JP2501779B2 - アルカリプロテア―ゼの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換技術を利用
した、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物由来のア
ルカリプロテアーゼの工業的に有利な製造方法を提供す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】アルカリプロテアーゼはバチルス属細菌
が分泌する菌体外蛋白の典型的な例であり、その用途は
皮革加工用、食品工業用、洗剤添加用、医薬品など多岐
にわたる。従来、バチルス属微生物由来のアルカリプロ
テアーゼはこれらの菌からの醗酵法により製造されてい
る。しかし、従来の醗酵法では菌体量あたりの収量が低
く、また他の菌体外蛋白などの夾雑物が多く回収構造等
の工程が複雑になる。このため、より生産性が高く、製
造工程の簡略化されたプロテアーゼの製造法の開発が望
まれる。

【０００３】このため、従来からプロテアーゼ生産菌の
改良が行われており、このために一般に人工的突然変異
法が利用されてきたが、プロテアーゼ生産性の観点から
はいまだ充分満足するものは得られていない。さらに人
工的突然変異法では、酵素の特性に変化がおこる可能性
もあり、改良法としては最適とはいえない。また、最近
開発された遺伝子組換え技術を利用してアルカリプロテ
アーゼの生産性を高める試みもなされているが工業的に
利用可能なものとしては未だ成功の域には達していな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、遺伝
子組換技術によってアルカリプロテアーゼ生産能が向上
した微生物を作製し、これを用いて工業的に有利にアル
カリプロテアーゼを製造することができる方法を提供す
ることを目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の目
的を達成するための鋭意研究を重ねた結果、アルカリプ
ロテアーゼを生産することが知られているバチルス属微
生物から、アルカリプロテアーゼの生産に関与する遺伝
子をクローン化することに成功し、さらにこの遺伝子の
構成を解明した。さらにこのクローン化された遺伝子を
適当な宿主に導入することにより、該遺伝子が由来する
野性株よりはるかに高いアルカリプロテアーゼ生産能を
有する形質転換体を得、アルカリプロテアーゼの工業的
生産性を大幅に向上させることに成功した。

【０００６】従って、本発明は、バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属微生物由来のアルカリプロテアーゼをコード
する構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点ＨｐａＩとＨａｅ
III(２) とにより両端を規定されるアルカリプロテアー
ゼ構造遺伝子含有領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点ＨｐａＩとＨａｅIII(２) と
の間に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII ，ＳｐｈＩ及び
ＳａｃＩを含有し；且つ前記の制限酵素切断点の位置関
係が下記制限酵素地図：

【０００７】

【化２】 の通りであり；そして （ｃ）前記制限酵素切断片ＨｐａＩとＨａｅIII(２) と
の間に制限酵素切断点ＣｌａＩ，ＢｇｌII，ＢａｍＨ
Ｉ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，Ｘｂ
ａＩ、及びＸｈｏＩを含有しないことを特徴とするＤＮ
Ａ断片の導入により形質転換された微生物を培養し、得
られた培養物からアルカリプロテアーゼを採取すること
を特徴とするアルカリプロテアーゼの製造方法を提供す
るものである。

【０００８】

【具体的な説明】遺伝子組換え技術による微生物の改良
は一般に先ず遺伝子を、必要により該遺伝子の発現及び
発現生成物の分泌のための遺伝子と共に、その供与細胞
から取り出し、試験管内でベクターＤＮＡと結合させ、
得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に取り込ませる。そ
して目的とする組換え体ＤＮＡを有する宿主細胞を増殖
せしめ、導入遺伝子を発現せしめることによって目的の
生成物を得る。

【０００９】本発明においては、形質転換体におけるア
ルカリプロテアーゼの高い生産性を得るため、目的生成
物であるアルカリプロテアーゼの構造遺伝子と共に、該
構造遺伝子に天然に付随している発現・分泌に必要な領
域、例えばプロモーター領域、プレ・プロ配列コード領
域、ターミネーター領域を用いるのが好ましい。従っ
て、本発明においては、前記構造遺伝子とその関連遺伝
子領域を一体として切り出す。

【００１０】本発明におけるアルカリプロテアーゼの構
造遺伝子およびその関連遺伝子、すなわち発現・分泌の
ための領域を含むＤＮＡ断片は、通常アルカリプロテア
ーゼ生産能を有する微生物の染色体ＤＮＡより適当な制
限酵素によって切り出されたものが用いられるが、原則
としてその由来については特別な制限はなく、例えば土
壌や他の天然物から分離されるアルカリプロテアーゼ生
産能を有する野性株は勿論のこと、それらを紫外線照射
や化学物質による処理をして得られる人工的突然変異株
等いずれでもよい。

【００１１】この様な微生物としては、アルカリプロテ
アーゼ生産能を有するバチルス属微生物であれば特に制
限はなく、例えばバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、
バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ａｍｙｌｏｌｉｑａｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス
・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ）及びバチルス・ステアロサーモフィラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）、並びにその他のバチルス属に属する微生物が
あげられる。特にバチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ−
１４５８０、バチルス・ズブチルスＩＦＯ−３０１３、
バチルス・アミロリクエファシエンスＡＴＣＣ−２３８
４２、バチルス・ステアロサーモフィラスＡＴＣＣ−８
００５、バチルスＮＫＳ−２１（微工研条寄第９３号）
等が適している。

【００１２】上記の染色体供与微生物から、染色体ＤＮ
Ａ断片を得るには、公知の方法、例えばＳａｉｔｏ−Ｍ
ｉｕｒａの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａ
ｃｔａ ７２ ６１９（１９６３））やＭａｒｍｕｒの
方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３ ２０８（１９６
１））等を用いることができるが、これらの方法に限ら
ず他の如何なる方法でもよい。これらの染色体ＤＮＡよ
り該ＤＮＡを切出すのに用いられる制限酵素は、アルカ
リプロテアーゼの構造遺伝子およびその発現・分泌のた
めの領域に切断部位を有しないほうが扱いやすいが、切
断部位を有する制限酵素でも部分切断の条件で用いれば
よく、如何なるものでも使用可能である。

【００１３】この様にして染色体から切り出されたＤＮ
Ａ断片は、それを発現宿主細胞に導入するためのベクタ
ーに直接組み込むこともできるが、一旦クローニングベ
クターに組み込むことによってクローニングし、しかる
後に導入用ベクターに組み込むのが便利である。このよ
うなクローニングベクターとしては、用いる宿主菌中で
複製可能なものであれば何でもよく、例えば枯草菌を宿
主とする場合はｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４，ｐＥ１９
４，ｐＴＰ４，ｐＴＰ５、又はｐＳＤ３０５１（特開昭
６１−８８８７３）、あるいはそれらの一部又は全部を
含む複合プラスミド等が、また大腸菌を宿主とする場合
は、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＨＳＧ３９６，ｐＳ
Ｃ１０１，ｐＳＦ２１２４，ｐＪＢ８，ｐＡｃＹＣ１８
４，ｐＣＲ１，ＲＫ６，ｐＢＲ３２８、又はｐＳＤ３１
６５（特開昭６１−１０４７９０）、あるいはその一部
又は全部を含む複合プラスミド等があげられる。

【００１４】また、クローニングベクターとしてはファ
ージも利用可能であり、枯草菌を宿主とする場合はρ₁₁
ファージ、φ１０５ファージ等を、大腸菌を宿主とする
場合はλファージ、Ｍ１３ファージ等をあげることがで
きる。クローニング用宿主としては、上記クローニング
ベクターを複製することができるものであれば何でもよ
いが、形質転換能が高いほうが望ましく、例えば枯草
菌、大腸菌等があげられる。

【００１５】形質転換の方法は通常用いられる方法で実
施可能であり、例えば枯草菌の場合にはコンピーテント
セル法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ８１ ７４１（１９
６１）〕、プロトプラスト法〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．１６８ １１１（１９７８）〕、またはレスキュ
ー法〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１７７ ４５９
（１９８０）〕等を用いることができ、大腸菌の場合に
はカルシウム法〔Ｊ．Ｍｏｌ．５３ １５９（１９７
０）〕またはルビジウム法〔Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ６８ ｐ２５３ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ（１９７９）〕等を用いることができるが、
これらの方法に限らない。

【００１６】形質転換株は、枯草菌を宿主とする場合に
は選択培地として、スキムミルクまたはカゼインを含む
寒天培地を用いることでコロニーの回りに生ずるクリヤ
ーゾーンで容易に選択できる。大腸菌を宿主とする場合
にはリゾチーム、クロロホルム等で溶菌させた後生じる
クリヤーゾーンによる方法等で選択可能であるがこれら
の方法に限らない。上記により得られた形質転換株によ
り、常法により組換体ＤＮＡを調製し、目的のアルカリ
プロテアーゼの構造遺伝子並びにその発現・分泌に必要
な領域を有するＤＮＡ断片を含む組換体ＤＮＡを得るこ
とができる。

【００１７】上記のＤＮＡ断片は必ずしもその天然の形
態である必要はなく、そのＤＮＡ断片の一部または全部
を含む誘導体としても用いることができる。誘導体ＤＮ
Ａとしては、例えば該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素や、
Ｂａｌ３１、エキソヌクレアーゼIII 、Ｓ１ヌクレアー
ゼなどの酵素等を用いて短小化したＤＮＡ断片や末端に
リンカー等の合成ＤＮＡを結合したＤＮＡ断片、またア
ルカリプロテアーゼの構造遺伝子部分に他の遺伝子のプ
ロモーター領域、シグナル配列、ターミネーター等を結
合したＤＮＡ、等があげられるが、これらに限らず他の
ものでもかまわない。また、アルカリプロテアーゼのア
ミノ酸配列を変えることなく、１個又は複数個の塩基を
置換したＤＮＡや、酵素活性を破壊しない範囲でアミノ
酸の欠失、付加又は置換が行われている蛋白質をコード
するＤＮＡを使用することもできる。

【００１８】本発明はまた、前記のごとき、アルカリプ
ロテアーゼの構造遺伝子とその関連遺伝子を含むＤＮＡ
断片に加えて、これらが宿主細胞に導入された場合にそ
の宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含
有するＤＮＡにも関する。このＤＮＡは典型的にはベク
ターと結合した形をとることができるが、ベクターＤＮ
Ａと結合しない形でも用いることができる。これには線
状ＤＮＡ、環化されたＤＮＡが含まれる。選択可能な遺
伝子マーカーとは宿主菌内で発現するものであれば特に
制限はなく、例えば薬剤耐性遺伝子、アミノ酸生合成遺
伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミン生合成遺伝子、その
他生体内物質の生合成遺伝子などがあげられる。薬剤耐
性遺伝子としては、例えばテトラサイクリン耐性遺伝
子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシ
ン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられ
る。

【００１９】以上の様にしてクローニングされたＤＮＡ
断片は、前記クローニングベクターに組込まれたままで
発現宿主微生物に導入される（すなわち、クローニング
・ベクターがそのまま、発現宿主へＤＮＡ断片の導入の
ためのベクターとして使用される）か、又は他の導入用
ベクターに移された後、あるいはベクターを用いないＤ
ＮＡ断片のみで発現用宿主に導入される。

【００２０】導入用ベクターの種類は発現用宿主の種類
に依存して選択される。本発明の方法において使用する
発現用宿主としては、例えば大腸菌やバチルス属に属す
る細菌が挙げられる。導入用ベクターの選択はまた、導
入された遺伝子の発現宿主中での存在形態をいかにする
か、すなわち、導入された遺伝子を宿主の染色体に組み
込むか、ベクター中に維持するかによっても異る。発現
用宿主として大腸菌を使用する場合には、そのための導
入及び発現用ベクターとしてＣｏｌＥ１，ｐＳＣ１０
１，ｐＳＣ１０５，ｐＳＦ２１２４，ｐＪＢ８，ｐＡｃ
ＹＣ１８４，ｐＣＲ１，Ｒ６Ｋ，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ
３２５，ｐＢＲ３２８，ｐＵＣ１８，ｐＨＳＧ３９６，
ｐＳＤ３１６５等のプラスミドが使用される。

【００２１】他方、バチルス属細菌を発現用宿主として
用い、導入した遺伝子をプラスミド上に維持しようとす
る場合には、導入・発現用ベクターとして、例えば、ｐ
ＵＢ１１０，ｐＣ１９４，ｐＥ１９４，ｐＴＰ５，ｐＳ
Ｄ３０５１（特開昭６１−１６２１８７）等のプラスミ
ドを使用するのが好ましい。また、発現用宿主としてバ
チルス属細菌を使用し、導入された遺伝子を宿主の染色
体に組み込もうとする場合には、導入用ベクターは宿主
細胞中で複製しないことが好ましく、この場合にはバチ
ルス属発現用宿主に遺伝子を導入するためのベクターと
して、大腸菌用ベクター、例えばＣｏｌＥ１，ｐＳＣ１
０１，ｐＳＦ２１２４，ｐＪＢ８，ｐＡｃＹＣ１８４，
ｐＣＲ１，Ｒ６Ｋ，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＢ
Ｒ３２８，ｐＵＣ１８，ｐＨＳＧ３９６，ｐＳＤ３１６
５（特開昭６１−１０４７９０）等のプラスミドを用い
るか、あるいはベクターを用いないでＤＮＡ断片のみを
用いるのが好ましい。

【００２２】前記のごとく、本発明においては、大腸菌
やバチルス属に属する微生物のごとき細菌を用いること
ができるが、大腸菌は培養管理が容易であるが、菌体内
で生産された目的生成物を菌体内に分泌せしめることが
困難であるという問題点を有し、これに対して、バチル
ス属細菌は生産された蛋白を菌体外に分泌するので工業
的見地から有利である。そこでバチルス属細菌を発現用
宿主として用いる場合について詳細に説明する。バチル
ス属の発現用宿主としては、最初に遺伝子が切り出され
た細菌株と同じ株を用いる（すなわち、遺伝子供与株と
発現宿主株を同一にする）こともでき、又は異ることも
できる。

【００２３】遺伝子供与株と発現宿主株とが同一である
場合、宿主株が本来その染色体上に有するアルカリプロ
テアーゼ遺伝子に加えてさらにアルカリプロテアーゼ遺
伝子が人為的に導入されるため遺伝子のコピー数が増加
し、アルカリプロテアーゼの生産性の向上が保証される
こと、宿主株が本来生産するプロテアーゼと導入された
遺伝子により生産される目的プロテアーゼとが同一であ
るから、種類の異るプロテアーゼやその他の蛋白質が夾
雑することがなく、目的プロテアーゼの精製が容易であ
ること、等の利点を有する。他方、アルカリプロテアー
ゼ生産株は通常アルカリ性条件下で培養しなければなら
ないため、培養・醗酵管理が幾分厄介である。

【００２４】これに対して、バチルス・ズブチリス等、
通常の条件下で培養することができる株を発現用宿主と
して用いれば、その培養・醗酵管理が極めて容易にな
り、工業的見地から有利であるが、他方、宿主が本来生
産するプロテアーゼと導入された遺伝子が生産するプロ
テアーゼとが異るため、目的プロテアーゼの精製に困難
が伴う等、別途解決しなければならない問題点が存在す
る。本発明に用いられる宿主菌として代表的なものを列
挙すれば、バチルス・ズブチルス、バチルス・リケニホ
ルミス、バチルス・アミロリクェファシェンス、バチル
ス・アルカロフィラス、バチルス・ステアロサーモフィ
ラス、バチルス・セレウス、バチルス・ブレビス、バチ
ルス・チューリンゲンシス、バチルスＮＫＳ−２１等が
ある。

【００２５】宿主が本来生産するプロテアーゼが目的プ
ロテアーゼに夾雑するという前記の問題点を解決するた
めの１つの方法として、発現宿主としてプロテアーゼ非
生産性株を用いる方法がある。この様な菌株は前記のバ
チルス属の株を人為的に変異処理して得ることができ
る。尚、本発明においてＤＮＡを染色体に挿入する場合
には、導入されるＤＮＡと宿主菌の染色体ＤＮＡの一部
とが相同であることが必要であるが、導入されるＤＮＡ
の他の部分に宿主菌の染色体ＤＮＡとの相同性があれ
ば、アルカリプロテアーゼの構造遺伝子およびその発現
・分泌のための領域を含むＤＮＡ断片が宿主菌の染色体
ＤＮＡと相同性を有することは必ずしも必要ではない。

【００２６】該ＤＮＡの上記宿主菌への形質転換は、公
知の方法、例えばコンピーテントセル法〔Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．８１ ７４１（１９６１）〕或いはプロト
プラスト法〔Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １６
８，１１１（１９７９）〕等で実施可能であるが、これ
らの方法に限らず、如何なる方法でも可能である。尚、
形質転換にあたり、導入ＤＮＡが環状でない場合は、形
質転換頻度の向上のため、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ
等の酵素を用いて環状にしておくことが望ましい。

【００２７】形質転換の選択は、スキムミルクあるいは
カゼインを加えた寒天培地上でのクリアーゾーン形成や
導入ＤＮＡに結合した遺伝子マーカーの発現により行な
うことができるが、他の方法でも可能である。上記のよ
うにして得た形質転換株を培養する培地としては特に制
限はなく、該形質転換株が生育すれば用いることが可能
である。以下に本発明のプロテアーゼの製造法について
代表的な例を示し、更に具体的に説明する。但しこれら
は単なる例示であり、本発明はこれらのみに限られな
い。

【００２８】実施例１．プラスミドｐＨＳＧ３９６（宝
酒造株式会社）ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩで切断し、同様にＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで
切断し、大腸菌アルカリフォスファターゼにより末端リ
ン酸エステル結合を加水分解したプラスミドｐＵＢ１１
０〔Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
５，１４２８（１９７８）〕ＤＮＡとそれら生じたＤＮ
Ａ末端の数が同じになるように混合し、Ｔ４ファージＤ
ＮＡリガーゼを用いて結合反応を行った。

【００２９】このＤＮＡを用い、バチルス・ズブチルス
ＢＤ２２４（ｔｒｐＣ２ ｔｈｒ５ｒｅｃＥ４）をプロ
トプラスト法により形質転換し、カナマイシン耐性の形
質転換株を選択した。これらの形質転換株より、常法に
よりプラスミドＤＮＡを抽出・精製し、分析した結果ｐ
ＵＢ１１０のＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ切断点の間に、ｐ
ＨＳＧ３９６のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
間の部分が挿入された約３．８kbp の組換体プラスミド
ｐＳＤＴ８００（図１）を得た。

【００３０】他方、Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａの方法によ
り得たバチルスＮＫＳ−２１の染色体ＤＮＡを制限酵素
ＣｌａＩで切断し、同じくＣｌａＩで切断し、大腸菌ア
ルカリフォスターゼにより末端リン酸エステル結合を加
水分解したｐＳＤＴ８００と混合し、Ｔ４ファージＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合反応を行なう。このＤＮＡを用
いバチルス・ズブチルスＢＤ２２４をプロトプラスト法
で形質転換し、カナマイシン耐性の形質転換株を選択す
る。

【００３１】得られたカナマイシン耐性の形質転換株を
カナマイシン７０ppm 、スキムミルク２％を含むＬ寒天
培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％
塩化ナトリウム、１．５％寒天）に植え継ぎ３７℃で１
８時間保温し、クリアーゾーン形成を調べた。約２００
００株のカナマイシン耐性形質転換株について調べた結
果３株が、コロニーのまわりに大きなクリアーゾーンを
形成することを見出した。これら３株より、常法に従い
プラスミドＤＮＡを抽出精製し、分析したところいずれ
もｐＳＤＴ８００のＣｌａＩ切断部位に約３．２kbp の
ＤＮＡを挿入した組換体ＤＮＡが得られた。このＤＮＡ
をｐＳＤＴ２８２と命名した（図２）。

【００３２】ｐＳＤＴ２８２を用いてバチルス・ズブチ
ルスＢＤ２２４をコンピーテントセル法により形質転換
し、カナマイシン耐性の形質転換株を選択した。得られ
たカナマイシン耐性形質転換株はスキムミルク２％を加
えたＬ寒天培地で１００％大きなクリアーゾーンを形成
した。この形質転換株をＬ液体培地で２１時間培養し、
その培養上清のプロテアーゼ活性を測定したところこの
形質転換株はアルカリプロテアーゼを大量に分泌生産し
ていることが示された。

【００３３】プロテアーゼの活性は次の様にして測定し
た。培養上清を０．１Ｍ炭酸ソーダ０．１Ｍホウ酸一塩
化カリウム緩衝液（pH１０．０）で適当に希釈した液
０．５mlにpH１０．０の２％ミルクカゼイン溶液０．５
mlを加えて、３０℃で１０〜３０分酵素反応をさせた。
酵素反応の終了は０．２Ｍ酢酸−０．２Ｍ酢酸ソーダ緩
衝液を含む０．１Ｍトリクロル酢酸２mlを加えて反応を
停止させた。

【００３４】３０℃、１０分以上放置後濾紙を用いて濾
過した。濾液１mlに０．４Ｍ炭酸ソーダ５ml、６倍希釈
のフェノール試薬１mlを添加し、３０℃、２０分間放置
して発色させたのち６６０nmにおける吸光度を測定す
る。なお、酵素単位は国際酵素委員会の「エンザイムノ
ーメンクレイチャー」に従い、３０℃でpH１０．０の１
％カゼインを基質とし１秒間チロシン１モル相当量の６
６０nmの発色を示すトリクロル酢酸可溶性物質を遊離す
るアルカリプロテアーゼ量を１カタール（ｋａｔａｌ）
とする。

【００３５】また、この培養上清を抗原とし、枯草菌お
よびバチルスＮＫＳ−２１のアルカリプロテアーゼに対
する抗血清を用いた免疫二重拡散法の結果該形質転換株
の分泌するアルカリプロテアーゼはバチルスＮＫＳ−２
１型のものであることも判明した。

【００３６】ｐＳＤＴ２８２中の挿入ＤＮＡ断片の制限
酵素切断点（下方）、と、塩基配列の決定に基いて推定
される遺伝子中の各機能領域（上方）の関連を図３に示
す。約３．２kbp から成るＣｌａＩ断片は、制限酵素切
断点ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，Ｓ
ｍａＩ，ＸｂａＩ及びＸｈｏＩを含有していなかった。
アルカリプロテアーゼ関連遺伝子、すなわち、約２００
〜３００bpのプロモーター領域、約９０bpのＰｒｅ体コ
ード領域、約２７０bpのＰｒｏ体コード領域、約８２０
bpのアルカリプロテアーゼ構造遺伝子及び約１００bpの
ターミネーター領域がＨｐａＩ−ＨａｅIII 間の約２３
００bpの範囲に含まれる。

【００３７】実施例２．ｐＳＤＴ２８２を用いバチルス
ＮＫＳ−２１をプロトプラスト法により形質転換し、カ
ナマイシン耐性の形質転換株を取得した。該形質転換株
をカゼイン１％、ミートエキス１％、ポリペプトン１
％、及び炭酸水素ナトリウム１％を含有し、水酸化ナト
リウムでpHを９．５に調整した培地３００ml中で６６時
間振とう培養し、培養上清の酵素活性を測定したところ
２３．１マイクロカタール／ｌの酵素活性を示した。こ
れは平行して培養したバチルスＮＫＳ−２１の約５．１
倍であった。

【００３８】実施例３．プラスミドｐＨＳＧ３９６のＤ
ＮＡを制限酵素ＣｌａＩで切断し、大腸菌アルカリフォ
スファターゼにより末端リン酸エステル結合を加水分解
し、同様にＣｌａＩで切断したｐＳＤＴ２８２と混合
し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼで結合させる。このＤ
ＮＡを用い大腸菌ＪＭ１０５（ｔｈｉ ｒｐｓＬ ｅｎ
ｄＡ ｓｂｃＢ１５ ｈｓｐＲ４，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ
ＡＢ），〔Ｆ′，ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃ⁸
ＺΔＭ１５〕）をカルシウム法により形質転換し、クロ
ラムフェニコール耐性でかつ、イソプロピル−β−Ｄ−
チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドール−β−ガラクトシド
（Ｘ−Ｇａｌ）添加により白色コロニーを形成する形質
転換株を取得した。

【００３９】該形質転換株より組換体ＤＮＡを抽出精製
し、分析した結果、ｐＨＳＧ３９６のＣｌａＩ切断部位
に約３．２kbp のｐＳＤＴ２８２のＣｌａＩ切断断片が
挿入された組換体ＤＮＡ ｐＳＤＴ８１２が得られた
（図４）。

【００４０】実施例４．プラスミドｐＳＤ３１６５（特
開昭６１−１０４７９０）のＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩ
で切断し、大腸菌アルカリフォスファターゼにより末端
リン酸エステル結合を加水分解し、同様にＣｌａＩで切
断したｐＳＤＴ２８２と混合し、Ｔ４ファージＤＮＡリ
ガーゼで結合させる。このＤＮＡを用い大腸菌ＪＭ１０
５をカルシウム法により形質転換し、アンピシリン、テ
トラサイクリン、クロラムフェニコールにいずれも耐性
を有する形質転換株を取得する。該形質転換株より組換
体ＤＮＡを抽出精製し、分析した結果ｐＳＤＹ３１６５
のＣｌａＩ切断部位に、約３．２kbp のｐＳＤＴ２８２
のＣｌａＩ切断断片が挿入された組換体ＤＮＡ ｐＳＤ
Ｔ８３１が得られた（図５）。

【００４１】実施例５．実施例４において作製したプラ
スミドｐＳＤＴ８３１を用い、バチルスＮＫＳ−２１を
プロトプラスト法で形質転換し、クロラムフェニコール
耐性の形質転換体を得た。この形質転換株をカゼイン１
％、ミートエキス１％、ポリペプトン１％、炭酸水素ナ
トリウム１％を含有し、水酸化ナトリウムでpHを９．５
に調整した培地３００ml中で６６時間振とう培養し、培
養上清の酵素活性を測定したところ８．６マイクロカタ
ール／ｌの酵素活性を示した。これは平行して培養した
バチルスＮＫＳ−２１の約１．９倍であった。

【００４２】実施例６．実施例１において作製したプラ
スミドｐＳＤＴ２８２をＨａｅIII で切断し、アガロー
スゲル電気泳動法により各断片を分離する。アルカリプ
ロテアーゼの構造遺伝子およびその発現分泌のための領
域を含む約２．６kbのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル
部分を切りとり、常法によりＤＮＡを分離、精製した。
このＤＮＡ断片にＴ４−ファージＤＮＡリガーゼを作用
させ環状のＤＮＡにした。このＤＮＡを用い、バチルス
ＮＫＳ−２１にプロトプラスト法で形質転換する。

【００４３】得られた形質転換体を２％スキムミルクを
含んだＬ寒天培地に移し、大きなクリアーゾーンを形成
する株を選択した。該形質転換株をカゼイン１％、ミー
トエキス１％、ポリペプトン１％、及び炭酸水素ナトリ
ウム１％を含有し、水酸化ナトリウムでpHを９．５に調
整した培地３００mlで６６時間振とう培養し、培養上清
の酵素活性を測定したところ、７．７マイクロカタール
／ｌの酵素活性を示した。これは平行して培養したバチ
ルスＮＫＳ−２１の約１．７倍であった。

【００４４】実施例７．バチルス・ズブチルスＵＯＴ０
５３１（ＴｒｐＣ２，Ｌｅｕ Ａ８）（東京大学応用微
生物研究所）をＬ寒天培地で３０℃一晩生育させ、その
一白金耳量を０．５％酵母エキスを含むスピザイゼン培
地〔（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ０．２％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ １．４
％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．６％、クエン酸ナトリウム２Ｈ₂
Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ₄ ７Ｈ₂ Ｏ ０．０２％、グル
コース０．５％〕で対数増殖期中期まで培養した。培養
液を１００００Ｇ１０分間遠心分離して菌体を集め、Ｔ
ＭＮ緩衝液（０．１５％ ＮａＣｌ，１０mM ＭｇＣｌ
₂ ，１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０）で２回洗浄
した。

【００４５】次に菌体を５ml ＴＭ緩衝液（１０mM Ｍ
ｇＣｌ₂ ，１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０）に懸
濁し、０．５mgのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンを添加し、３７℃で１５分間振とうし
た。１００００Ｇ１０分間遠心分離して菌体を集めＴＭ
Ｎ緩衝液で２回洗浄後、２％スキムミルクを含むＬ寒天
培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％
ＮａＣｌ、１．５％寒天）に広げた。約１００００個の
コロニーの中から１株クリアーゾーンを形成しない株を
取得した。

【００４６】該菌株をＬ液体培地で３７℃２１時間培養
し、培養上清のプロテアーゼ活性をアンソン・ヘモグロ
ビン法（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２ ７９（１
９３８））によりpH７．０，pH１０．０で測定したとこ
ろ、０．１ナノカタール／ml以下であった。本菌株をバ
チルスＳＤ−８００と命名した。

【００４７】実施例８．ｐＳＤＴ２８２を用いバチルス
ＳＤ８００をプロトプラスト法により形質転換し、カナ
マイシン耐性の形質転換体を選択した。該形質転換株
を、カゼイン１％、ミートエキス１％及びポリペプトン
１％を含有し、炭酸ナトリウムでpH７．５に調整した培
地３００ml中で６６時間振とう培養し、培養上清の酵素
活性を測定したところ１８．６マイクロカタール／ｌの
酵素活性を示した。

【００４８】実施例９．ｐＳＤＴ２８２をＨａｅIII で
切断し、アガロースゲル電気泳動法により各断片を分離
する。アルカリプロテアーゼの構造遺伝子およびその発
現分泌のための領域を含む約２．６kbp のＤＮＡ断片を
含むアガロースゲル部分を切りとり、常法によりＤＮＡ
を分離、精製した。このＤＮＡ断片にＴ４ファージＤＮ
Ａリガーゼを作用させ環状のＤＮＡにした。

【００４９】このＤＮＡを用い、バチルスＳＤ ８００
をプロトプラスト法により形質転換した。得られた形質
転換株を２％スキムミルクを含んだＬ寒天培地に移し大
きなクリアーゾーンを形成する株を選択した。該形質転
換株（バチルスＳＤ−２００１）（微工研条寄第９７０
６号）をカゼイン１％、ミートエキス１％及びポリペプ
トン１％を含有し、炭酸ナトリウムでpH７．５に調整し
た培地３００ml中で６６時間振とう培養し、培養上清の
酵素活性を測定したところ７．９マイクロカタール／ｌ
の酵素活性を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、クローニング用ベクターｐＳＤＴ８０
０の制限酵素切断点地図を示す。

【図２】図２は、図１に示すｐＳＤＴ８００のＣｌａＩ
部位に、染色体由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含
む約３．２kbp のＣｌａＩ−ＤＮＡ断片が挿入されたバ
チルス用プラスミドｐＳＤＴ２８２の制限酵素切断点地
図を示す。

【図３】図３は、染色体由来の前記約３．２kbp のＣｌ
ａＩ−ＤＮＡ断片の制限酵素切断片地図（Ｂ）、並びに
アルカリプロテアーゼ構造遺伝子及びそれに関連する領
域の推定される位置（Ａ）を示す。（Ｂ）における数値
は各制限酵素切断点間のおよその塩基対の数を示す。
（Ａ）において、ｐは推定されるプロモーター領域、Ｐ
ｒｅは推定されるプレ体コード領域、Ｐｒｏは推定され
るプロ体コード領域、Ｍは成熟アルカリプロテアーゼの
コード領域（構造遺伝子）、そしてＴは推定されるター
ミネーター領域を示し、数字は各領域のおよその塩基対
数を示す。

【図４】図４は、プラスミドｐＳＤＴ２８２由来のアル
カリプロテアーゼ遺伝子を含有する約３．２kbのＣｌａ
Ｉ−ＤＮＡ断片を含有する大腸菌プラスミドｐＳＤＴ８
１２の制限酵素切断点地図を示す。

【図５】図５は、プラスミドｐＳＤＴ２８２由来のアル
カリプロテアーゼ遺伝子を含有する約３．２kbのＣｌａ
Ｉ−ＤＮＡ断片を含有する大腸菌プラスミドｐＳＤＴ８
３１の制限酵素切断片地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） ） (Ｃ１２Ｎ 15/09 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 藤原 嘉夫 東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電 工株式会社 生化学研究所内 (72)発明者 福山 志朗 東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電 工株式会社 生化学研究所内

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物
   由来のアルカリプロテアーゼをコードする構造遺伝子を
   含有するＤＮＡ断片であって、 （ａ）該ＤＮＡ断片は制限酵素切断点ＨｐａＩとＨａｅ
   III(２) とにより両端を規定されるアルカリプロテアー
   ゼ構造遺伝子含有領域を含んで成り； （ｂ）前記制限酵素切断点ＨｐａＩとＨａｅIII(２) と
   の間に他の制限酵素切断点ＨｉｎｄIII ，ＳｐｈＩ及び
   ＳａｃＩを含有し；且つ前記の制限酵素切断点の位置関
   係が下記制限酵素地図： 【化１】 の通りであり；そして （ｃ）前記制限酵素切断片ＨｐａＩとＨａｅIII(２) と
   の間に制限酵素切断点ＣｌａＩ，ＢｇｌII，ＢａｍＨ
   Ｉ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，Ｘｂ
   ａＩ、及びＸｈｏＩを含有しない；ことを特徴とするＤ
   ＮＡ断片を含むＤＮＡの導入により形質転換された微生
   物を培養し、得られた培養物からアルカリプロテアーゼ
   を採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製
   造方法。
2. 【請求項２】 前記形質転換された微生物がバチルス
   （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌であり、そして生
   産されたアルカリプロテアーゼを菌体外培養液から採取
   することを特徴とする、請求項１に記載の方法。