KR100411238B1 - 외래 단백질을 안정하게 발현하는 바실러스 속 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 외래 단백질을 안정하게 생산할 수 있는, 바실러스의 wprA 유전자가 파괴된 바실러스 속 균주에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스 균주의 단백질가수분해효소인 WprA를 코딩하는 유전자인 wprA 유전자가 파괴되어, WprA가 발현되지 않도록 제작된 균주이다. 본 발명의 재조합 균주를 사용하여 외래단백질을 제조할 경우, 고초균 내재의 단백질분해효소에 의한 외래 단백질이 손상되지 않으므로, 안정하게 외래 단백질을 제조할 수 있다.

Description

외래 단백질을 안정하게 발현하는 바실러스 속 미생물{Novel Bacillus sp. for the Stable Expression of Foreign Proteins}

본 발명은 외래 단백질을 안정하게 발현하는 신규한 바실러스 속 균주에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 외래 단백질을 안정하게 발현할 수 있도록, 바실러스 속 균주의 단백질 가수분해효소의 유전자가 파괴된 신규한 바실러스 속 균주 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

바실러스 속 균주(Bacillus sp.)는 인간에게 질병을 유발시키지 않으면서도,단백질 분비기구가 잘 발달되어 있고, 전체 유전자 염기서열이 알려져 있는 등의 여러가지 장점을 가지고 있다. 또한, 그가 가지고 있는 내재성 분비신호 서열로 인하여, 매우 중요한 외래 단백질의 생산균주로 알려져 있어, 다른 미생물과 달리 매우 활발히 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 바실러스 속 균주를 이용할 경우, 외래 단백질의 생산수율이 낮을 뿐만 아니라, 생산된 외래 단백질의 안정성이 저하되는 현상이 빈번하게 관찰되고 있는 바, 이러한 현상의 주요원인은 바실러스 속 균주 자체에서 분비되는 단백질가수분해효소에 의한 외래 단백질의 분해이다. 예를 들어, 혈전용해제로 알려진 스타필로키나제의 경우, 자연계에서 포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 극히 적은 양으로 생산되고 있으므로, 이를 바실러스 속 균주에서 대량으로 생산하려는 시도가 있었으나(참조: Behnke, D., and D. Gerlach., Mol. Gen. Genet., 210:528-534(1987); Schlott, B., et al., Bio/Technology., 12:185-189(1994); Lee, S. J. et al., Biotechnol. Lett., 20:113-116(1998)), 전기 균주의 단백질가수분해효소의 활성으로 인하여, 낮은 생산수율을 보였음은 물론, 생산된 스타필로키나제의 안정성이 저하됨이 알려졌다.

이러한 단점을 극복하기 위하여, 바실러스 속 균주의 단백질가수분해효소 7개를 파괴시키고, 레반수크라제(levansucrase)의 프로모터와 분비신호서열 뒤에 스타필로키나제 유전자를 위치시켜 수크로스(sucrose)로 스타필로키나제의 발현을 유도할 수 있는 균주가 개발되기도 하였으나(참조: Ye, R. et al., Biotechnol. Bioeng., 62:87-96(1999)), 이로부터 생산된 스타필로키나제의 안정성이 낮다는 문제점은 해결할 수 없었다.

따라서, 외래 단백질을 안정하게 발현시킬 수 있는 바실러스 속 균주를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 외래 단백질을 안정하게 발현시킬 수 있는 바실러스 속 균주를 개발하는 방법을 확립하고자 예의 연구노력한 결과, 바실러스 속 균주의 단백질 가수분해효소인 WprA를 코딩하는 유전자인 wprA 유전자가 파괴된 바실러스 속 균주를 외래 단백질의 발현벡터로 형질전환시켜 작제된 형질전환체에서 외래 단백질이 대량으로 발현되며, 전기 발현된 외래 단백질이 단백질 가수분해효소에 대해 안정적이므로, wprA 유전자가 파괴된 바실러스 속 균주가 외래 단백질을 안정하게 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 바실러스 속 균주의 wprA 유전자가 파괴된 바실러스 속 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 균주를 외래 단백질의 발현벡터로 형질전환시키고, 배양하며, 이로부터 외래 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 유전자 교환벡터 pDWPRA의 유전자 지도이다.

도 2는 배양시간에 따른 형질전환 균주의 성장곡선과 스타필로키나제의 발현 양상을 나타내는 그래프이다.

도 3은 각 균주의 배양액에 포함된 단백질분해효소에 의한 스타필로키나제의 활성의 변화를 나타내는 그래프이다.

본 발명의 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주는 바실러스 속 균주에서 외래 단백질을 안정하게 발현시킬 수 있도록, 단백질 가수분해효소인 WprA를 코딩하는 유전자인 wprA 유전자가 파괴되어, WprA가 발현되지 않도록 작제된 균주이다.

이하, 본 발명의 바실러스 속 균주를 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

바실러스 서브틸리스 WB600(참조: Wu, X. C. et al., J. Bacteriol., 173:4952-4958, 1991) 균주에서 발현되는 wprA 유전자를 불활성화시키기 위하여, 암피실린 저항유전자, 테트라사이클린 저항유전자, 테트라사이클린 저항유전자가 중간에 삽입된 wprA 유전자, 바실러스 오리진 및 대장균의 오리진을 포함하는 유전자 교환벡터(gene replacement vector)를 제조하고, 이를 사용하여 바실러스 서브틸리스 WB600 균주를 형질전환 시켰다. 그런 다음, 테트라사이클린 저항성 균주를 선별하고, 이를 열처리하여 전이되지 않은(unincorporated) 벡터를 제거한다. 선별된 균주의 제노믹 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)의 방법으로 스크리닝하여, 선별된 균주의 제노믹 DNA에서 wrpA 유전자가 붕괴되었음을 확인하고, 제노믹 DNA에서 wprA 유전자가 파괴된 균주를 "바실러스 서브틸리스 LB700(Bacillus subtilis,LB700)"이라 명명하고, 이를 2000년 8월 16일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 18039P로 기탁하였다.

서브틸리신 프로모터 및 신호서열(subtilisin promoter and signal sequence, SPS), 카나마이신 저항유전자, 스타필로키나제(staphylokinase, SAK)를 코딩하는 유전자, 바실러스 오리진 및 대장균의 오리진을 포함하는 스타필로키나제 발현벡터를 사용하여 바실러스 서브틸리스 LB700, 바실러스 서브틸리스 WB600, 바실러스 서브틸리스 DB431(참조: Doi, R. H. et al., Bacillus subtilis: a model system for heterologous gene expression, p. 261-272. In J. W. Kelly and T. O. Baldwin (ed.), Applications of enzyme biotechnology. Plenum Press, New York, N.Y., 1991)을 형질전환시킨 다음, 이들 각각을 배양하였다. 이들의 배양액을 검사한 결과, 형질전환된 바실러스 서브틸리스 LB700을 배양한 배양액에 가장 많은 량의 스타필로키나제가 축적되며, 전기 균주의 배양액에서 수득한 스타필로키나제의 안정성이 가장 우수함을 확인하였다. 이로부터, 바실러스 서브틸리스 LB700는 외래 단백질을 안정하게 생산할 수 있는 균주임을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 바실러스 서브틸리스 LB700의 작제

바실러스 속 균주의 wprA 유전자를 상동재조합(homologous recombination)의 방법으로 파괴하기 위하여, 유전자 교환벡터(gene replacement vector)를 다음과 같이 작제하였다: 먼저, 바실러스 서브틸러스 WB600(Bacillus subtilis WB600)의 제노믹 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 WPR-F: 5'-CCCGAATTCTTGATAGAGCTGGTTTTTTT TATA-3'(서열번호 1)와 프라이머 WPR-R: 5'-GCAGAATTCGCACAGCTTCGGCTTATCGGAATT-3'(서열번호 2)를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편을 EcoRI으로 절단하고 이를 pUC19(Cat No. 3219, TaKaRa, Japan)에 도입하여 pUC19-wprA를 작제하였다. 전기 벡터를 Bst1107I와 EcoRV로 절단하여 wprA를 포함하는 절편을 수득하고, 이를 XhoI 연결체와 융합시켰다. pUCTV2(참조: Wittchen, K. D., and F. Meinhardt., Appl. Microbiol. Biotechnol., 42:871-877, 1995)를 XhoI으로 절단하여 수득한 테트라사이클린 저항유전자를 wprA를 포함하는 절편의 XhoI 위치에 삽입하여, 테트라사이클린 저항유전자에 의해 파괴된 wprA 절편(tet-disrupted wprA fragment)을 수득하고, 전기 절편을 XhoI으로 절단된 pUCTV2의 EcoRI 부위에 삽입하여 유전자 교환벡터인 pDWPRA를 작제하였다(참조: 도 1).

전기 pDWPRA를 사용한 상동재조합에 의하여, 바실러스 서브틸러스 WB600을 형질전환시키고, 전기 형질전환된 균주를 30℃의 온도조건하에 테트라사이클린이 함유된 고체배지에서 배양하여, 테트라사이클린에 대한 저항성이 있는 균주를 선별한 다음, 42℃의 LB배지 5ml에 옮겨서 전이되지 않은(unincorporated) 벡터를 제거하고, 이로부터 염색체(chromosome)를 수득하였다. 전기 염색체를 PvuII로 절단한 다음, 이들을 주형으로 하고 프라이머 WPRP-F: 5'-TGCCAATTGGTTTTCAATTGTTTTAATAGA-3'(서열번호 3)와 프라이머 TETP-R: 5'-TAAAATTTGGTTGTGTCGTAAATTCGATTG-3'(서열번호 4)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻어진 PCR 절편은 wprA 유전자를 포함하므로, WprA의 활성부위를 코딩하는 유전자부위를 확인하여 wprA 유전자의 파괴여부를 알아보았다. 즉, 확인용 프루브로 WPRS-F: 5'-ACTTAAATTAATCACCTTTGCTCCTTTGTC-3'(서열번호 5)와 WPRS-R: 5'-CTGCGCTGACAGCCTTCATGACATTCA-3'(서열번호 6)를 사용한 혼성화(hybridization) 방법을 적용하여, 전기 염색체에서 WprA의 활성부위를 코딩하는 유전자부위를 검색한 결과, WprA의 활성부위를 코딩하는 유전자가 파괴되었음을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 전기 선별된 균주를 "바실러스 서브틸리스 LB700(Bacillus subtilisLB700)"이라 명명하고, 이를 2000년 8월 16일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 18039P로 기탁하였다.

실시예 2: 스타필로키나제의 제조

바실러스 속 균주에서 불안정하게 발현되는 것으로 알려진 스타필로키나제를 전기 바실러스 서브틸러스 LB700(KCTC 18039P) 균주에서 다음과 같이 제조하였다: 먼저, 플라스미드 pKWZ(참조: Park, S. S. et al., J. Bacteriol., 171:2657-2665, 1989)의 서브틸리신 프로모터 및 신호서열(subtilisin promoter and signal sequence, SPS)을 pUC18(Cat No. 3218, TaKaRa, Japan)의 HindIII-EcoRI 부위에 삽입한 것을 주형으로 하고, 프라이머 SPS-F: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'(서열번호 7)와 프라이머 SPS-R: 5'-TTGAGCTCGCCGGCCTGCGCAGACATGTTGCT-3'(서열번호 8)을 사용하여 PCR을 수행하여, SacI과 NaeI 제한효소 절단부위가 추가된 SPS 절편을 수득하였다. 전기 절편을 EcoRI과 SacI으로 절단하고, pUC19의 EcoRI-SacI 부위에 삽입시킨 후, 다시 EcoRI과 PstI으로 절단한 다음, pKK223-3(Cat No. 27-4935-01, Pharmacia Biotech, USA)의 EcoRI-PstI 부위에 삽입시켰다. 이어, pUB110(Gene back accessin No. NC_001384)(참조: McKenzie, T. et al., Plasmid, 15(2):93-103, 1986)의 복제기원(origin of replication)과 카나마이신 저항유전자를 SPS를 포함하는 pKK223-3에 삽입시켜서 pSM704를 작제하였다.

한편, S. aureus(NCTC 10033)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 SAK-F: 5'-TCAAGTTCATTCGACAAAGGAAAAT-3'(서열번호 9)와 프라이머 SAK-R: 5'-GGGAAGCTTATTTCTTTTCTATAACAACCTTTG-3'(서열번호 10)을 사용하여 PCR을 수행하고, SAK를 코딩하는 유전자를 포함하는 PCR 절편을 수득하였다. 전기 PCR 절편을 HindIII로 절단하고, pSM704의 NaeI-HindIII 부위에 삽입하여, SAK 발현벡터인 pSAK704를 작제하였다.

작제된 pSAK704를 사용하여, 실시예 1의 바실러스 서브틸리스 LB700, DB431 및 WB600을 형질전환시켰다. 형질전환된 각 균주를 250 ml의 Luria-Bertani 배양액에 접종한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 각 균주의 성장률과 SAK의 발현량을 시간별로 측정하였다(참조: 도 2).

도 2에서, ()은 LB700의 성장곡선, ()는 DB431의 성장곡선, ()은 WB600의 성장곡선, ()은 LB700의 배양액에 분비된 SAK의 양, ()은 DB431의 배양액에 분비된 SAK의 양 및 ()은 WB600의 배양액에 분비된 SAK의 양을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 세 균주의 성장 양상은 거의 유사하였으나, SAK의 발현양상은 큰 차이가 있음을 알 수 있었다. 즉, SAK의 발현양은 DB431 및 WB600에서는 12시간을 정점으로하여 시간이 지날수록 감소하였으나, LB700에서는 계속 증가하며, 일정시간 후, 그 양이 유지됨을 알 수 있었다.

실시예 3: 스타필로키나제의 안정성 검사

전기 실시예 2에서는 다른 균주에 비하여 바실러스 서브틸리스 LB700 균주에서 SAK가 대량으로 생산된다는 결과를 얻었는데, 이러한 결과가 SAK가 단백질 가수분해효소인 WprA에 의해 분해되는 비율이 현저하게 줄어들었기 때문인지를 확인하였다.

먼저, 다른 SAK 발현벡터를 사용하여 대장균을 형질전환시키고, 이를 배양하며, 이로부터 순수분리된 SAK를 수득하였다. 한편, 전기 바실러스 바실러스 LB700, DB431 및 WB600을 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양물을 원심분리하고, 여과하여 배양액을 수득하였다. 이어, 각 배양액 1㎖를 분취하고, 이들 각각에 순수분리된 SAK 5mg를 첨가한 다음, 37℃에서 방치하여 방치시간별로 SAK의 활성을 측정하였다(참조: 도 3). SAK의 활성은 40㎕의 SAK가 포함된 배양액과 10mM 인간의 플라스미노겐 40㎕를 20mM 인산완충용액(pH 7.5) 900㎕에 첨가하고, 25℃에서 25분간 반응시킨 다음, 20㎕의 50mM S-2251(V-0882, Sigma Aldrich Co., .U.S.A.)를 혼합시키고, 450nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.

도 3은 SAK와 배양액이 혼합된 직후의 활성을 100으로 하였을 때, 방치시간 별로 각 균주의 배양액과 혼합된 SAK의 활성을 나타낸 그래프이다. 도 3에서 보듯이, DB431와 WB600의 배양액과 혼합된 SAK의 활성은 방치 2시간 후, 처음 활성의 50%를 나타내고 있으나, LB700의 배양액과 혼합된 SAK의 활성은 방치 24시간 후에도, 처음 활성의 60% 정도가 유지됨을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 외래 단백질을 안정하게발현시킬 수 있는, 바실러스 속 균주의 wprA 유전자가 파괴된 바실러스 속 균주를 제공한다. 본 발명의 바실러스 속 균주를 사용하여 외래 단백질을 발현시킬 경우, 발현된 외래 단백질이 바실러스 속 균주의 단백질 가수분해효소에 대해 안정적이므로, 안정하게 외래 단백질을 발현시킬 수 있다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 기술은 단지 바람직한 실시예 뿐이며, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 바실러스 서브틸리스 WB600의 wprA 유전자가 상동재조합(homologous recombination)에 의해 파괴된 바실러스 서브틸리스 LB700(Bacillus subtilisLB700, KCTC 18039P)
5. 제 4항의 바실러스 서브틸리스 LB700(Bacillus subtilisLB700, KCTC 18039P)를 숙주 미생물로 사용하여 외래 단백질의 발현벡터로 형질전환시키고, 이를 배양한 배양액으로부터 외래 단백질을 수득하는 공정을 포함하는, wprA 유전자가 파괴된 바실러스 속 균주에서 외래 단백질을 제조하는 방법.
6. 삭제
7. 제 5항에 있어서,

   외래 단백질은 스타필로키나제(staphylokinase)인 것을 특징으로 하는

   wprA 유전자가 파괴된 바실러스 속 균주에서 외래 단백질을 제조하는 방법.