЬаготусск боид1акп, 8ассЬаготусск кЬ1утсп, 8ассЬаготусск погЬспык или штамма 8ассЬаготусск о\'|Гопшк. Согласно другому более предпочтительному воплощению промоторные последовательности получают из штамма 1<1иу\'сготусск 1асйк. Согласно другому более предпочтительному воплощению, промоторные последовательности получают из штамма УаггоМа Бро1уйса.

Согласно еще другому воплощению промоторные последовательности получают из мицелиального грибкового штамма, такого как Асгстопшт, Адгапсик, АкрсгдШик, АигсоЬаыбшт, СЬгукокрогит, Сорппик, СгурЮсоссик, ЕШЬак1бшт, Еикапит, Нитко1а, МадпаройЬс, Мисог, МуссЬорЬШога, №оса1Ьтакйх, №игокрога, РассПотусск, РсшсШшт, Рпотусск, РапсгосЬас!с, Р1сиго!ик, 8сЫ/орЬу11ит, Та1аготусск, ТЬсгтоаксик, ТШсй-пла- То1урос1абшт или штамма ТпсЬобсгта, более предпочтительно из Адгапсик Ь1крогик, АкрсгдШик аси1са!ик, АкрсгдШик а\\'атоп, АкрсгдШик Госйбик, АкрсгдШик |ароп1сик, АкрсгдШик шбикшк, АкрсгдШик шдсг, АкрсгдШик ко)ас, АкрсгдШик !иЬ1дсшк, АкрсгдШик огухас, АкрсгдШик \'абспк1к, СЬгукокрогит 1искпо^спкс, Нит1со1а тко1спк, Нит1со1а 1апидтока, Мисог т1сЬс1, МуссЬорЬШога ШсгторЬ11а, №игокрога сгакка, РсшсШшт ригригодспит, РсшсШшт сЬгукодспит, Руспорогик сшпаЬаппик, 8с1ихорЬу1Ь1т соттипс, ТЫск-иза 1сггск1пк, ТпсЬобсгта Ьаг/1апит, ТпсЬобсгта котпдн, ТпсЬобсгта 1опд1ЬгасЫа!ит, ТпсЬобсгта гсскс1 или штамма ТпсЬобсгта ттбс.

Согласно еще другому предпочтительному воплощению промоторные последовательности получают из Еикапит Ьас!пбю1бск, Еикапит ссгсаЬк, Еикапит сгоок^сЬспкс, Еикапит си1тогит, Еикапит дгатшсагит, Еикапит дгатшит, Еикапит Ьс!сгокрогит, Еикапит псдипб1, Еикапит охукрогит, Еикапит гсйси1а!ит, Еикапит гоксит, Еикапит катЬистит, Еикапит кагсосЬгоит, Еикапит крого!псЬю1бск, Еикапит ки1рЬигсит, Еикапит Юги1окит, Еикапит 1псЬоШссю1бск или штамма Еикапит νсηсηаΐит.

Необходимо понимать, что для вышеуказанных видов изобретение охватывает совершенные и несовершенные стадии и другие таксономические эквиваленты, например анаморфы, независимо от названия вида, под которым они известны. Специалист в данной области без труда определит идентичность соответствующих эквивалентов. Штаммы этих видов обычно общедоступны в некоторых коллекциях культур, таких как Шс Атспсап Турс СиЬигс СоИссПоп (АТСС), ОсШксЬс 8атт1ипд νοη М1кгоогдатктсп ипб 2с11киЬигсп 6тЬН (Э8М), Ссп!гаа1Ьигсаи Уоог 8сЬ1ттс1сиЬигск (СВ8) и АдпсиЬшШ ЙсксагсЬ 8стсс Ра!сп! СиЬигс СоПссПоп, №г1Ьсгп Всдюпа1 ЙсксагсЬ Ссп!сг (ΝΚΚΕ).

Кроме того, промоторные последовательности изобретения могут быть идентифицированы из других источников, включая микроорганизмы, выделенные из природных источников (например, почвы, компостов, воды, и др.), используя вышеуказанные зонды. Способы выделения микроорганизмов из природной среды хорошо известны из уровня техники. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть получены посредством аналогичного скрининга библиотеки геномной ДНК другого микроорганизма. Как только последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая промотор, определена с помощью зонда(ов), последовательность может быть выделена или клонирована путем использования способов, которые известны дл специалиста в данной области (см., например, 8атЬгоок с! а1., выше).

- 11 018840

В настоящем изобретении промоторная последовательность ДНК может также быть гибридным промотором, содержащим часть одного или более промоторов настоящего изобретения; часть промотора настоящего изобретения и часть другого известного промотора, например, лидирующей последовательности одного промотора и сайт начала транскрипции от другого промотора; или часть одного или более промоторов настоящего изобретения и часть одного или более других промоторов. Другой промотор может быть любой промоторной последовательностью, которая показывает транскрибирующую активность в выбранной грибковой клетке-хозяине, включая вариантный, усеченный и гибридный промотор, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные и внутриклеточные полипептиды, которые либо гомологичны, либо гетерологичны по отношению к клетке-хозяину. Другая промоторная последовательность может быть нативной или чужеродной к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, и нативной или чужеродной к клетке.

Согласно предпочтительному воплощению важные регуляторные субпоследовательности определяемого промотора могут быть слиты с другими 'основными' промоторами для увеличения их промоторной активности (как, например, описано в Μοί. МюгоЬю! 1994 Мау;12(3):479-90. Реди1а1юп οί 111е ху1апа8е-епсобшд х1пА депе οί ЛкретдШик ШЫдепкк. бе СгааГГ ЬН, уап беп Вгоеск НС, уап Οοуеη Λί, Уккет 1.).

Другие примеры других промоторов, пригодных для конструирования гибридных промоторов вместе с промоторами настоящего изобретения, включают промоторы, полученные из генов для амилазы ТАКА А. οπ'ζ;^. аспарагиновой протеиназы ΡΙιίζοιηικοΓ 1ше11ет нейтральной альфа-амилазы А. шдет, стабильной к действию кислот альфа-амилазы А. шдет, глюкоамилазы А. шдет или АкретдШик а\\анюп (д1аА), дрбА А. шдет, глюкооксидазы дοxС А. шдет, липазы ΡΙιίζοιηικοΓ 1ше11ек щелочной протеазы А. οιύζ;^ фосфатной изомеразы А. ο^уζае Ιηο^ ацетамидазы А. Ы1би1ап8 и трипсин-подобной протеазы Рикапиш οxу8рοшт (\УО 96/00787), а также промотор ЫА2-1р1 (гибрид промоторов из генов для нейтральной альфа-амилазы А. шдет и триозофосфатизомеразы А. ο^уζае, энолазы ^ассйагошусек сегемыае (ΕΝΟ-1), галактокиназы ^ассйагошусек сегемыае (САЫ), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы ^ассйагошусек сегемыае (АОМ/САР) и 3-фосфоглицераткиназы ^ассйагошусек сетеу181ае, и их мутанты, усеченные формы, и гибридные промоторы. Другие пригодные промоторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны в Ροπη-ΐΗο^Ι а1., 1992, УеаЧ 8: 423-488.

В настоящем изобретении промоторная последовательность ДНК может или не может являться тандемным промотором. Тандемный промотор определяется здесь как две или более промоторные последовательности, каждая из которых находится в функциональной взаимосвязи с кодирующей последовательностью и опосредует транскрипцию кодирующей последовательности в мРНК.

Тандемный промотор содержит два или более промотора настоящего изобретения или альтернативно один или более промоторов настоящего изобретения и один или более других известных промоторов, как, например, тех, которые приведены в качестве примеров выше, пригодных для конструирования гибридных промоторов. Две или более промоторные последовательности тандемного промотора могут одновременно обеспечивать транскрипцию последовательности нуклеиновой кислоты. Альтернативно, одна или более промоторные последовательности тандемного промотора могут обеспечивать транскрипцию последовательности нуклеиновой кислоты на различных стадиях клеточного роста или морфологически различных частях мицелия.

В настоящем изобретении промотор может быть чужеродным к кодирующей последовательности, кодирующей представляющее интерес соединение и/или к грибковой клетке-хозяину. Необходимо понимать, что вариантный, гибридный или тандемный промотор настоящего изобретения является чужеродным к кодирующей последовательности, кодирующей представляющее интерес соединение, даже если промотор дикого типа является нативным для кодирующей последовательности или для грибковой клетки-хозяина.

Вариантный, гибридный или тандемный промотор настоящего изобретения имеет по меньшей мере около 20%, предпочтительно по меньшей мере около 40%, более предпочтительно по меньшей мере около 60%, более предпочтительно по меньшей мере около 80%, более предпочтительно по меньшей мере около 90%, более предпочтительно по меньшей мере около 100%, еще более предпочтительно по меньшей мере около 200%, наиболее предпочтительно по меньшей мере около 300%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 400% промоторной активности родительского промотора, если вариантный, гибридный или тандемный промотор происходит из него.

Кодирующие последовательности

В настоящем изобретении, кодирующая последовательность в конструкции ДНК изобретении может кодировать полипептид. Полипептид может быть любым полипептидом, имеющим биологическую активность, представляющую интерес. Полипептид может быть гомологичным или гетерологичным к клетке-хозяину изобретения. Предпочтительно, полипептид представляет собой фермент.

Термин полипептид не относится здесь к специфичной длине кодируемого продукта и, следовательно, охватывает пептиды, олигопептиды и протеины.

Термин гомологичный ген или гомологичный полипептид здесь относится к гену или полипептиду, который получен из штамма, который принадлежит к аналогичному виду, включая его варианты, так как штамм фактически содержит ген или полипептид. Предпочтительно, донорный и акцепторный

- 12 018840 штаммы являются одинаковыми. Фрагменты и мутанты генов или полипептидов также считаются гомологичными, если ген или полипептид, из которого мутанты или фрагменты получены, являются гомологичным геном или полипептидом. Также ненативные комбинации регуляторных последовательностей и кодирующих последовательностей считаются гомологичными, так как кодирующая последовательность является гомологичной. Из этого следует, что термин гетерологичный относится к генам или полипептидам, для которых донорные и акцепторные штаммы не принадлежат к аналогичным видам или их вариантам.

Термин гетерологичный полипептид определяется здесь как полипептид, который не является нативным к грибковой клетке, нативный полипептид, который был модифицирован для изменения нативной последовательности, или нативный полипептид, чья экспрессия количественно изменяется в результате манипуляций над грибковой клеткой с использованием способов рекомбинирования ДНК. Например, нативный полипептид может быть рекомбинантно получен, например, посредством помещения кодирующей последовательности под контроль промотора настоящего изобретения с повышением экспрессии полипептида, с ускорением экспорта представляющего интерес нативного полипептида за пределы клетки посредством сигнальной последовательности и с увеличением количества копий гена, кодирующего полипептид, обычно получаемый клеткой.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения полипептид представляет собой пептидный гормон или его вариант, фермент или внутриклеточный протеин.

Внутриклеточный полипептид может быть протеином, вовлеченным в процесс секреции, протеином, вовлеченным в процесс укладки, пептидным переносчиком аминокислот, фактором гликозилирования, рецептором или его частью, антителом или его частью или репортерным протеином. Предпочтительно внутриклеточный белок является шапероном или фактором транскрипции. Пример такого описан в Арр1 МюгоЬю1 Вю1ес11по1. 1998 Ос1; 50(4):447-54 (Апа1у515 о£ 111е го1е о£ депе ЫрА, епсобтд (Не ииуог еибор1а5Ш1с гейси1ит скарегопе рго1ет ίη Не зесгейоп о£ 1ото1одои5 апб Не1его1одои5 ргсИетз ίη Ь1аск АзрегдПН. Рип! Р1, уап Сетегеп 1А, Игт1-КиууепЬоуеп 1, Неззтд 1С, уап МиуЫук- Наг1еуе1б СМ, ВеуегзЬегдеп А., Уетрз СТ, уап беп Нопбе1 СА). Это может быть использовано, например, для повышения эффективности клетки-хозяина как продуцента белка, если известно, что эта кодирующая последовательность, такая как шаперон или фактор транскрипции, является лимитирующим фактором в продукции белка. Другим предпочтительным внутриклеточным полипептидом является внутриклеточный фермент, такой как амадориаза, каталаза, ацил-СоА оксидаза, линолеатизомераза, транс-2-эноил-АСР-редуктаза, трихотецин-З-О-ацетилтрансфераза, алкогольдегидрогеназа, карнитин-рацемаза, И-манделат дегидрогеназа, эноил-СоА-гидратаза, фруктозиламин: кислород-оксидоредуктаза, 2-гидроксигепта-2,4-диен-1,7диоатизомераза, ИАИР-зависимая малатдегидрогеназа, оксидоредуктаза, хинонредуктаза. Другими внутриклеточными ферментами являются церамидазы, эпоксидгидролазы, аминопептидазы, ацилазы, альдолаза, гидролаза, аминопептидазы.

Согласно другому предпочтительному аспекту изобретения полипептид секретируется внеклеточно. Предпочтительно внеклеточный полипептид представляет собой фермент. Примерами внеклеточных ферментов являются целлюлазы, такие как эндоглюканазы, β-глюканазы, целлобиогидролаза или βглюкозидазы; гемицеллюлазы или пектиназы, такие как ксиланазы, ксилозидазы, мананназы, галактаназы, галактозидазы, пектин-метил эстеразы, пектинлиазы, пектатлиазы, эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, рамногалактуроназы, арабаназы, арабинофуранозидазы, арабиноксилангидролазы, галактуроназы, лиазы; амилолитические ферменты; фосфатазы, такие как фитазы, эстеразы, такие как липазы, протеолитический фермент, такой как протеаза, пептидазы, оксидоредуктазы, такие как оксидазы, трансферазы или изомеразы; пероксидазы, такие как лигниназы.

Кодирующая последовательность, содержащаяся в конструкции ДНК изобретения, может также кодировать фермент, вовлеченный в синтез первичного или вторичного метаболита, такого как органические кислоты, каротиноиды, (бета-лактамовые) антибиотики и витамины. Такой метаболит может рассматриваться как биологическое соединение настоящего изобретения.

Кодирующая последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид, может быть получена из любого прокариотического, эукариотического или иного источника. Предпочтительно, кодирующая последовательность и промотор, связанный с ней, являются гомологичными к клетке-хозяину, приводя к получению рекомбинантной клетки-хозяина, представляющей собой собственный клон.

Согласно воплощению изобретения кодирующая последовательность в конструкция ДНК согласно изобретению может являться вариантом, оптимизированным последовательностью, содержащей оптимизированную терминаторную последовательность, такую как, например, описано в \УО 2006/077258.

Кодирующая последовательность может быть частично синтезированной последовательностью нуклеиновой кислоты или полностью синтезированной последовательностью нуклеиновой кислоты. Кодирующая последовательность может оптимизироваться для применения ее кодона, предпочтительно в соответствии со способами, описанными в \УО 2006/077258 и/или \УО 2008/000632, которые представлены здесь посредством ссылки. \УО 2008/000632 относится к оптимизации кодоновой пары. Оптимизация кодоновой пары представляет собой способ, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, модифицированы относительно использования их кодонов, в частности кодоновых пар, ко

- 13 018840 торые используются, с получением повышенной экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, и/или повышением получения кодируемого полипептида. Кодоновые пары определяются здесь как набор двух последовательных триплетов (кодонов) в кодирующей последовательности.

Альтернативно, кодирующая последовательность может кодировать для экспрессии конструкции с антисмысловой РНК и/или РНКи (РНКинтерференция). Пример экспрессии антисмысловой РНК показан в Арр1 Епуйоп М1сгоЬю1. 2000 ЕеЬ;66(2):775-82. (Сйа^ас!е^^ζа!^ои о£ а £о1йа§е, рто!еш й18и1ййе йотегаке А., ш !йе рго!еш кесгеЮгу ра1йгау о£ АкрегдШик шдет. Пд1ат С., .кепек Ό.Τ, Рип! Р.Т, Уап Эеп Нопйе1 С.А., Агсйег Э.В.) или (Ζ^епие^ Я., ХУШтйхег Ь., 8оппета1й и. Лиа1у8^8 о£ !йе ехргеккюп о£ ро!а!о илйшей1рйо8рйа!е-д1исо8е ругорйо8рйогу1а§е апй ίΐ8 ш1пЬйюп Ьу апПкепке КПА. Р1ап!а. (1993);190(2):247-52.). Частичная, почти полная или полная инактивация экспрессии гена пригодна, например, для инактивации генов, контролирующих нежелательные побочные ветви метаболических путей, например, для увеличения продукции специфичных вторичных метаболитов, таких как (бета-лактамовые) антибиотики или каротиноиды. Полная инактивация также пригодна для снижения продукции токсических или нежелательных соединений (хризогенин в Решсййит; афлатоксин в АкретдШик: МасЭопа1й Κ.Ό. е! а1.: йе!егокагуоп 81ий1ек апй !йе депейс сойго1 о£ реи^с^11^и апй сйтукодепш ргойисйоп ш Решсййит сйгукодешт. 1 Сеп М1сгоЬю1. (1963) 33:375-83). Полная инактивация также пригодная для изменения морфологии организма таким образом, чтобы повысить процесс ферментации и обратного процессинга.

Другое воплощение изобретения относится к активному метаболическому перепрограммированию или инженерии грибковой клетки. Введение полностью новых путей и/или модификация нежелательных путей будут обеспечивать клетку, специфично адаптированную для получения специфического соединения, такого как протеин или метаболит.

В способах настоящего изобретения, если кодирующая последовательность кодирует полипептид, то указанный полипептид может также включать слитый или гибридный полипептид, в котором другой полипептид слит с Ν-концом или С-концом полипептида или его фрагментом. Слитой полипептид продуцируется путем слияния последовательности нуклеиновой кислоты (или ее части), кодирующей один полипептид, с последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее частью), кодирующей другой полипептид. Способы получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают легирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, при этом они входят в рамку, и экспрессия слитого полипептида происходит под контролем одного и того же промотора(ов) и терминатора. Гибридный полипептид может содержать комбинацию частичных или полных полипептидных последовательностей, полученных по меньшей мере из двух разных полипептидов, в которых одна или более могут быть гетерологичными к грибковой клетке.

Контрольные последовательности

Конструкции ДНК настоящего изобретения могут содержать одну или более контрольных последовательностей, в дополнении к промоторной последовательности ДНК, которые направляют экспрессию кодирующей последовательности в пригодной клетке-хозяине при условиях, совместимых с контрольными последовательностями. Под экспрессией будет подразумеваться включение любого этапа, вовлеченного в получение полипептида, включая, но не ограничивая, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию. Одна или более контрольные последовательности могут быть нативными к кодирующей последовательности или к хозяину. Альтернативно, одна или более контрольные последовательности могут быть замещены одной или более контрольными последовательностями, чужеродными к кодирующей последовательности, для повышения экспрессии кодирующей последовательности в клетке-хозяине.

Термин контрольные последовательности относится здесь к включению всех компонентов, которые необходимы или полезны для экспрессии кодирующей последовательности, включая промотор изобретения. Каждая контрольная последовательность может быть нативной или чужеродной к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Такие контрольные последовательности включают, но не ограничиваются, лидерную последовательность, оптимальную последовательность Козака или последовательность, инициирующую трансляцию (Кохак, 1991, 1. Вю1. Сйет. 266:19867-19870), например, как описано в \УО 2006/077258, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, сигнальную пептидную последовательность, расположенную против хода транскрипции последовательность, промотор изобретения, включая варианты, фрагменты и гибридные и тандемные промоторы, полученные из них, и терминаторы транскрипции. По меньшей мере, контрольные последовательности включают стоп-сигналы транскрипции и трансляции и промотор изобретения (часть). Контрольные последовательности могут обеспечиваться с линкерами для введения специфичных сайтов рестрикции, способствующих легированию контрольных последовательностей с кодирующей областью кодирующей последовательности.

Контрольная последовательность может являться подходящей терминаторной последовательностью транскрипции, т.е. последовательностью, распознаваемой клеткой-хозяином для завершения транскрипции. Терминаторная последовательность находится в функциональной взаимосвязи с 3'-концом кодирующей последовательности. Любой терминатор, который функционален в выбранной клетке-хозяине, может использоваться в нестоящем изобретении.

- 14 018840

Предпочтительные терминаторы для мицелиальной грибковой клетки-хозяина получены из генов для ТАКА амилазы А. огухас. глюкоамилазы А. П1дсг. антранилатсинтазы А. Ыби1апк, альфа-глюкозидазы А. шдет, гена 1грС и трипсин-подобной протеазы Еикагшт охукрогит.

Предпочтительные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев получены из генов для энолазы 8ассйаготусек сегеуЮае, цитохрома С 8ассйатотусек сегеуыае (СУС1) и глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы 8ассйатотусек сетеуЮае. Другие пригодные терминаторы для дрожжевых клетокхозяев описаны в Котапок е1 а1., 1992, выше.

Контрольная последовательность может также быть пригодной лидерной последовательностью. т.е. 5'-нетранслируемой областью мРНК, которая является значимой для трансляции клеткой-хозяином. Лидерная последовательность функционально взаимосвязана с 5'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Любая лидерная последовательность, которая функциональна в выбранной клетке-хозяине, может использоваться в настоящем изобретении.

Предпочтительные лидеры для мицелиальных грибковых клеток-хозяев получены из генов для ТАКА амилазы А. огухае, фосфатизомеразы А. п1би1аик 1г1оке и д1аА А. шдег.

Пригодные лидеры для дрожжевых клеток-хозяев получены из генов для энолазы 8ассйагошусек сегегыае (ΕΝΟ1), 3-фосфоглицераткиназы 8ассйагошусек сегеуЮае, альфа-фактора 8ассйагошусек сегеУ151ае и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 8ассйагошусек сегеуыае (АЭН2/ОАР).

Контрольная последовательность может также являться последовательностью полиаденилирования, последовательностью, функционально взаимосвязанной с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, и которая, когда транскрибируется, распознается клеткой-хозяином как сигнал для добавления полиаденозиновых остатков к транскрибированной мРНК. Любая последовательность полиаденилирования, которая функциональна в выбранной клетке-хозяине, может использоваться в настоящем изобретении.

Предпочтительные последовательности полиаденилирования для мицелиальных грибковых клетокхозяев получены из генов для ТАКА амилазы А. огухае, глюкоамилазы А. шдет, антранилатсинтазы А. п1би1ап8, трипсин-подобной протеазы Еикапит охукрогит, и альфа-глюкозидазы А. пщег.

Подходящие последовательности полиаденилирования для дрожжевых клеток-хозяев описаны в био апб 8йегтап, 1995, Мо1еси1аг Се11и1аг Вю1оду 15: 5983-5990.

Контрольная последовательность может также быть кодирующей сигнальный пептид областью, которая кодирует аминокислотную последовательность, прикрепленную к аминоконцу полипептида, и направляет кодируемый полипептид в клеточный секреторный путь. 5'-конец кодирующей последовательности из последовательности нуклеиновой кислоты может естественным образом содержать кодирующую сигнальный пептид область, прикрепленную естественным путем к рамке считывания трансляции вместе с сегментом кодирующей области, которая кодирует секретируемый полипептид. Альтернативно, 5'-конец кодирующей последовательности может содержать кодирующую сигнальный пептид область, которая чужеродна для кодирующей последовательности. Чужеродная кодирующая сигнальный пептид область может быть необходимой, если кодирующая последовательность обычно не содержит сигнальную область, кодирующую пептид. Альтернативно, чужеродная кодирующая сигнальный пептид область может просто замещать природную сигнальную область, кодирующую пептид, для повышения секреции полипептида. При этом любая сигнальная область, кодирующая пептид, которая направляет экспрессированный полипептид в секреторный путь выбранной клетки-хозяина, может использоваться в настоящем изобретении.

Примерами пригодных сигнальных областей, кодирующих пептид, для мицелиальных грибковых клеток-хозяев являются сигнальные области, кодирующие пептид, полученные из генов для ТАКА амилазы А огу/ае, нейтральной амилазы А. ищет, фитазы А. йсиит, глюкоамилазы А. ищет, эндоксиланазы А. шдет, аспартановой протеиназы КЫхотисот 1ше11ек целлюлазы Ншшсо1а шко1еик и липазы Нитюо1а 1апидтока.

Пригодные сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев получены из генов для альфафактора 8ассйатотусек сегеуыае и инвертазы 8ассйатотусек сегеуыае. Другие пригодные сигнальные области, кодирующие пептид, описаны в Котапок е1 а1., 1992, выше.

Контрольная последовательность может также быть областью, кодирующей пропептид, для аминокислотной последовательности расположенной на аминоконце полипептида. Итоговый полипептид известен как профермент или прополипептид (или, в некоторых случаях, зимоген). Прополипептид является обычно инактивированным и может быть преобразован в зрелый активный полипептид посредством каталитического или аутокаталитического отщепления пропептида от прополипептида. Область, кодирующая пропептид, может быть получена из генов для щелочной протеазы ВасШик киЬ1Шк (аргЕ), нейтральной протеазы ВасШик киЫШк (пргТ), альфа-фактора 8ассйатотусек сетеу^ае, аспартатной протеиназы КЫхотисот пнейет лакказы Мусе1юрЫйога ШетторЫ1а (УО 95/33836) и эндоксиланазы А. Ыдет (эндол).

Если сигнальная пептидная и пропептидная области присутствуют на аминоконце полипептида, то пропептидная область располагается рядом с аминоконцом полипептида, а сигнальная пептидная область

- 15 018840 располагается рядом с аминоконцом пропептидной области.

Также может являться необходимым добавление регуляторных последовательностей, которые запускают генную амплификацию. Примеры регуляторных последовательностей в эукариотических системах включают гены дигидрофолатредуктазы, которые амплифицируются в присутствии метотрексата, и гены металлотионеина, которые амплифицируются в присутствии тяжелых металлов.

Важным может быть удаление сайтов связывания сгеА (углеродная катаболитная репрессия, как описано ранее в ЕР 673429), изменение расС и агеА (для регуляции рН и азотом).

Экспрессионные векторы

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессионным векторам, содержащим конструкцию ДНК (содержащую кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК изобретения). Необязательно, по меньшей мере, две конструкции ДНК настоящего изобретения (содержащие кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК) содержатся в одной конструкции ДНК, при этом одна конструкция ДНК содержится в рекомбинантном экспрессионном векторе.

Предпочтительно по меньшей мере одна конструкция ДНК настоящего изобретения (содержащая кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК) присутствует в векторе. Вектор вводится в клетку-хозяина так, что он поддерживается как хромосомный интегрант и/или как самореплицирующийся внехромосомный вектор.

Рекомбинантный экспрессионный вектор может быть любым вектором (например, плазмидой или вирусом), который может условно подвергаться процедурам рекомбинации ДНК и может вызывать экспрессию кодирующей последовательности. Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую вектор вводится. Векторы могут быть линейными или закрытыми кольцевыми плазмидами. Специалист знает, используя общие знания уровня техники, как выбрать пригодный и подходящий вектор.

Вектор может являться автономно реплицирующимся вектором, т.е. вектором, который существует как внехромосомный объект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например плазмида, внехромосомный элемент, минихромосома или искусственная хромосома. Для автономной репликации вектор может содержать точку начала репликации, способствующей автономному реплицированию вектора в исследуемую клетку-хозяина. Примеры репликаторов для применения в дрожжевой клетке-хозяине 2 μ ориджин репликации, АВ81, АВ84, комбинацию из АВ81 и СЕЖ и комбинацию из АВ84 и СЕЖ. Ориджин репликации могут содержать мутацию, которая делает ее функционирование в клетке-хозяине чувствительным к температуре (см., например, ЕЕтЕсЬ, 1978, Ртосеебтдк оГ 111е Жбопа1 Асабету оГ 8с1епсек И8А 75:1433). Примером автономно поддерживаемого вектора клонирования в мицелиальных грибах является клонирующий вектор, содержащий последовательность АМА1. АМА1 является фрагментом размером 6,0 т.п.о. геномной ДНК, выделенным из А. шбЫапк. который способен автономно поддерживаться в АкретдШик (см., например, АИккепко апб С1н11егЬнск (1997), Еипда1 СепеГ Вю1. 21: 373-397).

Альтернативно, вектор может таким, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он интегрирован. Пример такой интегративной системы описан в ЕР 0357127В1. Кроме того, могут использоваться один вектор или плазмида или два или более векторов или плазмид, которые вместе содержат тотальную ДНК для введения в геном клетки-хозяина, или транспозон.

Векторы настоящего изобретения предпочтительно содержат один или более селектируемых маркеров, которые обеспечивают простой отбор трансформированных клеток. Хозяин может быть котрансформирован по меньшей мере двумя векторами, причем один содержит селектируемый маркер. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает резистентность к биоцидам или вирусам, резистентность к тяжелым металлам, прототрофию для ауксотрофов и тому подобные. Пригодными маркерами для дрожжевых клеток-хозяев являются АЭЕЗ, ΗΙ83, ЬЕи2, ЬУ82, МЕТ3, ТКР1 и иКА3. Селектируемые маркеры для использования в мицелиальной грибковой клетке-хозяине включают, но не ограничиваются, атб8 (ацетамидаза), атдВ (орнитин-карбамоилтрансфераза), Ьат (фосфинотрицинацетилтрансфераза), НудВ (гигромицинфосфотрансфераза), шаО (нитратредуктаза), ругС (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза), кС (сульфатаденилтрансфераза), 1грС (антранилатсинтаза), а также их эквиваленты. Маркер, придающий устойчивость против, например, флеомицина, гигромицина В или С418, также может использоваться. Предпочтительными для использования в клетке АкретдШик являются гены атб8 и ругС А. шби1аик или А. огухае и ген Ьаг 81герЮтусек йудгоксорюик. Маркерный ген атб8 предпочтительно используется с использованием методики, описанной в ЕР 635574 или \У0 97/0626, которая обеспечивает развитие рекомбинантных клеток хозяев, не содержащих селектируемый маркер, которые могут быть повторно трансформированы, используя этот же селектируемый маркерный ген. Предпочтительным селектируемым маркерным геном является кодирующая последовательность атб8 А.и1би1апк, слитая с промотором дрбА А.шбЫапк (ЕР 635574). Атб8 гены из других мицелиальных грибов также могут использоваться (\У0 97/06261).

Для интегрирования в геном клетки-хозяина вектор может основываться на промоторной последо

- 16 018840 вательности и/или кодирующей последовательности, кодирующей полипептид или другой элемент вектора, для стабильной интеграции вектора в геном посредством гомологичной или негомологичной рекомбинации. Альтернативно, вектор может содержать дополнительные последовательности нуклеиновых кислот для направленной интеграции посредством гомологичной рекомбинации в геном клеткихозяина. Дополнительные последовательности нуклеиновых кислот обеспечивают вектор, который вводится в геном клетки-хозяина в определенном положении(иях) в хромосоме(ах). Для повышения вероятности интеграции в определенное положение, элементы интеграции должны предпочтительно содержать достаточное число остатков нуклеиновой кислоты, предпочтительно по меньшей мере 30 п.о., предпочтительно по меньшей мере 50 п.о., предпочтительно по меньшей мере 0,1 т.н., еще предпочтительно по меньшей мере 0,2 т.н., более предпочтительно по меньшей мере 0,5 т.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 1 т.н., наиболее предпочтительно по меньшей мере 2 т.н., которые имеют высокий процент идентичности с соответствующей последовательностью-мишенью для повышения вероятности гомологичной рекомбинации. Предпочтительно, эффективность нацеленной интеграции в геном клеткихозяина, т.е. интеграции в предопределенный локус-мишень, повышается путем увеличенных способностей к гомологичной рекомбинации клетки-хозяина. Такой фенотип клетки предпочтительно включает дефектный ген ки70, как описано в ν0 2005/095624. ν0 2005/095624 раскрывает предпочтительный способ получения мицелиальной грибковой клетки, обладающей повышенной эффективностью к нацеленному интегрированию. Элементы интеграции могут являться любой последовательностью, которая гомологична последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, элементы интеграции могут быть некодирующими или кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот. Для обеспечения нацеленной интеграции вектор клонирования предпочтительно линеаризуют перед трансформацией клетки-хозяина. Линеаризация предпочтительно осуществляется так, что по меньшей мере один, но предпочтительно каждый, конец вектора клонирования фланкируется последовательностями, гомологичными к мишеневому локусу.

Предпочтительно интеграционные элементы в векторе клонирования, которые гомологичны локусу-мишени, происходят из высокоэкспрессирующего локуса, означая, что они происходят из гена, который способен экспрессироваться на высоком уровне в грибковой клетке-хозяине. Ген, способный экспрессироваться на высоком уровне, т.е. высоко экспрессирующийся ген, здесь определяется как ген, чья мРНК может составлять по меньшей мере 0,5% (вес./вес.) от общей клеточной мРНК, например, при индуцирующих условиях или альтернативно, ген, чей продукт может содержать по меньшей мере 1% (вес./вес.) от общего клеточного протеина, или, в случае секретированного генного продукта, может секретироваться до уровня по меньшей мере 0,1 г/л (как описано в ЕР 357127 В1). Ряд предпочтительных высоко экспрессирующихся грибковых генов представлен посредством примера: гены амилазы, глюкоамилазы, алкогольдегидрогеназы, ксиланазы, глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы или целлобиогидразы из Акретд1Ш или Тпсйобегша. Наиболее предпочтительным высоко экспрессирующимся геном для этих целей является ген глюкоамилазы, предпочтительно ген глюкоамилазы А. шдет, ген ТАКА-амилазы А. огухае, ген дрбА А. шби1апк, локус последовательности, выбранной из группы 8ЕЦ ΙΌ N0:1-4 и 13-55 или локус гена, перечисленного в табл. 1, локус последовательности А. шдет, выбранной из группы 8ЕЦ ΙΌ N0:13-55 или локус гена А. шдет, перечисленного в табл. 1, или ген целлобиогидразы Тпсйобегша теекек

Альтернативно, вектор может быть интегрирован в геном клетки-хозяина посредством негомологичной рекомбинации.

Более чем одна копия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, может быть введена в клетку-хозяина для повышения продукции генного продукта. Это может предпочтительно осуществляться путем интеграции в геном копий последовательности ДНК, более предпочтительно путем нацеливания интеграции последовательности ДНК в высокоэкспрессирующий локус, например, в локус глюкоамилазы или в локус последовательности, выбранной из группы 8ЕЦ ΙΌ N0:1-4 и 13-55 или в локус гена, перечисленного в табл. 1. Альтернативно, это может осуществляться путем взаимосвязи амплифицируемого селектируемого маркерного гена с последовательностью нуклеиновой кислоты, где клетки, содержащие амплифицируемые копии селектируемого маркерного гена, и, следовательно, дополнительные копии последовательности нуклеиновой кислоты, могут выбираться путем культивирования клеток в присутствии соответствующего селектируемого агента. Для увеличения числа копий последовательности ДНК, которая еще более экспрессируется, может быть использована техника конверсии генов, как описано в ν0 98/46772.

Процедура, используемая в легировании элементов, описанная выше, для конструирования рекомбинантных экспрессионных векторов настоящего изобретения, хорошо известна специалисту в данной области (см., например, 8атЬгоок е! а1., выше).

Трансформация

Введение экспрессионного вектора или конструкции нуклеиновой кислоты в клетку осуществляется с использованием общеизвестных способов. Они могут включать процесс, состоящий из образования протопласта, трансформации протопласта и регенерации клеточной стенки способом, известным рег ке. Пригодные процедуры трансформации клетки АкретдШик описаны в ЕР 238023 и Υе1ΐоη е! а1., 1984, Рго

- 17 018840 сеебтдз οί Ле Nаΐ^οηа1 Асабету οί Заепсез ИЗА 81: 1470-1474. Пригодные процедуры для трансформации АзрегдШнз и других мицелиальных грибковая клеток-хозяев с использованием АдгоЬайегшт ЛтеГаае^, описаны, например, в №11 ВЮескгюк 1998 Зер; 16(9): 839-42. ЕггаЛт ίη: №1 Β^οΐесйηο1 1998 16(11): 1074. АдгоЬайегшт ΐитеίас^еηз-теб^аΐеб ΐ^аη8ίο^таί^οη οί ПкнпепЮиз Лпдк бе ΟγοοΙ Мк Βиηбοск Р., Ηοοукааз Рк Вег)егзЬегдеп А.С. ипПетг Кезеагск ^аЬο^аΐο^у У1аагб1пдеп, Тке №Лег1апбз. Пригодный способ трансформации видов Ризалит описаны в Ма1агб1ег е1 а1., 1989, Сене 78: 147156 или в ЭД0 96/00787. Могут применяться и другие способы, такие как способ с использованием биолистической трансформации, как описано в: Вюкзкс Ιγηι·!^™^^ οί Ле οΜί^ίη р1ай ракюдешс Γηπ§η3, Егуз1рке дгаткпз Гзр. 1югбег С’кпзкапзеп ЗК, Кпибзеп З, С1езе Н. Сигг Сенек 1995 Эес; 29(1):100-2. Дрожжи могут быть трансформированы с использованием процедур, описанных в Вескег апб Сиагейе, 1п АЬе1зοη. к N. апб 3ίιηοη, М. I., еб1Юг5, Сшбе ίο УеаЧ Сепексз апб Мο1еси1а^ Вюкду, Ме^бз ίη Еπζутο1οду, ^Лте 194, рр 182-187, Асабетк Ргезз, 1пс., №\ν ΥοΛ Ι1ο е1 а1., 1983, китй οί Вайегккду 153: 163; апб Ηίηпеп е1 а1., 1978, Ргосеебтдз οί Ле №-Нюпа1 Асабету οί Зскпсез ИЗА 75: 1920.

Изобретение дополнительно относится к способу получения рекомбинантной клетки-хозяина изобретения, причем указанный способ включает:

(a) обеспечение по меньшей мере двух конструкций ДНК, причем каждая конструкция ДНК содержит кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК, где по меньшей мере две конструкции ДНК содержат по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК и где кодирующие последовательности, содержащиеся в указанных конструкциях ДНК, кодируют полипептиды, (b) обеспечение пригодной клетки-хозяина и (c) трансформацию указанной клетки-хозяина вместе с указанной конструкцией ДНК.

Необязательно указанные две конструкции ДНК содержатся в одной конструкции. Необязательно по меньшей мере одна конструкция ДНК присутствует в векторе.

Согласно предпочтительному воплощению стадия трансформации осуществляется посредством по меньшей мере двух отдельных этапов трансформации. Этап трансформации определяется здесь как процедура трансформации путем введения конструкции ДНК в родительскую клетку-хозяина и отделение трансформированного потомства от родительской клетки.

Экспрессия

Изобретение дополнительно относится к способу экспрессии кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине. Способ включает следующие стадии:

(a) обеспечение по меньшей мере двух конструкций ДНК, причем каждая конструкция ДНК содержит кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК, где по меньшей мере две конструкции ДНК содержат по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК, и где кодирующие последовательности, содержащиеся в указанных конструкциях ДНК, кодируют взаимосвязанные полипептиды, (b) обеспечение подходящей клетки-хозяина, (c) трансформация указанной клетки-хозяина с указанными конструкциями ДНК, (б) культивирование указанной клетки-хозяина при условиях, способствующих экспрессии кодирующей последовательности.

Необязательно, указанные две конструкции ДНК содержатся в одной конструкции. Необязательно, по меньшей мере одна конструкция ДНК представлена в векторе. Согласно предпочтительному воплощению стадия трансформации осуществляется посредством по меньшей мере двух отдельных событий трансформации.

Изобретение дополнительно относится к способу экспрессии кодирующей последовательности с помощью культивирования рекомбинантной клетки-хозяина изобретения при условиях, способствующих экспрессии кодирующей последовательности.

Получение

Изобретение дополнительно относится к способу получения полипептида, включающему:

(a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина изобретения при условиях, способствующих экспрессии полипептида, (b) необязательно выделение полипептида из культурального бульона и (c) необязательно очистка полипептида.

Изобретение также относится к способу получения метаболита, включающему:

(a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина изобретения при условиях, способствующих получению метаболита, (b) необязательно выделение метаболита из культурального бульона и (c) необязательно очистка метаболита.

В способах получения настоящего изобретения клетки культивируют в питательной среде, подходящей для получения полипептида или метаболита с использованием способов, известных из уровня техники. Примеры способов культивирования, которые приводятся не для ограничений изобретения, относятся к ферментации, поверхностной ферментации на твердой среде и поверхностной ферментации

- 18 018840 на жидком субстрате. Например, клетка может быть культивирована посредством культивации во встряхиваемой колбе, мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (включая непрерывную, периодическую, периодическую с подпиткой субстратом или твердофазную ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах, проводимой в подходящей среде и при условиях, при которых экспрессируется кодирующая последовательность и/или выделяется полипептид. Культивирование совершается в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, используя процедуры, известные из уровня техники. Подходящая среда доступна от коммерческих поставщиков или может быть получена в соответствии с опубликованными композициями (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Если полипептид или метаболит секретируется в питательную среду, то полипептид или метаболит может выделяться непосредственно из среды. Если полипептид или метаболит не секретируется, то он может быть выделен из клеточных лизатов.

Полипептиды могут быть определены с использованием способов, известных из уровня техники, которые являются специфичными для полипептидов. Эти способы определения могут включать применение специфичных антител, образование продукта фермента или элиминация ферментного субстрата.

Получаемый полипептид или метаболит может быть выделен с помощью способов, известных из уровня техники. Например, полипептид или метаболит может быть выделен из питательной среды с помощью традиционных процедур, включая, но не ограничивая, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, сушку распылением, испарение и преципитацию.

Полипептиды могут быть очищены с помощью различных способов, известных из уровня техники, включая, но не ограничивая, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирование и гель-хроматографию), электрофоретические способы (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальную растворимость (например, фракционирование сульфатом аммония), 8Э8- РАСЕ или экстракцию (см., например, Рго1ет РигШсайоп, I. -С. 1апкоп апб Ьагк Вубеп, ебйогк, УСН РиЬПкНегк, Ыете Уогк, 1989).

Модуляция экспрессии

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, содержащих промоторную последовательность ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, для изменения экспрессии кодирующей последовательности, кодирующей представляющее интерес соединение, которое является эндогенным для грибковой клетки-хозяина. Конструкции могут содержать минимальное количество компонентов, необходимых для изменения экспрессии эндогенного гена.

Согласно предпочтительному воплощению конструкции нуклеиновых кислот содержат (а) последовательность-мишень, (Ь) промоторную последовательность ДНК, содержащую а нуклеотидные последовательности, нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, (с) экзон и (б) донорный сайт сплайсинга. При введении конструкции нуклеиновой кислоты в клетку конструкция интегрируется посредством гомологичной рекомбинации в геном клетки в сайт эндогенного гена. Последовательность-мишень направляет интеграцию элементов (а)-(б) в эндогенный ген, так что элементы (Ь)-(б) находятся в функциональной взаимосвязи с эндогенным геном.

Согласно другому воплощению конструкции нуклеиновых кислот содержат (а) последовательность-мишень, (Ь) промоторную последовательность ДНК, содержащую а нуклеотидные последовательности нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, (с) экзон, (б) донорный сайт сплайсинга, (е) интрон и (Г) акцепторный сайт сплайсинга, где последовательность-мишень направляет интеграцию элементов (а)-(Г), так что элементы (Ь)-(Г) находятся в функциональной взаимосвязи с эндогенным геном. Однако конструкции могут содержать дополнительные компоненты, такие как селектируемый маркер. Селектируемые маркеры, которые могут использоваться, являются теми, которые описаны здесь ранее.

В обоих воплощениях введение этих компонентов приводит к получению новой единицы транскрипции, в которой экспрессия эндогенного гена изменена. По существу, новая единица транскрипции представляет собой слитой продукт из последовательностей, введенных нацеливающими конструкциями и эндогенным геном. Согласно воплощению, в котором эндогенный ген является измененным, ген активирован. Согласно этому воплощению гомологичная рекомбинация используется для замены, разрыва или блокировки регуляторной области, обычно связанной с эндогенным геном родительской клетки посредством вставки регуляторной последовательности, которая вызывает экспрессию гена на более высоких уровнях, чем для соответствующей родительской клетки.

Последовательность-мишень может быть в эндогенном гене, непосредственно примыкать к гену, в гене в обратном направлении или в обратном направлении от и на расстоянии от эндогенного гена. Могут использоваться одна или более последовательностей-мишеней. Например, кольцевая плазмида или фрагмент ДНК предпочтительно используют одну последовательность-мишень, тогда как линейная плазмида или фрагмент ДНК предпочтительно используют две последовательности-мишени.

- 19 018840

Конструкции дополнительно содержат один или более экзонов эндогенного гена. Экзон определяется как последовательность ДНК, которая копируется в РНК и присутствует в зрелой молекуле мРНК, так что экзонная последовательность находится внутри рамки считывания вместе с кодирующей областью эндогенного гена. Экзоны могут, необязательно, содержать ДНК, которая кодирует одну или более аминокислоты и/или частично кодирует аминокислоту. Альтернативно, экзон содержит ДНК, которая относится к 5'-некодирующей области. Там, где экзогенный экзон или экзоны кодируют одну или более аминокислоты и/или часть аминокислоты, конструкция нуклеиновой кислоты создается таким образом, что при транскрипции и сплайсинге, рамка считывания представляет собой рамку с кодирующей областью эндогенного гена, так что соответствующая рамка считывания части мРНК, полученной из второго экзона, является неизменяемой. Донорный сайт сплайсинга конструкций направляет сплайсинг одного экзона к другому экзону. Обычно, первый экзон располагается в 5'-направлении от второго экзона, и донорный сайт сплайсинга, перекрывающий и фланкирующий первый экзон на его 3'-стороне, узнает акцепторный сайт сплайсинга, фланкирующий второй экзон на 5'-стороне второго экзона. Акцепторный сайт сплайсинга, подобно донорному сайту сплайсинга, представляет собой последовательность, которая направляет сплайсинг одного экзона к другому экзону. Действуя вместе с донорным сайтом сплайсинга, аппарат сплайсинга использует акцепторный сайт сплайсинга для осуществления удаления интрона.

Предпочтительная стратегия по изменению экспрессии заданной последовательности ДНК содержит делецию заданной последовательности ДНК и/или замещение эндогенной промоторной последовательности заданной последовательности ДНК посредством модифицированной промоторной последовательности ДНК, как, например, промотора изобретения. Делеция и замещение предпочтительно осуществляются с помощью способа замещения гена, описанного в ЕР 0357127. Специфичную делецию гена и/или промоторной последовательности предпочтительно выполняют с использованием гена атб8 в качестве селектируемого маркерного гена, как описано в ЕР 635574. Посредством отбора на среде с фторацетамидом, как описано в ЕР 635574, получаемый штамм не содержит селектируемого маркера и может использоваться для дополнительных модификаций гена.

Альтернативно или в сочетании с другими упомянутыми техниками, может использоваться техника, основанная на рекомбинации космид в Е. со11 ш νίνο, как описано в: А гар1б шебюб Гог еГПс!сп1 депе гер1асетей т 1Не П1атеп1оик Гипдик А. шби1апк (2000) СНауегосНе. Μ-К., СЫсо, ί-Μ. апб б'ЕпГеН С.; N1.1с1ею ас1бк ВекеагсЬ, νο1. 28, по 22. Эта техника применима для другого мицелиального грибка, типа, например, А. шдег.

Изобретение, описываемое и заявленное здесь, не ограничивается в объеме специфичных воплощений, здесь описываемых, поскольку эти воплощения приводятся в качестве иллюстраций различных аспектов изобретения. Любые эквивалентные воплощения и/или комбинации предпочтительных аспектов изобретения входят в объем этого изобретения. Кроме того, различные модификации изобретения в дополнении к тем, которые приведены и описаны здесь, будут с очевидностью следовать для специалиста в данной области из вышеизложенного описания. Такие модификации также входят в объем приведенной формулы изобретения. В случае спора настоящее описание, включая определения, обеспечивать контроль.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Примеры

Экспериментальные данные Штаммы

АТ 1: Этот штамм А. шдег используется в качестве штамма дикого типа. Этот штамм депонирован в Институте СВ8 под номером депонирования СВ8 513.88.

АТ 2: Этот штамм А. шдег является штаммом АТ 1, содержащим делецию гена, кодирующего глюкоамилазу (д1аА). АТ 2 был сконструирован с использованием способа МАРКЕР -СЕНЕ РВЕЕ, который описан в патенте ЕР 0635574 В1. В этом патенте подробно описано, как удалить д1аАспецифичные последовательности ДНК в геноме СВ8 513.88. Процедура, приводящая к получению МАРКЕР -СЕЯЕ РВЕЕ Дд1аА рекомбинантного штамма СВ8513.88 А. шдег, в итоге совсем не содержащего чужеродной последовательности ДНК.

ВРВМ 44: Этот штамм Руспорогик сшпаЬагтик используется в примере 9 и доступен от Вапцие бе Векоигсек Еопдк|иек бе МагкеШе, Марсель, Франция, под номер депонирования ВВРМ44.

Анализ активности глюкоамилазы

Активность глюкоамилазы определяли с использованием п-нитрофенил α-Ό-глюкопиранозида (81дта), как описано в А0 98/46772.

Пример 1. Конструирование ДНК конструкции, содержащей промотор изобретения в функциональной взаимосвязи с кодирующей последовательностью.

Этот пример описывает конструирование экспрессирующей конструкции под контролем промотора, согласно изобретению. Используемая здесь кодирующая последовательность или репортерная конструкция представляет собой ген д1аА, кодирующий фермент глюкоамилазы СВ8 513.88 А. шдег. Глюкоамилаза применяется в качестве репортерного фермента, с помощью которого можно измерить актив

- 20 018840 ность промотора, согласно изобретению.

1.1. Описание интегративного экспрессионного вектора глюкоамилазы φ0ΒΤ0Ρ0ΕΑ)

Промотор глюкоамилазы и кодирующий глюкоамилазу ген β1;ιΑ из Α. шдег клонировали в экспрессионный вектор μ0ΒΤ0Ρ-8. который описан в \У0 99/32617. Клонирование осуществляли в соответствии с известными принципами и рутинными способами клонирования и получали плазмиду р^ΒΤ0Ρ^^Α (см. фиг. 1). По существу, этот экспрессионный вектор содержит промотор глюкоамилазы, кодирующую последовательность и терминаторную область, фланкированную 3' и 3 сайтами нацеливания на β1;ιΑ в векторе Е. сой.

1.2. Конструирование интегративного экспрессионного вектора глюкоамилазы вместе с множественными сайтами клонирования МС8 φ0ΒΤ0Ρ0ΕΑ-2)

С помощью ПЦР-методов, известных для специалиста в данной области (8атЬгоок е! а1., выше), с использованием 1 нг р^ΒΤ0Ρ^^Α в качестве матрицы, был получен фрагмент ПЦР, содержащий часть кодирующей последовательности β1;ιΑ, и фланкирован с сайтами рестрикции Х1о1 и Вд1/11. Этот фрагмент расщеплялся с участием Х1ю1 и Вд111 и вводился в вектор р6ΒΤ0Ρ6^Α, расщепленный Х1ю1 и Вд111, в результате чего образовывался вектор р6ΒΤ0Ρ6^Α-2 (см. фиг. 2). С помощью анализа последовательностей подтверждали последовательность введенного ПЦР-фрагмента, содержащего сайт множественного клонирования (МС8) и часть кодирующей последовательности β1;ιΑ.

1.3. Конструирование интегративного экспрессионного вектора вместе с промотором изобретения в функциональной взаимосвязи с последовательностью, кодирующей глюкоамилазу φ0ΒΤ0Ρ0ΕΑ-3)

Геномная ДНК штамма СВ8513.88 была секвенирована и проанализирована. С помощью ПЦРметодов, известных специалисту (8атЬгоок е! а1., выше) с использованием :

- 5'-ПЦР-праймера, содержащего нуклеотиды от 1 до 20 из последовательности, выбранной из группы 8ЕО Ш N0: 13-55 и промоторных ДНК последовательностей генов, перечисленных в табл. 1, фланкированных на 5'-конце с сайтом рестрикции Х1о1, и

- 3'-ПЦР-праймера, содержащего нуклеотиды от 1477 до 1497 (в некоторых случаях около 2000 нуклеотидов) из последовательности, выбранной непосредственно из указанной выше, фланкированной на 3'-конце сайтом рестрикции Αδθ1, и

- геномной ДНК штамма СВ8513.88 в качестве матрицы, соответствующие сайты рестрикции были прикреплены к промотору изобретения посредством ПЦР-амплификации. Результирующие фрагменты приблизительно по 1,5-2 т.п.о., содержащие последовательность из одной из 8Е0 Ш N0: 13-55 или одной из промоторных ДНК-последовательностей генов, перечисленных в табл. 1, были расщеплены посредством ΑκΟ и Х1о1 и введены в вектор р^ΒΤ0Ρ^^Α-2, расщепленный ΑκΟ и Х1ю1, с получением, например, вектора р^ΒΤ0Ρ^^Α-16 (для схематического расположения векторов см. фиг. 3) и других векторов, которые, например, указаны в табл. 2.

Таблица 2. Экспрессионные конструкции с рядом различных промоторов для экспрессии β1;ιΑ, кодирующего глюкоамилазу, в Α. шдег

Наименование плазмиды	Промотор	ЗЕ() ΙΠΝΟ;	Со<Ип§ зечиепсе
р6ВТ0РСЬА-1	21аА	-	С1аА
рСВТОРСЬА-16	§1аА с модифицированным сайтом инициации трансляции	16	С1аА
рСВТОРСЬА’17	ашуВ с модифицированным сайтом инициации трансляции	17	О1аА
рСВТОРСЬА-18	£Р<1А	18	61аА
рСВ'ГОРСЕА-19	Αη18β04220	19	С1аА

Последовательности введенных ПЦР-фрагментов, содержащих промоторы изобретения, были подтверждены с помощью анализа последовательностей.

Пример 2. Грибковая клетка-хозяин, трансформированная ДНК конструкцией

В следующем примере экспрессионная конструкция вводилась в грибковую клетку-хозяина посредством трансформации.

Для введения дополнительных векторов р6ΒΤ0Ρ6^Α-1 и р6ΒΤ0Ρ6^Α-16 до -19 в \УТ1 для увеличения числа копий β1;ιΑ трансформацию и отбор последующего трансформанта осуществляли, как описано в \У0 98/46772 и \У0 99/32617. Вкратце, линейную ДНК изолировали из вышеуказанных векторов р^ΒΤ0Ρ^^Α и трансформировали вместе с атб8, селектируемым геном-маркером, содержащим вектор, который обозначается как р^ΒΑΑ8-1 (сконструированный, как описывается в ЕР 635574В1). Оба типа векторов содержат два домена ДНК, гомологичных локусу β1;ιΑ из штамма-хозяина Α. шдег для направления нацеливания в 3'-3 терминаторный локус β1;ιΑ в \УТ1. Трансформанты отбирались на среде, содержащей ацетамид, и колонию очищали в соответствие со стандартными процедурами. Споры помещали на фторацетамидную среду для отбора штаммов, которые утратили маркер атб8. Выросшие колонии подвергали определению на предмет интеграции в локус β1;ιΑ и количества копий. Отбирали трансформанты р6ΒΤ0Ρ6^Α-1, -16, -17, -18 и -19 с дополнительной копией β1;ιΑ.

Альтернативно, кольцевая конструкция, которая представлена на фиг. 7, может использоваться для

- 21 018840 интегрирования в геном в кодирующую последовательность д1аА УТ1. Дополнительно, селектируемый маркерный ген и ген, представляющий интерес, контролируемый промотором изобретения, могут располагаться на одной конструкции. Пример такого вектора и способ его использования в трансформации могут быть найдены в УО 99/32617.

Пример 3. Введение дополнительного гена д1аА под контролем промотора изобретения в грибковую клетку-хозяина

Для изменения и повышения уровня экспрессии заданного гена в клетке-хозяине, дополнительные копии глюкоамилазы, функционально связанной с промотором изобретения, могут быть введены в заданную клетку-хозяина. В этом примере промотор изобретения, функционально связанный с кодирующей последовательностью д1аА, вводится следующим за эндогенно присутствующей глюкоамилазой, кодирующей ген д1аА, в грибковой клетке-хозяине. В следующем примере активность промотора изобретения измеряют посредством определения активности репортера (глюкоамилазы) в выбранных трансформантах. Таким образом, активность глюкоамилазы определяют в культуральном бульоне.

Выбранные трансформанты рбВТОРбЬА-1, 16, -17, -18, -19 из УТ 1 и оба штамма УТ 1 и УТ 2 использовали для выполнения экспериментов с применением встряхиваемой колбы в 100 мл среды, как описано в ЕР 635574 В1, при 34°С и 170 об./мин в инкубаторном шейкере с использованием 500 мл встряхиваемой колбы с отбойниками. Через 4 и 6 дней ферментации образцы отбирали для определения активности глюкоамилазы как описано выше. Активность глюкоамилазы в выбранных трансформантах рбВТОРбЬА-1, -16, -17, -18, -19 УТ1 была выше, по сравнению с УТ 1 после четырех-шести дней культивирования (фиг. 4). Неожиданно было показано, что введение второй копии гена д1аА под контролем другого промотора, а не д1аА, больше увеличивает экспрессию, чем можно было бы предположить, исходя из числа копий (более чем 200%). Также, используя модифицированный промотор д1аА или атуВ, наблюдалось большее увеличение, чем ожидалось, исходя из количества копий.

Дополнительно штаммы с многочисленными копиями конструкций рОВТОРОЬА показали, что продукция на генную копию была постоянной, по меньшей мере, до 5 копий для всех векторов (данные не показаны).

Пример 4. Конструирование конструкции рОВРЕЕ-РОЕАА для замещения промотора, содержащей промотор изобретения

Для изменения уровня экспрессии заданного гена в клетке-хозяине промотор изобретения может замещать эндогенный промотор указанного заданного гена. В этом примере, промотор изобретения замещает промотор глюкоамилазы, кодирующей ген д1аА в грибковой клетке-хозяине. Примеры 4, 5 и 6 описывают различные стадии этого процесса.

Замещающий вектор для промотора глюкоамилазы был создан в соответствии с известными принципами и сконструирован в соответствии с рутинными процедурами клонирования (см. фиг. 5). По существу, вектор для замещения промотора д1аА рОВРЕЕ-РОЬАА содержит приблизительно фланкирующие области размером 1000 п.о. из промоторной последовательности д1аА, которая замещается промотором изобретения через гомологичную рекомбинацию в заранее определенном геномном локусе. Используемые здесь фланкирующие области (см. фиг. 5) являются расположенными против хода транскрипции 5'областями промотора д1аА и частью кодирующей последовательности д1аА. В дополнении, замещающий вектор содержит двунаправленный селектируемый маркер атй§ А. шйикнъ. между прямыми повторами. Прямые повторы, использующиеся в этом примере, являются частью кодирующей последовательности д1аА. Общая конструкция таких векторов делеций ранее описывались в ЕР635574В1 и УО 98/46772.

Пример 5. Замещение промотора д1аА промотором изобретения в грибковой клетке-хозяине

Линейная ДНК расщепленного Νοΐ1 вектора рОВРЕЕ-РОЕАА с делецией была изолирована и использована для трансформации УТ 1 (СВ8513.88). Эта линейная ДНК может интегрировать в геном на локусе д1аА, тем самым замещая промоторную область д1аА вместе с конструкцией, содержащей атй§ и промотор изобретения (см. фиг. 6). Трансформанты отбирались на ацетамидной среде и колонии очищали согласно стандартным процедурам. Растущие колонии изучали с помощью ПЦР на предмет интегрирования на локусе д1аА. Делеция промотора д1аА определялась посредством амплификации бэнда, с размером, специфично для промотора изобретения, и утрата бэнда, специфично для промотора д1аА. Споры помещали на фторацетамидную среду для отбора штаммов, которые утратили маркер атй§. Кандидатные штаммы были протестированы с использованием Саузерн-блот-анализа на содержание надлежащей делеции промотора глюкоамилазы и замещение промотором изобретения. Штаммы ЙРОЬАА были отобраны как репрезентативные штаммы с промотором д1аА, замещенным промотором изобретения и имеющим восстановленную функциональную кодирующую последовательность д1аА (см. фиг. 6).

Пример 6. Получение полипептида глюкоамилазы, кодируемого кодирующей последовательностью д1аА под контролем замещенного промотора изобретения в грибковой клетке-хозяине

Выбранные штаммы ЙРОЬАА (надлежащие трансформанты рОВРЕЕ-РОЕАА УТ 1, изолированные в примере 5) и штамм УТ 1 использовали для осуществления экспериментов со встряхиваемой колбой в 100 мл среды, как описано в ЕР 635574 В1 при 34°С и 170 об./мин в инкубаторном шейкере с использованием 500 мл в встряхиваемой колбе с отбойниками. Через 4 и 6 дней ферментации образцы забирали для определения активности глюкоамилазы. Глюкоамилазная активность в выбранных транс

- 22 018840 формантах брбЬАА УТ1 была изменена по сравнению с таковой, измеренной для УТ 1 как через 4, так и через шесть дней ферментации.

Пример 7. Интеграция генов д1аА под контролем множественных промоторов изобретения в грибковой клетке-хозяине

Для изменения и повышения уровня экспрессии заданного гена в клетке-хозяине множественные дополнительные копии заданного гена, функционально связанного с различными промоторами изобретения, могут быть введены в заданную клетку-хозяина. В этом примере различные промоторы изобретения, функционально связанные с кодирующей последовательностью д1аА, вводятся в грибковую клеткухозяина УТ2. Примеры 7 и 8 описывают различные стадии этого процесса.

Для введения комбинации из векторов рбВТОРбЬА-1 и рбВТОРбЬА-16, -17 и -18 в УТ2, осуществляли котрансформацию и последующий отбор трансформанта, как описано в УО 98/46772 и УО 99/32617. В принципе, линейная ДНК двух вышеописанных векторов рбВТОРбЬА была выделена и котрансформирована вектором, содержащим селектируемый маркерный ген атб8, обозначенный как рбВАА8-1 (сконструирован, как описано в ЕР 635574В1). Оба типа векторов содержат два домена ДНК, гомологичных к локусу д1аА штамма-хозяина А. Одет с направлением нацеливания в 3'-3'' терминаторный локус д1аА в УТ 2. Трансформанты отбирались на ацетамидной среде, и колонии очищали в соответствие со стандартными процедурами. Котрансформанты идентифицировали с использованием способов ПЦР и колонии изучали на содержание копий д1аА и интеграцию двух разных конструкций рбВТОРбЬА на локусе д1аА. Выбирали трансформанты с 2 копиями д1аА и комбинацией рбВТОРбЬА1/16, рбВТОРбЬА-16/17 и рбВТОРбЬА-17/18.

Пример 8. Получение полипептида глюкоамилазы, кодируемого кодирующими последовательностями д1аА под контролем множественных промоторов изобретения в грибковой клетке-хозяине

Выбранные штаммы рбВТОРбЬА-1/16, рбВТОРбЬА-16/17 и рбВТОРбЬА-17/18, изолированные в примере 7, и штамм УТ 1 использовали для осуществления экспериментов со встряхиваемой колбой в 100 мл среды, как описано в ЕР 635574 В1 при 34°С и 170 об./мин в инкубаторном шейкере с использованием 500 мл встряхиваемой колбе с отбойниками. Через 4 и 6 дней ферментации образцы отбирали для определения активности глюкоамилазы. Глюкоамилазная активность в выбранных трансформантах рбВТОРбЬА-16/17 и рбВТОРбЬА-17/18 УТ2 была повышена по сравнению с трансформантами рбВТОРбЬА-1/16 и УТ 1, измеренная для УТ 1 как через 4, так и через 6 дней ферментации (данные не представлены). Это четко показывает, что экспрессия гена д1аА под контролем множественных и ненативных промоторов может обеспечивать повышенную экспрессию д1аА.

Пример 9. Дифференциальное получение полипептида лакказы, кодируемого геном 1сс3-1 Руспорогик стпаЬаттик, в Руспорогик шппаЬапшк

Как выше описано в подробностях, было продемонстрировано, что промотор 8С3 запускает экспрессию 1сс3-1, что приводит к высвобождению лакказы на периферии колоний Р. сшпаЬагтик. В отличие от этого промотор бРЭ и промотор лакказы запускают экспрессию, приводящую к высвобождению лакказы в центре и в средней части колоний соответственно.

Посредством трансформации штамма ВЕЕМ 44 двумя экспрессионными конструкциями лакказа высвобождалась на периферии и в середине (экспрессия 1сс3-1, контролируемая 8С3 и бРЭ), на периферии и в центре (экспрессия, контролируемая 8С3 и бРЭ) и в середине и в центре (экспрессия, контролируемая промотором лакказы и промотором бРЭ) колоний.

Соответственно, посредством использования комбинации экспрессирующих конструкций многие части мицелия могут быть вовлечены в секрецию лакказы. Этот феномен связан с повышением активности лакказы в жидких встряхиваемых культурах.

9.1. Материалы и методы

Культивирование Р. етпаЬаппих

Монокариотный штамм ВЕЕМ 44, дефицитный по лакказе, Руспорогик с^ηиаЬа^^иик (Вапцис бе Еекоигсек Еопдк|иек бе МаткеШе, Марсель, Франция) выращивали обычным образом при 30°С в жидкой или твердой (1,5% агар) солодовой среде для выращивания дрожжей (ΥΜ), содержащей, на литр, 10 г глюкозы, 5 г пептона, 3 г дрожжевого экстракта и 3 г солодового экстракта. Для получения лакказы использовали условия, которые были оптимальными для получения лакказы в диком типе Р. с^ηиаЬа^^иик (Ьотаксо1о е1 а1., 2003). Штаммы выращивали в 250 мл минимальной среды (ММ), либо содержащей, либо не содержащей стерилизованный посредством фильтрации этанол, в 1 л конических колбах Эрленмейера при 250 об./мин при 30°С. ММ содержит на литр: 20 г мальтозы, 1 г экстракта дрожжей, 2,3 г С₄Н₄О₆Ыа₂.2Н₂О, 1,84 г (ИН₄)2С₄Н₄О₆, 1,33 г КН₂РО₄, 0,1 г СаС1₂-2Н₂О, 0,5 г Мд8О₄, 0,07 г Ее8О₄-7Н₂О, 0,048 г 2п8О₄-7Н₂О, 0,036 г Мп8О₄Н₂О, 0,1 г Си8О₄ и 1 мл раствора витаминов (Та1ит е1 а1., 1950).

Трансформация Р. етпаЬаппих

Р. схппаЬатхпик трансформировали, как описано в А1уек АМ, Еесогб Е., Ьотаксо1о А., 8сЬо11теует К., АкЛег М., Уекке1к Тб., апб УоЧеп Н.А. ШдЫу еГПс1еп1 ргобисйоп о! 1ассаке Ьу Не Ьак1бютусе1е Руспорогик стпаЬагтик, Арр1 Епуноп М1стоЬю1. 2004 Ыоу; 70(11):6379-84. Все этапы в процедуре трансформации осуществляли при 30°С если не установлено иначе. 15-дневную колонию (6-8 см в диаметре)

- 23 018840 гомогенизировали в 50 мл среды ΥΜ в течение 1 мин в гомогенизаторе Уоринга. После добавления того же объема среды гомогенат выращивали в течение 24 ч при 200 об./мин. Эту культуру снова гомогенизировали, дважды разбавляли в ΥΜ и затем выращивали в течение 24 ч при 200 об./мин. Мицелий превращали в протопласты в 0,5 М Мд8О₄ или 0,5 М сахарозе при аккуратном встряхивании с использованием 1 мг мл^-1 глюканекса (8^дта-Λ1б^^сй). 1-10⁷ протопластов и 5 мкг плазмидной ДНК инкубировали в течение 15 мин во льду. Затем добавляли 1 объем полиэтиленгликоля 4000, смесь инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Протопласты регенерировали в течение ночи в 2,5 мл среды для регенерации (8рес1й е! а1., 1988, Ехр. Муто1. 12: 357-366). После добавления трех объемов среды УМ, содержащей 5 мкг мл^-1 флеомицина и 1% легкоплавкой агарозы, смесь распределяли по агарозной среде УМ, содержащей 5 мкг мл^-1 антибиотика. Трансформанты, в которые уже была введена кассета, резистентная к флеомицину, были повторно трансформированы той же выбранной кассетой путем добавления 500 мкг мл^-1 кофеина к среде, в дополнении к антибиотику.

Конструирование векторов для экспрессии лакказы

Для экспрессии гена лакказы 1сс3-1 из Р. аппаЬатшик под промоторами 8С3 и СРЭ 8. οοηιιηιικ, его кодирующую последовательность амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймеров NсοIРус и ВсПРус (табл. 3). Это привело к получению фрагмента с введенным сайтом №οΙ в стартовый кодон и сайтом рестрикции Вс11. непосредственно за стоп-кодоном. Для экспрессии гена 1сс3-1 под лакказным промотором, кодирующая последовательность амплифицировалась с использованием праймеров ΡΐΌΐηοΝίΌΓοΓ\\ΗΓά и Р^οтο^АС^еνе^ке (табл. 3), приводя к получению фрагмента с введенным сайтом №οΙ на 5'-конце и сайтом 8та1, расположенным непосредственно за стоп-кодоном. Амплифицированные кодирующие последовательности 1сс3-1 были клонированы в экспрессионный вектор рЕ8С и его производные рЕСР и рЕЬР, приводя к получению плазмид рЕ8СЬ1, рЕСРЬ1, рЕЬРЫ соответственно. Плазмида рЕ8С содержит резистентную к флеомицину кассету (8сйитеп апб ХУекке1к, 1994), в которой внутренний сайт №οΙ удален. Кроме того, она содержит регуляторные последовательности гена 8С3, между которыми могут клонироваться кодирующие последовательности, используя сайты №οΙ и ВатН1. Промотор 8С3 содержится в ΗίπΟΙΙΙ/№οΙ фрагменте размером 1,2 т.п.о., тогда как его терминатор состоит из ВатΗI/ΕсοΚI фрагмента размером 434 п.о. Плазмиды рЕСР и рЕЬР являются производными рЕ8С, в котором промотор 8С3 промотор замещен промоторными фрагментами Ηίΐ'ΐΟΙΙΙ/№οΙ СРЭ (700 п.н.) (Нагткеп е! а1. 1992) и лакказой (2,5 т.п.о.), соответственно. Лакказный промотор изолировали следующим образом. Расщепленную Вд/11 геномную ДНК Р. сшпаЬаттик превращали в кольцевую форму путем самолигирования и использовали в качестве матрицы для инвертированной ПЦР с использованием праймеров ШУ8Е и ШУА8Е (табл. 3). Итоговый фрагмент размером 3,5 т.п.о. был клонирован в ХЬТОРО Дпуйгодеп), приводя к получению плазмиды рРЬ.100. Секвенирование подтвердило, что рРЬ100 содержала промоторную область размером 2,5 т.п.о. Эта область была амплифицирована посредством ПЦР с использованием праймеров р^οтο^ΛСΤο^\\а^б и р^οтοNСΟ^еν (табл. 3), вводящих Н1пИШ и №οΙ сайты по 5'- и 3'-концам соответственно.

Таблица 3. Использующиеся праймеры для конструирования векторов для экспрессии лакказы, соответствующие последовательности праймеров и соответствующие 8ЕЭ Ш NΟ

Праймер	Последовательность	8Е<2 ГО ΝΟ:
МсоТРус	Мс1£асса18£сйа88йсса£1с	5
Ве1/1Рус	аса81аас18а«са8с1са8а88*с8С18	6
РготоИСО&пуагб	ассссс1сШс18асса188с§а8ЁЙссаЕ1с	7
РготоЬАСгсусгзе	(аасссе8ёС8<Лсаёа881с§с188В§1саа8£§с	8
ΙΝνδΕ	1с18а1са1ц1С8а88Иссац1сс	9
ΙΝ УАЗЕ	81сйсаа88асс18сёёаса§аса1с	10
Ргото1ас£опуаг<1	ассаа8сПа8а1с1сс£>аасса8ааа1:£с	11
РготоР1СОгеу	гасЕ8§аасс1С8Сса1881.са8а<Ш8а88881	12

Определение лакказной активности

Лакказную активность штаммов Р. аппаЬагшик наблюдали на твердой среде УМ, дополненной 0,2 мМ АВТ8 (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота), 8^дта-Λ1б^^сй) и 0,1 мМ Си8О₄. Лакказную активность в культуральной среде определяли количественно путем последующей реакции окисления 5 мМ АВТ8 при 420 нм (коэффициент экстинции 36 000 мМ^-1 см^-1) в присутствии 50 мМ №1К-тартрата, рН 4,0. Активность выражали как нкат мл^-1. 1 нкат определяли как количество фермента, катализирующего окисление 1 нмоль АВТ8 в секунду. Анализы выполняли при 30°С трижды. Стандартное отклонение не превышало 10% средних значений.

9.2. Продукция лакказы в Русποрο^ик аппаЬаппик

Ранее продукция лакказы в Русποрο^ик аппаЬагшик была продемонстрирована в соответствии с А1уек е! а1., выше.

Дефицитный по лакказе монокариотный штамм ВКРМ 44 (Вапцне бе Κ^κοω^κ Рοπд^^иек бе МагкеШе, МаткеШе, Ргапсе) Русποрο^οик аппаЬагшик был трансформирован нативным геном лакказы Шс3-1 (8ЕЭ ΙΌ NΟ: 4), помещенным под контроль лакказного промотора (8ЕЭ ΙΌ NΟ: 3) или промотора гена

- 24 018840 гидрофобила 8С3 (8ЕЦ ΙΌ ЫО: 2) или гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (СРИ) 8с1пхор11у11ит соттипе (8ЕЦ ΙΌ ЫО: 1). Контролируемая 8С3 экспрессия привела к лакказной активности, составляющей максимально 107 нкат мл^-1 в жидких встряхиваемых культурах. Это значение было в около 1,4 и 1,6 раз выше в случае применения СРИ и лакказных промоторов соответственно (табл. 4). 1сс3-1 мРНК и лакказная активность были значимо повышены в присутствии 25 г· л^-1 этанола, когда 1сс3-1 был экспрессирован после любого промотора (табл. 3). Продукция лакказы дополнительно повышалась в трансформантах, экспрессирующих ген 1сс3-1 под промотором лакказы или СРИ при росте в присутствии 40 г· л^-1 этанола. В этом случае максимальная активность составляла 3900 и 4660 нкат мл^-1 соответственно, соответствуя 1 и 1,2 г лакказы на литр.

Таблица 4. Активность лакказы (нкат^мл^-1) в среде из 14 дневных культур рекомбинантных штаммов Р. аппаЬаппиз ВКЕМ 44, экспрессирующих ген лакказы 1сс3-1 под лакказным промотором (Ь12-7 & Ь12-8), или промотором 8С3 (81 & 82) или СРИ (С11 апб С14) 8. соттипе. Штаммы выращивали в присутствии или отсутствии 25 г л^-1 этанола, п.б.: не определено. Эксперименты выполняли трижды. Стандартное отклонение составляло менее 10%

Штамм	Промотор	Активность -ЕЮН	Активность +ЕЮН
ВКЕМ 44	-—	η.ά.	η,ώ
31	5СЗ	107	431
32	8СЗ	49	138
Ь12-7	1ссЗ-1	175	1223
Ь12-8	1ссЗ-1	20	666
С11	ΟΡϋ	60	700
014	ОРО	145	1393

9.3. Дифференциальная продукция лакказы в Руспорогиз аппаЬаппиз

Конструкции рЕ8СЬ.1, рЕСРЬ.1, рЕЬРЬ.1, экспрессирующие ген лакказы 1сс3-1 под контролем промотора 8С3, СРИ и лакказы, соответственно, были трансформированы негативным по лакказе монокарионом ВКЕМ 44 Р. аппаЬаппиз (А1уез е! а1., 2004, выше). Трансформанты, продуцирующие лакказу, были отобраны путем добавления субстрата АВТ8 к среде, который был конвертирован в чистый продукт с помощью фермента. Пространственную и временную лакказную активность наблюдали, т.е. лакказную активность наблюдали в различные интервалы времени и анализировали локализацию лакказной активности в колонии. Два независимых трансформанта из каждой конструкции выбирали для исключения эффектов положения. Наличие РС мембраны между агарозной средой и колонией не влияло на пространственную и временную активность лакказы на среде, содержащей АВТ8. Колонии с введенным лакказным геном(ами) под контролем помотора СРИ показывали лакказную активность исключительно в центре колонии, начиная с 6 дня (фиг. 8). Через 10 дней роста активность распространялась на периферию, и деградация субстрата увеличивалась. Экспрессия, контролируемая 8С3, приводила к активности на периферии колонии с 5 дня. Через 10 дней роста активность все еще наблюдалась на периферии, и интенсивность продукта деструкции повышалась. Штаммы, трансформированные геном лакказы, регулирующиеся собственным промотором, показывали активность в середине колонии. Эта активность наблюдалась на 4 день. Через 10 дней роста зона активности распространялась вовне в степени, аналогичной распространению по периферии колонии. Из этих результатов мы заключаем, что пространственная и временная активность лакказы в среде, зависит от используемого промотора.

Рекомбинантный штамм С14 (трансформированный рЕСРЬ.1) был повторно трансформирован с рЕ8СЬ.1 с использованием флеомицина в комбинации с 500 мкг мл^-1 кофеина. Это привело к получению штаммов, секретирующих лакказы в двух зонах колонии, соответствующих зонам единичных трансформантов. Например, штамм С-88 высвобождает лакказу и в центре и на периферии колонии (фиг. 9), причем большая часть мицелия предназначена для секреции.

Лакказная активность определялась в жидких встряхиваемых культурах в присутствии 40 г· л^-1 этанола. Штамм С-88 продуцировал больше лакказы, чем родительский С14 (табл. 5).

Таблица 5. Продукция лакказы в рекомбинантных штаммах ВМКЕ 44 Р. аппаЬаппиз (негативный лакказный фон). 8 означает, что штамм трансформирован конструкцией, экспрессирующей 1сс3-1 под контролем промотора 8С3. Аналогично, С и Ь означают, что штаммы были трансформированы конструкцией, экспрессирующей ген 1сс3-1 под контролем промотора СРИ и лакказы, соответственно. Приведены штаммы, показывающие наиболее высокую активность, из 12 трансформантов, которые были отобраны на чашке. Культуры выращивали в присутствии 40 г· л^-1 этанола

Трансформант	Активность (нкат/мл)	Продукция (г/л)
81	500	0.125
Ы2-7	3600	0.9
014	4660	1.12
0-88	5310	1.3

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантная клетка-хозяин, являющаяся клеткой мицелилальных грибов, для продукции соединения, представляющего интерес, выбранного из полипептида, РНК или метаболита, содержащая по меньшей мере две конструкции ДНК, причем каждая конструкция ДНК содержит кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК, где по меньшей мере две конструкции ДНК содержат по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК и где кодирующие последовательности, содержащиеся в указанных конструкциях ДНК, кодируют взаимосвязанные полипептиды, где взаимосвязанные полипептиды выбраны из группы, состоящей из полипептидов, вовлеченных в продукцию одного соединения, представляющего интерес; или одного или нескольких полипептидов, которые являются соединениями, представляющими интерес, где указанные полипептиды являются идентичными полипептидами, где по меньшей мере одна по меньшей мере из двух промоторных последовательностей ДНК выбирается из группы, состоящей из:

   (ί) последовательности ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, (ίί) последовательности ДНК, способной к гибридизации с последовательностью ДНК согласно (ί), (ίίί) последовательности ДНК, имеющей по меньшей мере 80% гомологии с последовательностью ДНК согласно (ί), (ίν) субпоследовательности любой из последовательностей ДНК согласно (ί)-(ίίί).
2. 2. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.1, в которой по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК обладают различными экспрессионными характеристиками.
3. 3. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.1 или 2, где клетка-хозяин относится к видам Адалеих, ΑδрегдШих, РешсШшт, Руепорогих или Тпейойегта.
4. 4. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.3, где АхрегдШих является видом АхрегдШих шдег, АхрегдШих 5о)ае, АхрегдШих огухае.
5. 5. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.1-4, в которой кодирующая последовательность кодирует фермент.
6. 6. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп.1-4, в которой кодирующая последовательность кодирует фермент, вовлеченный в продукцию метаболита.
7. 7. Способ получения рекомбинантной клетки для продукции соединения, представляющего интерес, по любому из пп.1-6, включающий:

   (a) обеспечение по меньшей мере двух конструкций ДНК, причем каждая конструкция ДНК содержит кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК, где по меньшей мере две конструкции ДНК содержат по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК и где кодирующие последовательности, содержащиеся в указанных конструкциях ДНК, кодируют взаимосвязанные полипептиды, где взаимосвязанные полипептиды выбраны из группы, состоящей из полипептидов, вовлеченных в продукцию одного соединения, представляющего интерес, где соединением, представляющим интерес, является полипептид, РНК или метаболит; или одного или нескольких полипептидов, которые являются соединениями, представляющими интерес, где указанные полипептиды являются идентичными полипептидами, (b) обеспечение подходящей клетки-хозяина, являющейся клеткой мицелилальных грибов, и (c) трансформацию указанной клетки-хозяина указанными конструкциями ДНК, где по меньшей мере одна по меньшей мере из двух промоторных последовательностей ДНК выбирается из группы, состоящей из:

   (ί) последовательности ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, (ίί) последовательности ДНК, способной к гибридизации с последовательностью ДНК согласно (ί), (ίίί) последовательности ДНК, имеющей по меньшей мере 80% гомологии с последовательностью ДНК согласно (ί), (ίν) субпоследовательности любой из последовательностей ДНК согласно (ί)-(ίίί).
8. 8. Способ по п.7, в котором стадию (с) осуществляют посредством по меньшей мере двух отдельных событий трансформации.
9. 9. Способ экспрессии кодирующей последовательности, включающий культивирование рекомбинантного хозяина для продукции соединения, представляющего интерес, по любому из пп.1-6 при условиях, способствующих экспрессии кодирующей последовательности;

   или включающий:

   (а) обеспечение по меньшей мере двух конструкций ДНК, причем каждая конструкция ДНК содержит кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательно

   - 26 018840 стью ДНК, где по меньшей мере две конструкции ДНК содержат по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК и где кодирующие последовательности, содержащиеся в указанных конструкциях ДНК, кодируют взаимосвязанные полипептиды, где взаимосвязанные полипептиды выбраны из группы, состоящей из полипептидов, вовлеченных в продукцию одного соединения, представляющего интерес, где соединением, представляющим интерес, является полипептид, РНК или метаболит; или одного или нескольких полипептидов, которые являются соединениями, представляющими интерес, где указанные полипептиды являются идентичными полипептидами, (b) обеспечение подходящей клетки-хозяина, являющейся клеткой мицелилальных грибов, (c) трансформацию указанной клетки-хозяина указанными конструкциями ДНК, (б) культивирование указанной клетки-хозяина при условиях, способствующих экспрессии кодирующей последовательности, где по меньшей мере одна из по меньшей мере двух промоторных последовательностей ДНК выбирается из группы, состоящей из:

   (ΐ) последовательности ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, (ίί) последовательности ДНК, способной к гибридизации с последовательностью ДНК согласно (ί), (ίίί) последовательности ДНК, имеющей по меньшей мере 80% гомологии с последовательностью ДНК согласно (ί), (ίν) субпоследовательности любой из последовательностей ДНК согласно (ί)-(ίίί).
10. 10. Способ по п.9, в котором стадию (с) осуществляют посредством по меньшей мере двух отдельных событий трансформации.
11. 11. Способ получения полипептида, включающий:

    (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, являющейся клеткой мицелилальных грибов, для продукции соединения, представляющего интерес, по любому из пп.1-6 при условиях, способствующих экспрессии полипептида, (b) необязательно выделение полипептида из культурального бульона и (c) необязательно очистку полипептида;

    или включающий:

    (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, являющейся клеткой мицелилальных грибов, содержащей по меньшей мере две конструкции ДНК, причем каждая конструкция ДНК содержит кодирующую последовательность в функциональной взаимосвязи с промоторной последовательностью ДНК, где по меньшей мере две конструкции ДНК содержат по меньшей мере две различные промоторные последовательности ДНК и где кодирующие последовательности, содержащиеся в указанных конструкциях ДНК, кодируют взаимосвязанные полипептиды, где взаимосвязанные полипептиды выбраны из группы, состоящей из полипептидов, вовлеченных в продукцию одного соединения, представляющего интерес, где соединением, представляющим интерес, является полипептид, РНК или метаболит; или одного или нескольких полипептидов, которые являются соединениями, представляющими интерес, где указанные полипептиды являются идентичными полипептидами, при условиях, способствующих экспрессии полипептида, (b) необязательно выделение полипептида из культурального бульона и (c) необязательно очистку полипептида, где по меньшей мере одна по меньшей мере из двух промоторных последовательностей ДНК выбирается из группы, состоящей из:

    (ί) последовательности ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:1-4 и 13-55 и промоторных последовательностей ДНК генов, перечисленных в табл. 1, (ίί) последовательности ДНК, способной к гибридизации с последовательностью ДНК согласно (ί), (ίί) последовательности ДНК, имеющей по меньшей мере 80% гомологии с последовательностью ДНК согласно (ί), (ίν) субпоследовательности любой из последовательностей ДНК согласно (ί)-(ίίί).
12. 12. Способ получения метаболита, включающий:

    (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, являющейся клеткой мицелилальных грибов, для продукции соединения, представляющего интерес, по любому из пп.1-6 при условиях, способствующих продукции метаболита, (b) необязательно выделение метаболита из культурального бульона и (c) необязательно очистку метаболита.