KR20170093247A - 향상된 단백질 발현 - Google Patents

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KR20170093247A
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cell
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크리스티나 본조르니
로버트 아이 크리스텐슨
브라이언 에프 슈미트
키메나데 아니타 반
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다니스코 유에스 인크.
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Abstract

일반적으로 본 발명은 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변화(genetic alteration)를 갖는 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 포자 형성의 유전자의 발현 또는 활성화를 지연시키거나, 감소시키거나, 차단함으로써 관심 대상의 단백질의 발현을 향상시키는 유전자 변화를 갖는, 바실루스(Bacillus) 속의 구성원과 같은 그람(Gram) 양성 미생물을 포함한다. 유전자 변화는 kinA 유전자, phrA 유전자 또는 phrE 유전자의 발현을 감소시키는 것이다.

Description

향상된 단백질 발현{ENHANCED PROTEIN EXPRESSION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119 하에, 2014년 12월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/094,751호의 우선권을 주장하며, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일반적으로 본 발명은 관심 대상의 단백질(protein of interest; POI)의 발현을 증가시키는 유전자 변화(genetic alteration)를 갖는 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 포자 형성의 유전자의 발현 또는 활성화를 지연시키거나, 감소시키거나, 차단함으로써 관심 대상의 단백질의 발현을 향상시키는 유전자 변화를 갖는, 바실루스(Bacillus) 속의 구성원과 같은 그람(Gram)-양성 미생물을 포함한다. 유전자 변화의 예는 KinA, PhrA, 및/또는 PhrE의 발현 또는 활성을 감소시키는 것을 포함한다.
서열 목록의 언급
NB40522-WO-PCT_SequenceListing.txt로 명명된 텍스트 파일 서열 목록의 전자 제출 내용은 2015년 11월 30일자로 생성되었으며, 크기가 18 KB이고, 본원에 참고로 포함된다.
유전 공학은 산업용 생물반응기로서, 세포 공장으로서 그리고 식품 발효에서 사용되는 미생물의 개선을 허용하였다. 다수의 바실루스 종을 포함하는 그람-양성 유기체가 다수의 유용한 단백질 및 대사 산물을 생성하는 데 사용된다 (예를 들어 문헌[Zukowski, "Production of commercially valuable products", Doi and McGlouglin (eds.) Biology of Bacilli: Applications to Industry, Butterworth-Heinemann, Stoneham. Mass pp 311-337 [1992]] 참조). 산업계에서 사용되는 일반적인 바실루스 종은 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens) 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)를 포함한다. 이러한 바실루스 종의 주(strain)는, 그의 GRAS(일반적으로 안전하다고 인정됨(generally recognized as safe)) 상태 때문에, 식품 및 제약 산업에서 이용되는 단백질의 생성을 위한 천연 후보이다. 그람-양성 유기체에서 생성되는 단백질의 예는 효소, 예를 들어 α-아밀라아제, 중성 프로테아제, 알칼리 (또는 세린) 프로테아제 등을 포함한다.
박테리아 숙주 세포에서의 단백질 생성의 이해에 있어서의 진전에도 불구하고, 증가된 수준의 관심 대상의 단백질을 발현하는 새로운 재조합 주의 개발 필요성이 여전히 남아있다.
본 발명은 증가된 수준의 관심 대상의 단백질을 발현하는 재조합 그람 양성 세포 및 이의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 유전자 변화를 갖지 않는 박테리아 세포와 비교하여 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변화를 갖는 박테리아 세포에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 측면은 포스포릴레이(phosphorelay) 경로(예를 들어, 도 5에서의 포스포릴레이 경로의 개략도를 참조)를 활성화시키는 기능을 하는 유전자의 발현을 감소시키며 따라서 관심 대상의 단백질 (이하, “POI”)의 발현을 향상시키는 유전자 변화를 포함하는 그람 양성 미생물, 예컨대 바실루스 속의 구성원을 포함한다. 그러한 재조합 박테리아 세포의 제조 및 사용 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 측면은 (a) POI를 생성하는 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 단계 (여기서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함함) 및 (b) 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 POI가 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 단계 (여기서, POI의 발현 증가는 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 비변경된 (모) 그람 양성 박테리아 세포에서의 상기 POI의 발현과 비교한 것임)를 포함하는, 그람 양성 박테리아 세포로부터의 POI의 발현의 증가 방법에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 유전자 변화는 kinA 유전자, phrA 유전자 및/또는 phrE 유전자의 유전자 변화이다.
다른 특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 세포는 하나 이상의 결함성 또는 불활성 포자 형성 유전자 (예를 들어, 발현이 Spo0A에 의해 제어되는 또는 Spo0A의 하류에 있는 유전자)를 갖고, 따라서 이미 포자가 형성되지 못하게 된 모 세포로부터 유래된다. 예를 들어, 본 출원인은 심지어 이러한 포자-비형성성 유전자 배경에서도, 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 하나 이상의 단백질(즉, 포자 형성-개시 유전자의 발현을 제어하는 유전자)의 발현 또는 활성을 감소시키는 추가의 유전자 변화가 상기 세포로부터의 POI의 발현을 증가시킴을 관찰하였다. 따라서, 본 발명의 유전자 변경된 (딸) 세포에서의 단백질 발현/생성의 개선은 단지 그람 양성 세포의 포자 형성의 방지로 인한 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 변경된 그람 양성 (딸) 세포가 유래되는 모 그람 양성 세포는 비-기능성 포자 형성 유전자, 돌연변이된 포자 형성 유전자, 결실된 포자 형성 유전자 등을 가질 수 있다 (예를 들어, 포자 형성 결함 바실루스 세포를 이용하는 실시예 섹션을 참조).
특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스 속의 구성원 (예를 들어, 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스(B. lentus), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로서모필루스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필루스(B. alkalophilus), 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 소노렌시스(B. sonorensis), 비. 할로두란스(B. halodurans), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 라우투스(B. lautus), 비. 파불리(B. pabuli), 비. 세레우스(B. cereus), 비. 아가라드하에렌스(B. agaradhaerens), 비. 아키바이(B akibai), 비. 클라르키이(B. clarkii), 비. 슈도피르무스(B. pseudofirmus), 비. 레헨시스(B. lehensis), 비. 메가테륨(B. megaterium), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 서큐란스(B. circulans), 비. 깁소니이(B. gibsonii), 및 비. 튜린기엔시스(B. thuringiensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바실루스 세포)이다. 특정 실시 양태에서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스 세포이다. 특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 degU, degQ, degS, scoC4 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 돌연변이는 degU(Hy)32이다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 변경된 그람 양성 (딸) 박테리아 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 (모) 박테리아 세포와 비교하여 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 하나 이상의 발현 수준을 감소시킨다. 따라서, 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 어느 하나; kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 임의의 2가지; 또는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 3가지 전부의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 다른 실시 양태에서, 유전자 변화는 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 하나 이상의 활성을 감소시킨다. 따라서, 유전자 변화는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 어느 하나; KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 임의의 2가지; 또는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 3가지 전부의 활성을 감소시킬 수 있다.
특정 실시 양태에서, 야생형 kinA 유전자의 서열은 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하며, 야생형 phrA 유전자의 서열은 서열 번호 6의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하며, 야생형 phrE 유전자의 서열은 서열 번호 8의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하다. 특정 실시 양태에서, 야생형 KinA 단백질의 서열은 서열 번호 2의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하며, 야생형 PhrA 단백질의 서열은 서열 번호 7의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하며, 야생형 PhrE 단백질의 서열은 서열 번호 9의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 하나 이상의 전부 또는 일부의 결실이다.
특정 실시 양태에서, POI는 상동 단백질이다. 특정 실시 양태에서, POI는 이종 단백질이다. 특정 실시 양태에서, POI는 효소이다. 특정 실시 양태에서, 효소는 프로테아제, 셀룰라아제, 풀룰라나아제, 아밀라아제, 카르보하이드라아제, 리파아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 키나아제, 및 포스파타아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 특정 실시 양태에서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 특정 실시 양태에서, POI는 프로테아제이다. 특정 실시 양태에서, 프로테아제는 서브틸리신이다. 다른 특정 실시 양태에서, 서브틸리신은 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그(subtilisin Carlsberg), 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147, 서브틸리신 309, 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 본 방법은 POI의 단리 및 회수 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 단리되고 회수된 POI는 추가로 정제된다.
본 발명의 측면은 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경된 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 포자 형성-개시 유전자의 발현을 유도하는 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하는 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스 속의 구성원이다. 특정 실시 양태에서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 소노렌시스, 비. 할로두란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 파불리, 비. 세레우스, 비. 아가라드하에렌스, 비. 아키바이, 비. 클라르키이, 비. 슈도피르무스, 비. 레헨시스, 비. 메가테륨, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 깁소니이, 및 비. 튜린기엔시스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 특정 실시 양태에서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스 세포이다. 특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 degU, degQ, degS, scoC4 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 돌연변이는 degU(Hy)32이다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 하나 이상의 발현 수준을 감소시킨다. 따라서, 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 어느 하나; kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 임의의 2가지; 또는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 3가지 전부의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 다른 실시 양태에서, 유전자 변화는 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 하나 이상의 활성을 감소시킨다. 따라서, 유전자 변화는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 어느 하나; KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 임의의 2가지; 또는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 3가지 전부의 활성을 감소시킬 수 있다.
특정 실시 양태에서, 야생형 kinA 유전자의 서열은 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하며, 야생형 phrA 유전자의 서열은 서열 번호 6의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하며, 야생형 phrE 유전자의 서열은 서열 번호 8의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하다. 특정 실시 양태에서, 야생형 KinA 단백질의 서열은 서열 번호 2의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하며, 야생형 PhrA 단백질의 서열은 서열 번호 7의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하며, 야생형 PhrE 단백질의 서열은 서열 번호 9의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 하나 이상의 전부 또는 일부의 결실이다.
특정 실시 양태에서, 변경된 세포는 POI를 발현한다. 특정 실시 양태에서, POI는 상동 단백질이다. 특정 실시 양태에서, POI는 이종 단백질이다. 특정 실시 양태에서, POI는 효소이다.
특정 실시 양태에서, 효소는 프로테아제, 셀룰라아제, 풀룰라나아제, 아밀라아제, 카르보하이드라아제, 리파아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 키나아제, 및 포스파타아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 특정 실시 양태에서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시 양태에서, POI는 프로테아제이다. 특정 실시 양태에서, 프로테아제는 서브틸리신이다. 특정 실시 양태에서, 서브틸리신은 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147, 서브틸리신 309, 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 하나 이상의 발현 수준을 감소시킨다. 따라서, 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 어느 하나; kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 임의의 2가지; 또는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 3가지 전부의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 다른 실시 양태에서, 유전자 변화는 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 하나 이상의 활성을 감소시킨다. 따라서, 유전자 변화는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 어느 하나; KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 임의의 2가지; 또는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 3가지 전부의 활성을 감소시킬 수 있다.
특정 실시 양태에서, 야생형 kinA 유전자의 서열은 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하며, 야생형 phrA 유전자의 서열은 서열 번호 6의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하며, 야생형 phrE 유전자의 서열은 서열 번호 8의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하다. 특정 실시 양태에서, 야생형 KinA 단백질의 서열은 서열 번호 2의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하며, 야생형 PhrA 단백질의 서열은 서열 번호 7의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하며, 야생형 PhrE 단백질의 서열은 서열 번호 9의 서열에 대하여 적어도 80% 동일하다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 하나 이상의 전부 또는 일부의 결실이다.
특정 실시 양태에서, 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 관심 대상의 단백질을 발현한다. 특정 실시 양태에서, 본 방법은 상기 관심 대상의 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 상기 모 그람 양성 박테리아 세포 내에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 방법은 상기 관심 대상의 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포 내에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 상동 단백질이다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 이종 단백질이다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 효소이다. 특정 실시 양태에서, 효소는 프로테아제, 셀룰라아제, 풀룰라나아제, 아밀라아제, 카르보하이드라아제, 리파아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 키나아제, 및 포스파타아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 프로테아제이다. 특정 실시 양태에서, 프로테아제는 서브틸리신이다. 특정 실시 양태에서, 서브틸리신은 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147, 서브틸리신 309, 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시 양태에서, 본 방법은 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 상기 관심 대상의 단백질이 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포에 의해 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 방법은 상기 관심 대상의 단백질의 회수 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 측면은 상기에 개시된 방법에 의해 생성되는 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 포함한다.
도 1은 kinA (ΔkinA) 결실의 유전자 지도를 나타낸다.
도 2a는 AmyE를 발현하는 변경된 (ΔkinA) 비. 서브틸리스 세포 및 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다.
도 2b는 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포 및 변경된 (ΔkinA) 비. 서브틸리스 세포로부터의 AmyE 발현의 그래프를 나타낸다.
도 3a는 FNA를 발현하는 변경된 (ΔkinA) 비. 서브틸리스 세포 및 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다.
도 3b는 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포 및 변경된 (ΔkinA) 비. 서브틸리스 세포로부터의 FNA 발현의 그래프를 나타낸다.
도 4a는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP)을 발현하는 변경된 (ΔkinA) 비. 서브틸리스 세포 및 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다.
도 4b는 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포 및 변경된 (ΔkinA) 비. 서브틸리스 세포로부터의 GFP 발현의 그래프를 나타낸다.
도 5는 바실루스 세포에서 포자 형성 개시를 조절하는 포스포릴레이 경로의 개략도를 나타낸다. 하나 이상의 키나아제의 자가-포스포릴화가 특정 기아 신호(starvation signal)에 의해 트리거링되고(triggered), 이어서 Spo0F, Spo0B 및 Spo0A 단백질이 순차적으로 포스포릴화된다. Spo0A-P는 포자 형성 캐스케이드(cascade)의 활성화를 제어한다. 키나아제 (예를 들어, kinA, kinB, KinC, kinD, kinE) 및 포스파타아제 (예를 들어, RapA, RapB, RapE)는 유전자명으로 표시된다. 화살표는 표적 유전자의 발현에 대한 제어 또는 포스포릴화와 같은 긍정적인 효과를 나타내는 반면, 블런트-페이스 라인(blunt-face line)은 유전자 발현의 억제 또는 탈포스포릴화와 같은 부정적인 영향을 나타낸다. 예를 들어, 키나아제 KinA는 Spo0F 포스파타아제를 포스포릴화하고, 이는 포스포릴 기를 Spo0B, 그리고 그 후 Spo0A로 이전시키는 한편, 전사 조절자 AbrB는 spo0H (sigH) 발현 및 그 결과, spo0A 발현을 저해한다.
도 6은 phrA 결실의 유전적 구성물을 나타낸다.
도 7은 phrE 결실의 유전적 구성물을 나타낸다.
도 8a는 GFP를 발현하는 변경된 비. 서브틸리스 세포 (즉, 변경된 비. 서브틸리스 세포는 phrA 및 phrE 유전자 둘 모두의 결실을 포함함; 본원에서 ΔphrA/ΔphrE) 및 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다.
도 8b는 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포 및 변경된 (ΔphrA/ΔphrE) 비. 서브틸리스 세포로부터의 GFP 발현의 그래프를 나타낸다.
도 9a는 FNA를 발현하는 변경된 (ΔphrA/ΔphrE) 비. 서브틸리스 세포 및 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다.
도 9b는 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포 및 변경된 (ΔphrA/ΔphrE) 비. 서브틸리스 세포로부터의 FNA 발현의 그래프를 나타낸다.
도 10a는 AmyE를 발현하는 변경된 (ΔphrA/ΔphrE) 비. 서브틸리스 세포 및 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다.
도 10b는 발현하는 변경된 (ΔphrA/ΔphrE ) 비. 서브틸리스 세포 및 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포로부터의 AmyE 발현의 그래프를 나타낸다.
일반적으로 본 발명은 관심 대상의 단백질(이하, “POI”)의 발현/생성을 증가시키는 유전자 변화를 갖는 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 측면은 POI의 발현을 증가시키는, 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 하나 이상의 단백질의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 유전자 변화를 포함하는 그람 양성 미생물, 예컨대 바실루스 속의 구성원을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법을 더 상세하게 설명하기 전에, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술된 특정한 실시 양태에 한정되지 않는 것으로, 예컨대 물론 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 범주는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문에, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정한 실시 양태를 기술하기 위한 것이며, 한정하고자 하는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공될 경우, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의, 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한 하한치의 단위의 십분의 일까지의, 각각의 개재값(intervening value) 및 그 진술된 범위 내의 임의의 다른 진술된 값 또는 개재값이 본 발명의 조성물 및 방법 내에 포함된다는 것이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 그 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있으며, 본 발명의 조성물 및 방법 내에 또한 포함된다 (이는 그 진술된 범위에서의 임의의 구체적으로 배제된 한계치를 조건으로 한다). 진술된 범위가 한계치들 중 하나 또는 이들 둘 모두를 포함할 경우, 그 포함된 한계치들 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두가 배제된 범위가 본 발명의 조성물 및 방법에 또한 포함된다.
본원에서 “약”이라는 용어가 선행하는 수치 값을 이용하여 특정 범위가 제시된다. 본원에서 “약”이라는 용어는 이것이 선행하는 정확한 수와, 이 용어가 선행하는 수의 근사치이거나 대략적으로 이 수인 수의 문자 그대로의 뒷받침을 제공하기 위하여 사용된다. 소정의 수가 구체적으로 인용된 수의 근사치이거나 대략적으로 이 수인지를 결정하는 데 있어서, 비인용된 수의 근사치 또는 근삿값은 이것이 제시된 문맥에서 그 구체적으로 인용된 수의 실질적으로 등가인 수를 제공하는 수일 수 있다. 예를 들어, 수치 값과 관련하여, “약”이라는 용어는 이 용어가 달리 구체적으로 문맥에서 정의되어 있지 않으면, 그 수치 값의 -10% 내지 +10%의 범위를 나타낸다. 또 다른 실시예에서, “약 6의 pH 값”이라는 어구는 그 pH 값이 구체적으로 달리 정의되지 않으면 5.4 내지 6.6의 pH 값을 나타낸다.
본원에 제공된 제목은 본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 측면 또는 실시 양태의 제한이 아닌데, 이는 전체로서 본 명세서에 대하여 참고로 있을 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 전체로서 본 명세서에 대하여 참고로 더 충분히 정의된다.
본 문서는 읽기의 용이함을 위하여 다수의 섹션으로 정리되어 있지만, 독자라면 하나의 섹션에서 이루어진 진술이 다른 섹션에 적용될 수 있음을 알 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 상이한 섹션들에 사용되는 제목은 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 테스트에서 또한 사용될 수 있지만, 이제 대표적인 예시적 방법 및 재료를 설명한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 본원에 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 본 발명의 출원일 이전의 그의 개시를 위한 것이며, 본 발명의 조성물 및 방법이 종래 발명에 의해 그러한 간행물 이후라는 자격이 주어진다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
이러한 상세한 설명에 따라, 하기 약어 및 정의가 적용된다. 단수형(“a”, “an” 및 “the”)은 그 문맥이 달리 명백하게 기술하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함함을 주지한다. 따라서, 예를 들어, “효소”의 언급은 복수형의 그러한 효소를 포함하며, “투여량”의 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 투여량 및 이의 등가물의 언급을 포함하며, 다른 것도 마찬가지이다.
청구범위는 (예를 들어, 단서와 같은) 임의의 선택적 요소를 배제하도록 초안 작성될 수 있음이 추가로 주지된다. 그와 같이, 이러한 진술은 청구항 요소의 인용, 또는 “부정적인” 제한의 이용과 관련하여 “오로지”, “단지”, “배제하는” 등과 같은 그러한 배타적 용어의 사용을 위한 선행 근거로서의 역할을 하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “~로 본질적으로 이루어진”이라는 용어는, 이 용어 앞의 성분(들)이 전체 조성물의 30 중량% 미만인 총 양의 다른 공지된 성분(들)의 존재 하에 있으며 이러한 다른 공지된 성분은 상기 용어 앞의 성분(들)의 작용 또는 활성에 기여하지 않거나 이를 간섭하지 않는 조성물을 나타낸다는 것이 추가로 주지된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “포함하는”이라는 용어는 “포함하는”이라는 용어 앞의 성분(들)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아님을 의미한다는 것이 추가로 주지된다. “포함하는”이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 의무적이지만, 이 성분(들)을 포함하는 조성물은 다른 비-의무적 또는 선택적 성분(들)을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “~으로 이루어진”이라는 용어는 “~으로 이루어진”이라는 용어 앞의 성분(들)을 포함하며 이에 한정되지 않음을 의미한다는 것이 또한 주지된다. 따라서 “~으로 이루어진”이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 의무적인 것이며, 다른 성분(들)이 조성물에 전혀 존재하지 않는다.
이 개시 내용을 읽자마자 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 개시되고 예시된 개별 실시 양태 각각은 본원에 개시된 본 발명의 조성물 및 방법의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않고서 쉽게 임의의 다른 몇몇 실시 양태의 특징으로부터 분리되거나 이와 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특징을 갖는다. 임의의 열거된 방법은 열거된 사건의 순서대로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.
정의
일반적으로 본 발명은 하나 이상의 POI를 발현하고/하거나 생성하는 능력이 증가되도록 변경되거나 변형된 그람 양성 박테리아 세포 (및 이의 제조 및 사용 방법)에 관한 것이다.
따라서, 특정 실시 양태는 포스포릴레이 경로 (예를 들어, KinA, PhrA, PhrE를 코딩하는 유전자)를 활성화시키는 기능을 하는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하는 변경된 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 예를 들어, 비. 서브틸리스에서의 포스포릴레이 경로(즉, 신호 전달 시스템)는 일반적으로 전사 인자 Spo0A를 중심으로 돌아간다고 생각된다 (문헌["Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics"; Eds. A.L.Sonenshein, J.A. Hoch, R. Losick, Am. Society of Micorbiology, 1993] 참조).
더욱 구체적으로, 포스포릴레이 신호 전달 시스템의 역할은 궁극적으로 (불활성) Spo0A 전사 인자를 Spo0A~P로 포스포릴화시키는 것으로 생각되며, 여기서, 활성 Spo0A~P 전사 인자는 포자 형성의 초기 단계에 연루된 유전자의 전사에 책임이 있다. 본 발명의 임의의 특정 이론 또는 작동 양식에 구애되고자 함이 없이, 도 5는 일반적으로 바실루스 세포에서 포자 형성 개시를 조절하는 포스포릴레이 경로의 개략도를 나타낸다. 예를 들어, 특정 키나아제 (예를 들어, KinA, KinB 등)는 환경 신호의 해석 및 이 정보의 자가-포스포릴화 키나아제 단백질 (예를 들어, KinA에서 KinA~P로)로의 전달에 연루된 것으로 생각된다. 포스포릴화된 키나아제는 그 후에 포스페이트를 Spo0F 단백질로 이전시켜 Spo0F~P를 생성하는데, 이는 포스포릴레이에서 이차 메신저(messenger)로서의 역할을 하는 것으로 생각되며, 여기서, Spo0F~P는 그의 포스페이트를 Spo0B로 이전시켜 Spo0B~P를 생성하고, 이는 그 후 포스페이트 기를 Spo0A로 이전시켜 Spo0A~P를 생성한다.
임의의 특정 이론에 구애되거나 이를 고수하고자 함이 없이, 하기에 개시된 실시예 섹션은 바실루스 세포에서 KinA 활성의 차단 또는 감소 (이는 Spo0A 전사 인자의 포스포릴화 및 활성화를 차단하거나 감소시킴)가 하나 이상의 POI의 발현을 증가시킴을 입증한다. 더욱이, 임의의 특정 이론에 구애되거나 이를 고수하고자 함이 없이, 펜타펩티드 PhrA 및 펜타펩티드 PhrE (도 5 참조)는 각각 RapA 및 RapE 포스파타아제의 기능을 차단하는 작용을 하고 이는 KinA에 의해 활성화되는 포스포릴레이 경로를 탈억제한다. 실시예 섹션에서 입증되는 바와 같이, 바실루스 세포에서 Rap 포스파타아제에 대한 PhrA 및/또는 PhrE의 저해 활성의 차단은 POI의 발현을 증가시킨다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “변경된 세포”, “변형된 세포”, “변경된 박테리아 세포”, “변형된 박테리아 세포”, “변경된 숙주 세포” 또는 “변형된 숙주 세포”는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 기능을 하는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하는 재조합 그람 양성 박테리아 세포를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 “변경된” 그람 양성 박테리아 세포는 모 박테리아 세포로부터 유래되는 “변경된 세포”로서 추가로 정의될 수 있으며, 여기서, 변경된 (딸) 세포는 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 기능을 하는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, “비변경된 세포”, “비변형된 세포”, “비변경된 박테리아 세포”, “비변형된 박테리아 세포”, “비변경된 숙주 세포” 또는 “비변형된 숙주 세포”는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 기능을 하는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 상기 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하지 않는 “비변경된” ‘모’ 그람 양성 박테리아 세포를 나타낼 수 있다. 특정 실시 양태에서, 비변경된 (모) 그람 양성 박테리아 세포는 “대조 세포” 또는 비변경된 (모) 그람 양성 박테리아 “대조” 세포로 칭해진다.
예를 들어, 본 발명의 특정 실시 양태는 증가된 양의 POI를 발현하는 “변경된” 그람 양성 박테리아 (딸) 세포에 관한 것이며, 여기서, POI의 증가된 양은 “비변경된” 그람 양성 박테리아 (모) 세포(즉, 비변경된 그람 양성 박테리아 “대조” 세포)에서의 상기 POI의 발현과 비교한 것이다. 따라서, 본원에서 정의되는 바와 같이, “비변경된 박테리아 세포(들)”, “비변경된 그람 양성 박테리아 세포(들)”, “비변경된 그람 양성 박테리아 ‘대조' 세포(들)” 등의 용어 또는 어구가 본 발명의 상기 하나 이상의 “변경된 박테리아 세포”와의 비교 맥락에서 사용될 때, 변경된 (딸) 세포 및 비변경된 모 (대조) 세포 둘 모두는 본질적으로 동일한 조건 및 배지 하에 성장/배양됨이 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “숙주” 세포는 새롭게 도입된 DNA 서열을 위한 숙주 또는 발현 비히클로서 작용하는 능력을 갖는 “그람 양성 박테리아 세포”를 나타낸다.
본 발명의 특정 실시 양태에서, 숙주 세포는 바실루스 속의 구성원이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “바실루스 속” 또는 “바실루스 sp.”는 당업자에게 공지된 바와 같이 “바실루스” 속 내의 모든 종을 포함하며, 이는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 소노렌시스, 비. 할로두란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 파불리, 비. 세레우스, 비. 아가라드하에렌스, 비. 아키바이, 비. 클라르키이, 비. 슈도피르무스, 비. 레헨시스, 비. 메가테륨, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 깁소니이, 및 비. 튜린기엔시스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
바실루스 속은 분류학적 재편성을 계속 겪고 있음이 인정된다. 따라서, 상기 속은 현재 “게오바실루스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus)”로 명명된 비. 스테아로서모필루스와 같은 유기체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 재분류된 종을 포함하는 것으로 의도된다. 산소의 존재 하에서의 저항성 내생포자의 생성은 바실루스 속의 정의적 특징으로 간주되지만, 이러한 특성은 현재 명명된 알리시클로바실루스(Alicyclobacillus), 암피바실루스(Amphibacillus), 아네우리니바실루스(Aneurinibacillus), 아녹시바실루스(Anoxybacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus), 필로바실루스(Filobacillus), 그라실리바실루스(Gracilibacillus), 할로바실루스(Halobacillus), 파에니바실루스(Paenibacillus), 살리바실루스(Salibacillus), 서모바실루스(Thermobacillus), 우레이바실루스(Ureibacillus), 및 비르기바실루스(Virgibacillus)에도 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “핵산”은 센스 가닥을 나타내든지 안티센스 가닥을 나타내든지 간에, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, 및 RNA뿐만 아니라 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 단편 또는 일부도 나타낸다. 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 다수의 뉴클레오티드 서열이 주어진 단백질을 코딩할 수 있음이 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “벡터”라는 용어는 세포에서 복제될 수 있고 새로운 유전자 또는 DNA(폴리뉴클레오티드) 절편을 세포 내로 데려갈 수 있는 임의의 핵산을 나타낸다. 따라서, 상기 용어는 상이한 숙주 세포들 사이에서의 이전용으로 설계된 핵산 구성물을 나타낸다. “발현 벡터”는 외래 세포에서 이종성 DNA 단편을 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 나타낸다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 구매가능하다. “표적화 벡터”는 이것이 형질전환시키는 숙주 세포의 염색체 내의 영역에 상동성이고 그 영역에서 상동 재조합을 구동시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다. 표적화 벡터는 상동 재조합을 통하여 세포의 염색체 내에 돌연변이를 도입하는 데 있어서 그 용도가 발견된다. 일부 실시 양태에서, 표적화 벡터는 예를 들어 말단에 부가된 다른 비-상동성 서열(즉, 스터퍼(stuffer) 서열 또는 측면(flanking) 서열)을 포함한다. 말단들은 표적화 벡터가 예를 들어 벡터 내로의 삽입과 같이 폐쇄된 원을 형성하도록 폐쇄될 수 있다. 적절한 벡터(들)의 선택 및/또는 구성은 당업자의 지식 내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “플라스미드”라는 용어는 클로닝 벡터로서 사용되는, 그리고 많은 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 염색체외 자가-복제 유전 요소를 형성하는 원형 이중 가닥(ds) DNA 구성물을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 플라스미드는 숙주 세포의 게놈 내로 포함되게 된다.
“정제된” 또는 “단리된” 또는 “풍부화된”은 생체분자 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 자연에서 이것이 결부되어 있는 천연 발생 구성 성분의 일부 또는 이들 전부로부터 이를 분리함에 의해 그의 자연 상태로부터 변경됨을 의미한다. 그러한 단리 또는 정제는 최종 조성물에서 요망되지 않는 전 세포, 세포 잔사, 불순물, 외부 단백질 또는 효소를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테아제 처리, 황산암모늄 침전 또는 기타 단백질 염 침전, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 미세여과, 겔 전기영동 또는 구배에서의 분리와 같은 본 기술 분야에서 인정된 분리 기술에 의해 성취될 수 있다. 그 후 추가 이득을 제공하는 구성 성분, 예를 들어 활성화제, 항-저해제, 바람직한 이온, pH를 제어하기 위한 화합물 또는 기타 효소 또는 화학물질을 정제되거나 단리된 생체분자 조성물에 첨가하는 것이 추가로 가능하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 관심 대상의 생체분자 (예를 들어, 관심 대상의 단백질)의 발현을 언급할 때 “증가된”, “향상된” 및 “개선된”이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되어 생체분자의 발현(즉, 변경된 세포에서의 것)이 본질적으로 동일한 성장 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경된 (모) 세포에서의 발현 수준보다 더 높음을 나타낸다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 유전자 서열, ORF 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 “발현” 또는 “발현된”이라는 용어는 그 유전자, ORF 또는 폴리뉴클레오티드의 전사와, 적절할 경우, 생성된 mRNA 전사체의 단백질로의 번역을 나타낸다. 따라서, 문맥으로부터 명백한 바와 같이, 단백질의 발현은 오픈 리딩 프레임 서열의 전사 및 번역에서 생긴다. 숙주 미생물에서의 요망되는 생성물의 발현 수준은 숙주에 존재하는 상응하는 mRNA의 양, 또는 선택된 서열에 의해 코딩되는 요망되는 생성물의 양을 기반으로 하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 PCR에 의해 또는 노던(northern) 혼성화에 의해 정량화될 수 있다 (문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조). 선택된 서열에 의해 코딩되는 단백질은 다양한 방법에 의해 (예를 들어, ELISA에 의해, 단백질의 생물학적 활성의 분석에 의해, 또는 그 단백질을 인식하여 이에 결합하여 반응하는 항체를 사용한, 웨스턴(western) 블로팅 또는 방사면역측정법과 같은, 그러한 활성과는 관계없는 분석법의 이용에 의해) 정량화될 수 있다. “유전자 (또는 이의 폴리뉴클레오티드)의 맥락에서 “발현”이라는 용어는 단백질이 그 유전자 (또는 이의 폴리뉴클레오티드)의 핵산 서열을 기반으로 하여 생성되는 과정이며, 따라서 전사 및 번역 둘 모두를 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF), 또는 이의 유전자, 또는 이의 벡터를 “박테리아 세포 내로 도입하는”과 같은 어구에서 사용되는 바와 같이, “도입하는”이라는 용어는 원형질체 융합, 형질전환 (예를 들어, 염화칼슘법, 전기천공법), 형질도입, 형질감염, 콘쥬게이션(conjugation) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 본 기술 분야에 공지된 방법을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Ferrari et al., “Genetics,” in Hardwood et al, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72, 1989] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, “형질전환된” 및 “안정하게 형질전환된”이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 개입에 의해 도입된 세포를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈 내에 통합될 수 있거나 적어도 두 세대 동안 유지되는 에피좀 플라스미드로서 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “선발가능 마커” 또는 “선발 마커”라는 용어는 숙주 세포에서 발현이 가능한 핵산 (예를 들어, 유전자)으로서 그 핵산을 포함하는 숙주의 용이한 선발을 허용하는 핵산을 나타낸다. 그러한 선발가능 마커의 예는 항미생물제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, “선발가능 마커”라는 용어는 숙주 세포가 관심 대상의 유입 DNA를 흡수했거나 일부 다른 반응이 일어났다는 표시를 제공하는 유전자를 나타낸다. 전형적으로, 선발가능 마커는 외인성 DNA를 포함하는 세포와 형질전환 동안 어떠한 외인성 서열도 받지 않은 세포의 구별을 허용하기 위하여 숙주 세포에 항미생물적 내성 또는 대사적 이점을 부여하는 유전자이다. 본 발명에 따른 유용한 다른 마커는 영양요구성 마커, 예컨대 트립토판; 및 검출 마커, 예컨대 β-갈락토시다아제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “프로모터”라는 용어는 하류 유전자의 전사를 지시하는 기능을 하는 핵산 서열을 나타낸다. 실시 양태들에서, 프로모터는 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적절하다. 프로모터는, 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열 (“제어 서열”로도 칭해짐)과 함께, 주어진 유전자의 발현에 필요하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성인자(activator) 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적으로 부착된” 또는 “작동가능하게 연결된”은 공지되거나 요망되는 활성을 갖는 조절 영역 또는 기능성 도메인, 예컨대 프로모터, 종결자, 신호 서열 또는 인핸서 영역은 조절 영역 또는 기능성 도메인이 그의 공지되거나 요망되는 활성에 따라 표적 (예를 들어, 유전자 또는 폴리펩티드)의 발현, 분비 또는 기능을 제어하도록 하는 것과 같은 방식으로 그 표적에 부착되거나 연결됨을 의미한다.
“유전자 변화”라는 용어는, 재조합 세포 (예를 들어, “변경된” 그람 양성 박테리아 세포)를 설명하기 위하여 사용될 때, 그 세포가 모 세포와 비교하여 적어도 하나의 유전적 차이를 가짐을 의미한다. 상기 하나 이상의 유전자 변화는 염색체 돌연변이 (예를 들어, 염색체 영역의 삽입, 결실, 치환, 역위(inversion), 또 다른 것에 의한 대체 (예를 들어, 이종 프로모터에 의한 염색체 프로모터의 대체) 등) 및/또는 염색체외(extra-chromosomal) 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 플라스미드)의 도입일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 염색체외 폴리뉴클레오티드는 안정한 형질감염체(transfectant)/형질전환체를 생성하도록 숙주 세포의 염색체 내에 통합될 수 있다. 본 발명의 실시 양태는 KinA, PhrA, 및/또는 PhrE 단백질의 발현 또는 활성을 (전사에 의해, 번역에 의해, 또는 단백질 그 자신의 활성을 예를 들어 아미노산 서열의 돌연변이에 의해 감소시킴으로써) 감소시키는 유전자 변화를 포함한다. 본원에 상술된 바와 같이, 그러한 변화는 관심 대상의 단백질의 발현을 개선시킨다.
유전자의 “불활성화”는 유전자의 발현 또는 그의 코딩된 단백질의 활성이 차단되거나 달리 그의 공지된 기능을 발휘할 수 없음을 의미한다. 유전자의 불활성화는 임의의 적합한 수단을 통하여, 예를 들어 상기에 기술된 바와 같이 유전자 변화를 통하여 수행될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 불활성화된 유전자의 발현 생성물은 그 단백질의 생물학적 활성에 있어서의 상응하는 변화를 갖는 절두형(truncated) 단백질이다. 일부 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 하나 이상의 유전자의 불활성화를 포함하며, 상기 불활성화는 안정한 비-복귀 불활성화로 이어진다.
일부 실시 양태에서, 유전자 불활성화는 결실에 의해 달성된다. 일부 실시 양태에서, 결실에 대하여 표적화된 영역 (예를 들어, 유전자)은 상동 재조합에 의해 결실된다. 예를 들어, 결실에 대하여 표적화되는 영역에 대하여 상동성인 서열들 (여기서, 상기 서열들은 본원에서 “상동성 박스(homology box)”로서 칭해질 수 있음)이 양측에 있는 선발 마커를 갖는 유입 서열을 포함하는 DNA 구성물이 사용된다. DNA 구성물은 숙주 염색체의 상동 서열에 맞추어 정렬되며, 이중 교차 사건(double crossover event)에서 결실에 대한 표적화된 영역은 숙주 세포 염색체에서 절단된다.
“삽입” 또는 “부가”는 천연 발생 서열 또는 모 서열과 비교하여, 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 부가된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “치환”은 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 상이한 뉴클레오티드 또는 아미노산으로 대체하여 생긴다.
유전자를 돌연변이시키는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 부위 지정 돌연변이(site-directed mutation), 랜덤 돌연변이의 생성, 및 갭 형성 이중가닥 접근법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, 미국 특허 제4,760,025호; 문헌[Moring et al., Biotech. 2:646 [1984]]; 및 문헌[Kramer et al., Nucleic Acids Res., 12:9441 [1984]] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 유전자”는, 상이하지만 일반적으로 관련된 종으로부터의 유전자쌍을 나타내며, 이는 서로에게 상응하고 서로 동일하거나 매우 유사하다. 상기 용어는 유전자 중복(genetic duplication)에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 유사 유전자(paralogous gene))뿐만 아니라 종분화(speciation)(즉, 새로운 종의 발생)에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 이종상동성 유전자(orthologous gene))도 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “오르소로그(ortholog)” 및 “이종상동성 유전자”는 종분화에 의해 공통 조상 유전자(즉, 상동 유전자)로부터 진화된 상이한 종에서의 유전자를 나타낸다. 전형적으로, 오르소로그는 진화 과정 동안 동일 기능을 유지한다. 오르소로그의 확인은 새롭게 서열결정된 게놈에서의 유전자 기능의 신뢰가능한 예측에서 그 용도가 발견된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “파라로그(paralog)” 및 “유사 유전자”는 게놈 내에서의 중복에 의해 연관된 유전자를 나타낸다. 오르소로그는 진화 과정 내내 동일한 기능을 유지하지만, 파라로그에서는, 심지어 일부 기능이 흔히 원래의 것에 연관된다 해도, 새로운 기능이 발달된다. 유사 유전자의 예는 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 및 트롬빈 (이들 전부는 세린 프로테이나아제이며, 동일 종 내에서 함께 나타남)을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “상동성”은 서열 유사성 또는 동일성을 나타내며, 이때 동일성이 바람직하다. 이러한 상동성은 본 기술 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 결정된다 (예를 들어, 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]]; 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]]; 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]]; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 문헌[Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, “상사(analogous) 서열”은 유전자의 기능이 바실루스 서브틸리스 주 168로부터의 표기된 유전자와 본질적으로 동일한 것이다. 부가적으로, 상사 유전자는 바실루스 서브틸리스 주 168 유전자의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 다르게는, 상사 서열은 비. 서브틸리스 168 영역에서 발견되는 유전자의 70 내지 100%에 정렬되고/되거나 비. 서브틸리스 168 염색체에서의 유전자와 정렬되는 영역에서 발견되는 적어도 5 내지 10개의 유전자를 갖는다. 추가의 실시 양태에서, 상기 특성들 중 하나 초과의 특성이 서열에 적용된다. 상사 서열은 공지된 서열 정렬 방법에 의해 결정된다. 일반적으로 사용되는 정렬 방법으로는 BLAST가 있지만, 상기 및 하기에 나타낸 바와 같이, 서열들의 정렬에서 그 용도가 또한 발견되는 다른 방법이 있다.
유용한 알고리즘의 하나의 예로는 PILEUP이 있다. PILEUP은 진행식 쌍정렬(pairwise alignment)을 이용하여 관련 서열들의 군으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 이것은 또한 정렬을 생성하는 데 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 나타내는 트리(tree)를 나타낼 수 있다. PILEUP은 펭(Feng) 및 둘리틀(Doolittle)의 진행식 정렬 방법의 단순화를 이용한다 (문헌[Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]]). 상기 방법은 히긴스(Higgins) 및 샤프(Sharp)에 의해 설명된 것과 유사하다 (문헌[Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]]). 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 가중치, 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 가중 말단 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 또 다른 예로는 알츠슐(Altschul) 등에 의해 설명된 BLAST 알고리즘이 있다 (문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]]; 및 문헌[Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]]). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (문헌[Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996]] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 확인된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "서열 동일성 퍼센트(%)”는 관심 대상의 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의되며, 이는 상기 서열들을 정렬하고 갭을 도입하여 (필요할 경우) 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고서 정의된다.
“상동체” (또는 “호모로그(homolog)”)는 당해 아미노산 서열 및 당해 뉴클레오티드 서열과 특정한 정도의 동일성을 갖는 엔티티(entity)를 의미한다. 상동 서열은 통상적인 서열 정렬 툴(tool) (예를 들어, Clustal, BLAST 등)을 이용할 경우 당해 서열에 대하여 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상동체는 달리 특정되지 않으면 당해 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 잔기를 포함한다.
서열 정렬 수행 방법 및 서열 동일성 결정 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 과도한 실험 없이 수행될 수 있고, 동일성 값의 계산은 명확함을 가지고서 얻어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)]; 및 ALIGN 프로그램 (문헌[Dayhoff (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.)]을 참조한다. 다수의 알고리즘이 서열 정렬 및 서열 동일성 결정에 이용가능하며, 이는 예를 들어 문헌[Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌[Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]의 국부 상동성 알고리즘; 문헌[Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444]의 유사성 검색 방법; 스미스(Smith)-워터맨(Waterman) 알고리즘 (문헌[Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)]; 및 BLASTP, BLASTN, 및 BLASTX 알고리즘 (문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 참조)을 포함한다.
이러한 알고리즘을 이용한 전산화 프로그램이 또한 이용가능하며, 이는 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어, 또는 WU-BLAST-2 (문헌[Altschul et al., Meth . Enzym ., 266:460-480 (1996)]); 또는 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹(GCG)의 패키지, 버전 8에서 이용가능한 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA; 및 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 인텔리제네틱스(Intelligenetics)에 의한 PC/Gene 프로그램에서의 CLUSTAL. 당업자라면, 비교되는 서열들의 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘을 포함하여 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “혼성화”라는 용어는 본 기술 분야에 공지된 바와 같이 핵산의 한 가닥이 염기쌍 형성을 통하여 상보성 가닥과 연결되는 과정을 나타낸다.
핵산 서열은 두 서열이 중간 정도의 엄격도 내지 고 엄격도의 혼성화 및 세척 조건 하에서 서로에게 특이적으로 혼성화될 경우 기준 핵산 서열에 “선택적으로 혼성화가능”한 것으로 간주된다. 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도(Tm)를 기반으로 한다. 예를 들어, “최대 엄격도”는 전형적으로 대략 Tm-5℃ (프로브의 Tm보다 5° 아래)에서 나타나며; “고 엄격도”는 Tm보다 대략 5 내지 10℃ 아래에서 나타나며; “중간 엄격도”는 프로브의 Tm보다 대략 10 내지 20℃ 아래에서 나타나며; “저 엄격도”는 Tm보다 대략 20 내지 25℃ 아래에서 나타난다. 기능적으로, 최대 엄격도 조건은 혼성화 프로브와 엄격한 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 갖는 서열을 확인하는 데 사용될 수 있는 반면, 중간 또는 저 엄격도 혼성화는 폴리뉴클레오티드 서열 상동체를 확인하거나 검출하는 데 사용될 수 있다.
중간 정도의 엄격도의 혼성화 조건 및 고 엄격도 혼성화 조건은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 고 엄격도 조건의 예는 약 42℃에서의 50% 포름아미드, 5X SSC, 5X 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 100 μg/ml의 변성 캐리어(carrier) DNA에서의 혼성화, 이어서 실온에서의 2X SSC 및 0.5% SDS에서의 2회의 세척 및 42℃에서의 0.1X SSC 및 0.5% SDS에서의 추가의 2회의 세척을 포함한다. 중간 정도의 엄격도의 조건의 예는 37℃에서의, 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성 분쇄(sheared) 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서의 하룻밤 인큐베이션, 이어서 약 37 내지 50℃에서의 1x SSC에서의 필터의 세척을 포함한다. 당업자라면 인자, 예컨대 프로브 등을 수용하기 위하여 필요할 경우 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알고 있다.
“재조합”이라는 용어는, 생물학적 성분 또는 조성물 (예를 들어, 세포, 핵산, 폴리펩티드/효소, 벡터 등)과 관련하여 사용될 때, 생물학적 성분 또는 조성물이 자연에서는 발견되지 않는 상태로 있음을 나타낸다. 환언하면, 생물학적 성분 또는 조성물은 인간 개입에 의해 그의 자연 상태로부터 변형되었다. 예를 들어, 재조합 세포는 그의 천연 모(즉, 비-재조합) 세포에서는 발견되지 않는 하나 이상의 유전자를 발현하는 세포, 하나 이상의 천연 유전자를 그의 천연 모 세포와는 상이한 양으로 발현하는 세포, 및/또는 하나 이상의 천연 유전자를 그의 천연 모 세포와는 상이한 조건 하에 발현하는 세포를 포함한다. 재조합 핵산은 천연 서열과 하나 이상의 뉴클레오티드만큼 상이할 수 있고/있거나 이종성 서열 (예를 들어, 이종성 프로모터, 비-천연 또는 변이형 신호 서열을 코딩하는 서열 등)에 작동가능하게 연결될 수 있고/있거나, 인트론 서열이 없을 수 있고/있거나 단리된 형태로 존재할 수 있다. 재조합 폴리펩티드/효소는 천연 서열과는 하나 이상의 아미노산만큼 상이할 수 있고/있거나, 이종성 서열과 융합될 수 있고/있거나, 절두되거나 아미노산의 내부 결실을 가질 수 있고/있거나, 천연 세포에서는 발견되지 않는 방식으로 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터의 세포에서의 존재로 인하여 폴리펩티드를 과다발현하는 재조합 세포로부터) 발현될 수 있고/있거나 단리된 형태로 있을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드/효소는 그의 야생형 대응물과 동일하지만 비-천연 형태로 (예를 들어, 단리되거나 풍부화된 형태로) 존재하는 서열을 갖는다는 것이 강조된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “표적 서열”이라는 용어는 유입 서열이 숙주 세포 게놈 내에 삽입되는 것이 요망될 경우 당해 서열을 코딩하는 숙주 세포에서의 DNA 서열을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열은 기능성 야생형 유전자 또는 오페론을 코딩하는 반면, 다른 실시 양태에서, 표적 서열은 기능성 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비-기능성 유전자 또는 오페론을 코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “측면 서열”은 논의되고 있는 서열의 상류 또는 하류에 있는 임의의 서열을 나타낸다 (예를 들어, 유전자 A-B-C의 경우, 유전자 B의 측면에 A 및 C 유전자 서열이 있다). 일 실시 양태에서, 유입 서열에는 양측에 상동성 박스가 있다. 또 다른 실시 양태에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 양측에 스터퍼 서열이 있는 단위를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 측면 서열은 단지 한 측면에 (3’ 또는 5’에) 존재하지만, 실시 양태들에서 이것은 측면에 있게 되는 서열의 양측에 있다. 각각의 상동성 박스의 서열은 바실루스 염색체에서의 서열에 대하여 상동성을 갖는다. 이러한 서열은 바실루스 염색체에서 새로운 구성물이 통합되게 되는 장소 및 바실루스 염색체의 어떤 부분이 유입 서열에 의해 대체될 것인지를 지시한다. 일 실시 양태에서, 선발 마커의 5’ 및 3’ 말단의 측면에는 불활성화 염색체 절편의 섹션을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 있다. 일부 실시 양태에서, 측면 서열은 단지 한 측면에 (3’ 또는 5’에) 존재하지만, 실시 양태들에서 이것은 측면에 있게 되는 서열의 양측에 존재한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “증폭가능한 마커”, “증폭가능한 유전자” 및 “증폭 벡터”라는 용어는 적절한 성장 조건 하에 유전자의 증폭을 가능케 하는, 유전자를 코딩하는 벡터 또는 유전자를 나타낸다.
“주형 특이성”은 효소의 선택에 의해 대부분의 증폭 기술에서 달성된다. 증폭 효소는 이것이 사용되는 조건 하에서 핵산의 이종성 혼합물 중 핵산의 단지 특정 서열을 프로세싱하는 효소이다. 예를 들어, Qβ 레플리카아제의 경우, MDV-1 RNA는 이 레플리카아제의 특이적 주형이다 (예를 들어, 문헌[Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972]] 참조). 다른 핵산은 이 증폭 효소에 의해 복제되지 않는다. 이와 유사하게, T7 RNA 폴리머라아제의 경우, 이 증폭 효소는 그 자신의 프로모터에 대하여 엄격한 특이성을 갖는다 (문헌[Chamberlin et al., Nature 228:227 [1970]] 참조). T4 DNA 라이가아제의 경우, 이 효소는 두 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 라이게이션시키지 않으며, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 기질과 주형 사이에는 라이게이션 연결부에 미스매치가 있다 (문헌[Wu and Wallace, Genomics 4:560 [1989]]). 마지막으로, Taq 및 Pfu 폴리머라아제는, 고온에서 기능하는 그의 능력 덕분에, 결합되는 그리고 이에 따라 프라이머에 의해 규정되는 서열들에 대하여 높은 특이성을 나타내는 것으로 밝혀져 있으며; 고온은 프라이머의 표적 서열과의 혼성화를 유리하게 하고 비-표적 서열과의 혼성화는 그렇게 하지 않는 열역학적 조건으로 이어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “증폭가능한 핵산”이라는 용어는 임의의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산을 나타낸다. “증폭가능한 핵산”은 일반적으로 “샘플 주형”을 포함할 것으로 사료된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “샘플 주형”이라는 용어는 “표적” (하기에 정의됨)의 존재에 대하여 분석되는 샘플로부터 기원하는 핵산을 나타낸다. 이와는 대조적으로, “배경 주형”은 샘플에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 샘플 주형 이외의 핵산과 관련하여 사용된다. 배경 주형은 가장 흔히는 우연한 것이다. 이것은 이월(carryover)의 결과일 수 있거나, 이것은 샘플로부터 정제해 내고자 하는 핵산 오염물의 존재로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 검출할 것 이외의 유기체로부터의 핵산이 테스트 샘플에서 배경으로 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “프라이머”라는 용어는 정제된 제한효소 절단물에서와 같이 천연 발생적이든지 합성에 의해 생성된 것이든지 간에, 핵산 가닥에 상보성인 프라이머 신장 생성물의 합성이 유도되는 조건 하에 (즉, 뉴클레오티드 및 유도 에이전트(agent), 예컨대 DNA 폴리머라아제의 존재 하에 그리고 적합한 온도 및 pH에서) 두었을 때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 프라이머는 바람직하게는 증폭에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥일 경우, 프라이머는 신장 생성물의 제조에 사용되기 전에 먼저 그의 가닥들이 분리되도록 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도 에이전트의 존재 하에 신장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 소스(source) 및 방법의 용도를 포함하는 많은 인자에 의존할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “프로브”라는 용어는, 정제된 제한효소 절단물에서와 같이 천연 발생적이든지 합성에 의해, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되든지 간에, 관심 대상의 또 다른 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드들의 시퀀스(sequence))를 나타낸다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정한 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에서 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 프로브는 효소 (예를 들어, ELISA와, 효소-기반 조직화학 분석법), 형광, 방사성, 및 발광 시스템을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 검출 시스템에서 검출가능해지도록 임의의 “리포터(reporter) 분자”로 표지될 것으로 사료된다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지체에 한정되는 것으로 의도되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “표적”이라는 용어는, 폴리머라아제 연쇄 반응과 관련하여 사용될 때, 폴리머라아제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머가 결합하는 핵산 영역을 나타낸다. 따라서, “표적”을 다른 핵산 서열과 구분하고자 한다. “절편”은 표적 서열 내의 핵산 영역으로 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “폴리머라아제 연쇄 반응” (“PCR”)이라는 용어는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,683,195호, 미국 특허 제4,683,202호 및 미국 특허 제4,965,188호의 방법을 나타내며, 이는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA의 혼합물 중 표적 서열의 절편의 농도를 증가시키는 방법을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “증폭 시약”이라는 용어는 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고서 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액 등)을 나타낸다. 전형적으로, 증폭 시약은 다른 반응 성분과 함께 반응 용기 (테스트 튜브, 마이크로웰 등) 내에 두어지고 담긴다.
PCR을 이용하여, 몇몇 상이한 방법 (예를 들어, 표지된 프로브를 이용한 혼성화; 바이오티닐화(biotinylated) 프라이머의 혼입, 이어서 아비딘-효소 콘쥬게이트 검출; 32P-표지된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 예컨대 dCTP 또는 dATP의 증폭 절편 내로의 혼입)에 의해 게놈 DNA 내의 특정 표적 서열의 단일 카피를 검출가능한 수준까지 증폭시키는 것이 가능하다. 게놈 DNA에 더하여, 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 적절한 프라이머 분자 세트를 이용하여 증폭될 수 있다. 특히, PCR 과정 그 자체에 의해 생성된 증폭 절편 그 자체는 후속적인 PCR 증폭을 위한 효율적인 주형이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “PCR 생성물”, “PCR 단편” 및 “증폭 생성물”이라는 용어는 변성, 어닐링 및 신장의 PCR 단계의 2회 이상의 사이클이 완료된 후 화합물들의 생성된 혼합물을 나타낸다. 이러한 용어는 하나 이상의 표적 서열의 하나 이상의 절편의 증폭이 있었던 경우를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "RT-PCR"이라는 용어는 RNA 서열의 복제 및 증폭을 나타낸다. 이 방법에서, 가장 흔히는 열안정성 폴리머라아제가 이용되는 하나의 효소의 절차를 이용하여 역전사가 PCR에 커플링되며, 이는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,322,770호에 기술된 바와 같다. RT-PCR에서, RNA 주형은 폴리머라아제의 역전사효소 활성으로 인하여 cDNA로 전환되며, 그 후 폴리머라아제의 중합 활성을 이용하여 증폭된다(즉, 다른 PCR 방법에서와 같이).
본원에서 사용되는 바와 같이, “염색체 통합”이라는 용어는 유입 서열이 숙주 세포 (예를 들어, 바실루스)의 염색체 내에 도입되는 과정을 나타낸다. 형질전환 DNA의 상동성 영역들은 염색체의 상동성 영역들에 맞추어 정렬된다. 후속적으로, 상동성 박스들 사이의 서열은 이중 교차(즉, 상동 재조합)에서 유입 서열에 의해 대체된다. 본 발명의 일부 실시 양태에서, DNA 구성물의 불활성화 염색체 절편의 상동성 섹션들은 바실루스 염색체의 고유 염색체 영역의 측면 상동성 영역들에 맞추어 정렬된다. 후속적으로, 고유 염색체 영역은 이중 교차(즉, 상동 재조합)에서 DNA 구성물에 의해 결실된다.
“상동 재조합”은 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오티드 서열들의 부위에서의 두 DNA 분자 또는 쌍형성 염색체 사이에서의 DNA 단편의 교환을 의미한다. 일 실시 양태에서, 염색체 통합은 상동 재조합이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 서열”은 비교를 위하여 최적으로 정렬될 때 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 대하여 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%, 또는 70%의 서열 동일성을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 일부 실시 양태에서, 상동 서열들은 85% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 반면, 다른 실시 양태에서, 90% 내지 100%의 서열 동일성이 있으며, 더 많은 실시 양태에서 95% 내지 100%의 서열 동일성이 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “아미노산”은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이의 일부를 나타낸다. “단백질”, “펩티드” 및 “폴리펩티드”라는 용어는 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “관심 대상의 단백질” (POI)은 요망되고/되거나 평가 중인 단백질/폴리펩티드를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 세포내 단백질인 반면, 다른 실시 양태에서, 이것은 분비형 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 전분 분해 효소(amylolytic enzyme), 단백질 분해 효소, 셀룰로오스 분해 효소(cellulytic enzyme), 옥시도리덕타아제 효소 및 식물 세포벽 분해 효소로부터 선택되는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 효소를 포함한다. 더욱 구체적으로 이러한 효소는 아밀라아제, 프로테아제, 자일라나아제, 리파아제, 락카아제, 페놀 옥시다아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 에스테라아제, 퍼옥시다아제, 카탈라아제, 글루코스 옥시다아제, 피타아제, 펙티나아제, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 펙테이트 라이아제, 글루코시다아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 갈락토시다아제 및 키티나아제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 특정한 실시 양태에서, 관심 대상의 폴리펩티드는 프로테아제이다. 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 신호 펩티드(즉, 분비될 단백질 상의 아미노-말단 신장부)에 융합된 분비형 폴리펩티드이다. 거의 모든 분비형 단백질은 막에의 표적화 및 막을 가로지르는 전구체 단백질의 전좌에서 결정적인 역할을 하는 아미노-말단 단백질 신장부를 이용한다. 이러한 신장부는 막 이전 동안 또는 막 이전 직후 신호 펩티다아제에 의해 단백질 분해에 의해 제거된다.
본 발명의 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 폴리펩티드는 호르몬, 항체, 성장 인자, 수용체 등으로부터 선택된다. 본 발명에 포함되는 호르몬은 난포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 부신 피질 자극 호르몬 방출 인자, 소마토스타틴, 성선 자극 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 에리트로포이에틴, 인슐린 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 사이토카인, 예컨대 인터류킨 (예를 들어, IL-1 내지 IL-13), 인터페론, 콜로니 자극 인자 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체는 항체를 생성하는 것이 바람직한 임의의 종으로부터 직접적으로 수득된 면역글로불린을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 게다가, 본 발명은 변형된 항체를 포함한다. 다클론 및 단클론 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 특정한 실시 양태에서, 항체는 인간 항체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 “유도체” 또는 “변이체”는 C- 및 N-말단 중 어느 하나에의 또는 이들 둘 모두에의 하나 이상의 아미노산의 부가, 아미노산 서열에서의 하나의 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 폴리펩티드의 어느 하나의 말단 또는 양 말단에서의 또는 아미노산 서열에서의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 아미노산 서열에서의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입, 및 이들의 임의의 조합에 의해 전구체 폴리펩티드 (예를 들어, 천연 폴리펩티드)로부터 유래되는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드의 유도체 또는 변이체의 제조는 임의의 편리한 방식으로, 예를 들어, 천연 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 변형, 그 DNA 서열로 적합한 숙주를 형질전환시키는 것, 및 변형된 DNA 서열을 발현시켜 유도체형/변이체형 폴리펩티드를 형성하는 것에 의해 달성될 수 있다. 유도체 또는 변이체는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “이종 단백질”이라는 용어는 숙주 세포에서 천연적으로는 나타나지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 이종 단백질의 예는 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 카르보하이드라아제 및 리파아제를 포함하는 하이드롤라아제; 이소머라아제, 예컨대 라세마아제, 에피머라아제, 토토머라아제, 또는 뮤타아제; 트랜스퍼라아제, 키나아제 및 포스파타아제와 같은 효소를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 단백질은 백신 및 항체뿐만 아니라 성장 인자, 사이토카인, 리간드, 수용체 및 저해제도 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 치료적으로 유의한 단백질 또는 펩티드이다. 추가의 실시 양태에서, 단백질은 상업적으로 중요한 산업용 단백질/펩티드 (예를 들어, 프로테아제, 카르보하이드라아제, 예컨대 아밀라아제 및 글루코아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제 및 리파아제)이다. 일부 실시 양태에서, 단백질을 코딩하는 유전자는 천연 발생 유전자인 반면, 다른 실시 양태에서, 돌연변이 및/또는 합성 유전자가 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 단백질”은 세포에서 천연 발생되거나 천연인 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 특정 실시 양태에서, 세포는 그람 양성 세포인 한편, 다른 특정 실시 양태에서, 그람 양성 세포는 바실루스 세포이다. 대안적인 실시 양태에서, 상동 단백질은 이. 콜라이(E. coli)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다른 유기체에 의해 생성된 천연 단백질이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술을 통하여 상동 단백질을 생성하는 숙주 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “오페론”은 공통 프로모터로부터 단일 전사 단위로서 전사될 수 있고 이에 의해 공동 조절(co-regulation)되는 연접 유전자들의 군을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 오페론은 다수의 상이한 mRNA의 전사를 지시하는 다수의 프로모터를 포함할 수 있다.
상기에 개시된 바와 같이, 본 발명의 특정 실시 양태는 POI의 발현을 증가시키는 유전자 변화를 포함하는 변경된 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 측면은 변경된 그람 양성 세포, 예컨대 바실루스 속의 구성원을 포함하며, 여기서, 변경된 그람 양성 박테리아 (딸) 세포는 kinA 유전자, phrA 유전자 및/또는 phrE 유전자로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 감소시키는 유전자 변화를 포함한다. 본원에 개시되고 실시예 섹션에 추가로 기술된 바와 같이, 본 발명의 변경된 그람 양성 박테리아 세포(즉, kinA 유전자, phrA 유전자 및/또는 phrE 유전자로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 감소시키는 유전자 변화를 포함함)는, 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경된 그람 양성 박테리아 (모) 세포와 비교할 때, 하나 이상의 POI의 발현의 증가를 보여준다. 따라서, 본 발명의 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 어느 하나; kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 임의의 2가지; 또는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 3가지 전부의 발현 수준을 감소시키는 임의의 변화이다. 다른 실시 양태에서, 유전자 변화는 변경된 그람 양성 박테리아 (딸) 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 (모) 세포와 비교하여 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 하나 이상의 활성을 감소시킨다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 어느 하나; KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 임의의 2가지; 또는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 3가지 전부의 활성을 감소시키는 임의의 변화이다.
상기에 요약된 바와 같이, 본 발명의 측면은 그람 양성 박테리아 세포로부터의 POI의 발현을 증가시키는 방법을 포함하며, 이는 POI의 생성이 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 하나 이상의 유전자의 감소된 발현을 갖도록 유전자 변경된 그람 양성 (딸) 세포에서, 상응하는 비변경된 그람 양성 (모) 세포에서의 상기 POI의 생성에 비하여 증가된다는 관찰을 기반으로 한다. 상기에 개시된 바와 같이, 유전자 변화는 예를 들어 에피좀 부가 및/또는 염색체 삽입, 결실, 역위, 염기 변화 등에 의해 숙주 세포의 유전자 메이크업(make-up)을 변화시키는 숙주 세포에서의 임의의 변화로서 정의된다. 이와 관련하여 어떠한 제한도 의도되지 않는다.
특정 실시 양태에서, 모 그람 양성 세포는 하나 이상의 결함성 또는 불활성 포자 형성-개시 유전자(즉, 발현이 Spo0A에 의해 또는 Spo0A의 하류에서 제어되는 유전자)를 갖고, 따라서 모 세포는 포자가 형성되지 못하게 된다. 놀랍게도, 본 발명의 출원인은 심지어 이러한 유전적 배경(즉, 하나 이상의 결함성 또는 불활성 포자 형성-개시 유전자를 포함하는 모 그람 양성 세포)에서도, 추가의 유전자 변화 (예를 들어, kinA 유전자, phrA 유전자 및/또는 phrE 유전자로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 감소시키는 유전자 변화)가 그러한 변경된 그람 양성 박테리아 (딸) 세포에서 POI의 발현을 증가시킴을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명의 유전자 변경된 (딸) 세포에서의 단백질 발현/생성의 개선은 단지 그람 양성 세포의 포자 형성의 방지로 인한 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 변경된 그람 양성 세포가 유래되는 모 그람 양성 세포는 Spo0A에 의해 또는 시그마(Sigma) 인자인 SigF, SigG, SigE 및 SigK에 의해 조절되는 비-기능성/돌연변이된/결실된 포자 형성 유전자를 가질 수 있다 (예를 들어, 포자 형성 결함성 바실루스 세포를 이용하는 실시예 섹션을 참조).
특정 실시 양태에서, 본 발명은 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하는 변경된 그람 양성 박테리아 (딸) 세포의 생성 또는 수득 방법 (및 이의 조성물)에 관한 것이다. 다른 실시 양태에서, 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하는 변경된 변경된 그람 양성 박테리아 (딸) 세포는 관심 대상의 단백질이 변경된 그람 양성 (딸) 박테리아 세포에 의해 발현되도록 하는 조건 하에 배양될 때 증가된 양의 하나 이상의 POI를 발현하고/하거나 생성한다. 따라서, 이에 의해 POI의 발현 및/또는 생성은 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경된 그람 양성 박테리아 (모) 세포에서의 상기 POI의 발현 및/또는 생성과 비교할 때(즉, 이에 비하여) 변경된 그람 양성 박테리아 (딸) 세포에서 증가된다.
특정 실시 양태에 따르면, 유전자 변경된 그람 양성 박테리아 세포 (또는 유전자 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 생성하는 모 세포)는 바실루스 속의 구성원이다. 일부 실시 양태에서, 바실루스 세포는 호알칼리성 바실루스 세포이다. 다수의 호알칼리성 바실루스 세포가 본 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,217,878호; 및 문헌[Aunstrup et al., Proc IV IFS: Ferment. Technol. Today, 299-305 [1972]] 참조). 일부 실시 양태에서, 바실루스 세포는 산업용 관련 바실루스 세포이다. 산업용 바실루스 세포의 예는 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스(B. lentus), 비. 서브틸리스, 및 비. 아밀로리쿠에파시엔스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 실시 양태에서, 바실루스 세포는 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 푸밀루스, 비. 란투스, 비. 클라우시이, 비. 메가테륨, 또는 비. 튜린기엔시스와, 바실루스 속 내의 다른 유기체 (상기에 논의된 바와 같음)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시 양태에서, 비. 서브틸리스 세포가 사용된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,264,366호 및 미국 특허 제4,760,025호 (RE 34,606)에는 본 발명에서 그 용도가 발견되는 다양한 바실루스 숙주 세포가 기술되어 있지만, 다른 적합한 세포가 본 발명에서의 사용용으로 고려된다.
본원에 개시된 바와 같은 유전자 변경된 그람 양성 세포의 모 세포 (예를 들어, 모 바실루스 세포)는 재조합 그람 양성 세포이며, 여기서, POI를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드가 상기 세포 내로 도입되었다. POI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입이 모 세포에서 행해질 수 있지만, 이러한 단계는 또한 본원에 상술된 바와 같이 폴리펩티드 생성의 증가를 위하여 이미 유전자 변경된 세포에서 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 바실루스 서브틸리스 숙주 주, 예를 들어, 재조합 비. 서브틸리스 숙주 주이다.
본 발명의 측면에서 그 용도가 발견되는 다수의 비. 서브틸리스 주가 공지되어 있으며, 이는 1A6 (ATCC 39085), 168 (1A01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753 내지 PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39,087), ATCC 21332, ATCC 6051, MI113, DE100 (ATCC 39,094), GX4931, PBT 110, 및 PEP 211 주 (예를 들어, 문헌[Hoch et al., Genetics, 73:215-228 [1973]]; 미국 특허 제4,450,235호; 미국 특허 제4,302,544호; 및 유럽 특허 제0134048호 참조)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 발현 숙주로서의 비. 서브틸리스의 사용은 팔바(Palva) 등과 다른 이들에 의해 추가로 기술되어 있다 (문헌[Palva et al., Gene 19:81-87 [1982]] 참조; 또한 문헌[Fahnestock and Fischer, J. Bacteriol., 165:796-804 [1986]]; 및 문헌[Wang et al., Gene 69:39-47 [1988]] 참조).
특정 실시 양태에서, 산업용 프로테아제 생성 바실루스 주는 모 발현 숙주로서의 역할을 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명에서의 이러한 주의 사용은 프로테아제 생성 및 효율에 있어서의 추가의 향상을 제공한다. 2가지 일반적인 유형의 프로테아제, 즉 중성 (또는 “메탈로프로테아제”) 및 알칼리 (또는 “세린”) 프로테아제가 전형적으로 바실루스 sp.에 의해 분비된다. 세린 프로테아제는 활성 부위에 필수 세린 잔기가 있는, 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 세린 프로테아제는 25,000 내지 30,000의 범위의 분자량을 갖는다 (문헌[Priest, Bacteriol. Rev., 41:711-753 [1977]] 참조). 서브틸리신은 본 발명에서 사용하기 위한 세린 프로테아제이다. 매우 다양한 바실루스 서브틸리신, 예를 들어 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 309가 확인되었고 서열결정되었다 (예를 들어, 유럽 특허 제414279 B호; 국제 공개 제89/06279호 및 문헌[Stahl et al., J. Bacteriol., 159:811-818 [1984]] 참조). 본 발명의 일부 실시 양태에서, 바실루스 숙주 주는 돌연변이 (예를 들어, 변이체형) 프로테아제를 생성한다. 다수의 참고 문헌이 변이체형 프로테아제의 예를 제공한다 (예를 들어, 국제 공개 제99/20770호; 국제 공개 제99/20726호; 국제 공개 제99/20769호; 국제 공개 제89/06279호; RE 34,606; 미국 특허 제4,914,031호; 미국 특허 제4,980,288호; 미국 특허 제5,208,158호; 미국 특허 제5,310,675호; 미국 특허 제5,336,611호; 미국 특허 제5,399,283호; 미국 특허 제5,441,882호; 미국 특허 제5,482,849호; 미국 특허 제5,631,217호; 미국 특허 제5,665,587호; 미국 특허 제5,700,676호; 미국 특허 제5,741,694호; 미국 특허 제5,858,757호; 미국 특허 제5,880,080호; 미국 특허 제6,197,567호; 및 미국 특허 제6,218,165호 참조).
본 발명은 관심 대상의 단백질로서의 프로테아제에 한정되지 않음이 여기서 주지된다. 실제로, 본 발명은 그람 양성 세포에서의 증가된 발현이 요망되는 관심 대상의 매우 다양한 단백질 (하기에 상술됨)을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 측면에서 사용하기 위한 그람 양성 박테리아 세포는 유익한 표현형을 제공하는 다른 유전자에서의 추가의 유전자 변화를 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 유전자 중 적어도 하나에서 돌연변이 또는 결실을 포함하는 바실루스 세포가 이용될 수 있다: degU, degS, degR 및 degQ. 일부 실시 양태에서, 돌연변이는 degU 유전자 내에 있으며, 예를 들어 degU(Hy)32 돌연변이이다. (문헌[Msadek et al., J. Bacteriol., 172:824-834 [1990]]; 및 문헌[Olmos et al., Mol. Gen. Genet., 253:562-567 [1997]] 참조). 따라서, 본 발명의 측면에서 그 용도가 발견되는 모/유전자 변경 그람 양성 세포의 하나의 예로는 degU32(Hy) 돌연변이를 지닌 바실루스 서브틸리스 세포가 있다. 추가의 측면에서, 바실루스 숙주는 scoC4에서의 돌연변이 또는 결실 (문헌[Caldwell et al., J. Bacteriol., 183:7329-7340 [2001]]); spoIIE에서의 돌연변이 또는 결실 (문헌[Arigoni et al., Mol. Microbiol., 31:1407-1415 [1999]] 참조); oppA 또는 opp 오페론의 기타 유전자에서의 돌연변이 또는 결실 (문헌[Perego et al., Mol. Microbiol., 5:173-185 [1991]] 참조)을 포함할 수 있다. 실제로, oppA 유전자에서의 돌연변이와 동일한 표현형을 야기하는 opp 오페론에서의 임의의 돌연변이는 본 발명의 변경된 바실루스 세포의 일부 실시 양태에서 그 용도를 발견할 것으로 사료된다. 일부 실시 양태에서, 이러한 돌연변이는 단독으로 나타나는 한편, 다른 실시 양태에서, 돌연변이들의 조합이 존재한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 변경된 바실루스는 전술한 유전자들 중 하나 이상에 대한 돌연변이를 이미 포함하는 모 바실루스 숙주 주로부터 수득된다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 이전에 유전자 변경된 바실루스는 전술한 유전자들 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하도록 추가로 엔지니어링된다.
상기에 나타낸 바와 같이, 포스포릴레이 경로를 활성화시키는 적어도 하나의 유전자의 발현은 모 세포 (본질적으로 동일한 조건 하에 성장시킴)와 비교하여 유전자 변경된 그람 양성 세포에서 감소된다. 이러한 발현 감소는 임의의 편리한 방식으로 달성될 수 있으며, 전사 수준, mRNA 안정성, 번역에서의 것일 수 있거나, 그러한 유전자로부터 생성된 폴리펩티드들 중 하나 이상에서의 변이의 존재로 인한 것일 수 있는데 이는 그의 활성을 감소시킨다(즉, 이것은 폴리펩티드의 활성을 기반으로 할 경우 “기능적” 발현 감소이다). 이와 같이, 포자 형성-개시 유전자의 발현을 유도하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 감소시키는 방식 또는 유전자 변화의 유형의 제한은 의도되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 그람 양성 세포에서의 유전자 변화는 관심 대상의 유전자들의 프로모터들 중 하나 이상을 변경시키는 것으로서 이는 전사 활성을 감소시킨다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 하나 이상의 발현 수준을 감소시킨다. 따라서, 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 어느 하나; kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 임의의 2가지; 또는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 3가지 전부의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 다른 실시 양태에서, 유전자 변화는 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 하나 이상의 활성을 감소시킨다. 따라서, 유전자 변화는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 어느 하나; KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 임의의 2가지; 또는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 3가지 전부의 활성을 감소시킬 수 있다.
특정 실시 양태에서, 포자 형성-개시 유전자의 발현을 활성화시키기 위한 포스포릴레이 경로의 유전자의 발현은 유전자 변경된 그람 양성 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에서 배양된 야생형 및/또는 모 세포에서의 발현 수준의, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 또는 약 80%를 포함하여 약 3%까지 감소된다. 이와 같이, 포자 형성-개시 유전자의 발현을 유도하는 상기 하나 이상의 유전자의 발현 감소의 범위는 약 3% 내지 약 80%, 약 4% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 6% 내지 약 65%, 약 7% 내지 약 60%, 약 8% 내지 약 50%, 약 9% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 11% 내지 약 35%, 약 12% 내지 약 30%, 약 13% 내지 약 25%, 약 14% 내지 약 20% 등일 수 있다. 상기에 개시된 범위 내의 임의의 하위 발현 범위가 고려된다.
특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 임의의 1가지, 2가지 또는 3가지의 발현이, 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포에서의 이러한 유전자의 발현과 비교하여 감소된다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화 (또는 돌연변이)는 kinA 유전자의 발현을 감소시키는 것이다. 모 그람 양성 세포(즉, 본원에 기술된 바와 같이 유전자 변경되기 전)에서의 kinA 유전자는 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 것을 포함하여, 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 60% 동일한 유전자이다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 전부의 또는 일부분의 kinA 유전자의 결실이다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화 (또는 돌연변이)는 phrA 유전자의 발현을 감소시키는 것이다. 모 그람 양성 세포(즉, 본원에 기술된 바와 같이 유전자 변경되기 전)에서의 phrA 유전자는 서열 번호 6의 서열에 대하여 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 것을 포함하여, 서열 번호 6의 서열에 대하여 적어도 60% 동일한 유전자이다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 전부의 또는 일부분의 phrA 유전자의 결실이다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화 (또는 돌연변이)는 phrE 유전자의 발현을 감소시키는 것이다. 모 그람 양성 세포(즉, 본원에 기술된 바와 같이 유전자 변경되기 전)에서의 phrE 유전자는 서열 번호 8의 서열에 대하여 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 것을 포함하여, 서열 번호 8의 서열에 대하여 적어도 60% 동일한 유전자이다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 전부의 또는 일부분의 phrE 유전자의 결실이다.
특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 임의의 1가지, 2가지 또는 3가지의 발현이, 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포에서의 이러한 유전자의 발현과 비교하여 감소된다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화 (또는 돌연변이)는 KinA 단백질, 예를 들어, 변이형 KinA 단백질 (예를 들어, 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 가짐)의 활성을 감소시키는 것이다. 변이형 KinA 단백질은 서열 번호 2의 서열에 대하여 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화 (또는 돌연변이)는 PhrA 단백질, 예를 들어, 변이형 PhrA 단백질 (예를 들어, 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 가짐)의 활성을 감소시키는 것이다. 변이형 PhrA 단백질은 서열 번호 7의 서열에 대하여 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 유전자 변화 (또는 돌연변이)는 PhrE 단백질, 예를 들어, 변이형 PhrE 단백질 (예를 들어, 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 가짐)의 활성을 감소시키는 것이다. 변이형 PhrE 단백질은 서열 번호 9의 서열에 대하여 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 많은 상이한 단백질들은 그람 양성 세포에서 POI로서 그 용도가 발견된다(즉, 발현이 유전자 변경된 세포에서 증가된 단백질). POI는 상동 단백질 또는 이종 단백질일 수 있으며, 야생형 단백질, 천연 변이체 또는 재조합 변이체일 수 있다. 특정 실시 양태에서, POI는 효소이며, 특정 실시 양태에서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α- 글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α- 글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 특정 실시 양태에서, POI는 프로테아제이며, 여기서 프로테아제는서브틸리신, 예를 들어, 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147, 서브틸리신 309, 및 이들의 변이체로부터 선택되는 서브틸리신일 수 있다. 특정 실시 양태에서, POI는 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)이다.
특정 실시 양태에서, 이의 방법 및 조성물은 관심 대상의 단백질의 회수 단계를 추가로 포함한다. 관심 대상의 단백질의 발현/생성 수준은 (비변경된 모 세포와 비교하여) 유전자 변경된 그람 양성 (딸) 세포에서 증가되기 때문에, 회수되는 POI의 양은 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 (그리고 동일한 규모로) 배양될 때 상응하는 그람 양성 (모) 세포와 비교하여 증가된다. 세포내 및 세포외 발현 폴리펩티드의 발현 수준/생성을 검출 및 측정하기 위한 당업자에게 공지된 다양한 분석법이 있다. 그러한 분석법은 본 발명의 사용자에 의해 결정되며, POI의 아이덴티티(identity) 및/또는 활성 (예를 들어, 효소 활성)에 의존할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제의 분석에 있어서, 280 nm에서의 흡광도로서 또는 폴린법(Folin method)을 이용하여 비색법에 의해 측정되는 카제인 또는 헤모글로빈으로부터의 산-용해성 펩티드의 방출을 기반으로 하는 분석법이 있다 (예를 들어, 문헌[Bergmeyer et al., “Methods of Enzymatic Analysis” vol. 5, Peptidases, Proteinases and their Inhibitors, Verlag Chemie, Weinheim [1984]] 참조). 다른 분석법은 발색 기질(chromogenic substrate)의 가용화를 포함한다 (예를 들어, 문헌[Ward, “Proteinases, in Fogarty (ed.)., Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, London, [1983], pp 251-317] 참조). 분석법의 다른 예는 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-파라 니트로아닐리드 분석법(SAAPFpNA) 및 2,4,6-트리니트로벤젠 술포네이트 소듐 염 분석법(TNBS 분석법)을 포함한다. 당업자에게 공지된 다수의 추가의 참고 문헌은 적합한 방법을 제공한다 (예를 들어, 문헌[Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7911-7925 [1983]]; 문헌[Christianson et al., Anal. Biochem., 223:119 -129 [1994]]; 및 문헌[Hsia et al., Anal Biochem., 242:221-227 [1999]] 참조) .
또한 상기에 나타낸 바와 같이, 숙주 세포에서의 POI의 분비 수준의 결정 수단 및 발현된 단백질의 검출 수단은 관심 대상의 단백질에 특이적인 다클론 또는 단클론 항체를 이용한 면역분석법의 사용을 포함한다. 예는 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 형광 면역분석법(FIA), 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 포함한다. 그러나, 다른 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 관심 대상의 단백질의 평가에서 그 용도가 발견된다 (예를 들어, 문헌[Hampton et al., Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN [1990]]; 및 문헌[Maddox et al., J. Exp. Med., 158:1211 [1983]] 참조). 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명을 이용하여 생성된 변경된 바실루스 세포를 세포 배양물로부터의 POI의 발현 및 회수에 적합한 조건 하에 유지하고 성장시킨다 (예를 들어, 문헌[Hardwood and Cutting (eds.) Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]] 참조). 본원에 기술된 바와 같은 유전자 변경된 세포는 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 9가지 이상, 10가지 이상 등을 포함하여 1가지 초과의 POI를 발현할 수 있음이 추가로 주지된다. 일부 실시 양태에서, 박테리아 세크레톰(secretome)에서의 단백질의 증가된 발현이 요구되는데, 이는 세포로부터 분비되는 다수의 상이한 단백질들을 포함한다.
본 발명의 측면은 개선된 단백질 생성 능력을 갖는 변경된 그람 양성 박테리아 세포의 수득 방법을 포함한다. 일반적으로, 본 방법은 (상기에 정의된 바와 같이) 포스포릴레이 시스템을 활성화시키는 하나 이상의 유전자의 발현인 유전자 변경된 딸 그람 양성 세포를 생성하도록 모 그람 양성 세포를 유전자 변경시키는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 본 방법은 염색체 내에 통합되거나 에피좀 유전 요소로서 유지될 때 포스포릴레이 시스템을 활성화시키는 하나 이상의 유전자의 발현 수준인 유전자 변경된 그람 양성 세포를 생성하는 모 그람 양성 박테리아 세포 내로의 폴리뉴클레오티드 서열의 도입 단계를 포함한다.
당업자에게 잘 알려진 폴리뉴클레오티드 벡터 (예를 들어, 플라스미드 구성물)를 이용하여 바실루스 세포의 염색체를 변경시키거나 바실루스 세포에서의 에피좀 유전 요소를 유지하기 위한 바실루스 종의 형질전환을 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 바실루스 세포 내로의 폴리뉴클레오티드 서열의 도입에 적합한 방법은 예를 들어 문헌[Ferrari et al., “Genetics, Harwood et al. (ed.), Bacillus, Plenum Publishing Corp. [1989], pages 57-72]에서 발견되며; 또한 문헌[Saunders et al., J. Bacteriol., 157:718-726 [1984]]; 문헌[Hoch et al., J. Bacteriol., 93:1925 -1937 [1967]]; 문헌[Mann et al., Current Microbiol., 13:131-135 [1986]]; 및 문헌[Holubova, Folia Microbiol., 30:97 [1985]]을 참조하며; 비. 서브틸리스의 경우 문헌[Chang et al., Mol. Gen. Genet., 168:11-115 [1979]]; 비. 메가테륨의 경우 문헌[Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett., 7:261-263 [1980]]; 비. 아밀로리쿠에파시엔스의 경우 문헌[Smith et al., Appl. Env. Microbiol., 51:634 (1986)]; 비. 튜린기엔시스의 경우 문헌[Fisher et al., Arch. Microbiol., 139:213-217 [1981]]; 및 비. 스파에리쿠스(B. sphaericus)의 경우 문헌[McDonald, J. Gen. Microbiol.,130:203 [1984]]을 참조한다. 실제로, 원형질체 형질전환을 포함하는 형질전환 및 회합(congression), 형질도입, 및 원형질체 융합과 같은 방법은 공지되어 있으며 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 형질전환 방법은 특히 본 발명에 의해 제공되는 DNA 구성물을 숙주 세포 내에 도입하기 위한 것이다.
게다가, 숙주 세포 내로의 DNA 구성물의 도입은 표적화 DNA 구성물의 플라스미드 또는 벡터 내로의 삽입 없이 DNA를 숙주 세포 내에 도입하기 위한 본 기술 분야에 공지된 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 그러한 방법은 염화칼슘 침전법, 전기천공법, 네이키드 DNA, 리포좀 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 실시 양태에서, DNA 구성물은 플라스미드 내로의 삽입 없이 플라스미드와 함께 공동 형질전환될 수 있다.
선발가능 마커 유전자를 이용하여 안정한 형질전환체를 선발하는 실시 양태에서, 임의의 편리한 방법을 이용하여 유전자 변경 그람 양성 주로부터 선발 마커를 결실시키는 것이 바람직할 수 있으며, 이때 다수의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다 (문헌[Stahl et al., J. Bacteriol., 158:411-418 [1984]]; 및 문헌[Palmeros et al., Gene 247:255 -264 [2000]] 참조).
일부 실시 양태에서, 2가지 이상의 DNA 구성물들(즉, 각각이 숙주 세포를 유전자 변경하도록 설계된 DNA 구성물들)을 모 그람 양성 세포 내에 도입하여 세포 내에 2가지 이상의 유전자 변화, 예를 들어, 2개 이상의 염색체 영역에서의 변화를 도입한다. 일부 실시 양태에서, 이러한 영역들은 연접하는 반면 (예를 들어, 단일 오페론 내의 2개의 영역), 다른 실시 양태에서, 상기 영역들은 분리되어 있다. 일부 실시 양태에서, 유전자 변화 중 하나 이상은 에피좀 유전 요소의 부가에 의한 것이다.
일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 변경된 바실루스 주를 생성하기 위하여 본 발명에 따른 하나 이상의 DNA 구성물로 형질전환되며, 여기서, 2가지 이상의 유전자가 숙주 세포에서 불활성화되었다. 일부 실시 양태에서, 2가지 이상의 유전자가 숙주 세포 염색체로부터 결실된다. 대안적인 실시 양태에서, 2가지 이상의 유전자가 DNA 구성물의 삽입에 의해 불활성화된다. 일부 실시 양태에서, 불활성화된 유전자는 연접 유전자인 반면 (결실에 의해 불활성화되든지 및/또는 삽입에 의해 불활성화되든지 간에), 다른 실시 양태에서 상기 유전자는 연접 유전자가 아니다.
일단 유전자 변경된 숙주 세포가 생성되면, 이것은 관심 대상의 단백질이 발현되도록 하는 조건 하에 배양될 수 있으며, 여기서, 특정 실시 양태에서 POI는 회수된다.
일부 실시 양태에서, 본 발명은 (상기에 상세하게 기술된 바와 같이) 숙주 세포 내에 안정하게 포함될 때, 포자 형성-개시 유전자의 발현을 유도하는 포스포릴레이 시스템을 활성화시키는 하나 이상의 유전자의 발현이 감소되도록 세포를 유전자 변경시키는 유입 서열을 포함하는 DNA 구성물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, DNA 구성물은 시험관 내에서 어셈블링되며(assembled), 이어서 이 구성물을 적격성(competent) 그람 양성 (예를 들어, 바실루스) 숙주 내로 직접적으로 클로닝하여 DNA 구성물이 숙주 세포 염색체 내에 통합되도록 한다. 예를 들어, PCR 융합 및/또는 라이게이션을 이용하여 시험관 내에서 DNA 구성물을 어셈블링할 수 있다. 일부 실시 양태에서, DNA 구성물은 비-플라스미드 구성물인 반면, 다른 실시 양태에서 이것은 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 내에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 원형 플라스미드가 사용된다. 실시 양태들에서, 원형 플라스미드는 적절한 제한 효소(즉, DNA 구성물을 파괴하지 않는 것)를 사용하도록 설계된다. 따라서, 선형 플라스미드는 본 발명에서 그 용도가 발견된다. 그러나, 당업자에게 공지된 바와 같이, 다른 방법이 본 발명에서 사용하기에 적합하다 (예를 들어, 문헌[Perego, “Integrational Vectors for Genetic Manipulation in Bacillus subtilis, (Sonenshein et al. (eds.), Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, American Society for Microbiology, Washington, DC [1993]] 참조).
특정 실시 양태에서, DNA 표적화 벡터는 전부의 또는 일부의 kinA 유전자, phrA 유전자, 또는 phrE 유전자를 결실시키도록 (또는 이의 결실을 허용하도록) 설계된다. 특정 실시 양태에서, 다수의 DNA 구성물을 동시에 또는 순차적으로 이용하여 kinA 유전자, phrA 유전자, 및 phrE 유전자 중 임의의 2가지 또는 3가지를 결실시킨다. 특정 실시 양태에서, DNA 표적화 벡터는 선발 마커를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 선발 마커는 2개의 loxP 부위 사이에 위치하며 (문헌[Kuhn and Torres, Meth. Mol. Biol., 180:175-204 [2002]] 참조), 항미생물성 유전자는 그 후에 Cre 단백질의 작용에 의해 결실된다.
본 발명의 측면은 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 발현을 향상시키는 방법을 포함하며, 이는 모 그람 양성 박테리아 세포를 상기에 기술된 DNA 구성물 또는 벡터(즉, 숙주 세포 내에 안정하게 포함될 때, 포스포릴레이 경로의 하나 이상의 유전자의 발현이 감소되도록 세포를 유전자 변경시키는 유입 서열을 포함하는 것)로 형질전환시켜서, 상기 벡터와, 모 그람 양성 박테리아 세포의 관심 대상의 유전자의 상응하는 영역의 상동 재조합을 허용하여 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 생성하는 단계; 및 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 POI의 발현에 적합한 조건 하에 성장시키는 단계를 포함하고, 여기서 POI의 생성은 그람 양성 박테리아 (모) 세포와 비교하여 변경된 그람 양성 박테리아 (딸) 세포에서 증가된다. 그람 양성 세포, 돌연변이 및 이러한 본 발명의 측면에서 그 용도가 발견되는 기타 특징의 예가 상기에 상세하게 기술되어 있다.
DNA 구성물이 벡터 내에 포함되든지 플라스미드 DNA의 존재 없이 사용되든지 간에, 이것은 미생물의 형질전환에 사용된다. 임의의 적합한 형질전환 방법이 본 발명에서 그 용도가 발견될 것으로 사료된다. 특정 실시 양태에서, DNA 구성물의 적어도 하나의 카피가 숙주 바실루스 염색체 내에 통합된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 DNA 구성물이 숙주 세포의 형질전환에 사용된다.
본 발명의 실시에 대한 방식 및 방법은 하기 실시예의 참조에 의해 당업자에 의해 더 충분히 이해될 수 있으며, 실시예는 본 발명의 또는 이에 대한 청구범위의 범주를 어떠한 방식으로든지 한정하고자 하는 것이 아니다.
실시예
본 발명의 특정 실시 양태 및 측면을 입증하고 추가로 예시하기 위하여 하기 실시예를 제공하며, 하기 실시예는 이의 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기의 실험에 대한 개시 내용에서, 특정한 하기 약어가 적용된다:
℃ (섭씨 온도); rpm (분당 회전수); μg (마이크로그램); mg (밀리그램); μl (마이크로리터); ml (밀리리터); mM (밀리몰랄); μM (마이크로몰랄); sec (초); min (분); hr (시간); OD280 (280 nm에서의 광학 밀도); OD600 (600 nm에서의 광학 밀도); PCR (폴리머라아제 연쇄 반응); RT-PCR (역전사 PCR); SDS (소듐 도데실 술페이트).
실시예 1
kinA 유전자에서의 결실에 의한 바실루스에서의 증가된 단백질 발현
A. 바실루스 서브틸리스에서의 kinA 유전자좌의 결실
kinA의 결실을 kinA 결실 카세트를 이용하여 상동 재조합에 의해 모 바실루스 서브틸리스 세포 내에 도입하였다 (도 1). 결실을 kinA 유전자좌의 PCR 및 서열결정에 의해 확인하였다. 생성된 딸 세포를 ΔkinA로 표시하고, 비변경된 바실루스 서브틸리세 세포를 본원에서 모 세포로 칭하였다. 서열 번호 1은 kinA 유전자의 야생형 서열을 나타내며, 서열 번호 2는 KinA 단백질 서열을 나타낸다.
B. kinA 결실된 주에서의 아밀라아제 발현
aprE 프로모터로부터의 AmyE의 발현을 지시하며, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 내성(catR) 마커 유전자를 포함하는 아밀라아제 발현 구성물 (본원에서, "PaprE-amyE catR")을 ΔkinA (딸 세포) 및 비변경된 모 세포 둘 모두의 aprE 유전자좌 내에 도입하였다. 성숙 AmyE 단백질 서열이 서열 번호 3에 예시되어 있다.
상기 세포를 25 μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 루리아 한천 플레이트에서 증폭시켰다. ΔkinA (딸) 세포 및 모 세포를 5 mL의 루리아 브로스 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 1 ml의 예비배양물을 사용하여 37℃, 250 rpm에서 진탕 플라스크 내의 루리아 브로스 배지 25 ml에 접종하여 AmyE 아밀라아제 단백질의 발현을 테스트하였다. 세포 밀도를 스펙트라맥스(SpectraMax) 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))를 이용하여 1시간 간격으로 600 nm에서 측정하였다. 600 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 2a에 나타낸다. 예를 들어, 도 2a는 모 세포 및 ΔkinA (딸) 세포의 세포 성장이 동등함을 나타내며, 이는 (딸) 세포에서의 kinA 유전자의 결실이 세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타낸다.
전 브로스의 AmyE 아밀라아제 활성을 세랄파(Ceralpha) 시약 (아일랜드 위크로우 소재의 메가자임(Megazyme))을 이용하여 측정하였다. 세랄파 HR 키트로부터의 세랄파 시약 믹스를 처음에 10 ml의 밀리큐(MilliQ) 물에 용해시키고, 이어서 30 ml의 50 mM 말레이트 완충액 (pH 5.6)을 첨가하였다. 배양 상청액을 밀리큐 물에 40배 희석시키고, 5 μl의 희석 샘플을 55 μL의 희석시킨 표준 기질 용액(diluted working substrate solution)에 첨가하였다. MTP 플레이트를 진탕 후 실온에서 4분 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 70 μl의 200 mM 보레이트 완충액 (pH 10.2) (정지 용액)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 상기 용액의 흡광도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 400 nm에서 측정하였다. 400 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 2b에 나타낸다. 도 2b에서의 그래프는 변경된 (ΔkinA; 딸) 세포에서 6시간의 성장에서 출발하는 AmyE 생성의 증가를 나타낸다. 세포 성장이 변경된 (ΔkinA; 딸) 세포에서 영향을 받지 않는다는 것을 고려하면 (도 2a에 나타낸 바와 같음), 비변경된 (모) 바실루스 세포 (동일 배양 조건 하에 성장시킴)와 비교하여 변경된 (ΔkinA; 딸) 바실루스 세포에서의 AmyE 생성의 증가는 배양물 중 세포의 수의 증가로 인한 것이 아니라, 오히려 세포 그 자체(즉, 세포 대 세포 기반으로(cell-by-cell basis))의 증가된 발현 수준으로 인한 것이다.
C. kinA 결실된 주에서의 프로테아제 ( FNA ) 발현
FNA 프로테아제 (Y217L 치환을 포함하는 서브틸리신 BPN'; 서열 번호 4)의 발현에 대한 kinA 결실 (ΔkinA)의 영향을 FNA 발현 카세트 (본원에서, "PaprE-FNA-catR")를 포함하는 바실루스 서브틸리스 세포에서 테스트하였다. 변경된 비. 서브틸리스 (딸) 세포에서의 kinA 유전자를 도 1에 나타낸 구성물을 이용한 상기 주의 형질전환에 의해 결실시켰다. kinA 결실을 지닌 스펙티노마이신 내성 콜로니를 25 μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LA 플레이트에서 증폭시켰다. 모 비. 서브틸리스 세포 및 ΔkinA 넉아웃(knockout) 딸 세포를 5 mL의 루리아 브로스(Luria broth) 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 1 ml의 예비배양물을 이용하여 250 rpm에서 톰슨(Thompson) 플라스크 내의 2XNB (2X 영양 브로스(Nutrient Broth), 1XSNB 염, 국제 공개 제2010/14483호에 기술됨) 25 ml에 접종하여 프로테아제 발현을 테스트하였다. 전 브로스의 세포 밀도를 20배 희석시키고, 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 1시간 간격으로 600 nm에서 측정하였다. 600 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였으며, 그 결과가 도 3a에 제시되어 있는데, 이는 FNA 발현 비. 서브틸리스 모 세포 및 FNA 발현 비. 서브틸리스 딸 세포 (즉, ΔkinA)의 세포 성장이 동등함을 예시하고, 이는 딸 세포에서의 kinA 결실이 세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타내는 것이다.
FNA 프로테아제 발현을 국제 공개 제2010/144283호에 기술된 바와 같이 N-suc-AAPF-pNA 기질 (시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.))을 이용하여 모니터링하였다. 간략하게는, 전 브로스를 분석용 완충액 (100 mM 트리스(Tris), 0.005% 트윈(Tween) 80, pH 8.6)에서 40배 희석시키고, 10 μl의 희석 샘플을 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에 배열시켰다. AAPF 스톡을 분석용 완충액에 희석시키고 (DMSO 중 100 mg/ml AAPF 스톡의 100배 희석물) 190 μl의 이 용액을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 상기 용액의 흡광도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 405 nm에서 측정하였다. 405 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였으며, 그 결과가 도 3b에 제시되어 있는데, 이는 FNA 생성이 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 모 바실루스 세포의 배양물과 비교하여 ΔkinA 결실을 포함하는 딸 바실루스 세포 배양물에서 증가함을 나타낸다. 세포 성장이 변경된 (ΔkinA) 바실루스 딸 세포에서 영향을 받지 않는다는 것을 고려하면 (도 3a에 나타낸 바와 같음), 비변경된 모 바실루스 세포 (동일 배양 조건 하에 성장시킴)와 비교하여 바실루스 (ΔkinA) 딸 세포에서의 FNA 생성의 증가는 배양물 중 세포의 수의 증가로 인한 것이 아니라, 오히려 변경된 세포 그 자체(즉, 세포 대 세포 기반으로)의 증가된 발현 수준으로 인한 것이다.
D. kinA 결실된 주에서의 녹색 형광 단백질( GFP ) 발현
다른 단백질의 발현에 대한 kinA 결실의 영향을 테스트하기 위하여, aprE 프로모터의 제어 하의, 그리고 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 내성 마커를 추가로 포함하는 GFP 발현 카세트 (본원에서, "PaprE-GFP catR") (서열 번호 5는 GFP의 아미노산 서열을 나타냄)를 비변경된 비. 서브틸리스 모 세포 및 변경된 (ΔkinA) 비. 서브틸리스 딸 세포의 aprE 유전자좌 내에 도입하였다. 형질전환체를 5 μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 루리아 한천 플레이트 상에서 선발하였다. GFP를 발현하는 변경된 비. 서브틸리스 (ΔkinA) 딸 세포 및 GFP를 발현하는 비변경된 비. 서브틸리스 모 세포를 5 mL의 루리아 브로스에서 하룻밤 성장시켰다. 1 ml의 예비배양물을 사용하여 37℃, 250 rpm에서 진탕 플라스크 내의 2XNB 배지 (2X 영양 브로스, 1X SNB 염) 25 ml에 접종하여 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 테스트하였다. 20배 희석시킨 전 브로스의 세포 밀도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 1시간 간격으로 600 nm에서 측정하였다. 600 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였으며, 그 결과가 도 4a에 제시되어 있는데, 이는 GFP 발현 비. 서브틸리스 모 세포의 세포 성장이 GFP 발현 비. 서브틸리스 (ΔkinA) 딸 세포와 비교하여 감소됨을 나타내며, 이는 이러한 GFP 발현 세포에서의 kinA 결실이 세포 성장에 긍정적으로 영향을 줌을 나타낸다.
GFP 발현을 측정하기 위하여, 100 μl의 배양물을 96웰 마이크로타이터 플레이트로 옮기고, 495 nm 방출 컷오프(cutoff) 필터를 이용하여 485 nm의 여기 파장, 508 nm의 방출 파장을 이용하여 형광 플레이트 판독기에서 GFP 발현을 측정하였다. 485 / 508 nm에서의 상대 형광 단위(relative fluorescence unit; RFU)를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 4b에 나타낸다. 그래프는 kinA 결실로 인한 6시간의 성장으로부터의 GFP 생성의 증가를 나타낸다. 비변경된 비. 서브틸리스 모 세포와 비교하여 변경된 비. 서브틸리스 (ΔkinA) 딸 세포에서의 증가된 GFP 발현 수준은 단지 도 4a에서 관찰되는 세포 생존성의 향상으로부터 기대되는 것을 넘어선다.
실시예 2
phrA 및 phrE 유전자에서의 결실에 의한 바실루스에서의 증가된 단백질 발현
A. 바실루스 서브틸리스에서의 phrA 유전자좌의 결실
phrA 유전자의 결실을 도 6에 개략적으로 제시된 결실 카세트의 상동 재조합에 의해 모 바실루스 서브틸리스 세포 내에 도입하였다. phrA 결실(ΔphrA)을 phrA 유전자좌의 PCR 및 서열결정에 의해 확인하였다. 스펙티노마이신 마커 (specR)를 플라스미드 코딩된 Cre 리콤비나아제를 이용하여 제거하였다.
B. 변경된 ( ΔphrA ) 바실루스 세포에서의 phrE 유전자좌의 결실
phrE 유전자를 도 7에 개략적으로 제시된 결실 카세트의 상동 재조합에 의해 실시예 2.A에 기술된 변경된 (ΔphrA) 비. 서브틸리스 딸 세포에서 또한 결실시켰다. phrE 결실을 phrE 유전자좌의 PCR 및 서열결정에 의해 확인하였다.
C. 변경된 ( ΔphrA / ΔphrE ) 바실루스 세포에서의 단백질 발현
실시예 1에서 이전에 설명한 발현 카세트(즉, "PaprE-FNA catR" 카세트, "PaprE-GFP catR" 카세트 또는 "PaprE-amyE catR" 카세트)를 비변경된 (모) 비. 서브틸리스 세포 및 변경된 (ΔphrA/ΔphrE) 비. 서브틸리스 세포 내에 도입하였다. 주 선발, 세포 성장 및 효소 분석을 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하였다. "PaprE-FNA catR" 카세트를 포함하는 비. 서브틸리스 세포를 25 ppm의 클로람페니콜의 플레이트에서 선발하였다. "PaprE-GFP catR” 카세트 또는 "PaprE-AmyE catR" 카세트를 포함하는 비. 서브틸리스 세포를 5 ppm의 클로람페니콜의 플레이트에서 선발하였다. 세포 밀도 및 단백질 발현을 실시예 1에서 설명한 바와 같이 측정하였다.
도 8a는 GFP 발현 모 비. 서브틸리스 세포 및 GFP 발현 딸 (ΔphrA/ΔphrE) 비. 서브틸리스 세포의 세포 성장이 동등함을 예시하며, 이는 비. 서브틸리스 (딸) 세포에서의 phrA-phrE 결실이 세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타낸다. 도 8b는 phrA-phrE 결실의 결과로서 4시간의 성장으로부터의 GFP 생성의 증가를 예시한다.
도 9a는 FNA 발현 모 비. 서브틸리스 세포 및 FNA 발현 딸 (ΔphrA/ΔphrE) 비. 서브틸리스 세포의 세포 성장이 동등함을 예시하며, 이는 비. 서브틸리스 (딸) 세포에서의 phrA-phrE 결실이 세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타낸다. 도 9b는 phrA-phrE 결실의 결과로서 4시간의 성장으로부터의 FNA 생성의 증가를 예시한다.
도 10a는 AmyE 발현 모 비. 서브틸리스 세포 및 AmyE 발현 딸 (ΔphrA/ΔphrE) 비. 서브틸리스 세포의 세포 성장이 동등함을 예시하며, 이는 비. 서브틸리스 (딸) 세포에서의 phrA-phrE 결실이 세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타낸다. 도 10b는 phrA-phrE 결실의 결과로서의 AmyE 생성의 증가를 예시한다.
전술한 조성물 및 방법을 이해의 명확함을 위하여 예시 및 예로서 약간 상세하게 기술하였지만, 본원에서의 교시를 고려하면 이에 대하여 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 당업자에게 기꺼이 명백하다.
따라서, 전술한 것은 단지 본 발명의 조성물 및 방법의 원리를 예시한다. 당업자라면, 본원에 명백하게 기술되어 있지 않거나 예시되어 있지 않지만 본 발명의 조성물 및 방법의 원리를 구현하는 그리고 그의 사상 및 범주 내에 포함되는 다양한 처리 방식을 고안할 수 있음이 인정된다. 더욱이, 본원에 상술된 모든 실시예 및 조건적 언어는 주로 독자가 본 발명의 조성물 및 방법의 원리와 본 기술 분야의 심화에 본 발명자가 기여하는 개념을 이해하는 것을 돕고자 하는 것이며, 그렇게 구체적으로 상술된 실시예 및 조건을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 게다가, 본 발명의 조성물 및 방법의 원리, 측면 및 실시 양태와, 이의 특정 실시예를 상술하는 본원에서의 모든 진술은 이의 구조적 등가물 및 기능적 등가물 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 부가적으로, 그러한 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발될 등가물, 즉, 구조와는 관계 없이, 동일 기능을 수행하는 개발될 임의의 요소 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법의 범주는 본원에 예시되고 설명된 예시적인 실시 양태에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니다.
서열
서열 번호 1 - kinA 야생형 코딩 서열
Figure pct00001
서열 번호 2 - KinA 단백질 서열
Figure pct00002
서열 번호 3 - AmyE 단백질 서열
Figure pct00003
서열 번호 4 - FNA 단백질 서열
Figure pct00004
서열 번호 5 - GFP 단백질 서열
Figure pct00005
서열 번호 6 - phrA 야생형 코딩 서열
Figure pct00006
서열 번호 7 - phrA 단백질 서열
Figure pct00007
서열 번호 8 - phrE 야생형 코딩 서열
Figure pct00008
서열 번호 9 - phrE 단백질 서열
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> DANISCO US INC. <120> ENHANCED PROTEIN EXPRESSION <130> 40522-WO-PCT <150> 62/094,751 <151> 2014-12-19 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1821 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 gtggaacagg atacgcagca tgttaaacca cttcaaacaa aaaccgatat tcatgcagtc 60 ttggcctcta atggacgcat catttatata tctgccaact ccaaactgca tttgggctat 120 ctccaaggag agatgatcgg atcattcctc aaaacgtttc tgcatgagga agaccaattt 180 ttggttgaaa gctattttta taatgaacat catctgatgc cgtgcacctt tcgttttatt 240 aaaaaagatc atacgattgt gtgggtggag gctgcggtag aaattgttac gacaagagct 300 gagcggacag aacgggaaat cattttgaaa atgaaggttc ttgaagaaga aacaggccat 360 caatccctaa actgcgaaaa acatgaaatc gaacctgcaa gcccggaatc gactacatat 420 ataacggatg attatgaacg gttggttgaa aatctcccga gtccgctatg catcagtgtc 480 aaaggcaaga tcgtctatgt aaacagcgcg atgctttcaa tgctgggagc caaaagcaag 540 gatgctatta ttggtaaatc gtcctatgaa tttattgaag aagaatatca tgatatcgtg 600 aaaaacagga ttatacgaat gcaaaaagga atggaagtcg gaatgattga acagacgtgg 660 aaaaggcttg atggcacacc tgttcattta gaagtgaaag catccccgac cgtctacaaa 720 aaccagcagg ctgagctgct gctgctgatc gatatctctt caaggaaaaa attccaaacc 780 atcctgcaaa aaagccgtga acgatatcag ctgctgattc aaaattccat tgataccatt 840 gcggtgattc acaatggaaa atgggtattt atgaatgaat cgggaatttc cctgtttgaa 900 gcggctacat atgaggattt aattggcaaa aacatatacg atcagctgca tccttgcgat 960 cacgaggatg taaaagagag aatccaaaac attgccgagc aaaaaacaga atctgaaatt 1020 gtcaagcaat cctggttcac ctttcagaac agggtcatct atacggagat ggtctgcatt 1080 ccgacgacct tttttggtga agcggccgtc caggtcattc ttcgggacat ctcagagaga 1140 aaacaaacag aagaattgat gctgaaatcg gaaaaattat caatcgcagg gcagctcgcg 1200 gcgggaatcg cccatgagat ccgcaaccct cttacagcga tcaaaggatt tttacagctg 1260 atgaaaccga caatggaagg caacgaacat tactttgata ttgtgttttc tgaactcagc 1320 cgtatcgaat taatactcag tgaactgctc atgctggcga aacctcagca aaatgctgtc 1380 aaagaatatt tgaacttgaa aaaattaatt ggtgaggttt cagccctgtt agaaacgcag 1440 gcgaatttaa atggcatttt tatcagaaca agttatgaaa aagacagcat ttatataaac 1500 ggggatcaaa accaattaaa gcaggtattc attaatttaa tcaaaaatgc agttgaatca 1560 atgcctgatg ggggaacagt agacattatc ataaccgaag atgagcattc tgttcatgtt 1620 actgtcaaag acgaagggga aggtatacct gaaaaggtac taaaccggat tggagagcca 1680 tttttaacaa caaaagaaaa aggtacgggg cttggattaa tggtgacatt taatatcatt 1740 gaaaaccatc agggagttat acatgtggac agccatcctg aaaaaggcac agcgtttaaa 1800 atttcatttc caaaaaaata a 1821 <210> 2 <211> 606 <212> PRT <213> unknown <220> <223> Bacillus sp. <400> 2 Met Glu Gln Asp Thr Gln His Val Lys Pro Leu Gln Thr Lys Thr Asp 1 5 10 15 Ile His Ala Val Leu Ala Ser Asn Gly Arg Ile Ile Tyr Ile Ser Ala 20 25 30 Asn Ser Lys Leu His Leu Gly Tyr Leu Gln Gly Glu Met Ile Gly Ser 35 40 45 Phe Leu Lys Thr Phe Leu His Glu Glu Asp Gln Phe Leu Val Glu Ser 50 55 60 Tyr Phe Tyr Asn Glu His His Leu Met Pro Cys Thr Phe Arg Phe Ile 65 70 75 80 Lys Lys Asp His Thr Ile Val Trp Val Glu Ala Ala Val Glu Ile Val 85 90 95 Thr Thr Arg Ala Glu Arg Thr Glu Arg Glu Ile Ile Leu Lys Met Lys 100 105 110 Val Leu Glu Glu Glu Thr Gly His Gln Ser Leu Asn Cys Glu Lys His 115 120 125 Glu Ile Glu Pro Ala Ser Pro Glu Ser Thr Thr Tyr Ile Thr Asp Asp 130 135 140 Tyr Glu Arg Leu Val Glu Asn Leu Pro Ser Pro Leu Cys Ile Ser Val 145 150 155 160 Lys Gly Lys Ile Val Tyr Val Asn Ser Ala Met Leu Ser Met Leu Gly 165 170 175 Ala Lys Ser Lys Asp Ala Ile Ile Gly Lys Ser Ser Tyr Glu Phe Ile 180 185 190 Glu Glu Glu Tyr His Asp Ile Val Lys Asn Arg Ile Ile Arg Met Gln 195 200 205 Lys Gly Met Glu Val Gly Met Ile Glu Gln Thr Trp Lys Arg Leu Asp 210 215 220 Gly Thr Pro Val His Leu Glu Val Lys Ala Ser Pro Thr Val Tyr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Gln Ala Glu Leu Leu Leu Leu Ile Asp Ile Ser Ser Arg Lys 245 250 255 Lys Phe Gln Thr Ile Leu Gln Lys Ser Arg Glu Arg Tyr Gln Leu Leu 260 265 270 Ile Gln Asn Ser Ile Asp Thr Ile Ala Val Ile His Asn Gly Lys Trp 275 280 285 Val Phe Met Asn Glu Ser Gly Ile Ser Leu Phe Glu Ala Ala Thr Tyr 290 295 300 Glu Asp Leu Ile Gly Lys Asn Ile Tyr Asp Gln Leu His Pro Cys Asp 305 310 315 320 His Glu Asp Val Lys Glu Arg Ile Gln Asn Ile Ala Glu Gln Lys Thr 325 330 335 Glu Ser Glu Ile Val Lys Gln Ser Trp Phe Thr Phe Gln Asn Arg Val 340 345 350 Ile Tyr Thr Glu Met Val Cys Ile Pro Thr Thr Phe Phe Gly Glu Ala 355 360 365 Ala Val Gln Val Ile Leu Arg Asp Ile Ser Glu Arg Lys Gln Thr Glu 370 375 380 Glu Leu Met Leu Lys Ser Glu Lys Leu Ser Ile Ala Gly Gln Leu Ala 385 390 395 400 Ala Gly Ile Ala His Glu Ile Arg Asn Pro Leu Thr Ala Ile Lys Gly 405 410 415 Phe Leu Gln Leu Met Lys Pro Thr Met Glu Gly Asn Glu His Tyr Phe 420 425 430 Asp Ile Val Phe Ser Glu Leu Ser Arg Ile Glu Leu Ile Leu Ser Glu 435 440 445 Leu Leu Met Leu Ala Lys Pro Gln Gln Asn Ala Val Lys Glu Tyr Leu 450 455 460 Asn Leu Lys Lys Leu Ile Gly Glu Val Ser Ala Leu Leu Glu Thr Gln 465 470 475 480 Ala Asn Leu Asn Gly Ile Phe Ile Arg Thr Ser Tyr Glu Lys Asp Ser 485 490 495 Ile Tyr Ile Asn Gly Asp Gln Asn Gln Leu Lys Gln Val Phe Ile Asn 500 505 510 Leu Ile Lys Asn Ala Val Glu Ser Met Pro Asp Gly Gly Thr Val Asp 515 520 525 Ile Ile Ile Thr Glu Asp Glu His Ser Val His Val Thr Val Lys Asp 530 535 540 Glu Gly Glu Gly Ile Pro Glu Lys Val Leu Asn Arg Ile Gly Glu Pro 545 550 555 560 Phe Leu Thr Thr Lys Glu Lys Gly Thr Gly Leu Gly Leu Met Val Thr 565 570 575 Phe Asn Ile Ile Glu Asn His Gln Gly Val Ile His Val Asp Ser His 580 585 590 Pro Glu Lys Gly Thr Ala Phe Lys Ile Ser Phe Pro Lys Lys 595 600 605 <210> 3 <211> 425 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bacillus sp. <400> 3 Leu Thr Ala Pro Ser Ile Lys Ser Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ser Phe Asn Thr Leu Lys His Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala 20 25 30 Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly 35 40 45 Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met Ser Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro 50 55 60 Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe 65 70 75 80 Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala Glu Glu Tyr Gly Ile Lys Val Ile Val 85 90 95 Asp Ala Val Ile Asn His Thr Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asn 100 105 110 Glu Val Lys Ser Ile Pro Asn Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys 115 120 125 Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp Val Thr Gln Asn Ser Leu Leu Gly Leu 130 135 140 Tyr Asp Trp Asn Thr Gln Asn Thr Gln Val Gln Ser Tyr Leu Lys Arg 145 150 155 160 Phe Leu Asp Arg Ala Leu Asn Asp Gly Ala Asp Gly Phe Arg Phe Asp 165 170 175 Ala Ala Lys His Ile Glu Leu Pro Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Gln 180 185 190 Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn Thr Ser Ala Glu Phe Gln Tyr Gly Glu 195 200 205 Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser Arg Asp Ala Ala Tyr Ala Asn Tyr Met 210 215 220 Asp Val Thr Ala Ser Asn Tyr Gly His Ser Ile Arg Ser Ala Leu Lys 225 230 235 240 Asn Arg Asn Leu Gly Val Ser Asn Ile Ser His Tyr Ala Ser Asp Val 245 250 255 Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr Trp Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala 260 265 270 Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr Trp Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu 275 280 285 Gly Trp Ala Val Ile Ala Ser Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe 290 295 300 Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly Asn Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser 305 310 315 320 Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser Ala Leu Phe Glu Asp Gln Ala Ile Thr 325 330 335 Ala Val Asn Arg Phe His Asn Val Met Ala Gly Gln Pro Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn Gln Ile Phe Met Asn Gln Arg Gly Ser 355 360 365 His Gly Val Val Leu Ala Asn Ala Gly Ser Ser Ser Val Ser Ile Asn 370 375 380 Thr Ala Thr Lys Leu Pro Asp Gly Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala 385 390 395 400 Gly Ser Phe Gln Val Asn Asp Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ile Asn Ala 405 410 415 Arg Ser Val Ala Val Leu Tyr Pro Asp 420 425 <210> 4 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 4 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 5 <211> 238 <212> PRT <213> Ptilosarcus gurneyi <400> 5 Val Asn Arg Asn Val Leu Lys Asn Thr Gly Leu Lys Glu Ile Met Ser 1 5 10 15 Ala Lys Ala Ser Val Glu Gly Ile Val Asn Asn His Val Phe Ser Met 20 25 30 Glu Gly Phe Gly Lys Gly Asn Val Leu Phe Gly Asn Gln Leu Met Gln 35 40 45 Ile Arg Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Val 50 55 60 Ser Ile Ala Phe Gln Tyr Gly Asn Arg Thr Phe Thr Lys Tyr Pro Asp 65 70 75 80 Asp Ile Ala Asp Tyr Phe Val Gln Ser Phe Pro Ala Gly Phe Phe Tyr 85 90 95 Glu Arg Asn Leu Arg Phe Glu Asp Gly Ala Ile Val Asp Ile Arg Ser 100 105 110 Asp Ile Ser Leu Glu Asp Asp Lys Phe His Tyr Lys Val Glu Tyr Arg 115 120 125 Gly Asn Gly Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Ala Ile Leu 130 135 140 Gly Met Glu Pro Ser Phe Glu Val Val Tyr Met Asn Ser Gly Val Leu 145 150 155 160 Val Gly Glu Val Asp Leu Val Tyr Lys Leu Glu Ser Gly Asn Tyr Tyr 165 170 175 Ser Cys His Met Lys Thr Phe Tyr Arg Ser Lys Gly Gly Val Lys Glu 180 185 190 Phe Pro Glu Tyr His Phe Ile His His Arg Leu Glu Lys Thr Tyr Val 195 200 205 Glu Glu Gly Ser Phe Val Glu Gln His Glu Thr Ala Ile Ala Gln Leu 210 215 220 Thr Thr Ile Gly Lys Pro Leu Gly Ser Leu His Glu Trp Val 225 230 235 <210> 6 <211> 135 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 6 atgaaatcta aatggatgtc aggtttgttg ctcgttgcgg tcgggttcag ctttactcag 60 gtgatggttc atgcaggtga aacagcaaac acagaaggga aaacatttca tattgcggca 120 cgcaatcaaa catga 135 <210> 7 <211> 44 <212> PRT <213> unknown <220> <223> Bacillus sp. <400> 7 Met Lys Ser Lys Trp Met Ser Gly Leu Leu Leu Val Ala Val Gly Phe 1 5 10 15 Ser Phe Thr Gln Val Met Val His Ala Gly Glu Thr Ala Asn Thr Glu 20 25 30 Gly Lys Thr Phe His Ile Ala Ala Arg Asn Gln Thr 35 40 <210> 8 <211> 135 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 8 atgaaatcta aattgtttat cagtttatcc gccgttttaa ttggacttgc ctttttcgga 60 tctatgtata atggcgaaat gaaggaagca tcccggaatg taactctcgc acctactcat 120 gaattccttg tttaa 135 <210> 9 <211> 44 <212> PRT <213> unknown <220> <223> Bacillus sp. <400> 9 Met Lys Ser Lys Leu Phe Ile Ser Leu Ser Ala Val Leu Ile Gly Leu 1 5 10 15 Ala Phe Phe Gly Ser Met Tyr Asn Gly Glu Met Lys Glu Ala Ser Arg 20 25 30 Asn Val Thr Leu Ala Pro Thr His Glu Phe Leu Val 35 40

Claims (33)

  1. 그람(Gram) 양성 박테리아 세포에서 관심 대상의 단백질(protein of interest; POI)의 발현을 증가시키는 방법으로서,
    (a) POI를 생성하는 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 단계 (여기서, 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 kinA 유전자, phrA 유전자 또는 phrE 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화(genetic alteration)를 포함함); 및
    (b) 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 상기 POI가 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 단계 (여기서, POI의 증가된 발현은 비변경된 그람 양성 박테리아 세포에서의 상기 POI의 발현과 비교한 것임)를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (b)의 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 kinA, phrA 및 phrE로부터 선택되는 2가지 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 2가지 이상의 유전자 변화를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (b)의 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 kinA의 발현을 감소시키는 유전자 변화, phrA의 발현을 감소시키는 유전자 변화 및 phrE의 발현을 감소시키는 유전자 변화를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 유전자 변화는 추가로 kinA mRNA 전사체의 수준의 감소, phrA mRNA 전사체의 수준의 감소 및/또는 phrE mRNA 전사체의 수준의 감소로서 정의되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, POI의 발현의 증가는 추가로 POI mRNA 전사체의 수준의 증가로서 정의되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포 및 비변경된 그람 양성 박테리아 세포는 추가로 1가지 이상의 결함성 또는 불활성 포자 형성 유전자를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 1가지 이상의 결함성 또는 불활성 포자 형성 유전자는 Spo0A, SigF, SigG, SigE, SigK, spoIIAA, spoIIAB, spoIIR, spoIIGA, spoIIIAA, spoIIIAB, spoIIIAC, spoIIIAD, spoIIIAE, spoIIIAF, spoIIIAG, spoIIIAH, spoIVB, bofC, spoIVFA, spoIVFB, spoIVCA, spoIVCB, spoIIIC, 및 spoIIE로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스(Bacillus) 속의 구성원인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 렌투스(B. lentus), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로서모필루스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필루스(B. alkalophilus), 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 소노렌시스(B. sonorensis), 비. 할로두란스(B. halodurans), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 라우투스(B. lautus), 비. 파불리(B. pabuli), 비. 세레우스(B. cereus), 비. 아가라드하에렌스(B. agaradhaerens), 비. 아키바이(B. akibai), 비. 클라르키이(B. clarkii), 비. 슈도피르무스(B. pseudofirmus), 비. 레헨시스(B. lehensis), 비. 메가테륨(B. megaterium), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 서큐란스(B. circulans), 비. 깁소니이(B. gibsonii), 및 비. 튜린기엔시스(B. thuringiensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스 또는 비. 리케니포르미스인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 유전자 변화는 kinA, phrA, 및 phrE 유전자 중 하나 이상의 전부 또는 일부의 결실인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 유전자 변화는 KinA, PhrA, 및 PhrE 단백질 중 하나 이상의 활성을 감소시키는 방법.
  13. 제1항에 있어서, POI는 효소인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α- 글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α- 글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 효소는 프로테아제인 방법.
  16. 제1항에 있어서, POI를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 비변경된 그람 양성 세포에 비하여 발현 POI의 증가된 양은 10% 이상 증가된 것인 방법.
  18. 비변경된 그람 양성 박테리아 세포에서의 POI의 발현에 비하여 증가된 양의 POI를 발현하며, kinA 유전자, phrA 유전자 또는 phrE 유전자의 발현을 감소시키는 하나 이상의 유전자 변화를 포함하는 변경된 그람 양성 박테리아 세포.
  19. 제18항에 있어서, kinA, phrA 및 phrE로부터 선택되는 2가지 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 2가지 이상의 유전자 변화를 포함하는 변경된 세포.
  20. 제18항에 있어서, kinA의 발현을 감소시키는 유전자 변화, phrA의 발현을 감소시키는 유전자 변화 및 phrE의 발현을 감소시키는 유전자 변화를 포함하는 변경된 세포.
  21. 제18항에 있어서, 변경된 세포 및 비변경된 세포는 추가로 1가지 이상의 결함성 또는 불활성 포자 형성 유전자를 포함하는 변경된 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 1가지 이상의 결함성 또는 불활성 포자 형성 유전자는 Spo0A, SigF, SigG, SigE, SigK, spoIIAA, spoIIAB, spoIIR, spoIIGA, spoIIIAA, spoIIIAB, spoIIIAC, spoIIIAD, spoIIIAE, spoIIIAF, spoIIIAG, spoIIIAH, spoIVB, bofC, spoIVFA, spoIVFB, spoIVCA, spoIVCB, spoIIIC, 및 spoIIE로 이루어진 군으로부터 선택되는 변경된 세포.
  23. 제18항에 있어서, 바실루스 속의 구성원인 변경된 세포.
  24. 제23항에 있어서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 소노렌시스, 비. 할로두란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 파불리, 비. 세레우스, 비. 아가라드하에렌스, 비. 아키바이, 비. 클라르키이, 비. 슈도피르무스, 비. 레헨시스, 비. 메가테륨, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 깁소니이, 및 비. 튜린기엔시스로 이루어진 군으로부터 선택되는 변경된 세포.
  25. 제24항에 있어서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스 또는 비. 리케니포르미스인 변경된 세포.
  26. 제18항에 있어서, 상기 유전자 변화는 추가로 kinA mRNA 전사체의 수준의 감소, phrA mRNA 전사체의 수준의 감소 및/또는 phrE mRNA 전사체의 수준의 감소로서 정의되는 변경된 세포.
  27. 제18항에 있어서, kinA 유전자, phrA 유전자 또는 phrE 유전자의 발현을 감소시키는 상기 유전자 변화는 전부의 또는 일부분의 kinA, phrA, 및 phrE 유전자의 결실인 변경된 세포.
  28. 제18항에 있어서, 상기 유전자 변화는 KinA, PhrA, 및/또는 PhrE 단백질의 활성을 감소시키는 변경된 세포.
  29. 제18항에 있어서, POI는 효소인 변경된 세포.
  30. 제29항에 있어서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α- 글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α- 글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변경된 세포.
  31. 제29항에 있어서, 효소는 프로테아제인 변경된 세포.
  32. 제18항에 있어서, POI의 회수를 추가로 포함하는 변경된 세포.
  33. 제18항에 있어서, 비변경된 그람 양성 세포에 비하여 발현 POI의 증가된 양은 10% 이상 증가된 것인 변경된 세포.
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