JPH07184649A

JPH07184649A - 新規なプロテアーゼ、該酵素の製造方法、該酵素をコードする遺伝子、該酵素の変異体酵素

Info

Publication number: JPH07184649A
Application number: JP7222394A
Authority: JP
Inventors: Tadayuki Imanaka; 忠行今中; Shigeru Kawano; 茂川野; Takuya Maeda; 拓也前田; Masahiro Takagi; 昌宏高木
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1994-04-11
Publication date: 1995-07-25

Abstract

(57)【要約】【目的】タンパク質またはペプチドの限定分解などに
有用な新規なプロテアーゼを提供する。【構成】ラクトバチルス属に属する微生物が新規なプ
ロテアーゼＮｐｒＬを生産することを見いだし、該酵素
をコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を
明らかにした。また、該酵素を精製し、その酵素化学的
性質を明らかにした。更に、プロテアーゼＮｐｒＬのア
ミノ酸を置換させた変異型プロテアーゼを作成し、新た
な特異性を持ったプロテアーゼを得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な酵素、該酵素を
用いてタンパク質またはペプチドを選択的に加水分解す
る方法、微生物を用いた該酵素の製造方法、該酵素をコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクター
を含む形質転換体、該酵素の変異体酵素、該変異体酵素
をコードする遺伝子、該変異体酵素を用いてタンパク質
またはペプチドを選択的に加水分解する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より動物、植物、微生物などから数
多くのプロテアーゼが単離され、食品加工、光学分割、
タンパク質やペプチドの低分子化や限定分解、ペプチド
やタンパク質の合成、洗剤など数多くの分野で工業化さ
れ、利用されている。特に、特異性の厳密なプロテアー
ゼは、タンパク質やペプチドの限定分解、遺伝子組換え
技術により生産した融合タンパク質からの目的とするタ
ンパク質、ペプチド部分の切り出し、ペプチドの合成な
どに有用である。

【０００３】特異性の厳密なプロテアーゼのうち、カル
ボキシル末端側のペプチド結合を特異的に加水分解する
プロテアーゼとしては、アルギニン、リジンのカルボキ
シル末端側のペプチド結合を特異的に加水分解するトリ
プシン、リジンのカルボキシル末端側のペプチド結合を
特異的に加水分解するリジルエンドペプチダーゼ、酸性
アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）のカルボキ
シル末端側のペプチド結合を特異的に加水分解するＶ８
プロテアーゼ、プロリンのカルボキシル末端側のペプチ
ド結合を特異的に加水分解するプロリルエンドペプチダ
ーゼ、アスパラギンのカルボキシル末端側のペプチド結
合を特異的に加水分解するアスパラギニルエンドペプチ
ダーゼなどが知られている。

【０００４】また、疎水性アミノ酸に特異的なプロテア
ーゼとしては、チロシンやフェニルアラニンなどの芳香
族アミノ酸のカルボキシル末端側のペプチド結合を優先
的に加水分解するキモトリプシン、ロイシン、バリン、
イソロイシンなど疎水性アミノ酸のアミノ末端側のペプ
チド結合を優先的に加水分解するサーモリシンなどが知
られている。

【０００５】しかし、ロイシンまたはフェニルアラニン
のアミノ末端側で優先的にペプチド結合を加水分解する
プロテアーゼは知られていなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ロイ
シンまたはフェニルアラニンのアミノ末端側で優先的に
ペプチド結合を加水分解するプロテアーゼＮｐｒＬを提
供することにある。また、該酵素を用いてタンパク質ま
たはペプチドを選択的に加水分解することにある。ま
た本発明の目的は、微生物を用いて該酵素を製造するこ
とにある。

【０００７】本発明の別の目的は、該酵素をコードする
遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む形
質転換体を提供することにある。

【０００８】本発明の更なる目的は、該酵素の変異体酵
素、該変異体酵素をコードするＤＮＡを提供することに
ある。また、該変異体酵素を用いてタンパク質またはペ
プチドを選択的に加水分解することにある。

【０００９】

【問題点を解決するための手段】本発明者は、前記目的
を達成するため鋭意検討の結果、ペプチド性抗生物質で
あるグラミシジンＳを分解し、窒素源として利用できる
微生物が、新規なプロテアーゼを生産することを見いだ
した。そして該プロテアーゼをＮｐｒＬと命名した。

【００１０】即ち、本発明は、次の〜に示す性質を
有するプロテアーゼＮｐｒＬを提供するものである。

【００１１】作用：ペプチドまたはタンパク質に作用
し、ペプチド結合を加水分解する。

【００１２】基質特異性：ロイシンまたはフェニルア
ラニンのアミノ末端側で優先的にペプチド結合を加水分
解する至適ｐＨ及びｐＨ安定性：至適ｐＨは７〜９であり、
中性から弱アルカリ性で安定である。

【００１３】本発明の酵素は上記の条件を満たすもので
あればいかなる酵素でもよいが、典型的な本願発明の酵
素の上記以外の理化学的性質、及び酵素学的性質は以下
の通りである。

【００１４】作用適温の範囲：至適反応温度は、６０
℃である。

【００１５】阻害剤に対する挙動：ＰＭＳＦ（フェニ
ルメタンスルフォニルフルオリド）では活性が阻害され
ず、金属イオンキレーターであるＥＤＴＡ（エチレンジ
アミン４酢酸）により活性が阻害される。

【００１６】分子量：ドデシル硫酸ナトリウム存在下
におけるポリアクリルアミド電気泳動において分子量は
約３７０００である。

【００１７】なお、プロテアーゼＮｐｒＬの酵素活性の
測定方法は以下の通りである。

【００１８】５ｍｇ／ｍｌのアゾカゼイン（シグマ社
製）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）及
び５ｍＭ塩化カルシウムからなる基質液６００μＬに、
酵素液２００μＬを混合し、３７℃で２０分反応させ
た。停止液（１５％トリクロロ酢酸）を４８０μＬ添加
して反応を停止し、卓上遠心分離機で１５０００回転／
分で１０分間遠心分離し、上清６００μＬを別のチュー
ブに取った。この上清に、１０Ｎ水酸化ナトリウム３０
μＬを添加混合し、４４０ｎｍの吸光度を測定した。対
照は、酵素液と停止液を添加する順番を逆にした。活性
の単位（１Ｕ）は、光路長１ｃｍのキュベットを用いて
上記反応条件下に、吸光度を０．１増加させる酵素活性
とした。

【００１９】また、プロテアーゼＮｐｒＬの精製は、例
えば以下の方法で行うことができる。

【００２０】プロテアーゼＮｐｒＬ生産能を有するラク
トバチルス属に属する微生物またはプロテアーゼをコー
ドする遺伝子が導入された微生物を培養し、培養液を遠
心分離して培養上清を得る。培養上清を限外濾過などに
より濃縮し、硫安を８５％飽和まで添加する。遠心分離
により沈澱を回収し、適当な緩衝液に溶解し（例えば、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び５ｍＭ塩
化カルシウム）、同緩衝液に対して透析後、ＤＥＡＥ−
セファデックス（Sephadex）−５０カラムに添加し、塩
濃度勾配で溶出し、活性画分を得ることにより精製でき
る。

【００２１】次に、プロテアーゼＮｐｒＬ生産能を有す
る微生物について記述する。本発明のプロテアーゼＮｐ
ｒＬを生産する微生物は、通常以下の性質を有してい
る。

【００２２】（１）形態：短桿菌（２）胞子形成：形成しない（３）グラム染色：陽性（４）カタラーゼ：陰性（５）絶対好気条件：増殖せず（６）通性好気もしくは微好気条件：増殖する（７）グルコースからの酸生成：する（８）グルコースからのガス生成：しない（９）硫化水素の生成：しない（１０）増殖温度：２５〜４５℃ （１１）増殖ｐＨ：５．０〜９．５これらの性質を「ＡｎａｅｒｏｂｅＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ（第４版）」に記載の方法により分
類同定した結果、前記性質を有する微生物はラクトバチ
ルス（Lactobacillus ）属に属することが明らかになっ
た。本発明にかかるラクトバチルス属に属する微生物
は、プロテアーゼＮｐｒＬをコードする遺伝子をゲノム
内に含み、プロテアーゼＮｐｒＬ産生能を有する限り特
に限定されない。好ましいラクトバチルス属に属する微
生物としては、例えば、ラクトバチルス・エスピー（La
ctobacillus sp. ）Ｎｏ．１が挙げられる。この微生物
は、平成５年３月２６日に通産省工業技術院生命工学工
業技術研究所に微生物菌寄第Ｐ−１３５６３号（ＦＥＲ
ＭＰ−１３５６３）として寄託されている。

【００２３】ラクトバチルス属に属する微生物は、本発
明のプロテアーゼＮｐｒＬ以外にも菌体外にプロテアー
ゼを分泌し、プロテアーゼＮｐｒＬの生産量が低下する
場合がある。この場合には、プロテアーゼＮｐｒＬをよ
り効率よく生産するために、プロテアーゼＮｐｒＬをコ
ードする遺伝子をクローニングし、該遺伝子を任意のプ
ロモーターの支配下に大腸菌、枯草菌など適当な宿主微
生物において発現することにより生産することが望まし
い。また、プロテアーゼＮｐｒＬをコードするＤＮＡを
得ることにより、プロテアーゼを構成するいくつかのア
ミノ酸が欠失、置換、挿入した変異型プロテアーゼを容
易に作成でき、プロテアーゼの特異性、安定性などが変
化したプロテアーゼを容易に製造することが可能とな
る。

【００２４】プロテアーゼＮｐｒＬをコードするＤＮＡ
としては、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡが挙げられ、特に配列番号１に示す塩基配
列を有するＤＮＡが挙げられる。

【００２５】プロテアーゼＮｐｒＬのクローニングは、
プロテアーゼを生産するラクトバチルス属に属する微生
物より染色体ＤＮＡを調製し、適当な制限酵素により切
断したＤＮＡ断片を適当なベクターに導入し、得られた
プラスミドを適当な宿主に導入し、プロテアーゼ生産能
を付与された形質転換株を選択することにより行うこと
ができる。

【００２６】例えば、ラクトバチルス・エスピーＮｏ．
１株より染色体ＤＮＡを調製し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
で部分消化した後、ＤＮＡ断片を温度制御可能な発現ベ
クターｐＩＳＡ^ts４１２のＢａｍＨＩ部位に導入し、菌
体外プロテアーゼ活性が低下した宿主バチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis ）ＤＢ１０４株に導入し、テ
トラサイクリン及びカゼインを含むプレートに植菌し、
プロテアーゼ生産能を付与されたことによりプレート上
にクリアーゾーンを形成する形質転換株を選択する。得
られた形質転換株が保有するプラスミドのＢａｍＨＩ挿
入断片の塩基配列を明らかにすることによりプロテアー
ゼＮｐｒＬをコードするＤＮＡ配列及び該ＤＮＡがコー
ドするアミノ酸配列を決定することができる。

【００２７】本発明のＤＮＡの発現は、大腸菌、枯草
菌、乳酸菌など発現しようとする宿主に合わせてその宿
主中で機能するベクターを選択し、そのベクター上にプ
ロモーター、ターミネーターとともにアミノ酸配列をコ
ードする部分（オープンリーディングフレーム）を適当
な位置に挿入し、得られたプラスミドにより宿主を形質
転換し、得られたプロテアーゼＮｐｒＬ生産性を付与さ
れた形質転換株を培養することにより行うことができ
る。

【００２８】例えば、枯草菌由来のアルカリプロテアー
ゼや中性プロテアーゼ、アミラーゼのプロモーター、黄
色ブドウ球菌由来のプロテインＡのプロモーター、大腸
菌由来のβ−ガラクトシダーゼやトリプトファンオペロ
ン、ファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼやλ_PLプロ
モーターなどの制御下において発現することにより実施
できる。

【００２９】好ましいプロモーターには、安全性及び分
泌生産能が高いバチルス属細菌において効率的に機能す
るプロモーター、例えば枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子
（amy Ｅ）のプロモーター等が含まれる。なお、プロモ
ーターは、アミノ酸配列に基づいて化学合成してもよ
い。

【００３０】プラスミドベクターには、通常、リボソー
ム結合部位として機能するＳＤ（Shine-Dalgarno）配列
が前記プロモーターの下流側に連結されている場合が多
い。ＳＤ配列は、通常、前記プロテアーゼＮｐｒＬをコ
ードする遺伝子と前記プロモーターとの間に連結され
る。

【００３１】また、分泌蛋白質をコードするＤＮＡの翻
訳開始点から下流側には、シグナル配列を有している場
合が多い。前記バチルス属細菌、特に枯草菌由来のプロ
モーターを利用する場合、プロテアーゼＮｐｒＬの分泌
生産能を高めるため、分泌蛋白質のシグナル配列を利用
するのが有効である。分泌蛋白質のシグナル配列として
は、枯草菌（バチルス・サブチリス）、バチルス・アミ
ロリキファシエンス、バチルス・リケニホルミスなどの
バチルス属細菌が分泌する蛋白質のシグナル配列（例え
ばα−アミラーゼ、アルカリプロテアーゼ、中性プロテ
アーゼ、レバンシュークラーゼなどのシグナル配列）が
含まれる。前記シグナル配列のうち、特に枯草菌のα−
アミラーゼのシグナル配列が好適に利用される。

【００３２】また、前記ＳＤ配列の下流に連結されたプ
ロテアーゼＮｐｒＬ遺伝子の下流には、ターミネーター
が連結されていてもよい。ターミネーターは、特に限定
されず、例えば、枯草菌のα−プロテアーゼ遺伝子、ア
ルカリプロテアーゼ遺伝子のターミネーターや、これに
対応して化学合成したターミネーターなどであってもよ
い。

【００３３】プロテアーゼＮｐｒＬ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を、制限酵素で切断したベクターに結合させること
により、プラスミドベクターを構築できる。また、リボ
ソームＤＮＡとの相同組換えなどを利用して、染色体Ｄ
ＮＡに導入して発現させることも可能である。ベクター
は、宿主内で安定に複製可能であればよく、宿主の種類
に応じて適当に選択できる。宿主が枯草菌である場合、
ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＵＢ１１０、
ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＨＴ１５、ｐＢＤ１６、
温度制御可能な発現ベクターｐＩＳＡ^ts４１２やその誘
導体などが使用できる。

【００３４】好ましいベクターには、例えば、α−アミ
ラーゼ遺伝子（Amy Ｅ）のシグナル配列の下流側に、制
限酵素ＢａｍＨＩの認識部位を有する１４．２ｋｂの環
状プラスミドである温度制御可能な発現ベクターｐＩＳ
Ａ^ts４１２などが含まれる。

【００３５】なお、組換えプラスミドベクターの構築
は、「Molecular Cloning （第２版），J.Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)」な
どに記載された公知の方法、例えば、前記プロモータ
ー、ＳＤ配列、シグナル配列遺伝子、プロテアーゼＮｐ
ｒＬ遺伝子およびターミネーターをベクターに連結する
ことにより、本発明の組換えプラスミドベクターを構築
できる。

【００３６】なお、制限酵素によるプロテアーゼＮｐｒ
Ｌ遺伝子の切断部位、制限酵素によるベクターの切断部
位は、特に制限されないが、例えば、制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩにより部分消化したプロテアーゼＮｐｒＬ遺伝子の
ＤＮＡ断片を用いる場合、このＤＮＡ断片は、前記ベク
ターｐＩＳＡ^ts４１２の制限酵素ＢａｍＨＩによる切断
部位に導入することができる。ベクターｐＩＳＡ^ts４１
２の制限酵素ＢａｍＨＩによる切断部位にプロテアーゼ
ＮｐｒＬ遺伝子のＤＮＡ断片が導入されたプラスミドを
プラスミドｐＮＰ４５と称する。

【００３７】このようにして得られたプラスミドベクタ
ーを、宿主に導入して形質転換することにより、プロテ
アーゼＮｐｒＬの生産性の高い微生物（形質転換株）が
得られる。

【００３８】前記プラスミドベクターによる宿主の形質
転換は、慣用の方法、例えば、カルシウムイオンなどを
用いるコンピテントセル法、ポリエチレングリコールに
よるプロトプラスト形質転換法［Chang, S., et al., M
ol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979)］などを利用し
て行うことができる。

【００３９】前記宿主としては、例えば、大腸菌、枯草
菌、乳酸菌、酵母などが挙げられる。宿主微生物のう
ち、バチルス（Bacillus）属の微生物は、大腸菌などと
は異なり、エンドトキシンを生産しないこと、人体に寄
生しないことなどの理由から極めて安全性の高い微生物
である。また、蛋白質を菌体外に分泌生産する能力を有
しており、日本においては古くから納豆の製造に用いら
れている他、酵素、アミノ酸、抗生物質などの工業的な
生産菌としても用いられており、極めて利用しやすい微
生物である。

【００４０】バチルス属細菌の中でも好ましい宿主は、
安全性が高く、菌体外に蛋白質を多量に分泌する枯草菌
［バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）］であ
る。さらに、枯草菌の中でも、突然変異などの手法によ
り菌体外へのプロテアーゼ活性を低下させた菌株が好ま
しい。このような菌株を宿主とすると、宿主由来のプロ
テアーゼによる分解を抑制できるため、プロテアーゼＮ
ｐｒＬの生産に有利である。

【００４１】プロテアーゼ活性の低い枯草菌には、例え
ば、バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株［バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.），128;
601-606, 1985］；バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株
にpap 遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＤＹ−１
６株（微工研菌寄第９４８８号）；アルカリプロテアー
ゼおよび中性プロテアーゼの生産能を欠き、且つプロテ
アーゼ活性が野生株の３％以下の枯草菌に、sp o 0A△67
7 変異遺伝子を導入した菌株などが挙げられる。好まし
い菌株には、例えば、バチルス・サブチリス１０４ＨＬ
株にspo 0A△677 変異遺伝子を導入したバチルス・サブ
チリスＳＰＯ１１株（微工研菌寄第１０９８７号）、バ
チルス・サブチリスＤＹ−１６株にspo 0A△677 変異遺
伝子を導入したバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株（微
工研菌寄第１０９８８号）などが含まれる（特開平３−
１４３３８７号公報参照）。

【００４２】菌体外プロテアーゼ活性が低下した好まし
い宿主のうち、バチルス・ズブチリスＤＢ１０４株は、
分泌生産能が高く、宿主としての安全性が高く、菌体外
にほとんどプロテアーゼを生産しないという特色があ
る。

【００４３】なお、形質転換株は、前記ベクターのマー
カー、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子などを利用
して、カゼインなどを含む固体培地などに植菌し、培地
プレート上にクリアーゾーンを形成する形質転換株を選
択することにより得ることができる。

【００４４】前記プラスミドｐＮＰ４５を含むバチルス
・ズブチリスＤＢ１０４株は、平成５年３月２６日に、
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＤＢ１０
４（ｐＮＰ４５）株として、通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に、微生物寄託番号：微生物菌寄第Ｐ−
１３５６２号（ＦＥＲＭＰ−１３５６２）として寄託
されている。

【００４５】プロテアーゼＮｐｒＬは、慣用の方法、例
えば、ラクトバチルス属に属するロイシン特異的プロテ
アーゼ生産能を有する天然の微生物又は形質転換株を培
養することにより得ることができる。

【００４６】微生物の培養は、慣用の液体培養に準じて
行うことができる。すなわち、形質転換株の培養は、慣
用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源、増殖因子
成分などを含む液体培地で、振盪培養または通気撹拌培
養法により行うことができる。培地のｐＨは、例えば７
〜８程度である。培養は、微生物の培養に通常採用され
る条件、例えば、温度１５〜４５℃、好ましくは２５〜
４０℃、培養時間６〜６０時間程度の条件で行うことが
できる。

【００４７】宿主微生物が生産したプロテアーゼＮｐｒ
Ｌの分離生成は、慣用の方法、例えば、溶解度の差を利
用した塩析方法（例えば、硫酸アンモニウムによる沈澱
など）、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ＳＤＳ−ア
ガロースゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法、電気溶出法、イオン交換クロマトグラ
フィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティー
クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー
法、逆相高速液体クロマトグラフィー法、水素結合クロ
マトグラフィー法などやこれらを組合わせた方法で行う
ことができる。なお、培養液は、通常、遠心分離に供さ
れ、得られた培養上清は、必要に応じて適当なの濃縮手
段（例えば、限外濾過など）により濃縮できる。

【００４８】溶解度差を利用する方法においては、例え
ば、必要に応じて濃縮した培養上清に硫酸アンモニウム
を８５％飽和まで添加し、遠心分離により沈澱物を回収
し、適当な緩衝液（例えば、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）及び５ｍＭ塩化カルシウム）に溶解し、
同緩衝液に対して透析した後、ＤＥＡＥ−セファデック
ス（Sephadex）Ａ−５０カラムに添加し、塩濃度勾配で
溶出することにより、活性画分を得ることができる。

【００４９】プロテアーゼＮｐｒＬが菌体内やペリプラ
ズムに蓄積される場合には、慣用の方法、例えば、菌体
を粉砕し、前記分離精製に供することにより、プロテア
ーゼＮｐｒＬを得ることができる。

【００５０】また、プロテアーゼＮｐｒＬをコードする
ＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、基質特
異性や安定性などが変化した変異型プロテアーゼを生産
することができる。変異型プロテアーゼの作成は、例え
ば以下の方法で行うことができる。変異を導入したいア
ミノ酸を含むアミノ酸配列に対応する２本鎖ＤＮＡを化
学合成し、この合成したＤＮＡの（＋）鎖と（−）鎖と
をそれぞれプライマーとする（以下これらのプライマー
をそれぞれＭＸＲ、ＭＸＦと称する）。これら２種類の
プライマーと対になるＰＣＲプライマーを変異導入部位
の上流及び下流に存在するＤＮＡ配列をもとに合成する
（以下これらのプライマーをそれぞれＰ１、Ｐ２と称す
る）。次に、Ｐ１とＭＸＲ、Ｐ２とＭＸＦの組み合わせ
でＰＣＲを行い、変異型ＤＮＡを含む２種類のＤＮＡを
増幅することができる。これら２種類のＤＮＡは、ＭＸ
Ｆ及びＭＸＲプライマーの部分が共通している。次に、
増幅された２種類のＤＮＡを鋳型としてプライマーＰ
１、プライマーＰ２を用いてＰＣＲを行うことにより変
異が導入された２本鎖ＤＮＡを調製することができる。
得られた２本鎖ＤＮＡを発現ベクターに接続し、該ベク
ターで形質転換した微生物を培養し、培養物から酵素を
取得することによって、野生型酵素と同様に変異型酵素
を製造することができる。

【００５１】変異型酵素の例としては、配列番号２に示
したアミノ酸配列のうち１１１位に位置するチロシンが
トリプトファンに置換した変異酵素（Ｙ１１１Ｗ）及び
同部位がシステインに置換した変異酵素（Ｙ１１１Ｃ）
を挙げることができる。これら変異型酵素Ｙ１１１Ｗ、
Ｙ１１１Ｃは、インスリンＢ鎖を基質として切断を行っ
た結果、野生型酵素に比較してインスリンＢ鎖のＰｈｅ
２４−Ｐｈｅ２５間ペプチド結合の切断活性が低下して
いたが、Ｇｌｙ２３−Ｐｈｅ２４間ペプチド結合の切断
活性はほとんど影響されなかった。更に、変異酵素Ｙ１
１１Ｗ及びＹ１１１Ｃを、通常の反応条件（３０℃）よ
りも低温（１５℃以下）で反応することにより、インス
リンＢ鎖Ｔｙｒ１６−Ｌｅｕ１７間の切断活性が著しく
低下し、ほぼＧｌｙ２３−Ｐｈｅ２４間に特異的なプロ
テアーゼを得ることができた。

【００５２】

【実施例】以下に、実施例により本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００５３】［実施例１］プロテアーゼＮｐｒＬをコ
ードする遺伝子のクローニングラクトバチルス・エスピーＮｏ. １株をＬ培地（バクト
トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ，塩化ナトリウム５
ｇ／１Ｌ）に０．０１％のグラミシジンＳを添加した培
地中、３７℃で振盪培養し、遠心分離により菌体を調製
した。得られた菌体から常法により（T.Imanaka,et a
l.,J.Bacteriol.,147,776-786(1981) ）染色体ＤＮＡを
調製し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、図１に示
す温度制御可能な発現ベクターｐＩＳＡ^ts４１２のＢａ
ｍＨＩ部位に連結し、プロテアーゼ活性の低下した宿主
バチルス・ズブチリスＤＢ１０４株にコンピテントセル
法によって導入し、該宿主を形質転換した。

【００５４】プロテアーゼ生産株の選択は、１％乳製カ
ゼインと２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンとを含むＬ
−プレート上での、コロニー周囲のハロ（クリアーゾー
ン）形成を指標として行った。その結果、約２００００
株の形質転換株中１０株のハロ形成株が得られた。これ
らの株が生産するプロテアーゼの分子量はいずれもドデ
シル硫酸ナトリウム存在下におけるポリアクリルアミド
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において約３７０００で
あった。これらの株はいずれも同様のプロテアーゼ生産
能を有し、ほぼ同じ大きさの挿入断片がベクターにみら
れた。これらの株のうち１株が保持するプラスミドをｐ
ＮＰ４５と命名した。ｐＮＰ４５の構造を図２に示す。

【００５５】［実施例２］プロテアーゼ遺伝子の塩基
配列及び該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列プラスミドｐＮＰ４５の挿入断片のマッピング及びプロ
テアーゼ生産能を指標にしてプロテアーゼＮｐｒＬをコ
ードする遺伝子の領域を限定し、挿入断片の制限酵素地
図とともに図３に示した。

【００５６】なお、図２、図３においてＳ１、Ｓ４は制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩ; Ｘは制限酵素ＸｂａＩ; Ｈ１、Ｈ
２、Ｈ３は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ; Ｎは制限酵素Ｎｒ
ｕＩ; Ｄは制限酵素ＤｒａＩ; Ｅは制限酵素ＥｃｏＴ２
２Ｉ; Ｓ２は制限酵素ＳｐｈＩ; Ｐ１、Ｐ２は制限酵素
ＰｓｔＩによる認識部位をそれぞれ示している。

【００５７】次に、特定されたプロテアーゼＮｐｒＬを
コードする領域の塩基配列を決定した。決定された塩基
配列を配列番号１（配列部分のみ図１３）に示す。得ら
れた配列よりプロテアーゼＮｐｒＬの構造遺伝子は、１
６９８塩基からなり、５６６アミノ酸をコードしている
ことが明らかになった。塩基配列から予想されるアミノ
酸配列を配列番号２（配列部分のみ図１４〜図１６）に
示す。菌体外に分泌された成熟タンパク質から得られた
アミノ末端アミノ酸配列との比較から、構造遺伝子の最
初の２７アミノ酸はシグナルペプチドであることが判明
した。更に、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域を含むゲ
ノムＤＮＡの塩基配列を配列番号３（配列部分のみ図１
７〜図２１）に示す。

【００５８】［実施例３］プロテアーゼＮｐｒＬの生
産及び精製宿主バチルス・ズブチリスＤＢ１０４株（アルカリプロ
テアーゼ及び中性プロテアーゼ欠損株）をｐＮＰ４５で
コンピテントセル法により形質転換し、Ｌ培地（バクト
トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５
ｇ／Ｌ）に最終濃度２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン
及び塩化カルシウムを５ｍＭを添加した培地で３７℃で
終夜振盪培養し、培養液を８０００Ｇで１０分間遠心分
離し、上清を回収した。該上清を分画分子量１万の膜を
用いて限外濾過により約２倍濃縮し、濃縮液に硫安を８
５％飽和まで添加し、１晩４℃に放置した後、１０００
０Ｇ、６０分間遠心分離し沈澱を回収した。該沈澱を２
０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７. ５）、５
ｍＭ塩化カルシウムに溶解し、同緩衝液に１晩透析し
た。透析した酵素液を、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−セファデックス（Sephadex）Ａ５０カラム（１．５ｃ
ｍ内径×５０ｃｍ）を用いて分画した。酵素を塩濃度勾
配で溶出し、活性画分を回収し、精製酵素を得た。

【００５９】［実施例４］プロテアーゼＮｐｒＬの基
質特異性インスリンＡ鎖は、下記の２１個のアミノ酸配列からな
ることが知られている。

【００６０】（Ｎ末端）Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ
−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（Ｃ末端）インスリンＡ鎖にプロテアーゼＮｐｒＬを３７℃１時間
作用させ、氷酢酸を添加して反応を停止した。分解物を
逆相液体クロマトグラフィー［溶出条件：０〜４０％の
直線濃度勾配（２０分）のアセトニトリル−水混合溶媒
（０．１％のトリフルオロ酢酸含有）］により解析した
結果、図４（ａ）に示されるように３つのピークが検出
され、生成したペプチドのアミノ末端アミノ酸配列を解
析した結果、切断部位はＳｅｒ１２−Ｌｅｕ１３間及び
Ｇｌｎ１５- Ｌｅｕ１６間と同定された。前記インスリ
ンＡ鎖のアミノ酸配列を考慮すると、インスリンＡ鎖は
プロテアーゼＮｐｒＬによって、ロイシンのアミノ末端
側で選択的に切断されたことが明らかになった。なお、
対照として、基質を含まない反応液のクロマトグラムを
図４（ｂ）に、基質インスリンＡ鎖のクロマトグラムを
図４（ｃ）に示した。

【００６１】また、（Ｎ末端）Ｏｒｎ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（Ｃ末端）（Ｏｒｎはオルニチン
を表す）のペンタペプチドにプロテアーゼＮｐｒＬを作
用させ、シリカゲルプレートにより生成物を分析した結
果（展開はブタノール：酢酸：水＝４：１：１（体積
比））により行い、発色はニンヒドリン反応により行っ
た。図５に示す）、オルニチンのみが分解産物として検
出されたことから、該ペンタペプチドはプロテアーゼＮ
ｐｒＬによって、ロイシンのアミノ末端側で選択的に切
断されたことが明らかになった。

【００６２】インスリンＢ鎖は、下記の３０個のアミノ
酸配列からなることが知られている。

【００６３】（Ｎ末端）Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｈｒ（Ｃ末端）インスリンＢ鎖とプロテアーゼＮｐｒＬを基質／酵素＝
８００（μｇ／Ｕ）の比率で３０℃、１０分間反応させ
た結果、図６に示すように、主にＧｌｙ２３−Ｐｈｅ２
４、Ｐｈｅ２４−Ｐｈｅ２５、Ｔｙｒ１６−Ｌｅｕ１
７、Ａｌａ１４−Ｌｅｕ１５、Ｈｉｓ１０−Ｌｅｕ１１
間における切断を示すピーク（それぞれ図６におけるピ
ーク３とピーク７、ピーク２とピーク９、ピーク４とピ
ーク５、ピーク３とピーク６、ピーク１とピーク８）が
検出されたことから、前記インスリンＢ鎖のアミノ酸配
列を考慮すると、インスリンＢ鎖はプロテアーゼＮｐｒ
Ｌによって、ロイシン及びフェニルアラニンのアミノ末
端側で優先的に切断されたことが明らかになった。

【００６４】［実施例５］プロテアーゼＮｐｒＬの理
化学的性質の測定実施例３において取得されたプロテアーゼＮｐｒＬの理
化学的性質は以下の通りであった。

【００６５】（分子量）ドデシル硫酸ナトリウム存在
下におけるポリアクリルアミド電気泳動において分子量
は約３７０００であった。

【００６６】（至適ｐＨ）標準的な活性測定法で、緩
衝液のみを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
５〜８．５）または５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０〜１０．０）に変えて活性を測定した。活性のｐ
Ｈ依存性は図７に示される通りであり、至適ｐＨは、７
〜９であった。

【００６７】（温度依存性）標準的な活性測定方法で
温度のみを２０℃〜８０℃まで変えて測定した。活性の
温度依存性は図８に示す通りであり、至適温度は、６０
℃であった。

【００６８】（阻害剤）プロテアーゼＮｐｒＬの酵素
液に、１ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を添
加したところ、活性が阻害された。これに対して、１ｍ
ＭＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリド）
を添加したところ、活性は阻害されなかった。

【００６９】［実施例６］プラスミドｐＮＰ４５−１
の構築プロテアーゼＮｐｒＬへの変異導入操作を容易に行うた
めに、プロテアーゼＮｐｒＬをコードするＤＮＡを含む
プラスミドｐＮＰ４５の誘導体を構築した。まず、ｐＮ
Ｐ４５のプロテアーゼＮｐｒＬをコードするＤＮＡ以外
の部分に存在する２カ所のＢａｎＩ部位の除去を行っ
た。図９に示したｐＮＰ４５の図の実線部分にＢａｎＩ
部位が存在しており、この領域が温度感受性を示す発現
制御を担っている。ｐＮＰ４５をＳａｕ３ＡＩで部分消
化し、プロテアーゼＮｐｒＬをコードするＤＮＡを切り
出し、枯草菌における低コピー数ベクターｐＴＢ５２４
のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、ｐＮＰ４５−
１（１４．８ｋｂ）を構築した。

【００７０】［実施例７］変異酵素Ｙ１１１Ｗをコー
ドするＤＮＡの作成プロテアーゼＮｐｒＬの１１１位に存在するチロシンを
トリプトファンに置換した変異酵素Ｙ１１１Ｗを以下の
ように製造した。

【００７１】まず、変異を導入しようとする１１１位の
チロシンに対応するコドンをトリプトファンに対応する
ＴＧＧに置換した、以下の塩基配列を有するプライマー
Ｍ６Ｆ, Ｍ６Ｒを合成した。

【００７２】Ｍ６Ｆ:5'-C-GGA-AGT-AAG-TGG-AAT-AAT-G-3' Ｍ６Ｒ:3'-G-CCT-TCA-TTC-ACC-TTA-TTA-C-5' なお、Ｍ６Ｆ、Ｍ６Ｒに対応するアミノ酸配列はＧｌｙ
−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎである。Ｍ
６Ｆ, Ｍ６Ｒと対となるＰＣＲプライマーとしてそれぞ
れプライマーＰ２, プライマーＰ１を合成した。塩基配
列は以下の通りである。

【００７３】プライマーＰ１、Ｐ２にはそれぞれＥｃｏＴ２２Ｉ、Ｓ
ｐｈＩの制限酵素部位を導入してある。各プライマーの
ＮｐｒＬ遺伝子における相対的な位置関係を図１０に示
した。プライマーＰ１、Ｐ２は、ＰＣＲ増幅した断片を
プロテアーゼＮｐｒＬの残りの領域に結合できるように
設計した。

【００７４】ＰＣＲ反応は以下のように行った。鋳型Ｄ
ＮＡ１０ｎｇ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、塩化カリウ
ム１μｍｏｌ、硫酸アンモニウム１μｍｏｌ、硫酸マグ
ネシウム０．２μｍｏｌ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
８）２μｍｏｌ、トライトンＸ−１００（Triton X-10
0）０．１ｍｇ、ｄＡＴＰ・ｄＴＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣ
ＴＰ各２０ｎｍｏｌ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ２Ｕ
を含む１００μＬの反応液中で９４℃２分間、５２℃２
分間、７２℃３分間のサイクルを３０サイクル繰り返し
た。

【００７５】ＰＣＲにより変異導入部位を含むＤＮＡ断
片を調製し、ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＳｐｈＩ消化により６
２５ｂｐのＥｃｏＴ２２Ｉ−ＳｐｈＩ断片を得た。この
ＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１９のＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ間に
導入し、Ｍ１３ＰＳｍｕｔを得た。変異導入部位の配列
を塩基配列を決定することにより確認後、変異導入部位
を含むＢａｎＩ−ＳｐｈＩ断片４８０ｂｐを切り出し、
ｐＮＰ４５−１のＢａｎＩ−ＳｐｈＩ断片と断片を交換
し、ｐＮＰ４５−１ｍｕｔを得た。

【００７６】以上の工程を図１０に示す。なお、図１０
において＊は変異が導入された部位を示す。

【００７７】［実施例８］変異酵素Ｙ１１１Ｗの特性変異酵素Ｙ１１１Ｗのアゾカゼインに対する比活性は７
５６Ｕ／ｍｇであり、野生型プロテアーゼＮｐｒＬの１
２５０Ｕ／ｍｇに対して６０％であった。

【００７８】前記インスリンＢ鎖に変異酵素Ｙ１１１Ｗ
を酵素／基質＝８００（μｇ／Ｕ）の条件で３０℃５分
間作用させた後の切断パターンを図１１（ｂ）に示し
た。野生型のＮｐｒＬ（図６）に比較してＰｈｅ２４−
Ｐｈｅ２５間の切断活性が著しく低下していた。

【００７９】［実施例９］変異酵素Ｙ１１１Ｗの低温
での基質特異性の変化インスリンＢ鎖に対して、変異酵素Ｙ１１１Ｗを実施例
８と同様な条件下で温度のみ６０℃、３０℃、１５℃、
０℃と変えて作用させ、同程度な分解の程度になる時間
にサンプリングした。該切断における切断パターンの温
度による差異を図１１に示した。

【００８０】１５℃、０℃における反応においては、３
０℃、６０℃における反応に比較して明らかにＴｙｒ１
６−Ｌｅｕ１７間における切断活性が低下しており、切
断反応はほとんどＧｌｙ２３−Ｐｈｅ２４間に特異的で
あった。

【００８１】［実施例１０］変異酵素Ｙ１１１Ｃの作
成実施例７と同様な方法によって、プロテアーゼＮｐｒＬ
の１１１位に存在するチロシンがシステインに置換した
変異酵素Ｙ１１１Ｃを製造した。製造したＹ１１１Ｃを
実施例８及び実施例９と同様な方法においてインスリン
Ｂ鎖に作用させた。切断パターンを図１２に示す。Ｙ１
１１Ｃは、Ｙ１１１Ｗと同様３０℃における反応におい
てＰｈｅ２４−Ｐｈｅ２５間の切断活性が著しく低下
し、１５℃、０℃の低温においてはＴｙｒ１６−Ｌｅｕ
１７間における切断活性も低下し、切断反応は殆どＧｌ
ｙ２３−Ｐｈｅ２４間に特異的であった。

【００８２】［配列の種類等］以下、本明細書で表示さ
れている配列の番号、長さ、型、種類、起源および特徴
について以下に示す。なお、配列自体は、図面中に図示
している。

【００８３】配列番号１の配列について、配列番号：１配列の長さ：１６９８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ラクトバチルス（Lactobacillus ）株名：ｓｐ．Ｎｏ．１配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１６９８特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：１．．８１特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：８２．．１６９８特徴を決定した方法：Ｅ（配列自体は図１３に示す）配列番号２の配列について、配列番号：２配列の長さ：５６６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：ラクトバチルス（Lactobacillus ）株名：ｓｐ．Ｎｏ．１配列の特徴特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：１．．２７特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：２８．．５６６特徴を決定した方法：Ｅ（配列自体は図１４〜図１６に示す）配列番号３の配列について、配列番号：３配列の長さ：２１３８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ラクトバチルス（Lactobacillus ）株名：ｓｐ．Ｎｏ．１配列の特徴特徴を表す記号：-35 signal 存在位置：１５６．．１６１特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：-10 signal 存在位置：１７９．．１８４特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ＲＢＳ存在位置：２４５．．２４９特徴を決定した方法：Ｅ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：２５８．．１９５５特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：２５８．．３３８特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：３３９．．１９５５特徴を決定した方法：Ｅ（配列自体は図１７〜図２１に示す）

【００８４】

【発明の効果】本発明のプロテアーゼＮｐｒＬは、タン
パク質またはペプチドのロイシンまたはフェニルアラニ
ン残基のアミノ末端側で、優先的にタンパク質またはペ
プチドを加水分解する。この性質を利用して、タンパク
質またはペプチドをその中に含まれるロイシンまたはフ
ェニルアラニン残基のアミノ末端側で特異的に分解する
ことができる。また、プロテアーゼＮｐｒＬの逆反応を
利用して、ロイシンまたはフェニルアラニン残基のアミ
ノ末端側で、タンパク質またはペプチドを特異的に合成
することができる。また、ラクトバチルス（Lactobacil
lus ）属に属する微生物またはプロテアーゼＮｐｒＬを
含有するベクターで形質転換された微生物を培養するこ
とによって、プロテアーゼＮｐｒＬを効率良く産生する
ことができる。更に、プロテアーゼＮｐｒＬに置換、挿
入、欠失などの変異を導入することにより新しい特異性
を持ったプロテアーゼを得ることが可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】プロテアーゼＮｐｒＬのクローニングに用いた
ベクターｐＩＳＡ^ts４１２の構造を示す図である。

【図２】プラスミドｐＮＰ４５の構造を示す図である。

【図３】プロテアーゼＮｐｒＬの遺伝子断片の制限酵素
地図等の構造を示す図である。

【図４】プロテアーゼＮｐｒＬをインスリンＡ鎖と反応
させた生成物（ａ）酵素単独（ｂ）基質単独（ｃ）の液
体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図であ
る。

【図５】プロテアーゼＮｐｒＬをペンタペプチドと反応
させた生成物のシリカゲル薄層クロマトグラフィーのク
ロマトグラムを示す図である。

【図６】プロテアーゼＮｐｒＬとインスリンＢ鎖と反応
させた生成物の高速液体クロマトグラフィーにおけるク
ロマトグラム（ａ）及び生成したピークをアミノ酸分析
及びペプチドシーケンシングにより同定を行った結果
（ｂ）を示す図である。

【図７】プロテアーゼＮｐｒＬ活性のｐＨ依存性を示す
図である。

【図８】プロテアーゼＮｐｒＬ活性の温度依存性を示す
図である。

【図９】プラスミドｐＮＰ４５−１の構築方法を示す図
である。

【図１０】変異型酵素Ｙ１１１Ｗ及びＹ１１１Ｃの構築
方法を示す図である。

【図１１】変異型酵素Ｙ１１１ＷをインスリンＢ鎖と反
応させ、生成したペプチドを逆相液体クロマトグラフィ
ーで解析したクロマトグラムを示す図である。

【図１２】変異型酵素Ｙ１１１ＣをインスリンＢ鎖と反
応させ、生成したペプチドを逆相液体クロマトグラフィ
ーで解析したクロマトグラムを示す図である。

【図１３】配列番号１の配列を示す図である。

【図１４】配列番号２の配列を示す図である。

【図１５】配列番号２の配列を示す図である。

【図１６】配列番号２の配列を示す図である。

【図１７】配列番号３の配列を示す図である。

【図１８】配列番号３の配列を示す図である。

【図１９】配列番号３の配列を示す図である。

【図２０】配列番号３の配列を示す図である。

【図２１】配列番号３の配列を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:225）Ｃ１２Ｒ 1:225）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次のからに示す性質を有するプロテ
アーゼＮｐｒＬ。作用：ペプチドまたはタンパク質に作用し、ペプチド
結合を加水分解する。基質特異性：ロイシンまたはフェニルアラニンのアミ
ノ末端側で優先的にペプチド結合を加水分解する。至適ｐＨ及びｐＨ安定性：至適ｐＨは７〜９であり、
中性から弱アルカリ性で安定である。
【請求項２】タンパク質またはペプチドに請求項１記
載の酵素を作用させることにより、タンパク質またはペ
プチド中のロイシン残基またはフェニルアラニン残基の
Ｎ末端側のペプチド結合を選択的に加水分解する方法。
【請求項３】ラクトバチルス（Lactobacillus ）属に
属する請求項１記載のプロテアーゼＮｐｒＬを産生する
能力を有する微生物を培養し、培養物から請求項１に記
載の酵素を取得することを含む、請求項１記載のプロテ
アーゼＮｐｒＬを製造する方法。
【請求項４】請求項１記載の酵素をコードするＤＮＡ
を含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】請求項４記載のＤＮＡにおいて、ラクト
バチルス（Lactobacillus ）属に属する微生物の染色体
に由来するＤＮＡ。
【請求項６】配列番号２に示されるタンパク質をコー
ドする塩基配列を含むことを特徴とする請求項４記載の
ＤＮＡ。
【請求項７】請求項４記載のＤＮＡにおいて、プロテ
アーゼ活性を有しかつ配列番号２に示される配列中の１
個または複数個のアミノ酸を置換、挿入又は欠失したア
ミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を
含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項８】請求項４、請求項５、請求項６または請
求項７のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とす
るベクター。
【請求項９】請求項８記載のＤＮＡにより形質転換さ
れた微生物。
【請求項１０】微生物が細菌である請求項９記載の微
生物。
【請求項１１】請求項９または請求項１０記載の微生
物を培養し、培養物から請求項１に記載の酵素を取得す
ることを含む、請求項１記載の酵素の製造方法。
【請求項１２】配列番号２に示されるアミノ酸配列の
うち、１１１位に位置するチロシンがトリプトファンに
置換されたアミノ酸配列を有する変異体酵素。
【請求項１３】請求項１２記載の変異体酵素をコード
するＤＮＡを含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１４】配列番号２に示されるアミノ酸配列の
うち、１１１位に位置するチロシンがシステインに置換
されたアミノ酸配列を有する変異体酵素。
【請求項１５】請求項１４記載の変異体酵素をコード
するＤＮＡを含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１６】タンパク質またはペプチドに、請求項
１２または請求項１４記載の変異体酵素を低温で作用さ
せることにより、タンパク質またはペプチド中のフェニ
ルアラニン残基のＮ末端側のペプチド結合を選択的に加
水分解する方法。