CN111601894B - M23a家族蛋白酶的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效地制造M23A家族蛋白酶的方法。一种M23A家族蛋白酶的制造方法，其中，包括如下步骤：培养导入有编码M23A家族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸的芽孢杆菌属菌，从而在该芽孢杆菌属菌的细胞外制造成熟型M23A家族蛋白酶。

Description

M23A家族蛋白酶的制造方法

技术领域

本发明涉及一种M23A家族蛋白酶的制造方法。

背景技术

蛋白酶的M23家族是MEROPS数据库中被定义为能够分解Gly-Gly键的蛋白酶的蛋白酶家族。M23家族蛋白酶还具有分解弹性蛋白及细菌细胞壁的蛋白聚糖的活性，也被称为溶菌酶。M23家族蛋白酶分类为M23A亚族和M23B亚族这两个亚族，各亚族分别包含多种类型的酶。

在酶等蛋白质的商业化生产中，通常，培养导入有目标蛋白质的基因的大肠杆菌等宿主以表达该蛋白质，并回收由宿主生产的成熟型蛋白质。在多数蛋白酶中，前蛋白最先表达，它经过自加工(self-processing)转换为成熟型蛋白质，并在细胞或培养物中积累，作为目标物被回收。然而，M23A亚族蛋白酶不会通过自加工(self-processing)向成熟体转换，从而不能从大肠杆菌宿主中回收成熟型蛋白质(非专利文献1、2)。因此，作为M23A亚族蛋白酶的生产方法，探讨了培养天然的M23A亚族蛋白酶生产菌株的方法。非专利文献1中记载了使天然生产作为目标的M23A亚族蛋白酶的野生型菌株生产该M23A亚族蛋白酶的方法，并且，为了降低生产成本，进一步探讨了提高蛋白酶生产効率的培养条件。另外，在非专利文献3中，为了降低生产成本，从自然界获得了比现有的M23A亚族蛋白酶生产菌显示出更高的生产性的菌株。

另一方面，专利文献1中记载了从水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)中分离的属于M23A亚族的β-裂解蛋白酶，另外还记载了使大肠杆菌、芽孢杆菌属菌等宿主表达该酶而进行制造。然而，专利文献1中实际上并未记载使用异源宿主生产该酶的内容。专利文献1中指出了β-裂解蛋白酶进行自加工(self-processing)的可能性。但是，如上述的非专利文献1、2中所公开那样，在随后的研究中报道了M23A亚族蛋白酶不能进行自加工(self-processing)，因此，很明显，专利文献1并未解决上述的异源表达系统中M23A亚族蛋白酶缺乏自加工(self-processing)的问题。此外，如非专利文献3所记载，专利文献1之后报道了β-裂解蛋白酶相对于枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有很强的溶菌活性。因此，非专利文献1～3中所示的见解说明了如下事实：专利文献1中公开的β-裂解蛋白酶在大肠杆菌、芽孢杆菌属菌中的异源表达并不现实，这种异源表达反而是非常困难的。

综上所述，M23A亚族蛋白酶虽然具有优异的特征，但由于缺乏自加工(self-processing)、溶菌活性，只能通过培养天然的M23A亚族蛋白酶生产菌株的方法来获得成熟型酶。实际上至今尚未报道有M23A亚族蛋白酶成功地以成熟型异源表达的例子。

专利文献1：日本特开平4-108387号公报

非专利文献1：《分子》(Molecules),2014,19:4779-4790

非专利文献2：《细菌学杂志》(Journal of bacteriology),1996,178:6608-6617

非专利文献3：《生物科学与生物工程杂志》(Journal of bioscience andbioengineering),2003,95:27-34

发明内容

本发明提供一种M23A家族蛋白酶的制造方法，其中，包括如下步骤：培养导入有编码M23A家族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸的芽孢杆菌属菌，从而在该芽孢杆菌属菌的细胞外制造成熟型M23A家族蛋白酶。

附图说明

图1为重组枯草芽孢杆菌的培养上清的FRET-GGGGG分解活性。

图2为重组枯草芽孢杆菌的培养上清的SDS-PAGE图像。

图3为重组枯草芽孢杆菌168株及Dpr9株的培养上清的FRET-GGGGG分解活性。

图4为重组枯草芽孢杆菌168株及Dpr9株的培养上清的蛋白质印迹图像。

图5为导入有编码各种M23A亚族蛋白酶的前蛋白的基因的重组枯草芽孢杆菌的培养上清的FRET-GGGGG分解活性。

具体实施方式

在本说明书中，核苷酸序列及氨基酸序列的同一性是通过利普曼-皮尔森(Lipman-Pearson)法(《科学》(Science)，1985，227：1435-1441)来进行计算。具体而言，通过使用基因信息处理软件Genetyx-Win的同一性分析(Search homology)程序，将要比较的单位大小(Unit size to compare)(ktup)设为2进行分析而算出。

在本说明书中，有关氨基酸序列或核苷酸序列的“至少80％的同一性”是指同一性为80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步优选98％以上、进一步优选99％以上。

在本说明书中，关于氨基酸序列及核苷酸序列上的“相当于…的位置”或“相当于…的区域”，是通过以赋予各氨基酸序列或核苷酸序列中存在的保守氨基酸残基或核苷酸最大同源性的方式对准(比对(alignment))目标序列与参照序列(例如，序列号1的核苷酸序列)来确定。关于比对，能够使用公知的算法来执行，其流程是本领域技术人员公知的。例如，能够在默认设置下使用Clustal W多重比对程序(《核算研究》(Nucleic AcidsRes.)，1994，22：4673-4680)，由此进行比对。或者，也能够使用作为Clustal W修订版的Clustal W2、Clustal omega。Clustal W、Clustal W2及Clustal omega能够在例如欧洲生物信息学研究所研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、或日本国立遗传学研究所所运营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])的网站上使用。通过上述的比对以对应于参照序列的任意的区域的方式对齐的目标序列的位置或区域被看做“相当于”该任意的区域的“位置”或“区域”。

在本说明书中，控制区与基因的“可操作地连接”是指基因与控制区以该基因能够在该控制区的制御下进行表达的方式连接。基因与控制区的“可操作地连接”的流程是本领域技术人员熟知的。

在本说明书中，有关基因的“上游”及“下游”是指该基因的转录方向的上游及下游。例如，“配置于启动子的下游的基因”表示在DNA正义链(sense strand)上该基因存在于启动子的3’侧，基因的上游表示DNA正义链上的该基因的5’侧的区域。

在本说明书中，针对细胞的功能、特性、性状所使用的术语“本来”用于表示该细胞原本就存在该功能、特性、性状。相反，术语“外源”用于表示该细胞原本不存在而从外部导入的功能、特性、性状。例如，“外源”基因或多核苷酸是从外部导入细胞中的基因或多核苷酸。外源基因或多核苷酸既可以是来自与其所导入的细胞同源的生物，也可以是来自异源的生物(即，异源基因或多核苷酸)。

本说明书中记载的枯草芽孢杆菌的基因的名称基于日本枯草芽孢杆菌功能分析网络(JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis)(BSORF DB)中网络公开的([bacillus.genome.ad.jp/]，2006年1月18日更新)枯草芽孢杆菌基因组数据。本说明书中所记载的枯草芽孢杆菌的基因编号表示BSORF DB中注册的基因编号。

本发明提供M23A家族蛋白酶的制造方法。

针对M23A亚族蛋白酶不能在异源宿主中转换为成熟体这一现有的见解(例如，非专利文献1、2)，本发明人等惊奇地发现：通过将M23A家族蛋白酶基因导入到芽孢杆菌属菌宿主中并进行培养，从而能够从培养物中高效地回收成熟型M23A家族蛋白酶。

M23A亚族蛋白酶除了具有分解弹性蛋白及细菌细胞壁的活性之外，还具有清除角质污垢的能力，由于这一优异的特征，有望在各种产业中得到应用(日本特愿2018-005193)。根据本发明的方法，通过使用芽孢杆菌属菌宿主，能够以简便的流程高效地制造成熟型M23A家族蛋白酶。根据本发明，能够解决现有的M23A家族蛋白酶的生产中的问题，例如，天然的表达成熟型M23A家族蛋白酶的野生型菌株的生产性低下的问题，及大肠杆菌宿主中缺乏成熟体的问题等。

本发明的M23A亚族蛋白酶的制造方法包括：培养导入有编码目标M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸的芽孢杆菌属菌(Bacillus)的步骤。

通过本发明制造的M23A亚族蛋白酶是具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键的分解活性的成熟体酶。作为通过本发明制造的M23A亚族蛋白酶的优选例，可列举：β-裂解金属肽酶(beta-lytic metallopeptidase；BLP)、LasA蛋白质(Las A protein；LasA，也称为葡萄球菌溶血素(Staphylolysin))及嗜水气单胞菌蛋白酶(Aeromonas hydrophila proteinase；AhP，也称为Mername-AA291peptidase)。它们在MEROPS数据库([http://merops.sanger.ac.uk])中作为属于M23A亚族的蛋白酶被公开。BLP(MEROPS ID：M23.001)是由序列号1的氨基酸序列构成的多肽。LasA(MEROPS ID：M23.002)是由序列号4的氨基酸序列构成的多肽。AhP(MEROPS ID：M23.003)是由序列号7的氨基酸序列构成的肽。BLP、LasA及AhP是具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键的分解活性的酶。

作为通过本发明制造的M23A亚族蛋白酶的其它优选例，可列举与上述BLP、LasA及AhP具有同等的功能的多肽。作为具有与该BLP、LasA及AhP具有同等的功能的多肽的例子，可列举：由与序列号1、4及7中任意一种的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键的分解活性的多肽。作为具有与BLP同等的功能的多肽的优选例子，可列举：由与序列号1的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽，其中，优选地，所述氨基酸序列在相当于序列号1的氨基酸序列的22位、121位及123位的位置具有His，在相当于36位的位置具有Asp。作为具有与LasA同等的功能的多肽的优选例子，可列举：由与序列号4的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽，其中，优选地，所述氨基酸序列在相当于序列号4的氨基酸序列的23位、120位及122位的位置具有His，在相当于36位的位置具有Asp。作为具有与AhP同等的功能的多肽的优选例子，可列举：由与序列号7的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽，其中，优选地，在相当于序列号7的氨基酸序列的21位、118位及120位的位置具有His，在相当于34位的位置具有Asp。

作为通过本发明制造的M23A亚族蛋白酶的再一优选例子，可列举：来自胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的BLP同源物(WP＿057941690.1，在以下的本说明书中称为LgBLP)、及来自抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)的BLP同源物(WP＿057970430.1，在以下的本说明书中称为LaBLP)。LgBLP是由序列号10的氨基酸序列构成的多肽。LaBLP是由序列号13的氨基酸序列构成的多肽。LgBLP及LaBLP是具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键的分解活性的酶。

作为通过本发明制造的M23A亚族蛋白酶的再一优选例子，可列举具有与上述LgBLP及LaBLP同等的功能的多肽。作为具有与LgBLP同等的功能的多肽的优选例子，可列举：由与序列号10的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽。作为具有与LaBLP同等的功能的多肽的优选例子，可列举：由与序列号13的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽。

优选地，通过本发明制造的M23A亚族蛋白酶为选自上述BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、及具有与它们同等的功能的多肽中的至少一种。

本发明中使用的导入于芽孢杆菌属菌的编码M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸，是包含编码通过上述的本发明的方法制造的目标M23A亚族蛋白酶的前区的序列和编码成熟型蛋白质的序列的多核苷酸。M23A亚族蛋白酶的前区，是指有助于“在前蛋白上位于该前区的下游的M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质区域”的三维结构的形成的区域。作为编码该前蛋白的多核苷酸的例子，可列举：编码BLP的前蛋白的多核苷酸(序列号2)、编码LasA的前蛋白的多核苷酸(序列号5)、编码AhP的前蛋白的多核苷酸(序列号8)、编码LgBLP的前蛋白的多核苷酸(序列号11)、及编码LaBLP的前蛋白的多核苷酸(序列号14)。作为编码该前蛋白的多核苷酸的其它例子，可列举：编码包含分泌信号的BLP的前蛋白的多核苷酸(序列号3)、编码包含分泌信号的LasA的前蛋白的多核苷酸(序列号6)、编码包含分泌信号的AhP的前蛋白的多核苷酸(序列号9)、编码包含分泌信号的LgBLP的前蛋白的多核苷酸(序列号12)、及编码包含分泌信号的LaBLP的前蛋白的多核苷酸(序列号15)。

在序列号2的多核苷酸中，523～1062号核苷酸区域编码BLP的成熟型蛋白质，其上游编码前区。在序列号3的多核苷酸中，595～1134号核苷酸区域编码BLP的成熟型蛋白质，在其上游具有前区的编码区，进一步，其上游编码分泌信号。关于编码分泌信号的区域，能够通过SignalP(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)等工具来确定。基于利用SignalP的预测的序列号3的多核苷酸上的BLP的分泌信号编码区为1～72号核苷酸区域。

在序列号5的多核苷酸中，616～1164号核苷酸区域编码LasA的成熟型蛋白质，其上游编码前区。在序列号6的多核苷酸中，709～1257号核苷酸区域编码LasA的成熟型蛋白质，在其上游具有前区的编码区，进一步，其上游编码分泌信号。基于利用SignalP的预测的序列号6的多核苷酸上的LasA的分泌信号编码区为1～93号核苷酸区域。

在序列号8的多核苷酸中，565～1104号核苷酸区域编码AhP的成熟型蛋白质，其上游编码前区。在序列号9的多核苷酸中，625～1164号核苷酸区域编码AhP的成熟型蛋白质，在其上游具有前区的编码区，进一步，其上游编码分泌信号。基于利用SignalP的预测的序列号9的多核苷酸上的AhP的分泌信号编码区为1～60号核苷酸区域。

在序列号11的多核苷酸中，529～1065号核苷酸区域编码LgBLP的成熟型蛋白质，其上游编码前区。在序列号12的多核苷酸中，628～1164号核苷酸区域编码LgBLP的成熟型蛋白质，在其上游具有前区的编码区，进一步，其上游编码分泌信号。基于利用SignalP的预测的序列号12的多核苷酸上的LgBLP的分泌信号编码区为1～99号核苷酸区域。

在序列号14的多核苷酸中，550～1086号核苷酸区域编码LaBLP的成熟型蛋白质，其上游编码前区。在序列号15的多核苷酸中，628～1164号核苷酸区域编码LaBLP的成熟型蛋白质，在其上游具有前区的编码区，进一步，其上游编码分泌信号。基于利用SignalP的预测的序列号15的多核苷酸上的LaBLP的分泌信号编码区为1～78号核苷酸区域。

被上述的多核苷酸编码的前区对位于其下游的成熟型蛋白质区域的三维结构的形成作出贡献。

因此，作为编码目标M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸的再一例子，可列举：包含编码M23A亚族蛋白酶的前区的多核苷酸和连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶的成熟型蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。作为编码该M23A亚族蛋白酶的前区的多核苷酸的例子，可列举由下列序列构成的多核苷酸：序列号2的1～522号核苷酸区域的序列、序列号5的1～615号核苷酸区域的序列、序列号8的1～564号核苷酸区域的序列、序列号11的1～528号核苷酸区域的序列、序列号14的1～549号核苷酸区域的序列、或与它们具有至少80％同一性的序列。被这些多核苷酸编码的前区有助于位于其下游的M23A亚族蛋白酶的成熟型蛋白质区域的三维结构的形成。作为编码该M23A亚族蛋白酶的成熟型蛋白质的多核苷酸的例子，可列举：编码上述的BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、及具有与它们同等的功能的多肽的多核苷酸。

作为编码目标M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸的再一例子，可列举以下的多核苷酸：

由与序列号2的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号2的523～1062号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选BLP或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号2的1～522号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选BLP或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号3的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号3的595～1134号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选BLP或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号3的1～594号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选BLP或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号5的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号5的616～1164号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选LasA或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号5的1～615号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选LasA或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号6的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号6的709～1257号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选LasA或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号6的1～708号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选LasA或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号8的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号8的565～1104号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选AhP或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号8的1～564号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选AhP或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号9的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号9的625～1164号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选AhP或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号9的1～624号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选AhP或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号11的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号11的529～1065号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选LgBLP或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号11的1～528号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选LgBLP或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号12的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号12的628～1164号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选LgBLP或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号12的1～627号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选LgBLP或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号14的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号14的550～1086号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选LaBLP或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号14的1～549号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选LaBLP或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸；

由与序列号15的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号15的628～1164号核苷酸区域的区域具有编码BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽(优选LaBLP或具有与其同等的功能的多肽)的核苷酸序列的多核苷酸；以及

具有序列号15的1～627号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶成熟型蛋白质(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、或具有与它们同等的功能的多肽，优选LaBLP或具有与其同等的功能的多肽)的序列的多核苷酸。

作为上述多核苷酸中所含的编码BLP、LasA、AhP、LgBLP及LaBLP、以及具有与它们同等的功能的多肽的核苷酸序列的例子，可列举：序列号2的523～1062号的序列、序列号5的616～1164号的序列、序列号8的565～1104号的序列、序列号11的529～1065号的序列、及序列号14的550～1086号的序列、以及与这些中的任意之一具有至少80％的同一性的核苷酸序列。被这些核苷酸序列编码的多肽均具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性。

关于编码该前蛋白的多核苷酸，能够按照常规方法来制备。例如，通过常规方法从本来生产目标M23A亚族蛋白酶的微生物中提取基因组DNA、或提取RNA并通过逆转录而合成cDNA，由此能够制备编码该前蛋白的多核苷酸。例如，关于编码BLP的前蛋白的多核苷酸(序列号2及3)，能够从溶杆菌属(Lysobacter sp.)(NBRC 12725或NBRC12726)，Achromobacterlyticus M497-1，溶杆菌属(Lysobacter sp.)IB-9374，胶状溶杆菌(Lysobactergummosus)DSMZ 6980等进行制备。关于编码LasA的前蛋白的多核苷酸(序列号5及6)，能够从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC10145，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)FRD1等进行制备。关于编码AhP的前蛋白的多核苷酸(序列号8及9)，能够从嗜水气单胞菌嗜水亚种(Aeromonas hydrophilasubsp.hydrophila)ATCC 7966，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)(Chester)Stanier(ATCC 51307)等进行制备。关于编码LgBLP的前蛋白的多核苷酸(序列号11及12)，能够从胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)等进行制备。关于编码LaBLP的前蛋白的多核苷酸(序列号14及15)，能够从抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)等进行制备。能够从公共微生物保存机构购入上述微生物。

对通过上述流程获得的编码前蛋白的多核苷酸进一步进行位点特异性突变导入，由此也可以制备编码目标M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸。或者，关于编码目标M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸，也可以基于该前蛋白的氨基酸序列通过化学合成而得到。

编码该前蛋白的多核苷酸可以可操作地与控制区连接。在本说明书中，“控制区”是具有对配置于其下游的基因在细胞内的表达进行控制的功能的区域，优选是具有使配置与其下游的基因组成型表达或过表达的功能的区域。更具体而言，控制区被定义为如下：存在于基因的编码区的上游，并具有与RNA聚合酶相互作用而控制编码该区的转录的功能的区域。优选地，本说明书中的控制区是指基因的编码区的上游200～600个核苷酸左右的区域。控制区包含转录起始控制区及/或翻译起始控制区、或者从转录起始控制区至翻译起始控制区的区域。转录起始控制区是包含启动子及转录起始点的区域，翻译起始控制区是相当于与起始密码子共同形成核糖体键合位点的Shine-Dalgarno(SD)序列的位点(Shine，J.，Dalgarno，L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1974，71：1342-1346)。

作为该控制区的优选例子，可列举在芽孢杆菌属菌中起作用的控制区，例如，来自芽孢杆菌属细菌的α-淀粉酶基因、蛋白酶基因、aprE基因或spoVG基因的控制区、芽孢杆菌KSM-S237株的纤维素酶基因(日本特开2000-210081号公报)的控制区、芽孢杆菌KSM-64株的纤维素酶基因(日本特开2011-10387公报)的控制区、以及来自金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因的控制区(均参见日本特开2009-089708号公报)等，但不做特别限定。作为该控制区的更优选例子，可列举：芽孢杆菌KSM-S237株的纤维素酶基因的启动子(序列号16)、芽孢杆菌KSM-64株的纤维素酶基因的启动子(序列号17)。另外，作为优选的控制区，可列举与序列号16或17至少具有80％的同一性，且具有控制基因的转录及翻译的功能的核苷酸序列。

另外，编码该前蛋白的多核苷酸可以与编码分泌信号的序列(称为分泌信号序列)可操作地连接，其中，该分泌信号具有使被表达的蛋白质向细胞外分泌的功能。作为该分泌信号序列的优选例子，可列举在芽孢杆菌属菌中起作用的分泌信号序列，例如，来自芽孢杆菌属菌的分泌信号序列。作为来自芽孢杆菌属菌的分泌信号序列的优选例子，可列举：芽孢杆菌KSM-S237株的纤维素酶基因的分泌信号序列(序列号18)、芽孢杆菌KSM-64株的纤维素酶基因的分泌信号序列(序列号19)、枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amyE的分泌信号序列(序列号20)等。作为来自芽孢杆菌属菌的分泌信号序列的再一例，可列举：与序列号18～20中的任意之一具有至少80％的同一性，且具有使被表达的蛋白质向细胞外分泌的功能的核苷酸序列。与这些来自芽孢杆菌属菌的分泌信号序列连接的编码该前蛋白的序列可以包含或不包含天然型M23A亚族蛋白酶的分泌信号序列(例如，上述的序列号3、6、9、12或15中所含的分泌信号序列)。

因此，对于编码该前蛋白的多核苷酸而言，除了包含开放阅读框(ORF，OpenReading Frame)之外，还可以包含非翻译区(UTR，untranslated region)的核苷酸序列。例如，该多核苷酸可以包含上述的启动子、分泌信号序列及终止子。

能够按照常规方法向芽孢杆菌属菌导入编码该前蛋白的多核苷酸。例如，将编码该前蛋白的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体导入宿主芽孢杆菌属菌细胞中，从而能够向该宿主细胞的基因组中整合该多核苷酸。或者，也可以将包含该多核苷酸的表达载体导入宿主芽孢杆菌属菌细胞中。

向宿主芽孢杆菌属菌细胞导入多核苷酸或载体时，例如，能够使用感受态细胞法、电穿孔法、原生质体法、粒子枪法、PEG法等公知的转化技术。

通过常规方法将编码该前蛋白的多核苷酸、及根据需要使用的控制区或者分泌信号序列插入并连接于任意的载体中，由此能够构建包含编码该前蛋白的多核苷酸的载体。对于该载体的种类不作特别限定，可以为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒、YAC载体、穿梭载体等任意的载体。另外，该载体优选为能够在宿主细胞内扩增的载体，更优选为表达载体。作为优选的载体的例子，没有限定，可列举：pHA3040SP64、pHSP64R或pASP64(日本特许第3492935号)、pHY300PLK(能够转化大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两者的表达载体；Jpn JGenet，1985，60：235-243)、pAC3(《核酸研究》(Nucleic Acids Res)，1988，16：8732)等穿梭载体；pUB110(《细菌学》(J Bacteriol)，1978，134：318-329)，pTA10607(《质粒》(Plasmid)，1987，18：8-15)等能够用于芽孢杆菌属细菌的转化的质粒等。另外，也能够使用来自大肠杆菌的质粒(例如，pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC57、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)。

作为被导入编码该前蛋白的多核苷酸的芽孢杆菌属菌，不作特别限制，但优选枯草芽孢杆菌或其突变株。优选地，该芽孢杆菌属菌向细胞外分泌或伴随着溶菌而释放(下面，将该过程简称为“释放”)目标M23A亚族蛋白酶以外的其它蛋白酶。作为该其它蛋白酶的例子，可列举：选自被aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及相当于这些的基因所编码的细胞外蛋白酶中的至少一种。目前已经掌握了这些细胞外蛋白酶是降低重组酶的生产性的主要原因，也报道有在缺失了这些细胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌株中重组酶的生产性得到了提高(日本特开2006-174707号公报)。与此相对，在本发明提供的M23A家族蛋白酶的制造方法中，反而优选将保持这些细胞外蛋白酶的芽孢杆菌属菌用作用于生产酶的宿主。

aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr及aprX为枯草芽孢杆菌基因。将这些基因的基因编号及所编码的蛋白质的功能示于表1中。作为相当于aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、及aprX的基因，可列举：在核苷酸序列中分别与epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、及aprX具有至少80％的同一性，且编码(如表1所示)相同功能的蛋白质的来自芽孢杆菌属菌的基因。关于这些基因，能够在上述的BSORF DB中检索。

[表1]

因此，被导入编码该前蛋白的多核苷酸的该芽孢杆菌属菌优选具有细胞外蛋白酶活性。关于微生物的细胞外蛋白酶活性，能够通过测定该微生物的培养上清的偶氮酪蛋白分解活性来检测。关于培养上清的偶氮酪蛋白分解活性，能够根据后述的实施例5(5-2)中所示的方法来测定。对于培养上清具有偶氮酪蛋白分解活性的微生物，将其判断为具有细胞外蛋白酶活性。

优选地，被导入编码该前蛋白的多核苷酸的该芽孢杆菌属菌是表达选自下述基因中的至少一种基因，且向细胞外分泌或释放被该基因编码的细胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌或其突变株，其中，所述基因是：aprE或相当于其的基因、epr或相当于其的基因、wprA或相当于其的基因、mpr或相当于其的基因、nprB或相当于其的基因、bpr或相当于其的基因、nprE或相当于其的基因、vpr或相当于其的基因、及aprX或相当于其的基因。更优选地，该芽孢杆菌属菌是表达下述基因，且向细胞外分泌或释放被该基因编码的细胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌或其突变株，其中，所述基因是：aprE或相当于其的基因、epr或相当于其的基因、wprA或相当于其的基因、mpr或相当于其的基因、nprB或相当于其的基因、bpr或相当于其的基因、nprE或相当于其的基因、vpr或相当于其的基因、及aprX或相当于其的基因。

在本发明的方法中，培养重组芽孢杆菌属菌，该重组芽孢杆菌属菌是通过如上所述的流程获得的且其中导入有编码目标M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸。对于该芽孢杆菌属菌，通过通常的芽孢杆菌属菌的培养方法进行培养即可。例如，用于培养芽孢杆菌属菌的培养基包含菌体的生长所需的碳源及氮源。作为碳源，例如，可列举：葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖、甲醇等。作为氮源，例如，可列举：铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、豆粕、马铃薯提取液等。该培养基中根据需要还可以包含其它营养素，例如，无机盐(例如，氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如，四环素、新霉素、卡那霉素、大观霉素(spectinomycin)、红霉素等)等。关于培养条件，例如，温度、通气搅拌条件、培养基的pH及培养时间等，可以根据菌种、性状、培养规模等而适当地进行选择。

在本发明的方法中，通过培养该重组芽孢杆菌属菌来表达目标M23A亚族蛋白酶的前蛋白。表达后的前蛋白被分泌或释放至细胞外，并在此通过该芽孢杆菌属菌分泌或释放的其它细胞外蛋白酶的作用而被加工，从而转换为具有酶活性的成熟型M23A亚族蛋白酶。因此，在本发明的方法中，在该重组芽孢杆菌属菌的细胞外制造成熟型M23A家族蛋白酶。所制造的成熟型M23A亚族蛋白酶积累在培养物的细胞外成分中。

按照以上的流程，通过本发明的方法制造成熟型M23A亚族蛋白酶。对于所制造的M23A亚族蛋白酶，能够按照常规方法从培养物中进行回收。在本发明的方法中，所制造的M23A亚族蛋白酶积累在细胞外，因此能够在不破坏细胞的情况下回收目标酶。例如，通过离心分离或过滤等从培养物中除去细胞，并通过通常的方法从所收集的上清或滤液中回收酶，其中，该通常的方法为利用硫酸铵等的盐或乙醇等的有机溶剂的沉淀、使用超滤膜等的浓缩或脱盐、离子交换或凝胶过滤等各种使用色谱法的精制等。

另外，作为示例的实施方式，本发明还包含以下的物质、制造方法、用途、方法等。但本发明不限定于这些实施方式。

[1]一种M23A家族蛋白酶的制造方法，其中，包含如下步骤：培养导入有编码M23A家族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸的芽孢杆菌属菌，从而在该芽孢杆菌属菌的细胞外制造成熟型M23A家族蛋白酶。

[2]根据[1]所述的方法，其中，优选所述M23A家族蛋白酶是：由序列号1、4、7、10或者13的氨基酸构成的多肽；或者，由与序列号1、4、7、10及13中任意一种的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键的分解活性的多肽。

[3]根据[2]所述的方法，其中，优选所述编码M23A家族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸为以下的多核苷酸，：

由序列号2、3、5、6、8、9、11、12、14及15中任意一种的核苷酸序列构成的多核苷酸；或

包含编码M23A亚族蛋白酶的前区的多核苷酸与连接于其下游的编码M23A亚族蛋白酶的多核苷酸的多核苷酸；

优选地，编码该M23A亚族蛋白酶的前区的多核苷酸为由序列号2的1～522号核苷酸区域的序列、序列号5的1～615号核苷酸区域的序列、序列号8的1～564号核苷酸区域的序列、序列号11的1～528号核苷酸区域的序列、序列号14的1～549号核苷酸区域的序列、或与它们具有至少80％同一性的序列构成，且有助于位于其下游的M23A亚族蛋白酶的成熟型蛋白质区域的三维结构的形成的多核苷酸。

[4]根据[2]所述的方法，其中，优选所述编码M23A家族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸为以下的多核苷酸：

由与序列号2的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号2的523～1062号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号2的1～522号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号3的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号3的595～1134号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号3的1～594号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号5的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，并且在相当于序列号5的616～1164号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号5的1～615号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号6的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号6的709～1257号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号6的1～708号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号8的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号8的565～1104号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号8的1～564号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号9的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号9的625～1164号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号9的1～624号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号11的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号11的529～1065号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号11的1～528号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号12的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号12的628～1164号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号12的1～627号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号14的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号14的550～1086号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；

具有序列号14的1～549号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸；

由与序列号15的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成，且在相当于序列号15的628～1164号核苷酸区域的区域具有编码所述M23A家族蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸；或者

具有序列号15的1～627号核苷酸区域的序列或与该序列具有至少80％同一性且编码M23A亚族蛋白酶的分泌信号及前区的序列、及连接于其下游的编码所述M23A家族蛋白酶的序列的多核苷酸。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，优选所述编码M23A家族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸进一步包含分泌信号区。

[6]根据[5]所述的方法，其中，优选所述分泌信号区为来自芽孢杆菌属菌的分泌信号区。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，优选所述芽孢杆菌属菌为向细胞外分泌蛋白酶或伴随溶菌而释放蛋白酶的菌。

[8]根据[7]所述的方法，其中，优选所述芽孢杆菌属菌具有细胞外蛋白酶活性。

[9]根据[7]或[8]所述的方法，其中，优选所述蛋白酶为选自被aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX及相当于这些的基因编码的细胞外蛋白酶中的至少一种。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，优选所述芽孢杆菌属菌为枯草芽孢杆菌或其突变株。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，优选进一步包括：从获得的培养物中回收M23A家族蛋白酶的步骤。

实施例

以下，使用实施例更具体地说明本发明。但是，本发明的技术范围并不限定于这些实施例。

将以下的实施例中使用的引物的序列示于表2中。

[表2]

引物名称	序列	序列编号
			BLP_S237signal_F	gaaggaaacactcgtatgaaaaaaatctcaaaagc	21
BLP_S237signal_R	aactagtttaatagattagttcggtccaggattcac	22
			vector-F	tctattaaactagttatagggttatctaaagg	23
vector-sig-R	acgagtgtttccttctgctgc	24
			ΔBLPsig_F	tgcagcatctgctcagggacatggattaa	25
ΔBLPsig_R	tgagcagatgctgcaagagctgccggaa	26
			BLPsig_F	ttaggaggtaatatgatgaaaaaaatctcaaaagctggtctgg	27
BLPsig_R	catattacctcctaaatatttttaaagtaattgaatc	28
			Δpro_F	ttgcagcatctccgaatggactgcttca	29
Δpro_R	tcggagatgctgcaagagctgccggaa	30
			ΔBLPsig2_F	tctgctcagggacatggattaag	31
amyEsig(BLP)_F	ttaggaggtaatatgatgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactg	32
			amyEsig(BLP)_R	atgtccctgagcagaagcactcgcagccgccggt	33
BLP_FLAG_F	acaaagatgatgatgataaataatctattaaactagttatagggttatctaaagg	34
			BLP_FLAG_R	catcatcatctttgtaatcgttcggtccaggattcac	35
LasA_F	gcagctcttgcagcacatgatgatggcctg	36
			LasA_CR	tagtttaatagattagtggtggtggtggtgcagagccagtcccgg	37
pHY_just_F	taatctattaaactagttatagggttatctaaagg	38
			pHY_just_R_NEW	tgctgcaagagctgccggaaa	39
LasA_Chis_n_R	cagagccagtcccggattatac	40
			AhP_F	ttaggaggtaatatgatgtctcgtccgatcc	41
AhP_R	aactagtttaatagattagtcgattccgtt	42
			vector-R	catattacctcctaaatatttttaaagtaattg	43
LgBLP_F	gcagctcttgcagcagcggaacgtggtctgagc	44
			LgBLP_R	tagtttaatagattagtgacccggattggtgaacc	45
LaBLP_F	gcagctcttgcagcaggcggtcgtgatgcgaatg	46
			LaBLP_R	tagtttaatagattacggattggtgaagtagccg	47
ΔS237N_fw	tgcagcaatgaaaaaaatctcaaaagctggtctgg	48
			ΔS237N_rv	tttttcattgctgcaagagctgccggaa	49
2R_bacillus-Chis	aactagtttaatagattagtggtggtggtggtggtcgattccgtt	50

实施例1：利用重组枯草芽孢杆菌生产BLP

(1-1)BLP表达质粒的构建

利用GenScript公司的人工基因合成服务，制备将BLP基因(序列号3)插入于质粒pUC57中的产物(BLP/pUC57)。以BLP/pUC57为模板，使用引物对BLP＿S237signal＿F/BLP＿S237signal＿R(序列号21及22)及PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)进行PCR。以WO2006/068148A1的实施例7中记载的质粒pHY-S237为模板，使用引物对vector-F/vector-sig-R(序列号23及24)，同样地进行PCR。利用DpnI(New England Biolabs公司)对PCR产物分别进行DpnI处理。使用获得的片段，按照In-Fusion、HD Cloning kit(Clontech公司)的工序进行In-Fusion反应。将In-Fusion反应液转化至ECOS^TM Competent E.coli DH5α(NIPPON GENE CO.,LTD.，310-06236)中，从而构建质粒(pHY-BLP)。

(A)pHY-BLP2

以pHY-BLP为模板，使用引物对ΔBLPsig＿F/ΔBLPsig＿R(序列号25及26)进行PCR。将PCR产物转化至E.coli HST08 Premium Competent Cells(TaKaRa Bio公司)，从而构建质粒(pHY-BLP2)。pHY-BLP2是由BLP基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，BLP基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、S237分泌信号序列(序列号18)、编码BLP前蛋白(前区+成熟体)的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(B)pHY-BLP3

以pHY-BLP为模板，使用引物对BLPsig＿F/BLPsig＿R(序列号27及28)进行PCR。将PCR产物转化至E.coli HST08 Premium Competent Cells(TaKaRa Bio公司)，从而构建质粒(pHY-BLP3)。pHY-BLP3是由BLP基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，BLP基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、编码BLP前原蛋白(分泌信号+前区+成熟体)的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(C)pHY-BLP4

以pHY-BLP2为模板，使用引物对Δpro＿F/Δpro＿R(序列号29及30)进行PCR。将PCR产物转化至E.coli HST08 Premium Competent Cells(TaKaRa Bio公司)，从而构建质粒(pHY-BLP4)。pHY-BLP4是由BLP基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，BLP基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、S237分泌信号序列(序列号18)、编码BLP成熟蛋白质的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(D)pHY-BLP5

以pHY-BLP为模板，使用引物对ΔBLPsig2＿F/BLPsig＿R(序列号31及28)进行PCR。以枯草芽孢杆菌168株(Bacillus subtilis Marburg No.168株：《自然》(Nature)，1997，390，p.249)基因组DNA为模板，使用引物对amyEsig(BLP)＿F/amyEsig(BLP)＿R(序列号32及33)，同样地进行PCR。使用所获得的片段进行In-Fusion反应，从而构建质粒(pHY-BLP5)。pHY-BLP5是由BLP基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，BLP基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、amyE分泌信号序列(序列号20)、编码BLP前蛋白(前区+成熟体)的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(1-2)重组枯草芽孢杆菌的制作

使用枯草芽孢杆菌168株作为宿主。通过以下的方法将(1-1)中获得的BLP表达质粒pHY-BLP2～5及空载体pHY300PLK(TaKaRa Bio公司)分别导入到宿主中。向1mL的LB培养基中接种枯草芽孢杆菌168株，在30℃、200spm下震荡培养一晩。将获得的培养液10μL接种于1mL的新的LB培养基中，在37℃、200spm下培养3小时。对培养液进行离心分离，回收颗粒物。向颗粒物中添加包含4mg/mL的溶菌酶(SIGMA公司)的SMMP(0.5M蔗糖、20mM马来酸二钠、20mM氯化镁六水合物、35％(w/v)抗生素培养基3号(Antibiotic medium 3，Difco公司))500μL，并在37℃下孵育1小时。接着，通过离心分离回收颗粒物，并悬浮于400μL的SMMP。将悬浮液33μL、各质粒20ng混合，再加入100μL的40％(w/v)PEG并搅拌，进一步加入350μL的SMMP之后，在30℃下震荡1小时。将获得的液200μL涂抹在包含四环素(15μg/mL，SIGMA公司)的DM3再生琼脂培养基(其中包含：0.8％琼脂(和光纯药)、0.5％琥珀酸二钠六水合物、0.5％酪蛋白氨基酸(Casamino Acids,工业级(Technical)，Difco公司)、0.5％酵母抽提物、0.35％磷酸一钾、0.15％磷酸二钾、0.5％葡萄糖、0.4％氯化镁六水合物、0.01％牛血清白蛋白(SIGMA公司)、0.5％羧甲基纤维素、0.005％台盼蓝(trypan blue,Merck公司)及氨基酸混合液(色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸各10μg/mL)；％表示(w/v)％)上，在30℃下孵育3天，从而获得所形成的菌落。

(1-3)重组枯草芽孢杆菌的培养及培养上清的获得

向以最终浓度为15ppm的方式添加有四环素的LB培养基1mL中接种(1-2)中获得的重组枯草芽孢杆菌菌落，然后，在30℃、150spm下培养一晩。第二天，将培养液400μL接种于2×L-麦芽糖培养基(其中包含：2％胰蛋白胨、1％酵母抽提物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰五水合物、21μM ZnSO₄、15ppm四环素；％表示(w/v)％)5mL中，在30℃、150spm下培养2天后，通过离心分离回收培养上清。

(1-4)培养上清中的酶活性的测定

作为底物，使用荧光基团Nma与淬火基团Lys(Dpn)之间为五甘氨酸的FRET底物[以下称为FRET-GGGGG](由PH日本公司接单生产)。在此，Nma是指2-(N-甲基氨基)苄基(Nma)。另外，Lys(Dpn)是指在赖氨酸(Lys)的侧链上具有2,4-二硝基苯基(Dnp)的物质。在96孔检测板(AGCTECHNO GALSS公司，3881-096)中添加(1-3)中获得的培养上清(适当稀释)2μL、20mM Tris-HCl(pH7.5)200μL，再添加FRET-GGGGG溶液(1mM FRET-GGGGG，100mM Tris-HCl(pH7.5))10μL，从而制备反应液。使用infinite M200(TECAN公司)，在温度30℃、激励波长340nm、测定波长440nm下经时地测定反应液的荧光强度。在相同反应条件下，测定反应液(该反应液使用20mM Tris-HCl(pH7.5)代替酶溶液，使用FRETS-25-STD1及FRETS-25-STD2(株式会社肽研究所)的等摩尔溶液代替FRET-GGGGG)的荧光强度，并制作校正曲线。将1单位(U)的活性定义为如下：在将包含1μmol FRETS-25-STD1及1μmol FRETS-25-STD2的溶液的荧光强度设为X时，显示X/min的荧光强度的变化所需的酶量。求得培养上清的FRET-GGGGG分解活性(U/mL)。

将测定的结果示于图1中。在导入有空载体的重组株的培养上清中，未检测到FRET-GGGGG分解活性，但在导入有编码BLP前蛋白的质粒(pHY-BLP2、3、5)的重组株的培养上清中，检测到了FRET-GGGGG分解活性。由此显示：在导入有编码BLP前蛋白的多核苷酸的重组枯草芽孢杆菌的培养上清中，存在具有甘氨酸-甘氨酸键的分解活性的酶。另外，与导入有包含BLP的本来的分泌信号的质粒(pHY-BLP3)的重组株相比，在导入有包含S237分泌信号的质粒(pHY-BLP2)及包含amyE分泌信号的质粒(pHY-BLP5)的重组株中，培养上清的FRET-GGGGG分解活性更高。由此显示：通过将在枯草芽孢杆菌中高效地起作用的分泌信号连接于前蛋白，提高了BLP的生产性。另外，在导入有不包含BLP的前区的质粒(pHY-BLP4)的重组株的培养上清中，未检测到FRET-GGGGG分解活性，由此显示：前区是BLP成熟体的生产中所必须的。

(1-5)SDS-PAGE

向(1-3)中获得的培养上清中混合最终浓度为2mM的苯甲基磺酰氟(Nacalaitesque公司)。将该混合液与添加有25mM的二硫苏糖醇(Thermo Fisher Scientific公司)的2×Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad公司)以1:1混合，并在100℃下加热5分钟。将获得的溶液作为样品，使用Any kD^TMMini-PROTEANTGX^TM免染胶(Bio-Rad公司)进行SDS-PAGE。标志物使用Precision Plus Protein^TM未着色标准品(Bio-Rad公司)。

SDS-PAGE的结果显示：在导入有编码BLP前蛋白的质粒(pHY-BLP2、3)的重组枯草芽孢杆菌的培养上清中，在BLP成熟体(19.3kDa)的位置处检测到条带(图2)。

实施例2：细胞外蛋白酶对成熟BLP生产的影响

(2-1)BLP-FLAG表达质粒的构建

以(1-1)中获得的质粒pHY-BLP2为模板，使用引物对BLP＿FLAG＿F/BLP＿FLAG＿R(序列号34及35)及PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)进行PCR。利用DpnI(NewEngland Biolabs公司)对PCR产物进行DpnI处理，将反应液转化至ECOS^TM CompetentE.coli DH5α(NIPPON GENE CO.,LTD.，310-06236)，从而构建质粒(pHY-BLP-FLAG)。质粒HY-BLP-FLAG是由BLP-FLAG基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，BLP-FLAG基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、S237分泌信号序列(序列号18)、C端追加有FLAG(注册商标)标签(DYKDDDDK的氨基酸序列)的编码BLP前蛋白的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(2-2)重组枯草芽孢杆菌的制作及培养上清的获得

作为宿主，使用枯草芽孢杆菌168株、及缺失9种细胞外蛋白酶基因(aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr及aprX)的枯草芽孢杆菌Dpr9株(日本特开2006-174707号公报的实施例1～5中制作的Kao9株)。通过与(1-2)相同的流程将(2-1)中获得的质粒pHY-BLP-FLAG及空载体pHY300PLK(TaKaRa Bio公司)分别导入宿主中，获得重组枯草芽孢杆菌的菌落。对于获得的重组枯草芽孢杆菌菌落，通过与(1-3)相同的流程进行培养，得到培养上清。

(2-3)培养上清中的酶活性的测定及蛋白质印迹

通过与(1-4)相同的流程测定(2-2)中获得的培养上清的酶活性。另外，使用(2-2)中获得的培养上清，通过与(1-5)相同的流程进行SDS-PAGE。使用Trans-Blot Turbo^TM系统(Bio-Rad公司)和Trans-Blot Turbo^TM Mini PVDF转录包(Bio-Rad公司)将SDS-PAGE后的凝胶转录至PVDF膜。使用iBind Western System(Life Technologies公司)使转录后的薄膜与HRP标记抗DYKDDDDK抗体(CST)进行反应，然后，使用ImmunoStar^TMZeta(富士薄膜和光纯药)检测目标蛋白质。

酶活性的测定的结果如下：在168株重组体中检测到了FRET-GGGGG分解活性，但在缺失细胞外蛋白酶的Dpr9株的重组体中，未检测到FRET-GGGGG分解活性(图3)。另外，免疫印迹的结果显示：在168株的重组体中，在BLP成熟体(19.3kDa)的位置处检测到了条带；在Dpr9株的重组体中，在BLP前蛋白(38.1kDa)的位置处检测到了条带(图4)。这些结果显示：培养物中的细胞外蛋白酶在活性型BLP成熟体的生产中承担了重要的作用，特别是作用于BLP的成熟化。

另一方面，针对9株的蛋白酶缺失株(Δepr株、ΔwprA株、Δmpr株、ΔnprB株、Δbpr株、ΔnprE株、Δvpr株、ΔaprE株、及ΔaprX株)，从全部株的重组体的培养上清中测定到了FRET-GGGGG分解活性。其中，8株的活性相对于168株为80％以上。剩余1株也相对于168株具有50％以上的FRET-GGGGG分解活性。这些结果及上述Dpr9株的结果表明：细胞外蛋白酶有助于活性型BLP成熟体的生产。

实施例3：利用重组枯草芽孢杆菌生产各种M23A亚族蛋白酶-1

(3-1)LasA表达质粒的构建

利用GenScript公司的人工基因合成服务，制备将LasA基因(序列号6)插入于质粒pUC57中的产物(LasA/pUC57)。以LasA/pUC57为模板，使用引物对LasA＿F/LasA＿CR(序列号36及37)，按照PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)的工序进行PCR。以pHY-S237(WO2006/068148A1)为模板，使用引物对pHY＿just＿F/pHY＿just＿R＿NEW(序列号38及39)，同样地进行PCR。利用DpnI(New England Biolabs公司)对各个PCR产物进行DpnI处理。使用获得的片段，按照In-Fusion、HD Cloning kit(Clontech公司)的工序进行In-Fusion反应。将反应液转化至E.coli HST08 Premium Competent Cells(TaKaRa Bio公司)，从而构建质粒(pHY-LasA)。以pHY-LasA为模板，使用引物对pHY＿just＿F/LasA＿Chis＿n＿R(序列号38及40)及KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)进行PCR、DpnI消化及连接(ligation)。将反应液转化至E.coli HST08 Premium Competent Cells(TaKaRa Bio公司)，从而构建质粒(pHY-LasA2)。pHY-LasA2是由LasA基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，LasA基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、S237分泌信号序列(序列号18)、编码LasA前蛋白(前区+成熟体)的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(3-2)AhP表达质粒的构建

利用GenScript公司的人工基因合成服务，制备将AhP基因(序列号9)插入于质粒pUC57中的产物(AhP/pUC57)。以AhP/pUC57为模板，使用引物对AhP＿F/AhP＿R(序列号41及42)，按照PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)的工序进行PCR。以pHY-S237(WO2006/068148A1)为模板，使用引物对vector-F/vector-R(序列号23及43)，同样地进行PCR。利用DpnI(New England Biolabs公司)对各个PCR产物进行DpnI处理。使用所获得的片段，按照In-Fusion、HD Cloning kit(Clontech)的工序进行In-Fusion反应。将反应液转化至E.coli HST08 Premium Competent Cells(TaKaRa Bio公司)，从而构建质粒(pHY-AhP)。pHY-AhP是由AhP基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，AhP基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、AhP分泌信号序列、编码AhP前蛋白(前区+成熟体)的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(3-3)LgBLP表达质粒的构建

利用GenScript公司的人工基因合成服务，制备将来自胶状溶杆菌(Lysobactergummosus)的BLP同源物(WP＿057941690.1，以下也称为LgBLP)的基因(LgBLP基因、序列号11)插入于质粒pUC57的产物(LgBLP/pUC57)。以LgBLP/pUC57为模板，使用引物对LgBLP＿F/LgBLP＿R(序列号44及45)，按照PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)的工序进行PCR。以pHY-S237(WO2006/068148A1)为模板，使用引物对pHY＿just＿F/pHY＿just＿R＿NEW(序列号38及39)，同样地进行PCR。利用DpnI(New England Biolabs公司)对各自的PCR产物进行DpnI处理。使用获得的片段，按照In-Fusion、HD Cloning kit(Clontech)的工序进行In-Fusion反应。将反应液转化至E.coli HST08 Premium Competent Cells(TaKaRa Bio公司)，从而构建质粒(pHY-LgBLP)。pHY-LgBLP是由LgBLP基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，LgBLP基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、S237分泌信号序列(序列号18)、编码LgBLP前蛋白(前区+成熟体)的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(3-4)LaBLP表达质粒的构建

利用GenScript公司的人工基因合成服务，制备将来自抗生素溶杆菌(Lysobacterantibioticus)的BLP同源物(WP＿057970430.1，以下也称为LaBLP)的基因(LaBLP基因、序列号14)插入于质粒pUC57的产物(LaBLP/pUC57)。以LaBLP/pUC57为模板，使用引物对LaBLP＿F/LaBLP＿R(序列号46及47)，按照PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)的工序进行PCR。以pHY-S237(WO2006/068148A1)为模板，使用引物对pHY＿just＿F/pHY＿just＿R＿NEW(序列号38及39)，同样地进行PCR。利用DpnI(New England Biolabs公司)对各个PCR产物进行DpnI处理。使用获得的片段，按照In-Fusion、HD Cloning kit(Clontech公司)的工序进行In-Fusion反应。将反应液转化至E.coli HST08 Premium CompetentCells(TaKaRa Bio公司)，从而构建质粒(pHY-LaBLP)。pHY-LaBLP是由LaBLP基因表达用序列和pHY300PLK载体序列构成，其中，LaBLP基因表达用序列是由S237启动子序列(序列号16)、S237分泌信号序列(序列号18)、编码LaBLP前蛋白(前区+成熟体)的序列、S237终止子序列依次连接而成。

(3-5)重组枯草芽孢杆菌的制作

作为宿主使用枯草芽孢杆菌168株。通过与(1-2)相同的流程将(3-1)～(3-4)中获得的各质粒及空载体pHY300PLK(TaKaRa Bio公司)分别导入于宿主中，从而获得重组枯草芽孢杆菌的菌落。

(3-6)重组枯草芽孢杆菌的培养及培养上清的获得

通过与(1-3)相同的流程培养(3-5)中获得的重组枯草芽孢杆菌菌落，得到培养上清。

(3-7)培养上清的酶活性的测定

通过与(1-4)相同的流程测定(3-6)中获得的培养上清的酶活性。需要说明的是，在LasA活性的测定中使用的是将空载体导入株及LasA表达质粒导入株的培养上清用Amicon Ultra 10K(Merck Millipore公司)浓缩至20倍而得到的产物。测定结果显示：对于全部的M23A亚族蛋白酶，在导入有编码前蛋白的多核苷酸的重组枯草芽孢杆菌的培养上清中，检测到了比空载体导入枯草芽孢杆菌的培养上清更高的FRET-GGGGG分解活性(图5)。

实施例4：利用重组枯草芽孢杆菌生产各种M23A亚族蛋白酶-2

(4-1)包含BLP的培养上清的制备

(4-1-1)表达载体的制作

利用GenScript公司的人工基因合成服务，制备将BLP基因(序列号3)插入于质粒pUC57中的产物(BLP/pUC57)。以BLP/pUC57为模板，使用引物对BLP＿S237signal＿F/BLP＿S237signal＿R(序列号21及22)及PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)进行PCR反应。以WO2006/068148 A1的实施例7中记载的质粒pHY-S237为模板，使用引物对vector-F/vector-sig-R(序列号23及24)，同样地进行PCR反应。利用DpnI(New England Biolabs公司)对各个PCR产物进行DpnI处理。接着，按照In-Fusion、HD Cloning kit(Clontech公司)的工序进行In-Fusion反应。

使用In-Fusion反应液转化ECOS^TMCompetent E.coli DH5α(NIPPON GENE CO.,LTD.，310-06236)。将转化处理后的细胞涂抹在含有氨苄西林的LB板上，并在37℃下培养一晩。将板上所形成的菌落接种于包含氨苄西林的LB培养基中，培养一晩后，回收菌体并使用高纯质粒分离试剂盒(High Pure Plasmid Isolation Kit，Roche公司)提取质粒(BLP/pHY)。以提取的BLP/pHY为模板，使用引物对ΔS237N＿fw/ΔS237N＿rv(序列号48及49)进行PCR反应。将该PCR产物转化至E.coli HST08 Premium Competent Cells(TaKaRa Bio公司)。将转化处理后的细胞涂抹于包含氨苄西林的LB板上，并在37℃下培养一晩。将板上所形成的菌落接种于包含氨苄西林的LB培养基中，培养一晩后，回收菌体并使用高纯质粒分离试剂盒(High Pure Plasmid Isolation Kit，Roche公司)提取质粒(BLP2/pHY)。

(4-1-2)酶生产转化株的制作

在1mL的LB培养基上接种枯草芽孢杆菌168株(Bacillus subtilis MarburgNo.168株：《自然》(Nature)，390，1997，p.249)，在30℃、200rpm下震荡培养一晩。在1mL的新的LB培养基上接种该培养液10μL，在37℃、200rpm下培养3小时。离心分离该培养液，回收颗粒物。向颗粒物中添加包含4mg/mL的溶菌酶(SIGMA公司)的SMMP[0.5M蔗糖、20mM马来酸二钠、20mM氯化镁六水合物、35％(w/v)抗生素培养基3号(Antibiotic Medium 3，Difco公司)]500μL，并在37℃下孵育1小时。接着，通过离心分离回收颗粒物，并悬浮于400μL的SMMP。将悬浮液13μL、(4-1-1)中获得的质粒BLP2/pHY溶液(10mM Tris-HCl，pH8.5，34.2ng/μL)2μL、SMMP20μL混合，再加入100μL的40％PEG并搅拌，进一步加入SMMP 350μL之后，在30℃下震荡1小时。将该液体200μL涂抹在包含四环素(15μg/mL，SIGMA)的DM3再生琼脂培养基[其中包含：0.8％琼脂(和光纯药)、0.5％琥珀酸二钠六水合物、0.5％酪蛋白氨基酸(Casamino Acids,工业级(Technical)，Difco公司)、0.5％酵母抽提物、0.35％磷酸一钾、0.15％磷酸二钾、0.5％葡萄糖、0.4％氯化镁六水合物、0.01％牛血清白蛋白(SIGMA公司)、0.5％羧甲基纤维素、0.005％台盼蓝(trypan blue,Merck公司)及氨基酸混合液(色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸各10μg/mL)；％表示(w/v)％]上，在30℃下孵育3天，从而获得所形成的菌落。

(4-1-3)利用转化株制造酶

向LB培养基中以最终浓度成为15ppm的方式添加四环素。向该培养基5mL中接种(4-1-2)中获得的枯草芽孢杆菌转化体菌落，然后，在30℃、250rpm下培养一晩。第二天，将该培养液400μL接种于2×L-麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母抽提物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰五水合物、15ppm四环素、6ppm硫酸锌七水合物；％表示(w/v)％)20mL，在32℃、230rpm下培养2天后，通过离心分离回收包含由菌体产生的酶的培养上清。

(4-2)包含LasA的培养上清的制备

利用GenScript公司的人工基因合成服务，制备将LasA基因(序列号6)插入于质粒pUC57中的产物(LasA/pUC57)。以LasA/pUC57为模板，使用引物对LasA＿F/LasA＿CR(序列号36及37)，按照PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)的工序进行PCR反应。以WO2006/068148 A1的实施例7中记载的质粒pHY-S237为模板，使用引物对pHY＿just＿F/pHY＿just＿R＿NEW(序列号38及39)，同样地进行PCR反应。利用DpnI(New England Biolabs公司)对各个PCR产物进行DpnI处理。接着，按照In-Fusion，HD Cloning kit(Clontech公司)的工序进行In-Fusion反应，从而得到质粒(LasA/pHY)溶液。

使用获得的质粒(LasA/pHY)溶液，通过与上述(4-1-2)相同的流程进行枯草芽孢杆菌prsA基因表达强化株(日本特开2007-49986号公报的实施例1中制作的prsA-Kc株)的转化，从而获得枯草芽孢杆菌转化体菌落。向2×L液体培养基中以最终浓度成为15ppm的方式添加四环素。向该培养基5mL中接种枯草芽孢杆菌转化体菌落之后，在30℃、250rpm下培养一晩。从培养液中回收颗粒物，从颗粒物中提取质粒LasA/pHY。以所提取的质粒LasA/pHY为模板，使用引物对pHY＿just＿F/LasA＿Chis＿n＿R(序列号38及40)、以及KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO公司)，进行PCR反应、利用Dpn I的质粒消化、及连接，从而得到质粒(LasA2/pHY)。

使用获得的质粒(LasA2/pHY)，通过与上述(4-1-2)相同的方法进行转化。此时，使用枯草芽孢杆菌prsA基因表达强化株(日本特开2007-49986号公报的实施例1中制作的prsA-Kc株)作为宿主。接着，对于所获得的转化株通过与(4-1-3)相同的流程进行培养，回收包含由菌体产生的酶的培养上清。

(4-3)包含AhP的培养上清的制备

利用GenScript公司的人工基因合成服务，制备将AhP基因(序列号9)插入于质粒pUC57中的产物(AhP/pUC57)。以AhP/pUC57为模板，使用引物对AhP＿F/2R＿bacillus-Chis(序列号41及50)，按照PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa Bio公司)的工序进行PCR反应。以WO2006/068148 A1的实施例7中记载的质粒pHY-S237为模板，使用引物对vector-F/vector-R(序列号23及43)，同样地进行PCR反应。利用DpnI(New England Biolabs公司)对每个PCR产物进行DpnI处理。接着，按照In-Fusion，HD Cloning kit(Clontech公司)的工序进行In-Fusion反应，从而得到质粒(AhP/pHY)溶液。

使用获得的质粒(AhP/pHY)，通过与上述(4-1-2)相同的方法进行转化。此时，使用枯草芽孢杆菌168株作为宿主。接着，对于获得的转化株通过与(4-1-3)相同的流程进行培养，回收包含由菌体产生的酶的培养上清。

(4-4)由培养上清制备蛋白酶

由(4-1)～(4-3)中获得的培养上清制备目标蛋白酶。使用Amicon Ultra截留分子量10K(Merck Millipore公司)，通过BufferA对培养上清进行缓冲液交换。使用AKTAexplorer 10S(GE Healthcare公司)由缓冲液交换後的液体制备酶。首先，将通过该缓冲液交换所得到的液体通入柱子1，接着，使用BufferB使柱子1的吸附成分洗脱。从洗脱截留中回收确认到FRET-GGGGG的分解活性的截留液。接下来，通过使用20mM Tris-HCl(pH7.5)、200mM NaCl的溶液平衡后的柱子2对所回收的截留液进行体积排阻色谱(Size ExclusionChromatography)，并回收确认到FRET-GGGGG的分解活性的截留液。使用Amicon Ultra截留分子量10K，通过20mM Tris-HCl(pH7.5)溶液对所回收的截留液进行缓冲液交换，得到包含目标蛋白酶的酶溶液。用于各培养上清的BufferA、BufferB、柱子1、及柱子2如表3所述。

[表3]

实施例5：枯草芽孢杆菌细胞外蛋白酶活性的测定

(5-1)枯草芽孢杆菌的培养及培养上清的获得

将枯草芽孢杆菌168株、9株的细胞外蛋白酶缺失株(Δepr株、ΔwprA株、Δmpr株、ΔnprB株、Δbpr株、ΔnprE株、Δvpr株、ΔaprE株、及ΔaprX株)及Dpr9株分别接种于LB培养基1mL，然后，在30℃、150spm下培养一晩。第二天，将培养液400μL接种于2×L-麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母抽提物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰五水合物、21μMZnSO₄；％表示(w/v)％)5mL，在30℃、150spm下培养2天后，通过离心分离回收培养上清。

(5-2)培养上清的偶氮酪蛋白分解活性的测定

使用偶氮酪蛋白(SIGMA公司)作为测定培养上清中所含的蛋白酶的活性的底物。向底物溶液(1％(w/v)偶氮酪蛋白、50mM Tris-HCl(pH7.5))中添加(5-1)中获得的培养上清50μL，并在37℃下使其反应18小时。添加5％三氯乙酸水溶液2mL淬灭反应，在15000rpm、4℃下离心5分钟。适当稀释上清后，使用光路长度为1cm的比色杯测定340nm的吸光度。颠倒培养上清和5％三氯乙酸水溶液的添加顺序，并将其作为对照组。将检测到的吸光度与对照组相比统计学上显著地(t检验，p＜0.05)增加的培养上清，判定为具有偶氮酪蛋白分解活性。测定的结果显示：在168株及9株的细胞外蛋白酶缺失株(Δepr株、ΔwprA株、Δmpr株、ΔnprB株、Δbpr株、ΔnprE株、Δvpr株、ΔaprE株、及ΔaprX株)的培养上清中，检测到了偶氮酪蛋白分解活性；另一方面，在Dpr9株的培养上清中，未检测到(检测限界以下)。该结果与每株的活性型BLP生产能力一致(表4)。

[表4]

株	培养上清的偶氮酪蛋白分解活性	活性型BLP生产能力
			168	+	+
Δepr	+	+
			ΔwprA	+	+
Δmpr	+	+
			ΔnprB	+	+
Δbpr	+	+
			ΔnprE	+	+
Δvpr	+	+
			ΔaprE	+	+
ΔaprX	+	+
			Dpr9	-	-

实施例6：与天然BLP生产菌的BLP生产性的比较

(6-1)BLP生产菌的培养及培养上清的获得

目前为止，作为生产活性型BLP的方法，得到验证的只有培养单独分离的天然BLP生产菌的方法。在本实施例中，使天然BLP生产菌生产BLP，并将其生产性与实施例1的BLP生产性重组枯草芽孢杆菌进行比较。

将天然BLP生产菌水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)M497-1株接种于LB培养基1mL之后，在30℃、150spm下培养一晩。第二天，将培养液400μL接种于2×L-麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母抽提物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰五水合物、21μMZnSO₄；％表示(w/v)％)5mL，在30℃、150spm下培养2天后，通过离心分离回收培养上清。

(6-2)培养上清的酶活性的测定

通过与(1-4)相同的流程测定(6-1)中获得的培养上清的酶活性。测定的结果显示，从水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)M497-1株的培养上清中检测到了14U/mL的FRET-GGGGG分解活性。这一值远远小于实施例1的成熟BLP表达重组枯草芽孢杆菌的活性(图1，分别为43、594及613U/mL)。需要说明的是，迄今为止的报道中最高效地生产BLP的菌株为非专利文献3中记载的溶杆菌属(Lysobacter sp.)IB-9374株。但是，其生产性是水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)M497-1株的2.4倍，远远不及实施例1的重组枯草芽孢杆菌的BLP生产性。综上可知：本发明不仅在异源表达上相比现有技术具有很大优势，它还是一种在其生产性方面也相比现有技术具有很大优势的技术。

以上，对本发明的实施方式进行了说明，但是需要注意的是：它们不是旨在将本发明限定于所说明的特定实施方式。本领域技术人员能够理解属于本发明的范围内的各种其它的变更及修改。本说明书中引用的文献及专利申请作为参考引用，与完全记载于本说明书中相同。

序列表

<110> 花王株式会社

<120> M23A家族蛋白酶的制造方法

<130> KS1612

<150> JP 2018-005193

<151> 2018/01/16

<150> JP 2018-005194

<151> 2018/01/16

<150> JP 2018-219142

<151> 2018/11/22

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 179

<212> PRT

<213> 水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)

<220>

<223> β-裂解金属肽酶(BLP)成熟蛋白质

<400> 1

Ser Pro Asn Gly Leu Leu Gln Phe Pro Phe Pro Arg Gly Ala Ser Trp

1 5 10 15

His Val Gly Gly Ala His Thr Asn Thr Gly Ser Gly Asn Tyr Pro Met

20 25 30

Ser Ser Leu Asp Met Ser Arg Gly Gly Gly Trp Gly Ser Asn Gln Asn

35 40 45

Gly Asn Trp Val Ser Ala Ser Ala Ala Gly Ser Phe Lys Arg His Ser

50 55 60

Ser Cys Phe Ala Glu Ile Val His Thr Gly Gly Trp Ser Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr His Leu Met Asn Ile Gln Tyr Asn Thr Gly Ala Asn Val Ser Met

85 90 95

Asn Thr Ala Ile Ala Asn Pro Ala Asn Thr Gln Ala Gln Ala Leu Cys

100 105 110

Asn Gly Gly Gln Ser Thr Gly Pro His Glu His Trp Ser Leu Lys Gln

115 120 125

Asn Gly Ser Phe Tyr His Leu Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Gly Tyr Arg

130 135 140

Ile Thr Ala Thr Gly Ser Ser Tyr Asp Thr Asn Cys Ser Arg Phe Tyr

145 150 155 160

Leu Thr Lys Asn Gly Gln Asn Tyr Cys Tyr Gly Tyr Tyr Val Asn Pro

165 170 175

Gly Pro Asn

<210> 2

<211> 1062

<212> DNA

<213> 水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)

<400> 2

tctgctcagg gacatggatt aagcggcgaa gatctggttt actcttacga tgaaatgttt 60

gattttgata tcgatgccta cctggcaaaa catgcgccgc atctgcataa acatagcgaa 120

gaaatctctc attgggccgg atattctggc atttcaccga aagttcttat cgcattaatg 180

gaacaacagt caggagctgt gagcgccaaa agagcaacaa atcgcccgtt tggcaaactt 240

gccagagcag atggatttgg cgcccaaaca cgcgaagtgg cgttagctct gagagaatct 300

ctttatgaac gcgatccgga tggagccaaa ggcccggtca cattagccag agcaaacccg 360

ctgcaggcac tttttgaacg ctcaggagat aatgaaccgg cagcggcttt aagaggagat 420

ggcgaatttc aacttgtcta cggcagatta tttaacgaac cgcgccaggc aaaagccgca 480

agcgatagat ttgcgaaagc tggaccggat gttcaaccgt tatctccgaa tggactgctt 540

cagtttccgt ttccgagagg cgcatcttgg catgtgggcg gagctcatac aaacacagga 600

tcaggcaatt atccgatgtc aagcctggat atgtcaagag gcggaggctg gggaagcaat 660

caaaacggca attgggtttc agcgagcgcg gctggatctt ttaaacgcca ttcttcatgc 720

tttgctgaaa ttgttcatac aggcggctgg tcaacaacat actaccatct gatgaacatc 780

cagtacaata caggcgcgaa cgttagcatg aatacagcca tcgcaaaccc ggctaataca 840

caagcgcagg ctctgtgcaa cggaggccaa agcacaggac cgcatgaaca ttggtcactg 900

aaacagaacg gctcatttta ccatctgaac ggaacatacc tttcaggcta tagaatcaca 960

gcgacaggca gctcttatga tacaaattgt agccgctttt atttgacaaa aaatggacag 1020

aactactgct atggttatta tgtgaatcct ggaccgaact aa 1062

<210> 3

<211> 1134

<212> DNA

<213> 水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)

<400> 3

atgaaaaaaa tctcaaaagc tggtctggga ctggctctgg tctgtgctct ggcgacgatt 60

ggaggcaacg catctgctca gggacatgga ttaagcggcg aagatctggt ttactcttac 120

gatgaaatgt ttgattttga tatcgatgcc tacctggcaa aacatgcgcc gcatctgcat 180

aaacatagcg aagaaatctc tcattgggcc ggatattctg gcatttcacc gaaagttctt 240

atcgcattaa tggaacaaca gtcaggagct gtgagcgcca aaagagcaac aaatcgcccg 300

tttggcaaac ttgccagagc agatggattt ggcgcccaaa cacgcgaagt ggcgttagct 360

ctgagagaat ctctttatga acgcgatccg gatggagcca aaggcccggt cacattagcc 420

agagcaaacc cgctgcaggc actttttgaa cgctcaggag ataatgaacc ggcagcggct 480

ttaagaggag atggcgaatt tcaacttgtc tacggcagat tatttaacga accgcgccag 540

gcaaaagccg caagcgatag atttgcgaaa gctggaccgg atgttcaacc gttatctccg 600

aatggactgc ttcagtttcc gtttccgaga ggcgcatctt ggcatgtggg cggagctcat 660

acaaacacag gatcaggcaa ttatccgatg tcaagcctgg atatgtcaag aggcggaggc 720

tggggaagca atcaaaacgg caattgggtt tcagcgagcg cggctggatc ttttaaacgc 780

cattcttcat gctttgctga aattgttcat acaggcggct ggtcaacaac atactaccat 840

ctgatgaaca tccagtacaa tacaggcgcg aacgttagca tgaatacagc catcgcaaac 900

ccggctaata cacaagcgca ggctctgtgc aacggaggcc aaagcacagg accgcatgaa 960

cattggtcac tgaaacagaa cggctcattt taccatctga acggaacata cctttcaggc 1020

tatagaatca cagcgacagg cagctcttat gatacaaatt gtagccgctt ttatttgaca 1080

aaaaatggac agaactactg ctatggttat tatgtgaatc ctggaccgaa ctaa 1134

<210> 4

<211> 182

<212> PRT

<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)

<220>

<223> Las A 蛋白质 (LAS) 成熟蛋白质

<400> 4

Ala Pro Pro Ser Asn Leu Met Gln Leu Pro Trp Arg Gln Gly Tyr Ser

1 5 10 15

Trp Gln Pro Asn Gly Ala His Ser Asn Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr

20 25 30

Ser Ser Phe Asp Ala Ser Tyr Asp Trp Pro Arg Trp Gly Ser Ala Thr

35 40 45

Tyr Ser Val Val Ala Ala His Ala Gly Thr Val Arg Val Leu Ser Arg

50 55 60

Cys Gln Val Arg Val Thr His Pro Ser Gly Trp Ala Thr Asn Tyr Tyr

65 70 75 80

His Met Asp Gln Ile Gln Val Ser Asn Gly Gln Gln Val Ser Ala Asp

85 90 95

Thr Lys Leu Gly Val Tyr Ala Gly Asn Ile Asn Thr Ala Leu Cys Glu

100 105 110

Gly Gly Ser Ser Thr Gly Pro His Leu His Phe Ser Leu Leu Tyr Asn

115 120 125

Gly Ala Phe Val Ser Leu Gln Gly Ala Ser Phe Gly Pro Tyr Arg Ile

130 135 140

Asn Val Gly Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Asp Cys Arg Arg Tyr Tyr Phe

145 150 155 160

Tyr Asn Gln Ser Ala Gly Thr Thr His Cys Ala Phe Arg Pro Leu Tyr

165 170 175

Asn Pro Gly Leu Ala Leu

180

<210> 5

<211> 1164

<212> DNA

<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 5

catgatgatg gcctgccggc atttcgttat tcagccgaac tgctgggtca actgcagctg 60

ccgtctgtgg cactgccgct gaatgatgac ctgtttctgt atggccgtga tgcggaagca 120

tttgatctgg aagcgtatct ggcactgaat gcaccggcac tgcgtgataa aagcgaatat 180

ctggaacatt ggtcaggcta ttattctatt aatccgaaag ttctgctgac actgatggtc 240

atgcaaagcg gtccgctggg tgcaccggat gaacgtgcac tggcagcacc gctgggccgt 300

ctgtcagcca aacgcggttt tgatgcgcag gtgcgcgatg ttctgcagca gctgtctcgc 360

cgttattatg gctttgaaga atatcaactg cgccaggcag cagcacgtaa agcagttggc 420

gaagatggtc tgaatgcagc atctgcagcg ctgctgggcc tgctgcgtga aggtgcaaaa 480

gtcagcgcag tgcagggcgg taatccgctg ggtgcatatg cccagacctt tcagcgcctg 540

tttggtacac cggcggcaga actgctgcag ccgtcaaatc gtgttgcacg tcaactgcag 600

gcaaaagcgg cactggcacc gccgagcaac ctgatgcagc tgccgtggcg tcagggctat 660

tcatggcagc cgaatggtgc acatagcaac acgggctcag gttatccgta tagctcattt 720

gatgccagct atgattggcc gcgttggggc tctgcaacct atagcgtggt tgcagcccat 780

gcgggtacag tccgcgtgct gtctcgttgc caagttcgtg tcacacatcc gtctggttgg 840

gcaaccaatt attatcatat ggatcagatt caggtgagca acggtcagca ggtttcagca 900

gatacgaaac tgggcgttta tgcaggtaat atcaacacag ccctgtgcga aggcggttct 960

agcacgggcc cgcatctgca tttttctctg ctgtataatg gtgcgtttgt ctcactgcag 1020

ggcgcatctt ttggtccgta tcgcatcaac gtgggcacca gcaattatga taacgattgt 1080

cgccgttatt acttctacaa tcagtctgct ggaacaaccc actgtgcctt tagaccgctg 1140

tataatccgg gactggctct gtaa 1164

<210> 6

<211> 1257

<212> DNA

<213> 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 6

atgcaacata aaagaagccg tgcgatggcg agcccgagaa gcccgttcct gtttgtgctg 60

ctggccctgg cggtgggtgg tactgccaac gcgcatgatg atggcctgcc ggcatttcgt 120

tattcagccg aactgctggg tcaactgcag ctgccgtctg tggcactgcc gctgaatgat 180

gacctgtttc tgtatggccg tgatgcggaa gcatttgatc tggaagcgta tctggcactg 240

aatgcaccgg cactgcgtga taaaagcgaa tatctggaac attggtcagg ctattattct 300

attaatccga aagttctgct gacactgatg gtcatgcaaa gcggtccgct gggtgcaccg 360

gatgaacgtg cactggcagc accgctgggc cgtctgtcag ccaaacgcgg ttttgatgcg 420

caggtgcgcg atgttctgca gcagctgtct cgccgttatt atggctttga agaatatcaa 480

ctgcgccagg cagcagcacg taaagcagtt ggcgaagatg gtctgaatgc agcatctgca 540

gcgctgctgg gcctgctgcg tgaaggtgca aaagtcagcg cagtgcaggg cggtaatccg 600

ctgggtgcat atgcccagac ctttcagcgc ctgtttggta caccggcggc agaactgctg 660

cagccgtcaa atcgtgttgc acgtcaactg caggcaaaag cggcactggc accgccgagc 720

aacctgatgc agctgccgtg gcgtcagggc tattcatggc agccgaatgg tgcacatagc 780

aacacgggct caggttatcc gtatagctca tttgatgcca gctatgattg gccgcgttgg 840

ggctctgcaa cctatagcgt ggttgcagcc catgcgggta cagtccgcgt gctgtctcgt 900

tgccaagttc gtgtcacaca tccgtctggt tgggcaacca attattatca tatggatcag 960

attcaggtga gcaacggtca gcaggtttca gcagatacga aactgggcgt ttatgcaggt 1020

aatatcaaca cagccctgtg cgaaggcggt tctagcacgg gcccgcatct gcatttttct 1080

ctgctgtata atggtgcgtt tgtctcactg cagggcgcat cttttggtcc gtatcgcatc 1140

aacgtgggca ccagcaatta tgataacgat tgtcgccgtt attacttcta caatcagtct 1200

gctggaacaa cccactgtgc ctttagaccg ctgtataatc cgggactggc tctgtaa 1257

<210> 7

<211> 179

<212> PRT

<213> 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)

<220>

<223> 嗜水气单胞菌蛋白酶(AhP)成熟蛋白质

<400> 7

Ala Gly Gly Gln Phe Gln Leu Pro Trp Arg Gln Gly Tyr Ser Trp Lys

1 5 10 15

Ala Asn Gly Ala His Ser His Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser

20 25 30

Ile Asp Val Ser Tyr Asp Trp Pro Gly Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Thr

35 40 45

Val Thr Ala Ala Asn Ser Gly Thr Val Thr Val Phe Ser Arg Cys Gln

50 55 60

Val Arg Val Thr Ala Thr Asn Gly Trp Ala Thr Asn Tyr Tyr His Met

65 70 75 80

Ser Gly Ile Ser Val Arg Ser Gly Asp Tyr Val Ala Ala Asp Thr Pro

85 90 95

Ile Gly Thr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Glu Ala Leu Cys Glu Gly Gly

100 105 110

Ser Ser Thr Gly Pro His Leu His Phe Ser Leu Leu Tyr Asn Gly Val

115 120 125

Phe Gln Ser Leu Gln Gly Gln Arg Leu Ser Ser Tyr Ala Val Asn Val

130 135 140

Gly Ala Ser Asn Tyr Asp Asp Asn Cys Asn Arg Phe Trp Leu Tyr Asn

145 150 155 160

Gln Arg Asn Gly Gln Arg Tyr Cys Ala Trp Gln Pro Leu Tyr Asn Asn

165 170 175

Gly Ile Asp

<210> 8

<211> 1104

<212> DNA

<213> 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)

<400> 8

ggcgatattc acgctccgct ggctccgtat cattttacgg cgcagcaact ggcagcatct 60

caaaccccgg cactgccgct ggatgaagca cattttgttt ttggcgaagc cgcgatggca 120

tttgatctgc atgattttct gctgcagcag gccccgcatc tgctgccgaa agaagaagtc 180

attctgcatt ggagcggtat cacgtcactg aatccgcagc tgctgctggc cctgatggaa 240

gcgagctcac agctgatttc agcaccgtct gaacaggcca tggcagcccc gtttgcgaaa 300

ctggtgaatg cacgtggctt tgataaccag ctggaactga tggcccgcca gctgtctgaa 360

cgtttttatc aggcacgcgc ccagcagaaa ctgatgcaac gttctgcacc ggcactggcc 420

ccgcaggcgg cacatcaggc cgcgctggca tcaatgctgt ctaccagcat gcagcgtcag 480

ctgggcgaac agtggcagac cctgtttggt caagatgcaa tgacaagccc gcgcggcggt 540

gcagcagcac cggcagcccc gctggcaggc ggtcaatttc agctgccgtg gcgtcagggc 600

tattcttgga aagcgaatgg tgcacattct catacaggca gcggttatcc gtattctagc 660

atcgatgtca gctatgattg gccgggttgg ggcggtgcga cctatacagt gacggcggca 720

aactcaggta ccgtgacagt gtttagccgt tgccaggtcc gtgtgacagc aaccaatggc 780

tgggcgacaa actattatca tatgagcggc atttcagtgc gttctggtga ttatgttgcc 840

gcggatacac cgatcggcac gtatgcctca aatcgcaacg aagcgctgtg cgaaggcggt 900

tcatctacgg gtccgcatct gcattttagc ctgctgtata atggcgtttt tcagtcactg 960

cagggtcagc gtctgagctc atatgcagtt aatgtcggcg ccagcaacta tgatgataat 1020

tgtaaccgct tttggctgta taaccaaaga aacggacaac gctactgtgc ttggcaaccg 1080

ctgtataata acggaatcga ctaa 1104

<210> 9

<211> 1164

<212> DNA

<213> 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)

<400> 9

atgtctcgtc cgatcccgtc cctgctgatg ctggctctgc tgccggctgc tggttgggct 60

ggcgatattc acgctccgct ggctccgtat cattttacgg cgcagcaact ggcagcatct 120

caaaccccgg cactgccgct ggatgaagca cattttgttt ttggcgaagc cgcgatggca 180

tttgatctgc atgattttct gctgcagcag gccccgcatc tgctgccgaa agaagaagtc 240

attctgcatt ggagcggtat cacgtcactg aatccgcagc tgctgctggc cctgatggaa 300

gcgagctcac agctgatttc agcaccgtct gaacaggcca tggcagcccc gtttgcgaaa 360

ctggtgaatg cacgtggctt tgataaccag ctggaactga tggcccgcca gctgtctgaa 420

cgtttttatc aggcacgcgc ccagcagaaa ctgatgcaac gttctgcacc ggcactggcc 480

ccgcaggcgg cacatcaggc cgcgctggca tcaatgctgt ctaccagcat gcagcgtcag 540

ctgggcgaac agtggcagac cctgtttggt caagatgcaa tgacaagccc gcgcggcggt 600

gcagcagcac cggcagcccc gctggcaggc ggtcaatttc agctgccgtg gcgtcagggc 660

tattcttgga aagcgaatgg tgcacattct catacaggca gcggttatcc gtattctagc 720

atcgatgtca gctatgattg gccgggttgg ggcggtgcga cctatacagt gacggcggca 780

aactcaggta ccgtgacagt gtttagccgt tgccaggtcc gtgtgacagc aaccaatggc 840

tgggcgacaa actattatca tatgagcggc atttcagtgc gttctggtga ttatgttgcc 900

gcggatacac cgatcggcac gtatgcctca aatcgcaacg aagcgctgtg cgaaggcggt 960

tcatctacgg gtccgcatct gcattttagc ctgctgtata atggcgtttt tcagtcactg 1020

cagggtcagc gtctgagctc atatgcagtt aatgtcggcg ccagcaacta tgatgataat 1080

tgtaaccgct tttggctgta taaccaaaga aacggacaac gctactgtgc ttggcaaccg 1140

ctgtataata acggaatcga ctaa 1164

<210> 10

<211> 178

<212> PRT

<213> 胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)

<220>

<223> LgBLP 成熟蛋白质

<400> 10

Ser Pro Asn Gly Leu Leu Gln Phe Pro Phe Pro Arg Gly Ala Arg Trp

1 5 10 15

His Val Gly Gly Ala His Thr Asn Thr Gly Ser Gly Asn Tyr Pro Met

20 25 30

Ser Ser Leu Asp Met Ser Leu Gly Gly Gly Trp Gly Ser Asn Gln Ser

35 40 45

Asn Thr Trp Val Ser Ala Ser Ala Asn Gly Ser Phe Lys Arg His Ser

50 55 60

Ser Cys Phe Ala Glu Ile Val His Ser Gly Gly Trp Ser Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr His Leu Met Asn Ile Arg Tyr Asn Thr Gly Ala Asn Val Gly Ser

85 90 95

Asn Thr Ala Ile Ala Asn Pro Ala Asn Thr Arg Ala Gln Ala Leu Cys

100 105 110

Asn Gly Gly Ser Ser Thr Gly Pro His Glu His Trp Ser Leu Lys Leu

115 120 125

Asn Gly Ser Phe Tyr His Leu Asn Gly Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr Arg

130 135 140

Ile Thr Ala Thr Gly Ser Ser Tyr Asp Thr Asn Cys Ser Arg Phe Tyr

145 150 155 160

Leu Ala Lys Asn Gly Gln Asn Tyr Cys Ser Gly Trp Phe Thr Asn Pro

165 170 175

Gly His

<210> 11

<211> 1065

<212> DNA

<213> 胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)

<400> 11

gcggaacgtg gtctgagcgg ccaggacctg gtttatagct acgatgaaat gtttgatttc 60

gacattgatg cgtacctggc gaaaaacgcg ccgcatctga gccgtcacgc ggaaagcatc 120

agccattggg cgggttatag cggcattagc ccgaaagtgc tgatcgcgct gatggaacag 180

caaagcggcg cgattacccg taaacatgca gcagcagatg cagcaaaacg tccgtttggt 240

gcactggcga aagcgaaaga tttcaatggt cagacccgtg aagttgcgca agcgctgcgt 300

gaagcgctgt acgaaaacga cggtccggat gcaaagggtg cagttaccgt ggcacgtgca 360

aatccgctgc aggcactgtt tgaacgtgcg ggtgcaagcc aagcaagcgc aaaactgagc 420

ggtgacggcg aatttcagct ggtgtatggt cgtctgttca acgaaccgcg tcaggcacag 480

gcaccgagcg cacgttttgc aaaagcgggt ccggatgttc agccgctgag cccgaatggc 540

ctgctgcaat ttccgtttcc gcgtggtgcg cgttggcatg tgggcggtgc gcacaccaac 600

accggtagcg gcaattaccc gatgagcagc ctggacatga gcctgggcgg tggctggggc 660

agcaaccaaa gcaatacctg ggttagcgcg agcgcgaacg gtagctttaa acgtcatagc 720

agctgcttcg cggaaattgt gcacagcggt ggctggagca ccacctatta ccatctgatg 780

aacattcgtt acaataccgg tgcgaacgtt ggcagcaata ccgcgattgc aaatccggca 840

aatacccgtg cacaggcact gtgcaatggt ggcagcagca ccggcccgca tgaacactgg 900

agcctgaaac tgaacggtag cttttatcat ctgaatggtg cgtatctgag cggctaccgt 960

atcaccgcga ccggcagcag ctatgatacc aactgcagcc gtttttacct ggcgaaaaac 1020

ggtcaaaatt attgcagcgg ctggttcacc aatccgggtc actaa 1065

<210> 12

<211> 1164

<212> DNA

<213> 胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)

<400> 12

atgtctaaca aaacaggatc taaccaggca ttttctaaaa tgggattagc attattaaca 60

tgctgcgttt tagcagcaat ctctggagga gcaggagcag cggaacgtgg tctgagcggc 120

caggacctgg tttatagcta cgatgaaatg tttgatttcg acattgatgc gtacctggcg 180

aaaaacgcgc cgcatctgag ccgtcacgcg gaaagcatca gccattgggc gggttatagc 240

ggcattagcc cgaaagtgct gatcgcgctg atggaacagc aaagcggcgc gattacccgt 300

aaacatgcag cagcagatgc agcaaaacgt ccgtttggtg cactggcgaa agcgaaagat 360

ttcaatggtc agacccgtga agttgcgcaa gcgctgcgtg aagcgctgta cgaaaacgac 420

ggtccggatg caaagggtgc agttaccgtg gcacgtgcaa atccgctgca ggcactgttt 480

gaacgtgcgg gtgcaagcca agcaagcgca aaactgagcg gtgacggcga atttcagctg 540

gtgtatggtc gtctgttcaa cgaaccgcgt caggcacagg caccgagcgc acgttttgca 600

aaagcgggtc cggatgttca gccgctgagc ccgaatggcc tgctgcaatt tccgtttccg 660

cgtggtgcgc gttggcatgt gggcggtgcg cacaccaaca ccggtagcgg caattacccg 720

atgagcagcc tggacatgag cctgggcggt ggctggggca gcaaccaaag caatacctgg 780

gttagcgcga gcgcgaacgg tagctttaaa cgtcatagca gctgcttcgc ggaaattgtg 840

cacagcggtg gctggagcac cacctattac catctgatga acattcgtta caataccggt 900

gcgaacgttg gcagcaatac cgcgattgca aatccggcaa atacccgtgc acaggcactg 960

tgcaatggtg gcagcagcac cggcccgcat gaacactgga gcctgaaact gaacggtagc 1020

ttttatcatc tgaatggtgc gtatctgagc ggctaccgta tcaccgcgac cggcagcagc 1080

tatgatacca actgcagccg tttttacctg gcgaaaaacg gtcaaaatta ttgcagcggc 1140

tggttcacca atccgggtca ctaa 1164

<210> 13

<211> 178

<212> PRT

<213> 抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)

<220>

<223> LaBLP 成熟蛋白质

<400> 13

Ala Gly Pro Ala Asn Gly Phe Leu Gln Phe Pro Tyr Pro Arg Gly Ala

1 5 10 15

Ser Trp His Val Gly Gly Ala His Thr Asn Thr Gly Ser Gly Asn Tyr

20 25 30

Pro Met Ser Ser Leu Asp Met Ser Arg Gly Gly Gly Trp Gly Ser Asn

35 40 45

Gln Ser Gly Asn Trp Val Ser Ala Ser Ala Gly Gly Ser Phe Lys Arg

50 55 60

His Ser Ser Cys Phe Ala Glu Val Val His Ser Gly Gly Trp Ser Thr

65 70 75 80

Thr Tyr Tyr His Met Met Asn Leu Gln Tyr Gly Thr Gly Ala Ser Val

85 90 95

Ala Ala Asn Ser Arg Ile Gly Asn Pro Ala Asn Thr Arg Ala Gln Ala

100 105 110

Leu Cys Asn Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro His Glu His Trp Ser Leu

115 120 125

Lys Tyr Asn Gly Ser His Tyr His Leu Asn Gly Val Tyr Leu Ser Gly

130 135 140

Tyr Gln Ile Thr Ala Leu Gly Ser Ser Tyr Asp Thr Asn Cys Ser Arg

145 150 155 160

Phe Tyr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Arg Tyr Cys Ser Gly Tyr Phe Thr

165 170 175

Asn Pro

<210> 14

<211> 1086

<212> DNA

<213> 抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)

<400> 14

ggcggtcgtg atgcgaatgc agcagcaggt ctgagcggtc aggatctggt ttatagctac 60

gacgaaatgt ttgatttcga caccgcggcg tatctggcga aacatgcgcc gcacctggtt 120

cgtcatagcg aaagcattag ccactgggcg ggttacagca gcattagccc gaaagtgctg 180

atcgcgctga tggaacagca aagcggtgtt gtgagccgtc aacgtgcaag cgcagatgca 240

atgcgtcgtc cgtttggcaa actgagcgcg gcgaaagact tcaatagcca gacccgtgaa 300

gttgcgaccg cgctgcgtca ggcgctgtat gaacaagaag atgcgagcct ggcgccgcaa 360

ggtcgtgttc cgctggcacg tagcaacccg ctgcaggcgc tgtatctgca agcaggtgaa 420

agccaggcaa gcgcagcact gcgtggtgac ggcgaatttc agcaagtgta cggtcgtctg 480

ttcaatgaac cgcgtaaggc agcaccggca agcgcacgtt ttgcagatac cagcgatgtt 540

aatgcactgg caggtccggc gaatggcttt ctgcagttcc cgtatccgcg tggcgcgagc 600

tggcatgtgg gcggtgcgca caccaacacc ggtagcggca attacccgat gagcagcctg 660

gatatgagcc gtggcggtgg ctggggtagc aaccaaagcg gcaattgggt tagcgcgagc 720

gcgggtggca gctttaaacg tcatagcagc tgcttcgcgg aagttgtgca cagcggtggc 780

tggagcacca cctattacca tatgatgaac ctgcaatatg gtaccggtgc gagcgtggca 840

gcaaatagcc gtattggtaa tccggcaaat acccgtgcac aggcactgtg caatggtggc 900

gcgagcaccg gtccgcatga acactggagc ctgaaatata acggcagcca ttaccacctg 960

aatggtgttt atctgagcgg ctaccaaatc accgcgctgg gcagcagcta tgacaccaac 1020

tgcagccgtt tttacctgag caaaaatggt agccgttatt gcagcggcta cttcaccaat 1080

ccgtaa 1086

<210> 15

<211> 1164

<212> DNA

<213> 抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)

<400> 15

atgaaagcaa tctctaaagc aagattagga ttattagcat gctgcatcgc agcagcaatc 60

ggaggaacag caacagcagg cggtcgtgat gcgaatgcag cagcaggtct gagcggtcag 120

gatctggttt atagctacga cgaaatgttt gatttcgaca ccgcggcgta tctggcgaaa 180

catgcgccgc acctggttcg tcatagcgaa agcattagcc actgggcggg ttacagcagc 240

attagcccga aagtgctgat cgcgctgatg gaacagcaaa gcggtgttgt gagccgtcaa 300

cgtgcaagcg cagatgcaat gcgtcgtccg tttggcaaac tgagcgcggc gaaagacttc 360

aatagccaga cccgtgaagt tgcgaccgcg ctgcgtcagg cgctgtatga acaagaagat 420

gcgagcctgg cgccgcaagg tcgtgttccg ctggcacgta gcaacccgct gcaggcgctg 480

tatctgcaag caggtgaaag ccaggcaagc gcagcactgc gtggtgacgg cgaatttcag 540

caagtgtacg gtcgtctgtt caatgaaccg cgtaaggcag caccggcaag cgcacgtttt 600

gcagatacca gcgatgttaa tgcactggca ggtccggcga atggctttct gcagttcccg 660

tatccgcgtg gcgcgagctg gcatgtgggc ggtgcgcaca ccaacaccgg tagcggcaat 720

tacccgatga gcagcctgga tatgagccgt ggcggtggct ggggtagcaa ccaaagcggc 780

aattgggtta gcgcgagcgc gggtggcagc tttaaacgtc atagcagctg cttcgcggaa 840

gttgtgcaca gcggtggctg gagcaccacc tattaccata tgatgaacct gcaatatggt 900

accggtgcga gcgtggcagc aaatagccgt attggtaatc cggcaaatac ccgtgcacag 960

gcactgtgca atggtggcgc gagcaccggt ccgcatgaac actggagcct gaaatataac 1020

ggcagccatt accacctgaa tggtgtttat ctgagcggct accaaatcac cgcgctgggc 1080

agcagctatg acaccaactg cagccgtttt tacctgagca aaaatggtag ccgttattgc 1140

agcggctact tcaccaatcc gtaa 1164

<210> 16

<211> 575

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌KSM-S237(Bacillus sp. KSM-S237)

<220>

<223> KSM-S237 启动子

<400> 16

gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa 60

taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt 120

gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac 180

gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata 240

aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa 300

tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat 360

gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta 420

gtaataatat agataactta taagttgttg agaagcagga gagcatctgg gttactcaca 480

agttttttta aaactttaac gaaagcactt tcggtaatgc ttatgaattt agctatttga 540

ttcaattact ttaaaaatat ttaggaggta atatg 575

<210> 17

<211> 617

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌KSM-64(Bacillus sp. KSM-64)

<220>

<223> KSM-64启动子

<400> 17

gaacaagtac ttaccatttt agagtcaaaa gatagaagcc aagcaggatt tgccgatgca 60

accggcttat atttagaggg aatttctttt taaattgaat acggaataaa atcaggtaaa 120

caggtcctga ttttattttt ttgaattttt ttgagaacta aagattgaaa tagaagtaga 180

agacaacgga cataagaaaa ttgtattagt tttaattata gaaaacgctt ttctataatt 240

atttatacct agaacgaaaa tactgtttcg aaagcggttt actataaaac cttatattcc 300

ggctcttttt ttaaacaggg ggtgaaaatt cactctagta ttctaatttc aacatgctat 360

aataaatttg taagacgcaa tatacatctt ttttttatga tatttgtaag cggttaacct 420

tgtgctatat gccgatttag gaagggggta gattgagtca agtagtcata atttagataa 480

cttataagtt gttgagaagc aggagagaat ctgggttact cacaagtttt ttaaaacatt 540

atcgaaagca ctttcggtta tgcttatgaa tttagctatt tgattcaatt actttaataa 600

ttttaggagg taatatg 617

<210> 18

<211> 87

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌KSM-S237(Bacillus sp. KSM-S237)

<220>

<223> KSM-S237信号(KSM-S237 signal)

<400> 18

atgttaagaa agaaaacaaa gcagttgatt tcttccattc ttattttagt tttacttcta 60

tctttatttc cggcagctct tgcagca 87

<210> 19

<211> 87

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌KSM-64(Bacillus sp. KSM-64)

<220>

<223> KSM-64信号(KSM-64 signal)

<400> 19

atgttaagaa agaaaacaaa gcagttgatt tcttccattc ttattttagt tttacttcta 60

tctttatttc cgacagctct tgcagca 87

<210> 20

<211> 74

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<223> amyE信号(amyE signal)

<400> 20

atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60

tttcatttgg ttct 74

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial); BLP_S237signal_F

<400> 21

gaaggaaaca ctcgtatgaa aaaaatctca aaagc 35

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> BLP_S237signal_R

<400> 22

aactagttta atagattagt tcggtccagg attcac 36

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> vector-F

<400> 23

tctattaaac tagttatagg gttatctaaa gg 32

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> vector-sig-R

<400> 24

acgagtgttt ccttctgctg c 21

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> delta-BLPsig_F

<400> 25

tgcagcatct gctcagggac atggattaa 29

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> delta-BLPsig_R

<400> 26

tgagcagatg ctgcaagagc tgccggaa 28

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> BLPsig_F

<400> 27

ttaggaggta atatgatgaa aaaaatctca aaagctggtc tgg 43

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> BLPsig_R

<400> 28

catattacct cctaaatatt tttaaagtaa ttgaatc 37

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> delta-pro_F

<400> 29

ttgcagcatc tccgaatgga ctgcttca 28

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> delta-pro_R

<400> 30

tcggagatgc tgcaagagct gccggaa 27

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> delta-BLPsig2_F

<400> 31

tctgctcagg gacatggatt aag 23

<210> 32

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> amyEsig(BLP)_F

<400> 32

ttaggaggta atatgatgtt tgcaaaacga ttcaaaacct ctttactg 48

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> amyEsig(BLP)_R

<400> 33

atgtccctga gcagaagcac tcgcagccgc cggt 34

<210> 34

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> BLP_FLAG_F

<400> 34

acaaagatga tgatgataaa taatctatta aactagttat agggttatct aaagg 55

<210> 35

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> BLP_FLAG_R

<400> 35

catcatcatc tttgtaatcg ttcggtccag gattcac 37

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> LasA_F

<400> 36

gcagctcttg cagcacatga tgatggcctg 30

<210> 37

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> LasA_CR

<400> 37

tagtttaata gattagtggt ggtggtggtg cagagccagt cccgg 45

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> pHY_just_F

<400> 38

taatctatta aactagttat agggttatct aaagg 35

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> pHY_just_R_NEW

<400> 39

tgctgcaaga gctgccggaa a 21

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> LasA_Chis_n_R

<400> 40

cagagccagt cccggattat ac 22

<210> 41

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> AhP_F

<400> 41

ttaggaggta atatgatgtc tcgtccgatc c 31

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> AhP_R

<400> 42

aactagttta atagattagt cgattccgtt 30

<210> 43

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> vector-R

<400> 43

catattacct cctaaatatt tttaaagtaa ttg 33

<210> 44

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> LgBLP_F

<400> 44

gcagctcttg cagcagcgga acgtggtctg agc 33

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> LgBLP_R

<400> 45

tagtttaata gattagtgac ccggattggt gaacc 35

<210> 46

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> LaBLP_F

<400> 46

gcagctcttg cagcaggcgg tcgtgatgcg aatg 34

<210> 47

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> LaBLP_R

<400> 47

tagtttaata gattacggat tggtgaagta gccg 34

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> delta-S237N_fw

<400> 48

tgcagcaatg aaaaaaatct caaaagctgg tctgg 35

<210> 49

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> delta-S237N_rv

<400> 49

tttttcattg ctgcaagagc tgccggaa 28

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 2R_bacillus-Chis

<400> 50

aactagttta atagattagt ggtggtggtg gtggtcgatt ccgtt 45

Claims (10)

1.一种M23A亚族蛋白酶的制造方法，其中，

包括如下步骤：

培养导入有编码M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸的芽孢杆菌属菌，从而在该芽孢杆菌属菌的细胞外制造成熟型M23A亚族蛋白酶，

所述M23A亚族蛋白酶为由序列号1、4、7、10或者13的氨基酸构成的多肽，

所述芽孢杆菌属菌为枯草芽孢杆菌或其突变株，该枯草芽孢杆菌的突变株是缺失了9种细胞外蛋白酶基因aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr和aprX中的任一种基因的枯草芽孢杆菌。

2.一种M23A亚族蛋白酶的制造方法，其中，

包括如下步骤：

培养导入有由序列号2、3、5、6、8、9、11、12、14及15中任意一种的核苷酸序列所示的多核苷酸的芽孢杆菌属菌，从而在该芽孢杆菌属菌的细胞外制造成熟型M23A亚族蛋白酶，

所述M23A亚族蛋白酶为由序列号1、4、7、10或者13的氨基酸构成的多肽，

所述芽孢杆菌属菌为枯草芽孢杆菌或其突变株，该枯草芽孢杆菌的突变株是缺失了9种细胞外蛋白酶基因aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr和aprX中的任一种基因的枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述编码M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸为以下的多核苷酸：

由序列号2的1～522号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号3的1～594号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号5的1～615号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号6的1～708号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号8的1～564号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号9的1～624号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号11的1～528号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号12的1～627号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号14的1～549号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸；

由序列号15的1～627号核苷酸区域的序列、及连接于其下游的编码所述M23A亚族蛋白酶的序列构成的多核苷酸。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，

所述编码M23A亚族蛋白酶的前蛋白的多核苷酸进一步包含分泌信号区。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，

所述分泌信号区为来自芽孢杆菌属菌的分泌信号区。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

所述芽孢杆菌属菌为向细胞外分泌蛋白酶或伴随溶菌而释放蛋白酶的菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，

所述芽孢杆菌属菌具有细胞外蛋白酶活性。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，

所述蛋白酶为选自被aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr及aprX所编码的细胞外蛋白酶中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，

所述蛋白酶为选自被aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr及aprX所编码的细胞外蛋白酶中的至少一种。

10.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

进一步包括：从获得的培养物中回收M23A亚族蛋白酶的步骤。