KR101576355B1 - 덱스트라나아제 활성을 갖는 신규 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 덱스트란 분해 효소를 생산하는, 박테로이데스 자일라니솔벤스(Bacteroides xylanisolvens) EFEL 001(기탁번호 KACC91918P), 박테로이데스 유니포르미스 (Bacteroides uniformis) EFEL 002(기탁번호 KACC91919P) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus) EFEL 003(기탁번호 KACC91920P)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 신규한 박테로이데스속 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 동정한 상기 신규한 박테로이데스속 균주들은 덱스트란 분해 효소인 덱스트라나아제를 생산하는 활성이 있어, 기능성 올리고당의 생산에 활용될 수 있는 있을 뿐만 아니라 발효유, 유제품, 김치 등 다양한 식품 및 음료의 제조를 위한 식품 첨가제 및 발효제로 활용될 수 있는 효과가 있다.

Description

덱스트라나아제 활성을 갖는 신규 미생물 및 이의 용도{Novel strain having dextranase activity and use thereof}

본 발명은 덱스트라나아제 활성을 갖는 신규 미생물 및 이의 용도에 관한 것으로, 한국인 장내 유래 덱스트라나아제 활성을 갖는 신규 미생물에 관한 것이다.

덱스트란은 글루칸 폴리머(glucan polymer)로 주로 α-1,6- 결합으로 이루어져 있고 α-1,3-, α-1,4-, α-1,2-와 같은 가지 결합도 가지고 있어 사람의 소화효소에 의해 분해되지 않으며, 김치와 같은 발효 식품에서 Leuconostoc mesenteroides에 의해 생성되고, 이는 대장까지 도달하여 장내미생물에 의해 분해되어 장내 유익균의 증식에 도움을 주는 prebiotic 후보 물질이다. 다양한 김치에서 풍부하게 검출되고 있어 한국인이 지속적으로 섭취하고 있는 대표적 미생물 생성 다당물질이다.

또한, 덱스트라나아제는 덱스트란의 α-1,6-결합을 가수분해하는 효소이다. 엔도-덱스트라나아제는 무작위적으로 분해하여 이소말토올리고당을 생성한다. 덱스트라나아제는 의료용 덱스트란 생산, 덱스트란 구조 분석, 이소말토올리고당 생산, 충치 예방과 같은 목적에 의해 상업적으로 이용된다. 식품산업에서 현탁액으로부터 덱스트란을 제거하는데 중요한 역할을 한다.

상업적인 덱스트라나아제는 Penicillium이나 Chaetomium에서 주로 생산된다. 하지만 이러한 곰팡이류는 항생제와 독성 대사물질을 생성하기 때문에 식품에 첨가하기는 적합하지 않다. 따라서 대안으로 박테리아성 덱스트라나아제의 개발에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 덱스트라나아제를 생성하는 박테리아로는 주로 구강에서 분리된 스트렙토코커스(Streptococcus) 속이 있고, 토양에서 Paenibacillus illinoisensis 가 있고, 사탕수수(beet sugar)에서 Thermoanaerobacter pseudethanolicus 이 알려져 있다.

그러나 사람의 장내 환경은 국가와 인종마다 다르므로 덱스트란이 풍부한 김치를 주로 섭취하는 한국인으로부터 분리한 박테리아가 있다면 이의 응용은 식품산업에서 안정성에 대한 우려를 낮출 수 있을 것으로 예상된다.

대한민국 특허출원 제2001-0048442호

이에 본 발명자들은 덱스트란을 분해하는 장내 미생물을 한국인의 분변으로부터 분리 및 동정하고, 덱스트라나아제 활성이 있는 신규 균주를 확인함과 동시에 이를 기능성식품소재인 이소말토올리고당을 제조하는 방법과 같은 상업적 용도로 활용할 수 있다는 것을 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은 덱스트란 분해 효소를 생산하는, 박테로이데스 자일라니솔벤스(Bacteroides xylanisolvens) EFEL 001(기탁번호 KACC91918P), 박테로이데스 유니포르미스 (Bacteroides uniformis) EFEL 002(기탁번호 KACC91919P) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus) EFEL 003(기탁번호 KACC91920P)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 신규한 박테로이데스속 균주를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 박테로이데스속 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 박테로이데스속 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 발효제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 신규한 덱스트라나아제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 신규한 덱스트라나아제를 암호화하는 덱스트라나아제 유전자를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 덱스트라나아제 유전자가 발현 벡터의 조절서열에 작동 가능하게 연결되어 포함된 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 이용하여 올리고당을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 덱스트란 분해 효소를 생산하는, 박테로이데스 자일라니솔벤스(Bacteroides xylanisolvens) EFEL 001(기탁번호 KACC91918P), 박테로이데스 유니포르미스 (Bacteroides uniformis) EFEL 002(기탁번호 KACC91919P) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus) EFEL 003(기탁번호 KACC91920P)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 신규한 박테로이데스속 균주를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 한국인 장내에서 유래된 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 신규한 박테로이데스속 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 신규한 박테로이데스속 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 발효제를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 신규한 덱스트라나아제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 덱스트라나아제는 박테로이데스 자일라니솔벤스(Bacteroides xylanisolvens) EFEL 001(기탁번호 KACC91918P)로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 덱스트라나아제는 박테로이데스 유니포르미스 (Bacteroides uniformis) EFEL 002(기탁번호 KACC91919P)로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 덱스트라나아제는 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus) EFEL 003(기탁번호 KACC91920P)로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 신규한 덱스트라나아제를 암호화하는 덱스트라나아제 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 덱스트라나아제 유전자가 발현 벡터의 조절서열에 작동 가능하게 연결되어 포함된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 이용하여 올리고당을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 덱스트란 분해 효소를 생산하는, 박테로이데스 자일라니솔벤스(Bacteroides xylanisolvens) EFEL 001(기탁번호 KACC91918P), 박테로이데스 유니포르미스 (Bacteroides uniformis) EFEL 002(기탁번호 KACC91919P) 및 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus) EFEL 003(기탁번호 KACC91920P)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 신규한 박테로이데스속 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명에서 동정한 상기 신규한 박테로이데스속 균주들은 덱스트란 분해 효소인 덱스트라나아제를 생산하는 활성이 있어, 기능성 올리고당의 생산에 활용될 수 있는 있을 뿐만 아니라 발효유, 유제품, 김치 등 다양한 식품 및 음료의 제조를 위한 식품 첨가제 및 발효제로 활용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 블루 덱스트란이 포함된 고체배지에서 덱스트란을 분해하여 투명환을 형성하는 장내세균 콜로니 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 RAPD-PCR(Random Amplified Polymorphic DNA-PCR)을 수행하여 상기 분리한 덱스트란 분해 장내세균의 유전자 특이적 패턴을 분석한 결과를 나타낸 것이며, 도 2에서 (A), (B), (C), (D)는 각각 M17, BHI, WCA, MRS 선택배지로서 이를 이용해 분리한 장내세균 중 동일한 밴드 분산도를 보이는 균주는 같은 것으로 간주하여 중복된 분리 균주의 갯수를 줄일 수 있도록 하였다.
도 3은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규 미생물들의 덱스트라나아제 활성을 zymogram으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 구형의 효소단백질을 선형으로 변성하여 전기영동 후 다시 구형으로 복원하고 덱스트란과 반응하여 나타나는 투명환으로 효소단백질의 존재 유무와 분자량을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명에서 분리 및 동정한 신규 미생물들을 이용하여 이소말토올리고당을 생성하는 활성이 있음을 가수분해를 통한 TLC 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. G는 포도당, M2는 말토스(맥아당), M3는 말토트리오스, IM2는 이소말토스, IM3는 이소말토트리오스이다. 본 발명에서 분리한 신규 미생물들은 도4에서 보듯이 다양한 길이의 이소말토올리고당을 생성한다.
도 5는 본 발명에서 분리 및 동정한 신규 미생물들의 계통수 분석 결과를 모식도로 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명에서 발굴한 신규 덱스트라나아제 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터를 제한효소로 처리한 후, 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 유전자 삽입 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이고, 6b는 본 발명에서 제조한 신규 덱스트라나아제 유전자가 도입된 재조합 벡터의 지도를 모식도로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 신규 덱스트라나아제 유전자가 도입된 재조합 벡터로 형질전환된 대장균에서 발현된 덱스트라나아제 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 신규 덱스트라나아제 유전자가 도입된 재조합 벡터로 형질전환된 대장균의 세포 용해물을 대상으로 HisTrap-FF 컬럼 크로마토그램을 통해 덱스트라나아제를 정제한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

본 발명의 신규 덱스트라나아제 활성을 갖는 미생물 분리 및 동정

건강한 한국인 성인의 분변 시료(2 g)을 단계적으로 희석하여 Blue dextran이 포함된 고체배지에 도말하였다. 이후 37℃ 에서 5일간 혐기 배양하여 투명환이 형성된 콜로니를 덱스트란 분해 균주로 선발하였다. 분리 균주는 OPL5 primer (ACGCAGGCAC)와 OPX14 primer (ACAGGTGCTG)를 이용한 multiple RAPD-PCR을 통해 형성된 균 특이적 패턴으로 같은 균주를 배제하였다. 이후 최종적으로 선별된 균주들에 대해 16S rRNA gene을 증폭하여 동정하였는데, Genomic DNA는 Walter 등의 방법에 따라 분리하였으며, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 primers는 27F primer (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492R primer (TACGGYTACCTTGTTA CGACTT)를 사용하였고, PCR조건은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초 간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension의 cycle을 35회 실시하였으며, 16S rRNA 염기서열 확인은 (주) Solgent사에 의뢰하여 분석하였다.

먼저, Blue dextran가 포함된 고체배지에서 투명환을 형성한 콜로니 사진을 도 1에 나타내었고, RAPD-PCR로 형성된 균 특이적 패턴을 도 2에 나타내었다. 또한, 도 1과 같은 방법으로 한국인의 분변에서 덱스트란을 분해하는 미생물을 100여개 분리하였으며, 도 2의 (A),(B),(C),(D)는 각각 M17, BHI, WCA, MRS 선택배지로서, 이를 이용해 분리한 장내세균 중 동일한 밴드 분산도를 보이는 균주는 같은 것으로 간주하여 중복된 분리 균주의 갯수를 줄일 수 있도록 하였다.

또한 최종 선별된 균주의 16S rRNA 유전자를 증폭하였는데, 대상 균주는 총 3개이며, 이들의 증폭된 16S rRNA의 크기는 각각 1270 bp, 1391 bp, 1400 bp인 것으로 나타났고, 염기서열을 해독한 결과 Bacteroides xylanisolvens XB1A, Bacteroides uniformis ATCC 8492, Bacteroides ovatus ATCC 8483와 높은 유사성을 보인 것으로 나타났으나, 전체적인 서열은 종래 알려진 균주와는 다른 신규한 균주임을 확인하였다.

따라서 이러한 염기서열 분석을 통해 본 발명에서 동정한 3가지 균주는 한국인 장내 유래의 신규한 Bacteroides에 속하는 균주로서, 본 발명자들은 이들 분리균을 각각 Bacteroides xylanisolvens EFEL 001, Bacteroides uniformis EFEL 002, Bacteroides ovatus EFEL 003으로 명명하였다.

또한, Bacteroides xylanisolvens EFEL 001의 16S rRNA 서열은 서열번호 1에 기재하였고, Bacteroides uniformis EFEL 002의 16S rRNA 서열은 서열번호 2에 기재하였으며, Bacteroides ovatus EFEL 003의 16S rRNA 서열은 서열번호 3에 기재하였다.

나아가 본 발명자들은 이들 3개의 균주들을 2014.01.14일에 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 기탁번호를 부여받았는데, Bacteroides xylanisolvens EFEL 001에 대해서는 KACC91918P의 기탁번호를, Bacteroides uniformis EFEL 002에 대해서는 KACC91919P의 기탁번호를, Bacteroides ovatus EFEL 003에 대해서는 KACC91920P의 기탁번호를 부여받았다.

<실시예 2>

본 발명의 신규 미생물의 덱스트라나아제 활성 분석

본 발명자들은 상기 실시예에서 분리한 균주들이 덱스트라나아제 활성이 있는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 분리한 균주를 37℃에서 24시간 전배양한 후 50 mL BHI(글루코스 브로스가 없는 BHI; Brain heart infusion 17.5 g, peptone 10 g, sodium chloride 5 g, disodium phosphate 2.5 g/L, pH 7.4, MB cell Co.)에 0.5 % dextran (sigma)이 첨가한 배지에 5 %의 양으로 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 이후 배양액을 원심 분리 (12,000 rpm, 10 min, 4 ℃, VISION) 하여 상등액 (extracellular)을 회수하고, 세포를 파쇄하여 원심분리 후 상등액 (intracellular)을 회수하였다. 수득한 상등액에 0.001% (w/v) SDS, 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM EDTA를 첨가하여 진탕배양 (180 rpm, 25 ℃, 30 min)한 다음, 다시 원심분리하여 상등액 (membrane-bound)을 회수하였다.

이후 각각의 조효소액(즉, 상기 원심분리하여 수득한 Extracellular, intracellular, membrane-bound 상등액)을 2X zymogrm sample buffer와 1:1로 혼합하여 10분간 방치한 다음 zymogram gel에 전기영동 하였다. 1X Triton X-100 200 ml에 gel을 넣고 상온에서 2시간 동안 진탕 후 0.1M sodium acetate buffer로 상온에서 30분 동안 진탕하였다. 이후, 0.1M sodium acetate buffer를 새로 갈아주고 37℃에서 투명 밴드가 보일 때까지 배양하였다.

분석 결과, 본 발명에서 새롭게 분리 동정한 균주인 Bacteroides xylanisolvens EFEL 001, Bacteroides uniformis EFEL 002, Bacteroides ovatus EFEL 003의 세포막 (membrane bound) 조효소액에서 덱스트라나아제 활성이 있는 것으로 나타나 효소는 세포막에 대부분 부착되어 있고, 덱스트라나아제 활성을 갖는 단백질의 분자량은 약 50~70 kDa인 것으로 나타났다(도 3 참조).

<실시예 3>

본 발명의 신규 미생물을 이용한 이소말토올리고당의 생성

본 발명자들은 실제 본 발명에서 분리 및 동정한 상기 3가지의 균주를 이소말토올리고당을 생성하는 용도로 사용할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 분리된 균주들을 포도당이 없는 BHI(Brain heart infusion 17.5 g, peptone 10 g, sodium chloride 5 g, disodium phosphate 2.5 g/L, pH 7.4, MB cell Co.)에 탄소원으로 0.5 % dextran (sigma)만 첨가한 배지에 5 % 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후 생성된 가수분해 산물을 TLC를 통해 이소말토올리고당의 생성을 조사하였다.

분석 결과, Bacteroides xylanisolvens EFEL 001, Bacteroides uniformis EFEL 002, Bacteroides ovatus EFEL 003 균주는 모두 엔도-덱스트라나아제 활성이 있는 것으로 나타났고, 덱스트란을 분해하여 다양한 길이(중합도 2-10)의 이소말토올리고당을 생성하는 것으로 나타났다(도 4 참조). 또한 비교 결과를 위해 다른 균주를 사용하여 위와 동일한 실험을 수행한 결과들도 도 4에 함께 나타나 있다.

<실시예 4>

본 발명의 신규 미생물 유래 신규의 덱스트라나아제 효소의 동정

상기와 같은 실험들을 통해 본 발명자들은 본 발명의 신규 미생물들이 덱스트라나아제 활성을 갖는다는 사실을 확인함에 따라 이들 미생물로부터 덱스트라나아제를 동정하고자 하였다.

이에 기존에 알려진 덱스트라나아제 서열을 이용하여 덱스트라나아제 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작한 후, PCR을 통해 gene을 증폭하였다. 증폭된 유전자는 이후 T-cloning하여 서열을 확인한 다음, 전체 서열을 확인하였다. PCR을 위해 사용한 프라이머 서열을 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

PCR 및 서열분석 결과, Bacteroides xylanisolvens EFEL 001, Bacteroides uniformis EFEL 002, Bacteroides ovatus EFEL 003 균주로부터 동정한 덱스트라나아제는 각각 1779 bp, 1806 bp, 1779 bp 크기의 염기서열을 가지고 있는 것으로 나타났고, 이들의 아미노산 서열을 기존에 알려진 공시균주의 그것들과 비교한 결과, 이들은 B. xylanisolvens XB1A와는 89.4 %, B. uniformis ATCC 8492와는 63.8 %, B. ovatus ATCC 8483와는 88.7 %의 상동성을 갖는 것으로 나타났고, 계통수 분석 결과 모두 GH 66 으로 분류되었다(도 5 참조).

또한, Bacteroides xylanisolvens EFEL 001로부터 분리된 덱스트라나아제의 아미노산 서열은 서열번호 4에 기재하였으며, 상기 아미노산을 암호화하는 cDNA 서열은 서열번호 5에 기재하였다. 또한, Bacteroides uniformis EFEL 002로부터 분리된 덱스트라나아제의 아미노산 서열은 서열번호 6에 기재하였으며, 상기 아미노산을 암호화하는 cDNA 서열은 서열번호 7에 기재하였고, Bacteroides ovatus EFEL 003으로부터 분리된 덱스트라나아제의 아미노산 서열은 서열번호 8에 기재하였으며, 상기 아미노산을 암호화하는 cDNA 서열은 서열번호 9에 기재하였다. 본 발명의 신규 Bacteroides의 미생물로부터 분리 및 동정한 상기 3가지의 덱스트라나아제는 종래 동일한 서열이 확인된 바 없는 신규한 단백질임을 알 수 있었다.

<실시예 5>

본 발명의 신규 덱스트라나아제의 정제 및 활성분석

<5-1> 신규 덱스트라나아제 유전자가 도입된 재조합 발현벡터 제조

상기 실시예 4에서 동정한 3가지 신규 덱스트라나아제 단백질을 코딩하는 cDNA 유전자(서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9)를 각각 당업계에서 판매하고 있는 pETDuet vector에 ligation시켜, 신규 덱스트라나아제 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터인 pETBxdex, pETBudex, pETBodex를 각각 제조하였고, 제대로 ligation이 되었는지 확인을 위해 제한효소인 EcoRI, PstI를 처리하여 분석한 결과, 모두 제대로 도입되어 재조합 벡터가 제조되었음을 확인할 수 있었다(도 6a 참조). 도 6b에는 상기 방법으로 재조합된 신규 덱스트라나아제가 삽입된 재조합 발현벡터의 지도를 나타낸 것으로, “dextranase”부분에 각각 서열번호 5, 7, 9의 cDNA 유전자를 대체하여 도입할 수 있으며, 도 6b은 이들 중 pETBxdex 재조합 벡터의 지도를 나타낸 것이다.

<5-2> 대장균에서 신규 덱스트라나아제의 발현 유도

상기 <5-1>의 재조합 벡터 중, pETBxdex 벡터를 대장균(E.coli)에 형질전환키시켜 대장균 내에서 신규 덱스트라나아제가 발현이 유도되어 과발현되었는지 확인하기 위해, pETBxdex 벡터로 형질전환된 대장균의 세포를 용해시키고 용해물들에 대해 가용성 분획(soluble fraction), 불용성 분획(insoluble fraction) 및 용해물자체(total protein)분획에 대해 SDS-PAGE로 전기영동 한 후, 염색한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 덱스트라나아제 유전자가 도입되지 않은 대조군 벡터(pETDuet)로 형질전환된 샘플에 비해 본 발명의 시료에서는 66kDa의 단백질이 과발현되어 있는 것으로 나타났다.

이는 덱스트라나아제의 질량 분석이 대략 65.3 kDa로 밝혀진 것과 같이 (Christensen et al, 2000), 본원 발명의 재조합 벡터를 통해 대장균에서 신규한 덱스트라나아제의 발현이 잘 유도되고 있다는 것을 알 수 있었다.

<5-3> 대장균으로부터 신규 덱스트라나아제의 정제

상기 <5-2>의 재조합 벡터가 형질전환된 대장균에서 과발현된 덱스트라나아제를 분리 및 정제하기 위해 당업계에서 단백질 정제에 사용되고 있는 방법인 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하였다. 즉, 신규한 덱스트라나아제를 코딩하는 덱스트라나아제 유전자를 His-tag이 결합된 N-terminus를 함유한 pETDuet(Novagen, USA)로 삽입한 후, E. coli에서 과발현시키고, 세포 용해물을 대상으로 one-step chromatographic 과정을 통해 homogeneity로 정제하였다.

분석 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 66kDa의 신규 덱스트라나아제 단백질이 정제된 것을 확인할 수 있었다.

<5-4> 본 발명의 신규 덱스트라나아제의 활성 분석

<5-3>을 통해 정제한 본 발명의 신규 덱스트라나아제의 활성을 측정하기 위해, 정제한 신규 덱스트라나아제를 dextran이 함유된 sodium acetate buffer에서 37C의 온도로 반응시켰다. 하기 표 2는 본 발명의 신규 덱스트라나아제(Bxdex) 가 정제되는 과정 동안의 효소 활성을 나타낸 것으로, 정제하지 않은 단백질 함유 용해물(crude enzyme)에 비해 정제한 단백질(Ni-NTA 정제)은 특이적 활성이 6.2배나 높은 8212.14 U/mg 활성도(dextran 분해활성도)를 갖는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규 미생물로부터 정제한 신규 덱스트라나아제 효소는 덱스트란을 분해하는 활성이 우수하여 덱스트란 분해 및 기능성 올리고당 생산에 유용하게 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

농업생명공학연구원 KACC91918 20140114 농업생명공학연구원 KACC91919 20140114 농업생명공학연구원 KACC91920 20140114

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University <120> Novel strain having dextranase activity and use thereof <130> pn1402-049 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1270 <212> RNA <213> Bacteroides xylanisolvens EFEL001 16sRNA sequence <400> 1 tgagtaacac gtatccaacc tgccgataac tcggggatag cctttcgaaa gaaagattaa 60 tatccgatag tatattaaaa ccgcatggtt ttactattaa agaatttcgg ttatcgatgg 120 ggatgcgttc cattagtttg ttggcggggt aacggcccac caagactacg atggataggg 180 gttctgagag gaaggtcccc cacattggaa ctgagacacg gtccaaactc ctacgggagg 240 cagcagtgag gaatattggt caatggacga gagtctgaac cagccaagta gcgtgaagga 300 tgactgccct atgggttgta aacttctttt atatgggaat aaagtattcc acgtgtggga 360 ttttgtatgt accatatgaa taaggatcgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac 420 ggaggatccg agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gagcgtaggt ggattgttaa 480 gtcagttgtg aaagtttgcg gctcaaccgt aaaattgcag ttgaaactgg cagtcttgag 540 tacagtagag gtgggcggaa ttcgtggtgt agcggtgaaa tgcttagata tcacgaagaa 600 ctccgattgc 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gaaagattaa 120 tacccgatgg catagttctt ccgcatggta gaactattaa agaatttcgg tcatcgatgg 180 ggatgcgttc cattaggttg ttggcggggt aacggcccac caagccttcg atggataggg 240 gttctgagag gaaggtcccc cacattggaa ctgagacacg gtccaaactc ctacgggagg 300 cagcagtgag gaatattggt caatggacga gagtctgaac cagccaagta gcgtgaagga 360 tgactgccct atgggttgta aacttctttt atacgggaat aaagtgaggc acgtgtgcct 420 ttttgtatgt accgtatgaa taaggatcgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac 480 ggaggatccg agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gagcgtaggc ggacgcttaa 540 gtcagttgtg aaagtttgcg gctcaaccgt aaaattgcag ttgatactgg gtgtcttgag 600 tacagtagag gcaggcggaa ttcgtggtgt agcggtgaaa tgcttagata tcacgaagaa 660 ctccgattgc gaaggcagct tgctggactg taactgacgc tgatgctcga aagtgtgggt 720 atcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acacagtaaa cgatgaatac tcgctgtttg 780 cgatatacag taagcggcca agcgaaagcg ttaagtattc cacctgggga gtacgccggc 840 aacggtgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggaggaaca tgtggtttaa 900 ttcgatgata cgcgaggaac cttacccggg cttgaattgc aactgaatga tgtggagaca 960 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accagccaag tagcgtgaag 360 gatgaaggct ctatgggtcg taaacttctt ttatatggga ataaagtttt ccacgtgtgg 420 aattttgtat gtaccatatg aataaggatc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 480 acggaggatc cgagcgttat ccggatttat tgggtttaaa gggagcgtag gtggattgtt 540 aagtcagttg tgaaagtttg cggctcaacc gtaaaattgc agttgaaact ggcagtcttg 600 agtacagtag aggtgggcgg aattcgtggt gtagcggtga aatgcttaga tatcacgaag 660 aactccgatt gcgaaggcag ctcactagac tgtcactgac actgatgctc gaaagtgtgg 720 gtatcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacacagta aacgatgaat actcgctgtt 780 tgcgatatac agtaagcggc caagcgaaag cattaagtat tccacctggg gagtacgccg 840 gcaacggtga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt 900 aattcgatga tacgcgagga accttacccg ggcttaaatt gcaacagaat atattggaaa 960 cagtatagcc gtaaggctgt tgtgaaggtg ctgcatggtt gtcgtcagct cgtgccgtga 1020 ggtgtcggct taagtgccat aacgagcgca acccttatct ttagttacta acaggttatg 1080 ctgaggactc tagagagact gccgtcgtaa gatgtgagga aggtggggat gacgtcaaat 1140 cagcacggcc cttacgtccg gggctacaca cgtgttacaa tggggggtac agaaggcggc 1200 tacctggtga caggatgcta atcccaaaaa cctctctcag ttcggatcga agtctgcaac 1260 ccgacttcgt gaagctggat tcgctagtaa tcgcgcatca gccatggcgc ggtgaatacg 1320 ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcaa gccatgaaag ccgggggtac ctgaagtacg 1380 taaccgcaag gagcgtccta 1400 <210> 4 <211> 590 <212> PRT <213> B. xylanisolvens dex polypeptide sequence <400> 4 Met Lys Lys Ile Ile Tyr Trp Val Ala Ala Phe Leu Ser Met Ala Cys 1 5 10 15 Ser Asp Asp His Gly Ser Asn Gln Glu Asn Gly Gly Ala Ser Gly Ser 20 25 30 Val Thr Glu Val Thr Pro Val Thr Ser Asp Leu Ser Val Asp Leu Ser 35 40 45 Thr Asp Lys Ala Phe Tyr Lys Pro Gly Glu Lys Val Val Phe Thr Ala 50 55 60 Glu Asp Ala Leu Pro Ala Gly Thr Lys Val Arg Tyr Arg Leu Leu Gly 65 70 75 80 Glu Val Val Gly Glu Glu Ser Val Asn Gly Thr Ser Trp Ile Trp Gln 85 90 95 Pro Pro Thr Thr Asp Phe Lys Gly Tyr Met Ala Glu Leu Tyr Arg Gln 100 105 110 Glu Asn Gly Thr Asp Val Ile Val Gly Thr Ile Ala Val Asp Val Ser 115 120 125 Ser Asp Pro Ser Arg Phe Pro Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asp Phe Ser 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ccaaccggga ggtctatacc gaggtagtga 600 agaagtatat ctctacacaa cacagcctgg gcatgaagtc catgttttac aatctatgtt 660 tcggagcttt ggacgatgcc gtttccgacg gagtaaagga agaatggtac atattcaaga 720 acacgggacg catggataag gattcgcatg acttgccctc cagttggaaa agtaatatct 780 tcctgctcaa tcccaccaat acggaatggc aggcatatat tgcccagaaa aacgatgatg 840 tttatgccaa tctggacttt gacggttatc agatagacca actgggaaac cggggtgacc 900 gctatgacta tgatggcaat aaggtaaatc tgcctaaggg atatgcctcg ttcatcgaag 960 ccatgaaaca gaagcatccg gacaagcgtt tggtgatgaa tgccgtctcc agctatggag 1020 cttcccagat agctggtacg ggtaaagtgg atttccttta taatgaagta tggggcgatg 1080 aggcaggctt caaggatctg cacaccatta tcaaagcgaa cgaccagtat ggcaaccatg 1140 ccttgaaaac ggtgtttgcc gcatatatga actatgacaa ggcaggtagc agtaccggtg 1200 agttcaatac accgggtgtg ctgctgacgg atgctgtgat atttgctttg ggaggctctc 1260 atttggaatt gggtgaccac atgctatgcc gcgagtactt tccaagcacg gctttgcaga 1320 tgaacgatgt actgaaaaca gccatgattc gttattatga ctttatgacg gcttatcaga 1380 acctgcttcg tgataaagat acggaggcgg agatttccgt 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Ala His Pro Asp Lys Ser Leu Val 325 330 335 Met Asn Ala Val Ser Arg Tyr Gly Ala Arg Gln Ile Gly Glu Thr Gly 340 345 350 Lys Val Asp Phe Phe Tyr Asn Glu Val Trp Ala Asp Glu Ala Asp Phe 355 360 365 Thr Asn Leu Lys Ala Ile Leu Tyr Glu Asn Gly Val Tyr Gly Asn Tyr 370 375 380 Gln Leu Asn Thr Val Phe Ala Ala Tyr Met Asn Tyr Asn Lys Ala Asp 385 390 395 400 Asn Arg Gly Glu Phe Asn Thr Pro Gly Ile Leu Leu Thr Asp Ala Val 405 410 415 Met Phe Ala Leu Gly Gly Ser His Leu Glu Leu Gly Gly Asp His Met 420 425 430 Leu Cys Lys Glu Tyr Phe Pro Asn Glu Asn Leu Thr Met Ser Glu Glu 435 440 445 Leu Lys Thr Ala Met Val Arg Tyr Tyr Asp Phe Leu Thr Ser Tyr Gln 450 455 460 Asn Leu Leu Arg Asp Gly Gly Thr Glu Asn Ser Val Ser Met Asn Cys 465 470 475 480 Thr Asn Gly Glu Met Arg Leu Asn Ser Trp Pro Pro Gln Gln Gly Ser 485 490 495 Val Thr Thr Tyr Ala Lys Gln Val Gly Gly Lys Gln Val Ile His Leu 500 505 510 Leu Asn Phe Ser Gln Ala Asn Ser Leu Ser Trp Arg Asp Val Asp Gly 515 520 525 Thr Met Pro Glu Pro Ala Leu Ile Xaa Lys Ala Ala Leu Gln Met Asn 530 535 540 Leu Ser Ala Lys Val Asn Lys Leu Trp Val Ala Ser Pro Asp Val His 545 550 555 560 Gly Gly Ala Leu Gln Glu Leu Ala Phe Thr Gln Glu Asn Gly Val Val 565 570 575 Ser Leu His Ala Phe Pro Glu Ile Leu Asp Asp Asp Cys Gly 580 585 590 <210> 9 <211> 1777 <212> DNA <213> B. ovatus dex cDNA <400> 9 atgaagaaaa taatatattg ggtggctgct ttcctgtgta tggcttgcag tgacgatcat 60 gggtcgaacc aggagaatgg aggagcttcg ggcagtgtca ccgaagtgac tccggtaaca 120 tcggatttaa gtgtggacct atctacggat aaggctttct ataaaccggg ggagaaagtg 180 gtatttacag cagatgacgc gttgcctgcc ggaattaaag ttcgttatcg tcttttaggg 240 gaggttgtcg gagaagagtc ggtaaatggt accagttgga catggcaacc gcctactact 300 gatttcaaag gatatatggc ggaactgtac cgtcaggaga atggtacaga tgtgattgtc 360 ggtacgattg cggtagatgt atccagtgat ccggcacgtt ttccgcgtta tggttttgtc 420 gctgatttca gtcgggagaa gacggctgaa aagacacagg aagagatggc gtatctgaat 480 cgtcatcaca tcaattgggt acagtttcag gactggcata ataagcatca ctggccgttg 540 ggcggtacac gcacacagtt ggacgaagtg tatatggaca tcgctaaccg ggaggtttat 600 acaagttcgg tgaaaaatta cattgaagcg cagcatcgtt tcggtatgaa gtctatgttt 660 tacaatcttt gtttcggagc gttggaggat gctgctacgg acggggtgaa gaaggaatgg 720 tatttgttta aggatgcttc tcacactact aaagacagcc atgatttgcc gggcggatgg 780 aaaagtaata tctatctggt ggatccttct aataaggaat ggcagaaata tttgaacgaa 840 aggaatgatg atgtatatgc gaactttgcc ttcgacggct atcagataga ccagttggga 900 cgacgcagca cgctttacaa ttacaacggt attccggtcg atctgcgtga gggatatgct 960 tcttttattg aagcgacgaa gcaggctcat ccggacaaga gtttggtgat gaatgcggtc 1020 agccgttacg gtgcccgtca gataggggag acaggtaaag ttgatttctt ctataatgag 1080 gtgtgggcgg atgaggctga ttttaccaat ctgaaagcca ttctttatga aaatggagtt 1140 tatggcaatt atcagttgaa tacggttttt gcagcttata tgaattataa taaagcggat 1200 aaccggggag aatttaatac gccgggtatc ttattgacag atgctgttat gtttgctttg 1260 ggtggttcgc acctggagtt gggaggcgat cacatgttgt gcaaagagta ctttccgaat 1320 gagaacctga caatgagcga agaattgaaa acagcgatgg ttcgttacta tgatttcctg 1380 acttcttatc aaaacctgct tcgtgacggt ggtacggaga atagtgtttc catgaattgt 1440 accaatggcg aaatgagatt gaatagttgg cctcctcaac agggatcagt tactacttat 1500 gccaagcagg taggtggcaa gcaagtgata catcttctta atttctcgca agcgaacagt 1560 cttagctgga gagatgtgga cggtacgatg ccggaaccgg ctctgattnc aaaagcagct 1620 ttgcaaatga atctgtcggc aaaggtgaat aagctgtggg tagcgtcgcc ggatgtacac 1680 ggaggagctt tgcaggaatt ggcctttaca caggagaacg gggtcgtctc attacatgcc 1740 ttccctgaaa tattggacga tgattgtggt tgaataa 1777 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> BXY_22030-N primer <400> 10 ttgaattcaa tgaagaaaat aatatattgg g 31 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BXY_22030 -C primer <400> 11 ttctgcagtt attcagccac aatcat 26 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BACUNI_01946-N primer <400> 12 ttgaattcaa tgaagaagat agtttataca aca 33 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BACUNI_01946-C primer <400> 13 ttctgcagtt attccatcac aagcat 26 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BACOVA_02784-N primer <400> 14 ttgaattcaa tgaagaaaat aatatattgg g 31 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BACOVA_02784-C primer <400> 15 ttctgcagtt attcaaccac aatcatc 27 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XYLdex - N primer <400> 16 aaaccagttg ggacgacgc 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XYLdex - C primer <400> 17 aagcgtcgtc ccaactggt 19 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNIdex - N primer <400> 18 aaacggttat cagatagacc aactgg 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNIdex - C primer <400> 19 aaccagttgg tctatctgat aaccgt 26

Claims (12)

1. 덱스트란 분해 효소를 생산하는 신규한 균주인 박테로이데스 자일아니솔벤스(Bacteroides xylanisolvens) EFEL 001(기탁번호 KACC91918P).
2. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 한국인 장내에서 유래된 것을 특징으로 하는 균주.
3. 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물.
4. 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 발효제.
5. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 신규한 덱스트라나아제.
6. 제5항에 있어서,
   서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 덱스트라나아제는 박테로이데스 자일아니솔벤스(Bacteroides xylanisolvens) EFEL 001(기탁번호 KACC91918P)로부터 분리 및 정제된 것을 특징으로 하는 신규한 덱스트라나아제.
7. 삭제
8. 삭제
9. 서열번호 5의 DNA 서열로 이루어진 신규한 덱스트라나아제를 암호화하는 덱스트라나아제 유전자.
10. 제9항의 덱스트라나아제 유전자가 발현 벡터의 조절서열에 작동 가능하게 연결되어 포함된 재조합 발현 벡터.
11. 제10항의 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
12. 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 이용하여 올리고당을 생산하는 방법.

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