KR0127560B1 - 단백질 분해 효소 코드화 유전자의 분자클로닝 및 발현 - Google Patents

단백질 분해 효소 코드화 유전자의 분자클로닝 및 발현

Info

Publication number
KR0127560B1
KR0127560B1 KR1019880701347A KR880701347A KR0127560B1 KR 0127560 B1 KR0127560 B1 KR 0127560B1 KR 1019880701347 A KR1019880701347 A KR 1019880701347A KR 880701347 A KR880701347 A KR 880701347A KR 0127560 B1 KR0127560 B1 KR 0127560B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bacillus
host cell
dna
protease
serine protease
Prior art date
Application number
KR1019880701347A
Other languages
English (en)
Other versions
KR890700665A (ko
Inventor
알베르투스 게라르투스 반 에에켈렌 크리스티아안
코르넬리스 반 데르 라안 요한네스
요한네스 조피에 마리에 뮬레너스 레오나르투스
Original Assignee
마가렛트 에이.호른
제넨코르 인터내셔널 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마가렛트 에이.호른, 제넨코르 인터내셔널 인코퍼레이티드 filed Critical 마가렛트 에이.호른
Publication of KR890700665A publication Critical patent/KR890700665A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR0127560B1 publication Critical patent/KR0127560B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

요약없음

Description

단백질 분해 효소 코드화 유전자의 분자클로닝 및 발현
본 발명의 분야는 바실러스(Bacillus) 균주에서의 재조합 기법을 사용하는 세린 프로테아제의 증가된 생성에 관한 것이다.
배경
바실러스는 알파-아밀라제, 중성 프로테아제 및 알칼리 또는 세린프로테아제와 같은 산업적으로 중요한 효소의 생성을 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 일반적으로, 박테리아의 세린 프로테아제는 세라티아(Serratia) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)종같은 그람음성유지체와 마이크로코커스(Micrococcus) 또는 바실러스 종같은 그람양성 박테리아를 포함하여 많은 원핵 유기체로부터 얻어질 수 없다. 특별히 관심있는 산업적 중요한 세린프로테아제 군은 알칼리 배지에서 고 활성을 가지는 것들이다. 산업용 세린 프로테아제와 고초균(B. subtilis), 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 알칼로필루스(B. alcalophilus) 및 다른 바실러스 종을 포함하여 각종 바실러스 종에 의해서 생성되는 한편, 고 알칼리 프로테아제는 일반적으로 알칼리 pH에서 성장할 수 있는 바실러스 균주에 의해 생성된다. 그러한 바실러스의 실례는 바실러스 신종(novo species) PB92이다.
단백질분해 효소, 특히 고알칼리 프로테아제를 고 수율로 생성할 수 있는 바실러스의 균주를 개발하는데에 실질적인 관심이 있다.
관련 문헌
간균속 균의 세포외재성효소에 대한 여러가지 유전자, 예를 들어 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스의 알파-아밀라제 유전자(Palva et al., Gene 15(1981)43-51), 바실러스 리케니포르미스의 알파-아밀라제 유전자(Ortlepp, Gene 23(1983) 267), 바실러스 스테아로써모필루스(B. stearothermophilus)의 알파-아밀라제 유전자(Mielenz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1983) 5975-5979; EP-A-0057976 및 고초균의 알파-아밀라제 유전자 (Yang et al., Nucleic Acids Res. 11(1983) 237); 고초균의 레반슈크라제 유전자(Gay et al., J. Bacteriol, 153(1983) 1424); 바실러스 스테아로써모필루스의 중성 프로테아제 코드화 유전자(Fuji etl al., J. Bacteriol. 156(1983) 831), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스의 중성 프로테아제 코드화 유전자(Honjo et al., J. Biotech. 1(1984) 165) 및 고초균의 중성 프로테아제 코드화 유전자(Yang et al., J. Bacteriol. 160(1984) 115); 고초균의 세린 또는 알칼리 프로테아제 코드화 유전자(Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984) 1184), 바실러스 리케니포르미스의 세린 또는 알칼리 프로테아제 코드화유전자(Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 13(1985) 8913) 및 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스의 세린 또는 알칼리 프로테아제 코드화 유전자(Wells et al., Nucleic Acids Res. 11(1983) 7911)가 성공적으로 클론되어 있다.
각종 바실러스 종에서의 산업적 세린 프로테아제의 생성은 예컨대 미합중국 특허 Nos. 3,674,643; 3,723,250; 및 4,480,043에 설명되어 있다. 알칼리 pH에서 성장할 수 있는 바실러스 균주에 의한 고 알칼리 단백질 분해효소의 생성은 예컨대 미합중국 특허 Nos. 3,723,250; Re. 30,602 및 4,480,037에 설명되어 있다.
산업적으로 중요한 효소의 생성을 위한 바실러스의 이용의 검토기사에 대해서는 예를 들어 데바보프의 바실러스의 산업적 이용 : The Molecular Biology of Bacilli, (Acad. Press, New York, 1982) 참조.
고초균의 원형질체 형질전환 프로토콜이 장과 코헨에 의해 기술되었다(Mol. Gen. Genet. 168(1979) 111-115). 유사한 프로토콜이 바실러스 메가테리움(B. megaterium) 원형질체(Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Letters 7(1980) 261-263), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 원형질체(Smith et al., Appl. and Env. Microbiol. 51(1986) 634), 바실러스 쑤린기엔시스(B. thuringiensis) 원형질체(Fisher et al., Arch. Microbiol. 139(1981) 213-217), 바실러스 스파에리쿠스(B. sphaericus) 원형질체(McDonald. J. Gen. Microbiol. 130(1984) 203), 및 바실러스 라르바에(B. larvae) 원형질체(Bakhiet et al., Appl. and Env. Microbiol. 49(1985) 577)의 성공적인 형질전환에 대하여 기술되어 있다. 그러나 바키에트 등(상기동일)은 바실러스 포필라에(B. popillae)에 대해서는 성공적이지 못한 결과를 기록하였다. 만 등은 Current Microbiol. 13(1986) 131-135에 바실러스 폴리믹사(B. polymyxa), 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 마세란스(B. macerans)및 바실러스 라테로스포루스(B. laterosporus)를 사용한 성공적인 형질전환을 기록하였다.
그러나 프로토콜은 양호한 원형질체 형질전환이 관찰되었음에도 불구하고 바실러스 코아귤란스(B. coagulans), 세레우스균(B. cereus)및 바실러스 푸밀루스(B. pumilus)에 대해서는 성공적이지 못하였다.
원형질체안으로 DNA를 도입하는 다른 방법으로는 리포솜을 함유하는 DNA와의 융합법이 있다(Holubova, Folia Microbiol. 30(1985)97).
발명의 개요
신규한 호알칼리성 바실러스 균주, 그러한 균주의 형질전환 방법 및 조성물이 제공된다. 신규한 DNA서열이 또한 제공되며 상기 DNA 서열은 호알칼리성 바실러스 균주로부터 유도된 고알칼리 단백질 분해 효소를 코드화하는 유전자를 포함한다.
양성 배경을 가지는 것이 바람직한 숙주 세포는 상기 고 알칼리 단백질분해 효소를 코드화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 구조체를 사용하여 형질전환된다.
고알칼리 pH에서 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에 플라스미드 구조체를 이용하여 원형질체 형질전환이 사용될 수 있다.
DNA 서열은 염색체외재성으로 보유될 수 있으며, 또는 숙주세포 게놈안에 통합될 수 있다.
특정 구체예의 설명
본 발명에 따라, 단백질 분해효소를 고수율로 생성하기 위한 신규한 DNA구조체와 균주, 뿐만 아니라 그의 제조방법이 제공된다. 숙주 세포는 숙주 바실러스 균주로부터 제조된 원형질체를 융합 조건하에 단백질분해효소를 코드화하는 DNA서열을 포함하는 플라스미드 구조체와 결합시킴으로써 형질전환된다.
고 알칼리 프로테아제는 알칼리 배지에서 고 활성을 가지는 세린프로테아제 또는 서브틸리신이다. 보다 구체적으로, 고 알칼리 프로테아제는 약 9이상의 pH값에서 최적활성을 가지며 약 11 또는 그 이상의 pH에서 이 최적 활성의 최소한 80%를 보유한다. 고 알칼리 프로테아제는 일반적으로 알칼리 pH에서 성장할 수 있는 바실러스 균주에 의해 생성된다.
합성, 게놈 DNA로부터의 단리, cDNA로부터의 제조, 또는 그의 조합을 포함하여 프로테아제 유전자를 단리하는데 사용된 기법들은 본 기술분야에 공지되어 있다.
고 알칼리 프로테아제 유전자의 단리 및 발현은 본 출원이 토대로 하고 있는 우선권서류, 유럽 특허 E-P-A-87200358.7에 개시되고 있고, 그 내용은 본원에 참고로 삽입되어 있다.
유전자 조작에 대한 각종 기법이 잘 알려져 있으며, 제한, 소화, 절제, 연결, 시험관내 돌연변이 유발, 프라이머 수복, 링커 및 어댑터의 사용등이 있다. 마니아티스 등의 Mouecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982 참조.
일반적으로, 본 발명은 고 알칼리 프로테아제를 발현하는 유기체로부터 게놈 라이브러리를 제조하는 단계를 포함한다. 수여 미생물의 게놈은 적합한 제한효소에 의하여 단리되고 절단된다. 그 결과로 생성되는 수여 균주의 DNA 단편의 그런후 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 있는 클로닝벡터에 연결된다.
삽입된 DNA 단편을 함유하고 있는 클론은 고초균에 대하여 전개된 것과 같이(Gryzan and Dubnow, Gene 20(1982) 459-469)내서 마커에 의하여 또는 직접 또는 양성 선택방법을 사용함으로써 확인될 수 있다. 더불어, 고 알칼리 프로테아제를 발현하는 클론은 발현 생성물에 직접적인 항체의 사용, 또는 기질의 손실 또는 단백질 분해 효소의 생성물의 형성의 검출에 의하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 항생물질 내성과 같은 마커유전자를 발현하는 클로니는 카제인 함유 아가 플레이트상에 있는 콜로니주위의 카제인 부산물의 증가된 침전에 의해 측정되는 바 프로테아제 생성에 대하여 스크린될 수 있다.
일단 완전한 유전자, cDNA 또는 염색체 DNA의 어느하나로서 확인되면, 발현을 제공하기 위하여 여러가지 방법으로 조작될 수 있다. 기존의 고알칼리 프로테아제 생성주인 호알칼리성 바실러스를 포함하는예를 들어 호알칼리성 박테리아를 포함한 바실러스 숙주가 사용될 수 있다. 바람직한 숙주유기체는 바실러스 신종 PB92이다. 그러므로 바실러스 숙주 균주에서 기능하는 다른 바실러스로부터 유도된 제어영역이 또한 사용될 수도 있지만 조절 신호 및 분비리더 서열등이 있는 야생형 서열을 유진하는 것이 편리하다. 그러므로 바실러스 세포를 형질전환하는 적당한 벡터는 촉진유전자 서열, 리보솜 결합 부위를 형성하는 서열 및 알칼리 프로테아제 유전자의 전자 및 번역의 종결을 제어하는 서열같은 제어영역을 포함하는 호알칼리성 바실러스로부터 얻을 수 있는 고 알칼리 프로테아제를 코드화하는 구조 유전자를 포함하며, 상기 제어 영역은 호알칼리성 바실러스 숙주세포에서 기능적이 된다.
벡터는 예를 들어 숙주 균주가 민감하게 반응하는 항생물질에 대한 내성을 부여하는 마커 유전자, 및 숙주 세포에서 자치적으로 복제할 수 있는 복제 기원을 추가로 포함할 수 있다. 복제 기원은 그의 기능을 숙주세포에서 온도-민감성으로 만드는 돌연변이를 가지는 것일 수 있으며, 그로써 에를리히가 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(1978) 1433에 기재한 바와같은 염색체 통합에 대한 선택을 가능하게 한다.
아미노산 서열은 고 알칼리 프로테아제 유전자에 대한 수여세포로서의 관심의 세포로부터의 mRNA 또는 DAN로부터 제조된 cDNA또는 게놈 라이브러리를 스크린하기 위한 프로브를 고안하기 위해 사용될 수 있다. 혼성체형성 프로브로서 고 알칼리 프로테아제 cDNA 또는 그의 단편을 사용함으로써, 다른 유기체에서 발견되는 구조적으로 관련된 유전자가 쉽게 클론될 수 있다. 특별히 관심이 있는 것은 바실러스 신종 PB92를 포함하여 호알칼리성 바실러스 균주로부터 얻을 수 있는 고 알칼리 세린 프로테아제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 토대로 한 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용 함으로써 고 알칼리 세린 프로테아제를 발현하는 유기체로부터의 유전자의 단리이다. 그러한 프로브는 길이에 있어서 전체 서열보다 상당히 짧지만 최소한 10, 바람직하게는 최소한 15, 보다 바람직하게는 20 뉴클레오티드이어야 한다. 유전자의 전 길이까지, 바람직하게는 1200 뉴클레오티드 이하 길이의 보다 긴 올리고 뉴클레오티드가 또한 유용하다. 두가지 RNA 및 DNA 프로브가 사용될 수 있다.
사용에 있어서, 프로브는 검출가능한 수단(예컨대32P,3H, 비오틴 또는 아비딘으로)으로 전형적으로 표지되며 유전자가 들어있는 유기체로부터의 단일-스트란드 DNA 또는 RNA와 항온반응된다. 혼성체 형성은 단일 스트란드 및 이중 스트란드(혼성체형성) DNA(또는 DNA/RNA)를 분리한 후 (전형적으로 니트로셀룰롱스지를 사용하여 분리)표지에 의해 검출한다. 올리고 뉴클레오티드의 사용에 적당한 혼성체형성 기법은 기술분야에서 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다.
프로브는 일반적으로 쉬운 확인을 허용하는 검출가능한 표지와 함께 사용되지만, 미표지 올리고 뉴클레오티드도 표지된 프로브의 전구체로서 및 이중-스트란드 DNA(또는 DNA/RNA)의 직접검출을 제공하는 방법에서의 사용에 유용한다. 따라서, 용어 올리고 뉴클레오티드 프로브는 표지 및 미표지의 두가지 형태를 말한다. 그런후, 연결 혼합물이 겨합하는 고초균 세포를 형질전환하기 위하여 사용된다. 그런후에 선택수단으로서 마커유전사를 사용하여, 재조합 플라스미드가 단리되고 제한 분석 및 서열화에 의하여 특성확인될 수 있다.
고 알칼리 프로테아제 생성을 위해 이미 세린 프로테아제를 생성하는 바실러스 균주를 형질전환하는데 사용하기에 바람직한 DNA 서열은 바실러스 신종 PB92로부터 기원하는 서열이다. DNA서열에 의해 코드화되는 세린 프로테아제의 아미노산 서열은 다음과 같다.
H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
프로테아제 유전자를 제공하는데 바람직한 균주는 바실러스 신종 PB92이지만, 본질적으로 동일한 세린 프로테아제가 다른 호알칼리성 바실러스로부터도 얻어질 수 있다. 바실러스 PB92의 아미노산 서열과 최소한 약 70%, 바람직하게는 약 80%의 동종성을 가지는 그러한 프로테아제 유전자는 본 발명의 범주내에 있는 것으로 이해되어져야 한다.
발현 생성물은 분비되는 것이 바람직하다. 알칼리 프로테아제가 분비되어 때문에, 야생-형 분비리더 신호와 프로세싱 신호가 사용될 수 있다. 또한, 융합된 유전자가 분비 리더와 프로세싱 신호를 코드화하는 구조 유전자에 5'서열을 제공함으로써 제조될 수 있다. 예시적인 이종 분리 리더로는 바실러스 아밀라제와 프로테아제 유전자의 분비리더가 있다. 적절한 리딩 프레임 중에서 분비 리더의 관심의 구조 유전자와의 융합에 의하여,성숙한 호알칼리성 프로테아제와 배양 배지로 분비될 수 있다.
발현 카세트는 전체 또는 부분이 천연 공급원으로부터 유도될 수 있고, 숙주세포와 동종인, 또는 숙주 세포와 이종인 공급원으로부터 전체 또는 부분적으로 유도될 수 있다. 본 발명이 각종 DNA 구조체(DNA서열, 벡터, 플라스미드, 발현카세트)는 단리되고 및/또는 정제되며, 또는 합성되므로 자연-발생은 아니다.
구조 유전자의 숙주 균주의 염색체 안으로의 통합 또는 염색체 외재성 성분상에서의 유지중에 어느 것이 바람직한 가에 따라서 바실러스에 대한 복제 시스템이 포함될 수도 있고 또는 포함되지 않을 수도 있다. 통합에 대해서는, 바실러스 게놈과의 플라스미드 구조체의 동종성의 연장이 제조합 가능성을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 더욱이, 온도 민감 복제 기원의 플라스미드 구조체안으로의 봉입은 염색체 통합에 대한 선택을 허용한다. 예를 들어 에를리히, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(1978) 1433참조.
구조 유전자의 하나이상의 복사물이 구조 유전자의 발현을 증폭시키기 위하여 숙주 세포안에 삽입될 수 있다. 구조유전자의 안정한 증폭은 구조유전자의 최소한 하나의 추가의 복사물을 숙주 세포 게놈안으로 통합시키고 구조유전자의 복사물이 내인성 염색체 서열에 의하여 분리되는 형질전환에 대하여 선택함으로써 얻어질 수 있다. 원핵 시스템에 대한 DNA구조체와 방법이 그 내용이 본원에 참고로 삽입된 유럽출원 EP-A-87200356.1에 기술되어 있다.
복제 시스템에 더불어, 통상의 최소한 하나의 마커 유전자가 플라스미드 구조체완에 포함된다. 마커 유전자는 생독소 또는 바이러스 내성, 또는 중금속에 대한 내성, 면역성 등을 제공하는 숙주에서 발현할 수 있는 구조 유전자를 의미한다. 생독소 내성에 대해서는, 이것은 항생물질, 예컨대 네오마이신, 카나마이신, 테트라사이클린 등에 대한 내성을 포함할 수 있다. 마커 유전자는 재조합 세포의 성장을 심각하게 방해하지 않는 항생물질 농도에서 낮은 복사 수에서의 선택을 제공하도록 선택될 것이다. 특별히 관심있는 것이 네오마이신에 대한 내성이다.
각종 DNA서열이 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있으며 플라스미드 구조체를 제공하기 위하여 구조 유전자의 삽입 또는 하위치환을 허용하는 하나 또는 그 이상의 편리함, 바람직하게는 단일한 제한 부위를 포함하는 벡터를 제공하도록 함께 결합될 수 있다.
일단 플라스미드 구조체가 제조되면, 그것은 적합한 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 바실러스는 어떠한 바실러스 균주일 수 있지만, 적합한 숙주 균주의 선택은 고알칼리 프로테아제이 생성을 개선시킬 수 있는 이를 고려해야 한다. 생성은 소정의 생성물 분해의 감소, 조절신호의 인지, 분비의 용이성등이 있는 숙주를 사용하는 것을 포함하여 다양한 방법으로 개선될 수 있다. 그러므로, 바람직한 숙주 바실러스는 야생형 바실러스 또는 돌연변이 바실러스의 어느 하나의 고알칼리 프로테아제 생성주이지만, 숙주 바실러스는 또한 고 알카리 프로테아제를 생성하지 않는 고알칼리 프로테아제 생성 돌연변이주일수도 있다.
고알칼리 프로테아제 생성 바실러스는 분류학적으로 잘 분류되어 있지는 않으며 일반적으로 호알칼리성 바실러스 균주로서 언급된다. 알칼리 pH에서 성장할 수 있는 바실러스 균주의 실례가 예를 들어 미합중국 특허 Nos. 3,723,250; Re. 30,602 및 4,480,037에 기술되어 있다. 바람직한 호알칼리성 바실러스 숙주 균주의 실례는 그중에서도 특히 미합중국 특허 No. Re. 30,602에 개시되어 있는 균주 바실러스 신종 PB92이다.
산업용 호알칼리성 바실러스 균주도 또한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 산업용 바실러스 균주는 토양에서 단리될 수 있는 유기체로부터 기원하거나 또는 기탁자 또는 다른 공급원으로부터 쉽게 구할 수 있으며 그러한 바실러스 균주의 유전학적 변형에 의하여 얻어진다. 산업용 바실러스 균주는 유전적 교환, 예컨대 파지 감염 또는 형질전환에 대한 내성이 됨에 의하여 특성확인 된다. 균주는 안정하며 포자형성을 할 수도 못할 수도 있다.
그것들은 통상 영양요구주이며 내인성 단백질 생성물, 예컨대 효소 알파-아밀라제와 각종 프로테아제를 고수율로 제공하도록 변형된다. 산업적 생산 방법으로 얻어진 내인성 단백질 생성물의 수율은 최소한 5 g/ℓ(0.5%중량/부피)까지의 양일 수 있다. 산업용 균주는 또한 DNase를 분비함으로써 배지중에서의 DNA의 분해를 유발하고, 유전적 교환에 대한 보호력을 제공한다.
호알칼리성 바실러스 균주의 형질전환은 상기 균주로부터의 원형질체의 사용을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 코헨등(상기 동일)에 의하여 기재된 바와 같은 종래의 원형질체 형질전환 프로토콜은 호알칼리성 바실러스 균주에 대해서는 작동하지 못한다. 그러므로 추가의 프로토콜이 개발되어야만 한다.
호알칼리성 바실러스를 위해서는, 원형질체의 형성 및 재생이 높은 pH, 바람직하게는 약 pH8에서 일어날 수 있다. 원형질체는 세포를 알칼리 보유 배지(AHM), pH7.8 내지 8.5에 재현탁시킨 후, 세포를 30 내지 80분동안 37℃에서 배양함으로써 제조될 수 있다. AHM의 실례에 대해서는 실시예 5 참조. 그 결과의 원형질체는 그런 다음 세척되어 라이소자임이 제거된 후, AHM에 재현탁된다.
그런 후에 플라스미드 구조체와 호알칼리성 바실러스 숙주 원형지체가 적합한 융합원의 존재하에 결합된다. 소정의 효력을 제공하는 어떠한 융합원이든지 사용될 수 있는 한편, 대부분의 폴리에틸렌 글리콜(분자량 1000 내지 8000)이 대단히 편리하게 고 효율 융합을 제공하는 것으로 발견된다.
바실러스 수용 균주로부터 제조된 원형질체는 5분을 넘지 않는 동안, 바람직하게는 2분 이내로 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에 플라스미드 구조와 혼합된다.
융합된 혼합물이 그런다음에 세포가 5시간까지, 바람직하게는 2 내지 시간동안 배양되어 있는 종래의 영양 배지로 재생 플레이트에 옮겨지기 전에 대치된다. 재생 플레이트는 형질전환체의 선택을 위하여 네오마이신 같은 항생물질을 함유한다.
DNA 구조체가 에피솜에 유지되어 있는 클론은 고 알칼리 세린 프로테아제 발현의 검출에 의하여 확인될 수 있다. 자신의 염색체의 통합부분으로서 발현 구조체를 함유하는 그런 클론들을 확인하기 위해서 나타나는 클론은 총 세포 DNA의 단리와 유리 플라스미드 DNA는 검출될 수 없지만 플라스미드의 마커 유전자는 발현되는 그런 클론들에 대해 선택함으로써 스크린된다. 그런 다음에 고알칼리 세틴 프로테아제의 발현을 검출하기 위한 적합한 방법으로 클론이 스크린될 수 있다.
특히적 항체의 사용, DNA 또는 RNA 혼성체형성, 효소 생성물의 형성 또는 효소 기질의 소멸을 포함하는 다양한 검출기법이 발현구조체의 존재와 관심의 구조 유전자의 발현, 즉 프로테아제 생성을 측정하기 위하여 클론의 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
생성된 프로테아제는 예를 들어 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 히스티딘-MOPS겔 전기영동 상에서의 프로테아제의 분자량 측정 및 합성 기질 숙시닐-L-알라닐-L-프롤릴-L-페닐알라닌-p-니트로-아날라이드에 대해 측정된 역학 변수 Km과 Vmax의 측정에 의하여 생화학적으로 특성 확인될 수 있다.
에피솜상에 또는 염색체상에 통합된 발현 구조체를 함유하고 있는 바실러스 숙주가 그런 다음에 효소합성을 유도하는 조건하에 영양 배지 중에서 성장된다.
영양 배지는 통상 형질전환되지 않은 숙주가 민감하게 반응하는 항생물질의 존재같은, 플라스미드의 유지수단을 포함할 것이다. 발효는 브로스(broth)가 소모될 때까지 계속될 수 있다. 생성물이 분비된 경우에 생성물은 종래 기법에 의하여, 예컨대 추출, 크로마토그래피, 전기영동 등에 의하여 브로스로부터 단리될 수 있다. 생성물이 원형질에 보유되는 경우, 세포는 원심분리, 여과 등에 의하여 수확되고, 기계적 분쇄, 세제, 라이소자임, 또는 기법에 의하여 용해되며, 앞서 기술된 바와 같이 생성물이 단리된다. 형질전환된 숙주세포가 고알칼리 프로테아제 생성주인 경우에, 본 발명을 사용함으로써 대단히 증가된 수율의 고알칼리 세린 프로테아제가 형질전환되지 않은 숙주 세포의 수율과 비교하여 통상 최소한 약 120%로 단일한 염색체외재생 유전자 복사물을 가지면서 이루어질 수 있다.
다음의 실시예를 한정하는 것이 아닌 예시로서 제공한다.
실험
제1도는 여러가지 서브틸리신과 비교하여 각각 pUB110과 pM58을 함유하는 고초균 DB104의 배양액으로부터의 상징액에 대해 수행된 히스티딘/MOPS겔 전기영동의 결과를 도시한다.
레인 1 : 카알스베르그(Carlsberg) 서브틸리스
레인 2 : 바실러스 PB92 프로테아제
레인 3 : 고초균 서브틸리스
레인 4 : 고초균 DB104(pM58)
레인 5 : 고초균 DB104(pUB110)
제2도는 플라스미드 pM48의 제한 지도이다. 또한, 서열화 스트래티지를 도면의 상단부에 도시한다. 직선화살표는 파지 M13 벡터 mp10, mp11 및 mp18에 클론된 단편을 표시한다. 도면의 하단부는 프로테아제 유전자상에 규칙적인 간격으로 위한 10 올리고 뉴클레오티드를 사용하는 서열화 스트래티지를 도시한다.
제3도는 바실러스 PB92 세린 프로테아제의 아미노산 서열과 상호 관련된 코팅 스트란드의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. DNA 서열의 촉진유전자(P1,P2), 리보솜 결합부위(rbs) 및 종결영역(term)이 또한 도시된다. 숫자가 표시된 직선은 서열화에 사용된 10 올리고 뉴클레오티드의 위치를 나타낸다.
제4A도는 플라스미드 pE194-neo 의 제조과정을 도시한다.
제4B도는 플라스미드 pMAX-4의 제조과정을 도시한다.
호알칼리성 바실러스 신종 PB92로부터의 게놈 DNA 라이브러리의 제조 및 세린 프로테아제 유전자의 단리
사이또-미우바에 의해 Biochim. Biophys. Acts 72(1963) 619-632에 기재된 방법에 따라 바실러스 신종 PB92(네덜란드 델프트소재의 기술 대학, 미생물 실험실에 번호 OR-60으로 기탁함, 미합중국 특허 No. Re. 30,602 참조)로부터 단리한 염색체를 DNA를 제한효소 Sau 3A로 부분적으로 소화시켜서 플라스미드 pUB110(Gryczan et al., J. Bacteriol. 134(1978) 318-329)의 BamH I 부위에 연결하였다. pUB110 플라스미드 DNA는 번보임과 돌리에 의해 기재된 바로대(Nucl. Acids Res. 7(1979) 1513-1523) 제조하였다.
연결혼합물은 스피찌짼등의 방법(J. Bacteriol. 81(1961) 741-746)에 따라 경합세포 ㎖당 0.6 내지 1㎍의 DNA를 사용하여 고초균 1A40(Bacillus Genetic Stock Centre)안에 형질전환하였다.
형질전환 혼합물로부터 세포를 : 2.8% K2HPO4, 1.2% KH2PO4, 0.4%(NH4)2SO4, 0.2% tri-Na-시트레이트·2H2O, 0.04%, MgSO4·7H2O, 0.0005% MnSO4·4H2O, 0.4% L-글루탐산, 0.5% 글루코스, 0.02% 카사미노, 50㎍/㎖의 트립토판, 20㎍/㎖의 메티오닌, 20㎍/㎖의 라이신, 20㎍/㎖의 네오마이신, 0.4% 카제인 및 1.5% 아가를 함유하고 있는 최소 플레이트 상에 배치하였다.
플레이트를 37℃에서 밤새 배양한 후에 50,000의 네오마이신 내성 콜로니중의 하나가 아가 플레이트에서 카제인 절단 생성물의 결과의 증가된 침전에 의해 측정한 바 증가된 프로테아제 생성을 나타냈다. 이 콜로니로부터 번보임과 돌리에 의해 Nucleic Acids Res. 7(1979) 1513-1523에 기재된 방법에 따라 DNA를 단리하고, pM48로 명명하였다.
실시예 2
PB92 세린 프로테아제 유전자의 발현
pM58을 함유하고 있는 고초균 1A40을 0.02% 카사미노산, 50㎍/㎖의 트립토판, 20㎍/㎖ 메티오닌, 20㎍/㎖의 라이신 및 20㎍/㎖의 네오마이신이 첨가된 최소 배지(Spizizen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44(1958) 1072-1078)중에서 성장시켰다.
24시간후, 배양액을 원심분리하고 기질로서 디메틸 카제인을 사용하여 프로테아제 활성에 대하여 상징액을 측정하였다(Lin et al., J. Biol. Chem. 244(1969) 789-793). 대조표준으로 사용한 플라스미드 pUB110을 함유하고 있는 고초균 1A40의 배양액은 PM58 형질전환된 배양액이 나타내는 프로테아제 활성의 1/60보다 적게 나타냈다. 프로테아제 활성을 1mM 플루오르화 페닐술포닐(PMSF)로 처리함으로써 완전히 저해하였으나, 20mM EDTA로 처리하여서는 저해하지 못했다.
상술한 상징액의 알리큇을 라엠리의 방법(Nature 227(1970) 680)에 따라 단백질 겔상에서 분석하였다. 이들 겔상에서의 분석용 샘플을 상징액을 5% 트리클로로아세트산(TCA)으로 처리함으로써 제조하였다. 샘플의 원심분리에 이어서 침전된 단백질 펠릿을 아세톤으로 2회 세척한 후 40㎕의 샘플완충액(0.5M Tris/HCl pH7.5, 10% 부피/부피 2-메프캅토에탄올, 50% 부피/부피 글리세롤 및 0.05% 브로모페놀 블루)중에 10분동안 비등에 의하여 녹였다. 전기영동후, 겔을 쿠마찌 브릴리언트 브루를 사용하여 염색하였다.
그런후 배양 상징액 샘플을 전기영동에 의하여 분석하였다. 세가지 상이한 고초균 1A40 균주를 사용하였다 : pUB : 또는 pM58을 함유하는 균주; 또는 플라스미드가 없는 균주; 그리고 대조표준으로서 바실러스 PB92 프로테아제를 함유하는 균주. 전기영동후, 겔을 쿠마찌 브릴리언트 블루를 사용하여 염색하고 탈색하였다. pM58을 함유하고 있는 고초균주 1A40으로부터의 샘플은 바실러스 PB92 프로테아제와 함께 이동하는 31kD 단백질을 함유하였다. 이 단백질은 pUB110을 함유하고 있는 고초균주 1A40의 대조레인에서는 검출하지 못했다.
모든 세린 프로테아제는 유사한 분자량을 가진다. 그러므로 바실러스 PB92의 클론된 세린 프로테아제를 프로테아제 음성 고초균주 DB104(R. Doi, J. Bacteriol. 160(1984) 442-444)로의 pM58 및 pUB110의 형질전환과 생성된 세포외재생 프로테아제의 분석에 의하여 고지의 세린 프로테아제(B. Subtilis Subtilisin, Carlsberg Subtilisin)와 구별하였다.
얻어진 형질 전환체를 0.02% 카사미노산, 50㎍/㎖의 히스티딘 및 20㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 최소 배지(Spizizen etl al., 상기 동일)에서 성장시켰다.
24시간후, 샘플을 취하여 원심분리하고 75mM KOH, 40mM 히스티딘, 100mM MOPS(2-(N-모르포리노)-프로판술폰산), pH 7.5 및 5% 폴리아크릴아미드를 함유하고 있는 히스티딘/MOPS 겔상에서 예비처리 없이 분석하였다. 전기영동 완충액은 40mM 히스티딘, 100mM MOPS, jpH6.6을 함유하였다. 샘플은 음극방향으로 흘렀다.
프로테아제 밴드를 아그파 팬 100 전문 필름으로 검출하였다(Zuidweg et al., Bitotechnol. and Bioengin. 14(1972) 685-714).
이들 결과를 제1도에 나타낸다. 도시된 바와 같이, pM58은 바실러스 PB92 프로테아제를 코드화하는 유전자를 은닉한다.
실시예 3
바실러스 PB92 세린 프로테아제 유전자의 서열화
pM58의 Bal I-Hpa I 단편의 전 서열을 상기의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(1977) 6463)에 의하여 측정하였다. pM58의 제한 단편(제2도 참조)을 파지 M13 벡터 mp10, mp11 및 mp18(Messing et al., Nucleic Acids Res. 9(1981) 309-321)에 클론하였다. pH58 단편의 삽입을 플라크 혼성체 형성에 의하여 스크린하였다. 서열화후에 10개의 뉴클레오티드가 유전자상에 규칙적인 간격으로 위치하도록 하였도 서열화를 반복하여 제3도에 도시한 서열을 확인하였다.
실시예 4
세린 프로테아제 함유 플라스미드 pMAX-4의 제조
플라스미드 pUCN 710(제4A도)을 제조하기 위하여 pUB110을 Taq Ⅰ과 PvuⅡ로 소화하였다. 네오마이신 내성을 제공하는 유전자의 함유하는 단편을 저융점 아가로스상에서 정제하고 클레노우 중합효소와 NTP(Maniatis. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982)를 사용하여 블런트로 만들었다.
플라스미드 pUC7(Vieira et al., Gene 19(1982) 259-268)을 Sal Ⅰ으로 선형화하여 상술한 바와 같이 블런트로 만들었다.
두가지 단편을 T4연결효소(maniatis)로 연결하고 대장균 JM103에 형질전환하였다. 50㎍/㎖의 암피실린과 10㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 2× TY플레이트(1.6%중량/부피 박토-트럽톤, 1% 중량/부피 효모 추출물, 0.5% NaCl)상에서 선택하였다.
그 결과의 플라스미드를 pUCN 710으로 명명하고 BamH Ⅰ으로 소화하였다. 플라스미드 pE194(Jordanescu, Plasmid 1(1978) 468-479)를 Bcl Ⅰ으로 소화하였다. 두가지 소화물로부터 단편을 T4연결효소로 연결하고 고초균 1A40에 형질전환하였다.
20㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 최소 플레이트에서 선택하였다(실시예 1 참조). 얻어진 플라스미드, pE194-neo(제4A도)는 네오마이신 유전자와 온도민감복제기원을 함유한다.
통합 벡터 pE194-neo에서 프로테아제 유전자의 하위클로닝은 다음과 같이 수행하였다 : pM58(실시예 1 참조)을 Hpa Ⅰ과 BAl Ⅰ과 Bal Ⅱ로 소화하였다.
플라스미드 pE194-neo를 Hpa Ⅰ으로 소화하였다. 이를 단편을 T4연결효소로 연결하고 고초균 1A40에 형질전환하였다. 형질전환체를 카제인 절단생성물 침전(결과물 형성, 실시예 1 참조)에 의해 판단되는 바, 네오마이신 내성과 프로테아제 생성의 증가를 토대로 하여 선택하였다. 플라스미드 pMAZX-4를 얻었고, 그의 구조를 제한 효소분석에 의해 확인하였다(제4B도 참조).
실시예 5
pMAX-4에 의한 바실러스 균주 PB92의 원형질체 형질전환
바실러스 균주 PB92를 100㎖의 NBSG-X배지(Thorne et al., J. Bacteriol. 91(1966) 1012-1020)중에서 성장시켰다. 배양액을 10분동안 4,500rpm에서 소르발 모델 GSA로터로 원심분리하였다. 바실러스를 0.4㎎/㎖의 라이소자임이 첨가된 멸균수중에 0.5M 슈크로스, 0.02M MgCl2및 0.02M 트리스/말레산염, pH8.0을 함유하고 있는 알칼리 보유 배지(AHM) 10㎖ 중에서 1시간 동안 37℃에서 배양시킴으로써 원형질체를 제조하였다.
원형질체를 펠릿화하고(4,500rpm에서 10분)5㎖의 AHM+pH8.0 완충액(3.5% 중량/부피 박토 페나싸이 브로스와 0.04% 중량/부피 알부민 메리에욱스가 첨가되어 있는 AHM 완충액)에 재현탁하여 혼합한 후 상기와 같이 재펠릿화하였다. 5.0㎖의 알칼리 호울딩 배지중에 재현탁한 후, 원형질체의이 현탁액 0.5㎖를 1㎍의 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 탈금속수 5㎍과 혼합하였고 30% 중량/부피 포리에틸레글리콜 8,000, pH8.0의 존재하에 2분동안 배양하였다.
AHM+pH8.0 배지로 1:3 희석하고 원심분리한 후, 펠릿을 소량(1㎖)의 AHM+에 재현탁하여 2 내지 3시간 동안 배양하였다.
100마이크로리터 알리큇을 0.5M Na 숙시네이트/HCl pH8.0, 1.5% 중량/부피 아가, 0.5% 중량/부피 카사미노산 0.5% 중량/부피 효모추출물 0.031M 인산염 완충액 pH8.0, 0.5% 중량/부피 글루코스, 0.02M MaCl2및 0.02% 중량/부피 알부민 메리에욱스를 함유하고 있는 새롭게 제조된 재생프레이트상에 놓았다.
이들 플레이트는 또한 1000㎍/㎖의 선택용 네오마이신을 함유하였다. 37℃에서 최소한 72시간 동안 배양한 후, 콜로니를 20㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 하아트 인퓨젼(Heart Infusion)아가 클레이트상에 주복-배치하였다.
실시예 6
바실러스 균주 PB92 염색체안으로의 pMAX-4의 통합
20㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 하아트 인퓨전(Heart Infusion) 플레이트상에서 성장된, pMAX-4를 함유하고 있는 바실러스 균주 PB92의 콜로니를 1㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 100㎖의 트립톤소야 브로스(TSB)에서 24시간동안 37℃에서 배양하였다. 그런후 2㎖의 배양액(약 109세포/㎖)을 1㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 100㎖의 동일 배지에 희석시켜서 24시간동안 50℃에서 배양하였다.
24시간후 5㎖의 배양액(약 109세포/㎖)을 상술한 바와 같이 다시 희석하고, 1㎍/㎖의 네오마이신의 존재하에 24시간동안 50℃에서 배양하였다. 마지막 과정을 한번 더 반복하였다.
그런후 세포 현탁액을 100배로 희석하여 1㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 하아트 인퓨전(HI) 아가(Difco) 플레이트상에 놓았다.
플레이트를 16시간 동안 50℃에서 배양하였다. 네오마이신 내서 클로니를 단리하여 1㎍/㎖의 네오마이신을 함유하고 있는 10㎖의 TSB 배지중에서 16시간 동안 37℃에서 배양하였다.
이들 배양액으로부터 총 DNA를 단리하고 (Holmes et al., Anal. Biochem. 114(1981) 193-197) 플라스미드 부재를 아가로스 겔 상에서의 DNA 전지영동에 의하여 조사하였다.
플라스미드 DNA를 검출할 수 없었던 샘플을 총 DNA의 고초균 1A4으로의 형질전환에 의하여 재조사하였다.
고초균 1A40을 형질전환시키는 능력이 없는 샘플을 플라스미드가 없는 것으로 간주하였다. 바실러스 PB92유도된 균주는 네오마이신 내성이며, 프로테아제가 없고 PBT109로 명명하였다. 이 균주는 그의 염색체안에 통합된 플라스미드 pMAX-4의 복사물을 함유하였다.
균주 PBT109에서의 통합은 동중 재조합에 의하여 소위 캄펠-형 메카니즘을 통하여 일어났고 그 결과로 플라스미드 서열에 의하여 분리되는 염색체 상에 두개의 프로테아제 유전자가 직렬로 위치하였다. 균주 PBT109의 이런 유전적 조직은 그 내용이 본원에 참고로 삽입되고 본원과 함께 출원된 공동계류중의 EPA-0 000 000에 도시된 바와 같이 확인하였다.
실시예 7
형질전환된 균주의 프로테아제 생성
형질전환된 균주의 프로테아제 생성을 미합중국 특허 No. Re. 30,602에 기재되어 있는 바와 같이 대략 109세포/㎖을 함유하는 TSB 배양액의 0.2㎖을 100㎖의 생성배지가 들어있는 500㎖ 진동 플라스크에 첨가함으로써 시험하였다. 그러나 고초균 균주를 시험할때 pH를 7.0으로 조정하였다.
네오마이신을 균주 DB104(pUB110), DB104(pMAX-4), PB92(pMAX-4)에 대해서는 20㎍/㎖의 농도로 및 PBT109에 대해서는 1㎍/㎖의 농도로 첨가하였다.
이들 셀 라인에 대한 상대적인 프로테아제 생성을 표 1에 제시한다.
[표 1] 형질전환된 바실러스에서의 프로테아제의 생성
pMAX-4의 프로테아제 유전자 만으로부터의 프로테아제 생성을 측정하기 위하여, 이 플라스미드를 또한 실시예 2에 기재한 바대로 엑소프로테아제 음성 고초균 주 DB104(R. Doi, J. Bacteriol 150(1984) 442-444)로 형질전환하였다.(Spizizen et al., (1961) 상기동일).
** 프로테아제 활성은 린 등이 J. Biol. Chem. 244(1969)789-793에 기재한 바와 같이 기질로서 디메틸카제인을 사용하여 측정하였다.
보다큰 규모(10리터)의 발효에 있어서, 발효 배진에 네오마이신이 첨가되지 않았다면, 바실러스 PB92(pMAX-4)는 PBT109와 비교하여 볼안정과 생성감소를 나타냈다.
상기 결과로부터 세틴 프로테아제를 코드화하는 동종 된 이종 유전자를 삼업용 바실러스 균주에 염색체안으로 안정하게 도입함으로써 세린 프로테아제 생성에 대한 간단하고 효과적인 방법이 제공된다는 것이 명백하다. 이미 세린 프로테아제를 생성하는 바실러스 숙주에서의 세린 프로테아제의 증가된 생성이 또한 제공된다. 플라스미드 구조체의 숙주 세포 염색체안으로의 통합은 발효 생성과 대단히 증가된 프로테아제 생성에 대해 염색체외재성 플라스미드 구조체가 존재하는 때보다 훨씬 항정한 상태를 유발한다.
본 명세서에 언급한 모든 공보와 특허출원은 각각의 공보 또는 특허 출원이 참고로 삽입된다고 구체적으로 및 개별적으로 지적한 것처럼 같은 정도로 본원에 참고로 삽입된다.
발명을 이제 완전히 기술하였으며 기술분야에 통상의 지식을 가진 사람에게는 첨부된 특허청구의 내용 또는 범주로 벗어남이 없이 거기에 많은 수정과 변형을 이루어질 수 있음이 분명할 것이다.

Claims (28)

  1. 전사의 방향으로, 바실러스 숙주세포에서 기능적인 전사조절영역 및 번역 개시영역,고 알칼리 단백질분해효소 코드화 DNA 서열,및 상기 숙주 세포에서 기능적인 전사 및 번역 종결 영역; 및 최소한 하나의 마커 유전자와 박테리아 플라스미드의 온도-민감 복제기원을 포함하며, 상기 DNA서열의 발현의 상기개시 및 종결영역의 조절 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질분해효소는 호알칼리성 바실러스균주, 종 PB92로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열이 바실러스 신종 PB92의 단백질 분해효소 코드화 유전자와 비교하여 뉴클레오티드 서열에 있어서, 최소한 70%의 동종성을 가지는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열이 실질적으로 다음의 아미노산 서열 :
    H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
    을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
  5. 형질전환된 바실러스 숙주세포에 있어서 : 전사의 방향으로 상기 숙주세포에서 기능적인 전사조절 영역과 번역 개시영역,고 알칼리 세린 프로테아제 코드화 DNA 서열 및 상기 숙주세포에서 기능적인 전사 및 번역 종결 조절 영역을 포함하며, 그중 상기 DNA 서열이 발현이 상기 전사 및 번역영역의 조절 제어하에 있는 최소한 하나의 마커 유전자와 박테리아 플라스미드의 온도-민감 복제 기원을 포함하는 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포의 염색체 안에 상기 DNA 서열의 최소한 2개의 복사물이 통합된 것을 특징으로 하는 세포.
  7. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 형질전환된 야생-형 세린 프로테아제 생성주인 것을 특징으로 하는 세포.
  8. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 야생-형 프로테아제 생성주의 형질전환된 돌연변이주인 것을 특징으로 하는 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돌연변이주는 세린 프로테아제 비-생성주인 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 제5항에 있어서, 상기 고 알칼리 세린 프로테아제는 바실러스 신종 PB92로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 세포.
  11. 호알칼리성 바실러스 균주 바실러스 신종 PB92 숙주세포에서의 세린프로테아제 제조방법에 이어서 : 전사의 방향으로, 전사 및 번역개시 조절영역; 세린 프로테아제 코드화 DNA 서열; 상기 숙주세포에서 기능적인 전사 및 번역 종결 조절영역; 및 형질전환된 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커 유전자를 포함하는 발현카세트를 상기 숙주세포에 도입하는 단계; 상기 발현 카세트를 포함하는 상기 형질전환된 숙주세포를 선택조건하에서 성장시킴으로써 실질적으로 형질전환되지 않은 친세포가 없는 형질전환된 배양액이 얻어지는 단계; 및 상기 형질전환된 배양액을 영양배지중에서 배양시킴으로써 상기 세린 프로테아제가 과잉생성되는 단계로 이루어지는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 숙주세포가 야생-형 세린 프로테아제 생성주인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 숙주세포가 야생-형 세린 프로테아제 생성주의 돌연변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 돌연변이주는 세린 프로테아제 비-생성주인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 호알칼리성 바실러스 세포를 형질전환하는 방법에 있어서 : 상기 바실러스 세포를 알칼리 배지중에서 약 20℃ 내지 70℃에서 라이소자임으로 전처리하여 원형질체를 형성하는 단계; 상기 라이소자임으로부터 상기 원형질체를 분히하는 단계; 상기 원형질체를 융합원의 존재하에 약 20℃ 내지 약 37℃에서 DNA구조체와 결합시키는 단계; 상기 융합원 및 재생하는 상기 바실러스 세포를 희석하는 단계; 및 상기 재생된 바실러스 세포를 선택조건하에서 성장시키는 단계로 이루어지는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 DNA구조체는 전사의 방향으로, 전사와 번역개시 조절영역; 관심의 폴리펩티드 코드화 DNA 서열; 및 전사가 번역종결 조절영역으로 포함하며 그중 상기 조절영역은 상기 숙주세포에 기능적인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 호알칼리성 바실러스균주 바실러스 신종 PB92숙주세포에서 관심의 폴리펩티드 생성을 증가시키는 방법에 있어서 : 융합원의 존재하에 알칼리 pH에서, 상기 숙주세포의 원형질체와 상기 숙주 세포에 내인성인 효소 코드화 DNA 서열, 상기 숙주세포에서 기능적인 복제 시스템 및 선택 마커 유전자를 포함하는 플라스미드 구조체를 결합시킴으로써 상기 DNA가 숙주 세포안에 삽입되는 단계; 상기 DNA를 함유하는 상기 숙주 세포를 선택하는 단계; 및 상기 숙주세포를 관심의 상기 폴리펩티드의 합성을 유도하는 조건하에서 성장시키는 단계로 이루어지는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 내인성 효소는 세린 프로테아제, 바람직하게는 고알칼리 프로테아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 DNA의 최소한 하나의 복사물이 상기 숙주 세포안에 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 실질적으로 다음의 아미노산 서열 :
    H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
    을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열.
  21. 형질전환된 바실러스 숙주 세포에 있어서, 상기 숙주세포에서 발현할 수 있는 세린 프로테아제 코드화 유전자를 포함하는 DNA단편을 단리하는 단계; 상기 DNA 단편을 선형 벡터 DNA에 결합시켜서 상기 유전자와 선택용 마커를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 숙주세포로부터 제조된 원형질체를 융합원의 존재하에 알칼리 pH에서 상기 벡터와 결합시킴으로써 상기 유전자가 상기 숙주세포에 도입되고 상기 숙주세포의 염색체안으로 통합되는 단계; 및 상기 유전자를 안정하게 함유하고 있는 숙주 세포를 선택하는 단계로 이루어지는 방법에 의하여 얻어지는 형질전환된 바실러스 숙주세포.
  22. 제21항에 있어서,상기 바실러스가 바실러스 신종 PB92인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실러스 숙주 세포.
  23. 제21항에 있어서, 상기 벡터는 pMAX-4인 것을 특징으로 하는 형질전환된 바실러스 숙주세포.
  24. 플라스미드 pMAX-4.
  25. 바실러스 PBT109.
  26. 바실러스 신종 BP92로부터 얻을 수 있는 고 알칼리 세린 프로테아제의 아미노산 서열을 코드화하는 서열과 혼성체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드로부터 선택된 최소한 15 서열의 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드.
  27. 제26항에 있어서, 방사성 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고 뉴클레오티드.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 최소한 20서열의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고 뉴클레오티드.
KR1019880701347A 1987-02-27 1988-02-26 단백질 분해 효소 코드화 유전자의 분자클로닝 및 발현 KR0127560B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL87200358.7 1987-02-27
EP87200358 1987-02-27
PCT/NL1988/000007 WO1988006624A2 (en) 1987-02-27 1988-02-26 Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR890700665A KR890700665A (ko) 1989-04-26
KR0127560B1 true KR0127560B1 (ko) 1997-12-29

Family

ID=8197584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019880701347A KR0127560B1 (ko) 1987-02-27 1988-02-26 단백질 분해 효소 코드화 유전자의 분자클로닝 및 발현

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5217878A (ko)
JP (1) JP3026567B2 (ko)
KR (1) KR0127560B1 (ko)
CN (1) CN88101681A (ko)
AT (2) ATE180016T1 (ko)
AU (1) AU620026B2 (ko)
BG (1) BG49049A3 (ko)
BR (1) BR8805647A (ko)
CA (1) CA1339100C (ko)
DE (2) DE3856331T2 (ko)
DK (2) DK175738B1 (ko)
FI (3) FI105483B (ko)
HU (1) HU213220B (ko)
LT (1) LT4000B (ko)
LV (1) LV10307B (ko)
NO (1) NO884423L (ko)
PT (1) PT86864B (ko)
RU (1) RU2023723C1 (ko)
WO (1) WO1988006624A2 (ko)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988006624A2 (en) * 1987-02-27 1988-09-07 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
GB2214508A (en) * 1988-01-27 1989-09-06 Bayer Ag Plasmid vector for the efficient expression of foreign genes fused with newly conceived transcriptional and translational signal sequences.
US6287841B1 (en) * 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
EP0370103A4 (en) * 1988-05-05 1991-11-27 Health Res Inst City New York Protease-deficient gram-positive bacteria and their use as host organisms for the production of recombinant products
US5665587A (en) * 1989-06-26 1997-09-09 Novo Nordisk A/S Modified subtilisins and detergent compositions containing same
JP3046344B2 (ja) * 1990-10-24 2000-05-29 塩野義製薬株式会社 新規プロテアーゼ
US5482849A (en) * 1990-12-21 1996-01-09 Novo Nordisk A/S Subtilisin mutants
DK58391D0 (da) * 1991-04-03 1991-04-03 Novo Nordisk As Hidtil ukendte proteaser
DE69333463D1 (de) * 1992-05-18 2004-05-06 Genencor Int Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen
US6436690B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-20 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
US6440717B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-27 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6599730B1 (en) * 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US5831004A (en) * 1994-10-27 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Inhibitors of metalloproteases, pharmaceutical compositions comprising same and methods of their use
US5646044A (en) * 1995-03-02 1997-07-08 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Expression systems for the production of target proteins in bacillus
US6455295B1 (en) * 1995-03-08 2002-09-24 The Procter & Gamble Company Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
IL117350A0 (en) * 1995-03-09 1996-07-23 Procter & Gamble Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) * 1995-03-09 2002-11-05 Procter & Gamble Company Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
DE69739020D1 (de) 1996-11-04 2008-11-13 Novozymes As Subtilase varianten und verbindungen
US5766871A (en) * 1996-11-27 1998-06-16 Food Industry Research And Development Institute Screening and characterization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase
US6485957B1 (en) 1999-04-30 2002-11-26 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. DNA encoding the human serine protease EOS
US6420157B1 (en) * 1999-04-30 2002-07-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Zymogen activation system
US6426199B1 (en) 1999-08-31 2002-07-30 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Dna
US6458564B1 (en) 1999-08-31 2002-10-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. DNA encoding the human serine protease T
CN1312370A (zh) * 2000-03-07 2001-09-12 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人atp依赖的丝氨酸蛋白水解酶11和编码这种多肽的多核苷酸
US6777218B1 (en) * 2000-03-14 2004-08-17 Novozymes A/S Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains
ATE500323T1 (de) * 2000-04-03 2011-03-15 Maxygen Inc Subtilisin-variante
DK2339016T3 (da) * 2002-03-29 2017-01-23 Danisco Us Inc Øget produktion af subtilisiner
WO2004101763A2 (en) 2003-05-12 2004-11-25 Genencor International, Inc. Novel lipolytic enzyme lip1
US20070213518A1 (en) * 2003-05-12 2007-09-13 Jones Brian E Novel Lipolytic Enzyme Lip2
WO2004101760A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Genencor International, Inc. Novel lipolytic enzyme elip
EP1667530A4 (en) 2003-09-19 2011-05-25 Ics Holdings Inc MANUFACTURE OF A COURABLE PRODUCT OF DOUGH
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
BRPI0416797A (pt) * 2003-11-19 2007-04-17 Genencor Int serina proteases, ácidos nucléicos codificando enzimas de serina e vetores e células hospedeiras incorporando as mesmas
JP2007532114A (ja) * 2004-04-09 2007-11-15 ジェネンコー・インターナショナル・インク バチルスにおけるｐｃｋＡ修飾および増強されたタンパク質発現
US20080044853A1 (en) * 2004-06-21 2008-02-21 Novozymes A/S Stably Maintained Multiple Copies of at Least Two Orf in the Same Orientation
US7202074B2 (en) * 2004-07-22 2007-04-10 University Of Chile Protein and nucleic acid sequence encoding a KRILL-derived cold adapted trypsin-like activity enzyme
CN101641438B (zh) 2007-03-12 2013-12-25 丹尼斯科美国公司 经修饰的蛋白酶
EP2460823B1 (en) 2007-05-10 2014-02-26 Danisco US Inc. A modified secretion system to increase expression of polypeptides in bacteria
ES2562919T3 (es) 2007-08-06 2016-03-09 University Of Chile Proteína y secuencia de ADN que codifica una actividad del tipo de la subtilisina adaptada al frío
DK2235176T3 (en) 2007-12-21 2017-09-25 Danisco Us Inc IMPROVED PROTEIN MANUFACTURING IN BACILLUS
FI123122B (fi) 2009-02-16 2012-11-15 Optogear Oy Laitteisto lasimateriaalin valmistamiseksi
CN105238801A (zh) 2009-04-24 2016-01-13 丹尼斯科美国公司 具有修饰的原区的蛋白酶
AR076941A1 (es) 2009-06-11 2011-07-20 Danisco Us Inc Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina
WO2013041689A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
CN103013960A (zh) * 2012-12-21 2013-04-03 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌
EP3089991B1 (en) 2013-12-31 2019-08-28 Danisco US Inc. Enhanced protein expression
CN107250371B (zh) 2014-12-16 2021-11-30 丹尼斯科美国公司 增强的蛋白质表达
KR20170093247A (ko) 2014-12-19 2017-08-14 다니스코 유에스 인크. 향상된 단백질 발현
JP7122373B2 (ja) * 2017-05-05 2022-08-19 バイオエコー ライフ サイエンシズ ゲーエムベーハー 生物試料からの高品質核酸の迅速精製

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1234445A (ko) 1967-10-03 1971-06-03
GB1205403A (en) 1967-11-10 1970-09-16 Novo Terapeutisk Labor As Preparation of proteolytic enzyme preparations
GB1519148A (en) * 1974-11-19 1978-07-26 Gist Brocades Nv Compositions of matter
FR2482980A1 (fr) 1980-05-20 1981-11-27 Biomerieux Sa Procede d'obtention de preparations de toxoplasmes pour le diagnostic de la toxoplasmose, et preparations ainsi obtenues
JPS6055118B2 (ja) 1982-02-08 1985-12-03 昭和電工株式会社 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法
DE3380878D1 (en) * 1982-11-01 1989-12-28 Miles Inc Method of heterologous cloning of gene in bacillus microorganism
IE81141B1 (en) * 1983-06-24 2000-04-05 Genencor Int Procaryotic carbonyl hydrolases
NZ208806A (en) * 1983-07-06 1988-07-28 Gist Brocades Nv Genetic engineering of industrial microorganism species: readily-transformable host used as intermediate in transfer of dna to the industrial species; plasmids
EP0138075A1 (en) * 1983-09-16 1985-04-24 Synergen Associates, Inc. A method for the generation and detection of enzyme variants with enhanced themostability and activity
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
FR2582316B1 (fr) * 1985-05-22 1988-12-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs d'expression de l'a-amylase dans bacillus subtilis, souches obtenues et procede de preparation d'a-amylase
DE3527913A1 (de) * 1985-08-03 1987-02-12 Henkel Kgaa Alkalische protease, verfahren zur herstellung von hybridvektoren und genetisch transformierte mikroorganismen
EP0254735B2 (en) * 1986-01-15 1998-06-17 Amgen Inc. METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS
EP0251446B1 (en) * 1986-04-30 1994-12-28 Genencor International, Inc. Non-human Carbonyl hydrolase mutants, DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors
WO1988006624A2 (en) * 1987-02-27 1988-09-07 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes
EP0479396B1 (en) * 1987-02-27 1999-06-09 Genencor International, Inc. Transformation of alkalophilic bacillus strains

Also Published As

Publication number Publication date
DK593988A (da) 1988-10-26
PT86864B (pt) 1992-05-29
CA1339100C (en) 1997-07-29
AU620026B2 (en) 1992-02-13
DE3856331T2 (de) 1999-10-14
JPH01502876A (ja) 1989-10-05
FI884904A (fi) 1988-10-24
FI105483B (fi) 2000-08-31
DE3856339T2 (de) 1999-11-04
DK200401262A (da) 2004-08-20
FI884904A0 (fi) 1988-10-24
LV10307A (lv) 1994-10-20
WO1988006624A3 (en) 1988-11-17
CN88101681A (zh) 1988-11-09
DK175738B1 (da) 2005-02-07
KR890700665A (ko) 1989-04-26
LV10307B (en) 1995-08-20
BR8805647A (pt) 1989-10-31
ATE181110T1 (de) 1999-06-15
JP3026567B2 (ja) 2000-03-27
FI119028B (fi) 2008-06-30
FI20001152A (fi) 2000-05-15
NO884423D0 (no) 1988-10-05
DK175852B1 (da) 2005-04-04
FI925413A0 (fi) 1992-11-27
AU1398088A (en) 1988-09-26
DE3856339D1 (de) 1999-07-15
PT86864A (pt) 1988-03-01
LT4000B (en) 1996-06-25
ATE180016T1 (de) 1999-05-15
DE3856331D1 (de) 1999-06-17
US5217878A (en) 1993-06-08
BG49049A3 (en) 1991-07-15
FI925413A (fi) 1992-11-27
NO884423L (no) 1988-10-05
WO1988006624A2 (en) 1988-09-07
HU213220B (en) 1997-03-28
RU2023723C1 (ru) 1994-11-30
DK593988D0 (da) 1988-10-26
LTIP1820A (en) 1995-08-25
FI106726B (fi) 2001-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR0127560B1 (ko) 단백질 분해 효소 코드화 유전자의 분자클로닝 및 발현
EP0283075B1 (en) Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes
JP4571304B2 (ja) バチルス細胞内でのポリペプチドの製法
AU620326B2 (en) Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms
JP2001514529A (ja) プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸
US5612192A (en) DNA base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant DNA including the whole or a part of the DNA base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant DNA
Honjo et al. Cloning and expression of the gene for neutral protease of Bacillus amyloliquefaciens in Bacillus subtilis
CA2234876C (en) Positive selection vector for bacillus sp.
JP2501779B2 (ja) アルカリプロテア―ゼの製造方法
KR100411238B1 (ko) 외래 단백질을 안정하게 발현하는 바실러스 속 미생물
Jacobs Cloning of, and studies on, genes coding for subtilisins Carlsberg and BPN'
Louw Characterization of an alkalophilic Bacillus brevis isolate with respect to its endo-(1, 3-1, 4)-β-glucanase gene, protein hyperproduction and the degS-degU operon
EP0303668A1 (en) Stable expression vectors

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J2X1 Appeal (before the patent court)

Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee