KR20100107591A

KR20100107591A - 류코노스톡 락티스로부터 유래된 글루칸수크라제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20100107591A
Application number: KR1020090025728A
Authority: KR
Inventors: 김중수; 연민지; 송재준; 최종현; 최낙식; 김용모; 손동호; 조현정; 한윤전; 장영효; 정민영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2010-10-06
Also published as: KR101091138B1

Abstract

본 발명은 김치 유산균로부터 분리된 류코노스톡 락티스(Leuconostoc Lactis) EG001 균주 유래의 신규 글루칸수크라제, 상기 글루칸수크라제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 글루칸수크라제 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 글루칸수크라제는 수크로즈, 글루코즈 등의 풍부한 탄수화물 자원을 이용하여 다당을 합성함으로써 식품, 의약품 산업에 유용하게 활용될 수 있다.

류코노스톡 락티스, 글루칸수크라제

Description

류코노스톡 락티스로부터 유래된 글루칸수크라제 및 그 제조방법{Glucansucrase Derived from Leuconostoc lactis and Method for Preparing the Same}

본 발명은 식품이나 제약 등의 산업에 유용한 글루칸 폴리머 (gluan polymer)를 합성하는데 응용할 수 있는 글루칸수크라제 (glucansucrase) 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 김치로부터 분리된 류코노스톡 락티스(Leuconostoc Lactis) EG001 균주 유래의 신규 글루칸수크라제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

유산균은 발효식품을 제조하는데 전통적으로 유용하게 이용되어 왔다. 유산균에 의해 생산되는 젖산(lactic acid)은 부패에 관여하는 미생물의 성장을 저해하는 효과가 있다. 또한, 유산균이 생산해내는 엑소폴리사카라이드(exopolysacharides) 또는 폴리사카라이드(polysacharides)는 발효식품의 독특한 맛을 내는 화합물의 전구체, 박테리오신(bacteriocins) 등을 포함하는 항생물질로써의 역할을 한다. 이러한 유산균의 특성은 인체에 유해하지 않으며, 식품 보관에 있어 장점이 있기 때문에 전통적으로 다양한 발효식품에 이용되어 왔다. 특히, 최 근에는 유산균이 생산하는 polymer는 건강식품, 제약산업에 유용한 화합물로 응용되고 있다 (Maher Korakli and Rudi F. Vogel, App. Microbiol. Biotechnol., 71, 790-803, 2006).

한편, 글루칸수크라제 (EC 2.4.1.5)는 다양한 유산균 (lactic acid bacteria)에서 일반적으로 수크로즈(sucrose)로부터 글루칸(glucans)으로 불리는 D-glucose polymers의 합성을 촉매하는 효소로 알려져 있다. 또한, Leuconostoc mesenteroides에서 주로 생산되는 효소는 덱스크란수크라제 (dextransucrases), Streptococcus species로부터 일반적으로 생산되는 효소는 글루코실트랜스퍼라제 (glucosyltransferases, GTFs)로도 불린다. 이 효소의 일반적인 구조는 signal peptide가 있는 N-terminal end, variable region, catalytic 또는 sucrose binding domain, C-terminal glucan binding domain으로 구성된다. 글루칸수크라제는 Leuconostoc과 Streptococcus 속 등 lactic acid bacteria에서 주로 생산된 후, 세포외로 분비되며, 주변에 있는 sucrose 기질을 polymer로 합성함으로써 세포를 외부 환경으로부터 보호한다. 이러한 글루칸수크라제는 다양한 분야에서 특히, 건강응용(health applications) 분야에서 올리고사카라이드(oligosacharides)를 합성하는데 중요하게 이용되고 있다 (FEMS Microbiology Reviews, 23, 131-151, 1999).

수크로즈(sucrose)로부터 합성된 글루칸(glucan)은 주쇄에 글루코즈(glucose) 단위가 α-(1-2), α-(1-3), α-(1-4), α-(1-6) 등 다양한 결합으로 연결된 호모폴리머(homopolymer)로서 글루칸수크라제의 종류에 따라 가지(chains) 결합의 종류, 비율 및 길이가 각각 달라진다. 따라서 다양하게 존재하는 글루칸수크라제는 서로 높은 유사성을 갖더라도 글루코시딕 결합(glucosidic linkages)의 형태에 따라서 다양한 글루칸을 합성할 수 있다. 이렇게 합성되는 글루칸은 하기와 같이 크게 다섯 그룹으로 분류 된다 (S. Kralj et al., Microbiology, 150, 3681-3690, 2004): (1) α-(1-4)-glucosidic bonds에 의해 주로 합성되는 루테란(reuteran), (2) α-(1-6)-linked glucopyranosyl units을 주쇄로 갖는 덱스트란(dextran), (3) α-(1-3) linkages를 주로 갖는 뮤탄(mutan), (4) α-(1-6)- 과 α-(1-3)-linked glucopyranosyl units을 차례로(alternative) 갖는 알테란(alteran), (5) α-(1-2) linkages [α-(1-2, 6) branching points가 주됨]를 주로 갖는 글루칸 폴리머(glucan polymers).

상기의 유산균은 전통적으로 오랫동안 발효식품의 제조에 유용하게 이용되어 왔고, 유산균으로부터 생산되는 글루칸수크라제는 식품산업 뿐만 아니라 제약 산업에서도 중요하게 여겨지는 화합물을 합성하는 반면, 다양한 대사 잠재력(metabolic potential) 때문에 효소의 작용기전에 대한 이해는 아직 완전하지 않은 실정이다.

이에, 본 발명자들은 글루칸수크라제의 작용기전을 이해하고, 다양한 응용가능성을 제시하고자 예의 노력한 결과, 김치 유산균에서 분리된 류코노스톡 락티스EG001로부터 글루칸수크라제 유전자를 클로닝하여, 상기 유전자를 재조합 미생물에서 발현시킨 다음, 상기 발현된 글루칸수크라제의 활성을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 상기 류코노스톡 락티스 EG001 유래의 글루칸수크라제, 상기 글루칸수크라제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 이를 이용한 글루칸수크라제의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 류코노스톡 락티스 EG001 유래 글루칸수크라제(glucansucrase), 상기 글루칸수크라제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 미생물로부터 글루칸수크라제를 회수하는 것을 특징으로 하는 글루칸수크라제의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 글루칸수크라제는 수크로즈, 글루코즈 등의 풍부한 탄수화물 자원을 이용하여 다당을 합성함으로써 식품, 의약품 산업 등에 활용될 수 있다. 또한, 글루칸 폴리머(glucan polymers) 합성에 있어 아직 알려지지 않은 반응에 응용함으로써 다른 산업에도 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서는 유산균으로부터 글루칸수크라제를 코딩하는 염색체 DNA를 클로닝하고, 이의 염기서열 및 글루칸수크라제의 아미노산 서열을 확인하였으며, 또한 확인된 유전자의 염기서열을 바탕으로 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제조한 후, 이를 이용하여 식품, 의약품 산업에서 유용한 글루칸수크라제를 생산하고자 하였다.

즉, 본 발명에서는, 김치 유산균으로부터 페놀-황산법 (Phenol-sulfuric acid)을 이용하여 글루칸 함량이 높은 균주를 선별 (Meulenbeld and Hartmans Biotechnol. and Bioeng., 70(4), 2000)한 후, 선별된 균주로부터 염색체 DNA를 분리한 다음, 이를 주형으로 PCR을 수행하여 글루칸수크라제 관련 유전자를 증폭시키고, 유전자의 염기서열을 확인하였으며, 또한 증폭된 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제조한 후, 이를 대장균에 도입시키고, 글루칸수크라제 유전자의 발현을 유도함으로써, 글루칸수크라제를 대량으로 제조할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 글루칸수크라제 (glucansucrase), 상기 글루칸수크라제를 코딩하는 유전자, 상기 유 전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 글루칸수크라제 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되고, 류코노스톡 락티스 (Leuconostoc lactis) EG001 유래인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는, 유산균 유래의 신규 글루칸수크라제를 찾기 위하여, 김치유산균을 수집하였고, 상기 균주들 중에서 글루칸 함량이 높은 균주를 페놀-황산법 (Phenol-sulfuric acid)을 이용하여 선별하였다. 이렇게 선별한 균주의 16s rRNA 염기서열을 확인하였고, 선별된 균주를 Leuconostoc Lactis EG001로 명명하였다.

본 발명에서는 상기 균주로부터 글루칸수크라제 유전자를 확보하기 위해 디제네레이트 프라이머를 제작하여 상기 효소를 암호화하는 유전자의 일부 서열을 PCR 증폭한 후 그 서열을 결정하였다. 그리고, 상기 유전자의 전체서열을 알기 위해 일부 알아낸 염기서열로부터 inverse PCR primer를 제작하여 PCR을 수행하였다. 상기 Degenerate PCR과 inverse PCR을 수행한 결과, 예상되는 약 4.5kb의 염기서열 길이 중 약 2.4kb의 염기서열을 결정할 수 있었다. 나머지 염기서열을 결정하기 위해서 Leuconostoc Lactis EG001의 염색체 DNA를 무작의적으로 절단하여 fosmid vector에 cloning한 후 library를 제작하였다. 제작된 library를 EPI300-T1 E. coli strain(EPICENTRE)에 형질전환하였고, colony PCR을 수행하여 상기 유전자가 있을 것으로 판단되는 콜로니(colony)를 선별하였다. 그리고 선별된 콜로니로부터 DNA를 수득하여 염기서열을 결정하였다. 이로써 약 4.5kb로 예상되는 글루칸수크라 제 유전자 염기서열을 결정할 수 있었다. 그 결과, 글루칸수크라제는 TTG를 시작코돈으로 하고, TAA를 종결코돈으로 이루어지는 4503개의 염기로 구성되는 것을 알 수 있었다. 그리고, 상기 유전자로부터 암호화 되는 효소는 약 165kDa의 molecular weight size를 가지며 1500개의 아미노산 서열로 구성되는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 효소의 아미노산 서열을 NCBI BlastP 검색 결과, Leuconostoc mesenteroides (AAN38835)의 dextransucrase (DsrR), Leuconostoc mesenteroides (CAB76565)의 dextransucrase (DsrB), Leuconostoc citreum KM20 (YP_001727410)의 glucosyltransferase에 각각 75%, 70%, 70%의 상동성을 갖는 신규한 글루칸수크라제인 것으로 확인되었다.

본 발명자들은 상기 글루칸수크라제를 클로닝하기 위하여 상기 밝혀진 효소의 유전자 서열로부터 프라이머를 제작하였고, Leuconostoc lactis EG001의 염색체 DNA를 template로 하여 글루칸수크라제 유전자를 PCR 증폭하였다. 증폭된 상기 유전자는 pET22b(+) 발현 벡터의 NcoI과 NotI 사이에 클로닝하였다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터는 pET22b(+), pET 계열의 벡터, pHCE, pGEX계열, pTRP, pMAL 계열 등의 단백질 발현벡터를 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있 다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션 (ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et. al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법 (electroporation) [Neumann, et. al., EMBO J., 1:841, 1982] 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전 자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 미생물의 염색체 (chromosome)에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속 등을 예시할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 글루칸수크라제 생성능을 가지는 재조합 미생물은 상기 류코노스톡 락티스(Leuconostoc Lactis) EG001 유래 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 숙주 미생물의 염색체에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 류코노스톡 락티스 EG001 유래의 글루칸수크라제 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 대장균 균주 [BL21(DE3)/pET22b(+)]를 배양하고, 배양된 균주를 파쇄하여, 글루칸수크라제 조효소액을 제조한 후, 이를 정제함으로써, 글루칸수크라제를 대량으로 제조할 수 있음을 확인하였다.

즉, 류코노스톡 락티스 EG001 유래의 글루칸수크라제를 대량으로 생산하기 위하여, 글루칸수크라제 유전자를 함유하는 재조합 벡터(pET22b(+))를 대장균 BL21(DE3)에 도입하였다. 그 후 형질전환된 재조합 대장균 균주 [BL21(DE3)/pET22b(+)]를 LB 액체배지 (100㎍/㎖ 앰피실린 첨가)에 진탕배양하여 상기 효소의 과발현을 유도하였다. 과발현을 유도한 배양체는 초음파 파쇄기로 파쇄한 후 원심분리 하였고, 이후 Ni-NTA affinity chromatography를 이용하여 활성을 나타내는 효소액을 수득하였다. 정제된 효소는 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 미생물로부터 글루칸수크라제를 회수하는 것을 특징으로 하는 글루칸수크라제의 제조방법에 관한 것이다.

상기 방법에 의하여 제조된 류코노스톡 락티스 EG001 유래의 글루칸수크라제의 최적 pH는 4.5 내지 6, 바람직하게는 5이고, 최적 온도는 25~35℃, 바람직하게는 약 30℃인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 글루칸수크라제는 10~45℃ 범위에서도 잔존 활성을 나타낼 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 균주의 분리 및 선별

신규 글루칸수크라제를 찾기 위해서 김치유산균을 수집하였다. 김치유산균은 MRS 배지 (Proteose peptone No.3 10g/L, Beef Extract 10g/L, Yeast Extract 5g/L, Sucrose 20g/L, Polysorbate 80 1g/L, Ammonium citrate 2g/L, Sodium Acetate 5g/L, Magnesium Sulfate 0.1g/L, Manganese Sulfate 0.05g/L, Dipotassium phosphate 2g/L)에 접종하고 30℃에 배양하였다. 수집된 김치유산균에서 글루칸(glucan) 함량이 높은 균주를 분리하기 위하여 페놀-황산법(Phenol-sulfuric acid)을 실시하였다 (Meulenbeld and Hartmans Biotechnol. and Bioeng., 70(4), 2000).

김치 유산균을 배양한 후, 배양액 100㎕에 75% 에탄올 1㎖을 넣고 침전시켜 건조 후, 증류수 100㎕에 녹였다. 상기 준비된 100㎕의 시료와 5% 페놀 100㎕를 1.5㎖ 튜브에 넣고 30초 동안 배양하였다. 튜브를 얼음에 넣고, 125㎕의 황산을 넣은 후 30초 동안 혼합하였다. 그리고 80℃ water bath에서 30분 동안 반응시키고, 튜브를 상온에서 식힌 후, 스펙트로포토메터(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도 490nm에서 측정하였다. 이 때 기준물질(standard)로 glucose를 사용하였다.

실시예 2. Leuconostoc lactis EG001 균주 유래 글루칸수크라제 유전자 분리 및 재조합 벡터 제작

실시예 1에서 선별된 글루칸 함량이 높은 균주를 LB broth (100㎍/㎖ ampicillin)에 배양한 후, 염색체 DNA를 추출하였다. 샘플 균주의 염기서열을 알기 위해, 추출한 염색체 DNA를 template로 사용하고, 기존에 알려져 있는 Degenerate 프라이머(서열번호 3 및 4)를 사용하여 Degenerate PCR을 수행하였다(S. Kralj et al., Biocatalysis and Biotransformation, 21(4-5), 181-187, 2003).

[서열번호 3]: 5'-GAYAAYWSNAAYCCNRYNGTNC-3'

[서열번호 4]: 5'-ADRTCNCCRTARTANAVNYKNG-3'

PCR 증폭은 2U Taq polymerase(Solgent), 10배 polymerase buffer (MgCl₂ 포함) 2㎕, 10mM dNTP 1㎕, 각 프라이머 (200uM) 2㎕, 주형 DNA (염색체 DNA) 100ng을 함유하는 PCR 반응용액 (20㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기를 이용하여 수행하였다.

PCR 반응은 95℃에서 3분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 95℃에서 30초간 변성, 52℃에서 1분 풀림 (annealing), 72℃에서 1분 연장 (extension)을 30회 반복하였다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 확보된 증폭단편은 pGEM T-easy 플라스미드에 클로닝하여 염기서열을 결정하였고, NCBI를 통해 글루칸수크라제의 일부와 상동성을 갖는 것을 확인하였다.

신규한 글루칸수크라제 유전자의 전체 서열을 결정하기 위해 인버스 PCR (inverse PCR) 방법을 이용하였다. 상기 Degenerate PCR의 결과로 얻은 염기서열로부터 하기 서열번호 5 및 6의 프라이머를 제작하였다.

[서열번호 5]: 5'-CACGATAGTGAAGTGCAAACG-3'

[서열번호 6]: 5'-ATCGTTGGCAGTAATCGAGC-3'

PCR 증폭을 위해 염색체 DNA를 Hind III 제한효소로 처리한 후, 제한효소로 처리된 염색체 DNA 500ng을 셀프 라이게이션 (self-ligation)에 사용하였다.

PCR 증폭은 2U EF Taq polymerase(Solgent), 10배 polymerase buffer (MgCl₂ 포함) 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 각 프라이머 (20mM) 2.5㎕, 주형 DNA (염색체 DNA) 25ng을 함유하는 PCR 반응용액 (50㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기를 이용하여 수행하였다.

PCR 반응은 95℃에서 3분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 95℃에서 30초간 변성, 50℃에서 1분 어닐링 (annealing), 72℃에서 1분 연장 (extension)을 30회 반복하였다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 확보된 증폭단편은 pGEM T-easy 플라스미드에 클로닝하여 염기서열을 결정하였고, 글루칸수크라제의 일부 서열을 확인하였다. 확인한 서열은 degenerate PCR 수행으로 얻은 염기서열과 합쳤고, 나머지 염기서열을 알기 위해 서열번호 7 및 8의 프라이머를 제작 후 2^nd inverse PCR을 수행하였다.

[서열번호 7]: 5'-ATAGCTTAGCACCAACAACAGAAC-3'

[서열번호 8]: 5'-GTTTCGCTGGCCTTGTTCA-3'

PCR 증폭을 위해 염색체 DNA는 Nco I 제한효소를 처리한 후, 제한효소 처리된 염색체 DNA 500ng을 셀프 라이게이션 (self-ligation)에 사용하였다.

PCR 반응은 95℃에서 3분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 95℃에서 30초간 변성, 50℃에서 1분 어닐링 (annealing), 72℃에서 1분 연장 (extension)을 30회 반복하였다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 확보된 증폭단편은 pGEM T-easy 플라스미드에 클로닝하여 염기서열의 결정을 의뢰하였고, 글루칸수크라제의 일부 서열을 더욱 확인하였다. 확인된 서열을 1^st inverse PCR 결과에 합쳤다.

Degenerate PCR, 첫 번째 inverse PCR, 그리고 두 번째 inverse PCR을 수행하여 약 4.5kb의 글루칸수크라제 유전자의 서열 중 약 2.4kb의 유전자 서열을 확인하였다. 그러나 나머지 서열을 더 확보하기위해 Copycontrol Fosmid Library Production Kit을 이용하여 fosmid library를 제작하고 (fosmid library 제작은 Epicentre사의 manual에 따라 제작되었음), 제작된 library를 colony PCR 하여 insert가 제대로 삽입되어 있는 것을 확인 후 fosmid를 정제하였다. Colony PCR 수행전에 하기 서열번호 9 및 10의 프라이머를 제작하였다.

[서열번호 9]: 5'-ACTGTGGCTTTCAACACCCA-3'

[서열번호 10]: 5'-TGTGCGCGCATCTTGGGTA-3'

PCR 증폭을 위해 fosmid library를 D.W.에 희석해서 100ng을 사용하였다.

PCR 증폭은 2U LA Taq polymerase(TaKaRa), 10배 polymerase buffer (MgCl₂ 포함) 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 각 프라이머 (5uM) 5㎕, 주형 DNA (염색체 DNA) 25ng을 함유하는 PCR 반응용액 (50㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기를 이용하여 수행하였다.

PCR 반응은 94℃에서 1분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 94℃에서 30초간 변성, 68℃에서 15분 어닐링 (annealing)을 30회 반복하였다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. PCR 수행으로 fosmid library를 선택하여 Alkaline 방법으로 purification 한 뒤 염기서열을 확인하였다. 그 결과, 4.5kb의 전체 염기서열을 확인 할 수 있었다.

NCBI BlastP 검색 결과, 상기 효소는 Leuconostoc mesenteroides (AAN38835)의 dextransucrase (DsrR), Leuconostoc mesenteroides (CAB76565)의 dextransucrase (DsrB) 및 Leuconostoc citreum KM20 (YP_001727410)의 glucosyltransferase에 각각 75%, 70% 및 70%의 상동성을 갖는 신규한 글루칸수크라제인 것으로 확인되었다.

Leuconostoc lactis EG001 균주 유래의 글루칸수크라제를 대장균(DH5α)에서 대량 생산하기 위하여, 상기 분리된 글루칸수크라제 유전자를 발현 벡터인 pET-22b(+)의 NcoI-NotI 부위에 삽입하여 재조합 DNA를 제조하였다. 글루칸수크라제의 PCR 증폭을 위해 Leuconostoc lactis EG001 균주의 염색체 DNA를 분리하고, NcoI site을 삽입시킨 서열번호 11의 정방향 프라이머, NotI site를 삽입시킨 서열번호 12의 역방향 프라이머를 제작하였다.

[서열번호 11]: 5'-AT CCATGG ATAGTAACCAAAACACAACTGGTT-3'

[서열번호 12]: 5'-AT GCGGCCGC CATATTGACGAGATCACCGTTG-3'

PCR 증폭은 2U Taq polymerase(Solgent), 10배 polymerase buffer (MgCl₂ 포함) 5㎕, 10mM dNTP 1㎕, 각 프라이머 (2uM) 5㎕, 주형 DNA (염색체 DNA) 100ng을 함유하는 PCR 반응용액 (50㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기를 이용하여 수행하였다.

PCR 반응은 95℃에서 5분간 변성 (denaturaion)을 수행한 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링 (annealing), 72℃에서 2분 연장 (extension)을 30회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 상기 방법으로 획득한 PCR 생산물은 pGEM T-easy vector(Promega)에 cloning후 NcoI-NotI으로 처리하여 pET-22b(+) expression vector의 NcoI-NotI 부위에 subcloning하여 재조합 벡터를 제조하였다.

실시예3. 재조합 대장균 배양에 의한 글루칸수크라제의 발현 및 정제

글루칸수크라제의 과잉 생산을 위하여, 실시예 2에서 제조된 재조합 벡터를 대장균 [BL21(DE3)] (Novagen)에 도입하였고, 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피 실린 (ampicillin)이 첨가된 LB 액체배지에서 37℃에서 16시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후 600nm에서 흡광도 값이 0.5가 되었을 때 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 20℃에서 12시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하여 효소의 과잉 생산을 유도하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고, 0.85% NaCl로 두 번 세척하였다. 회수된 균체에 1mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride), protease inhibitor cocktail (Roche) 및 10mM imidazole이 첨가된 100mM Tris-Cl (pH7.4)을 가하여 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상기 상등액은 Ni-NTA agarose를 이용한 크로마토그래피로 정제하였다.

효소의 정제여부는 250mM imidazole, 300mM NaCl, 20mM Tris-Cl (pH 8.0)을 포함하는 용출액으로 효소활성 분획을 취하여 SDS-PAGE를 수행한 후, CBB (Coomasie Brilliant Blue) 염색하여 확인하였다(도 1).

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 165kDa 크기의 정제된 글루칸수크라제(레인 4)를 확인할 수 있었다.

정제된 효소는 Amicon Ultra-15 (Millipore, 50K NMWL device)로 농축한 후, 20% 글리세롤(glycerol)을 포함한 100mM Tris-Cl (pH 7.4) 용액에 넣어 4℃에서 12시간 동안 투석 (dialysis)을 수행하였다.

정제된 글루칸수크라제의 표준 효소반응을 확인하기 위하여, 100mM sucrose, 50mM Sodium acetate (pH 5.2), 1mM CaCl₂, 적당히 희석된 정제된 효소를 최종 volume이 100㎕가 되도록 반응시켰다. 그 후 100℃에서 5분동안 열을 가하고, 반응 을 종료하였다. 종료한 반응액에 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) solution 100㎕를 넣은 후, 100℃에서 5분동안 열을 가하였다. 그리고, 얼음에서 5분동안 냉각하였고, D.W를 1㎖ 넣고, wavelength 575nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 유닛(U)은 sucrose가 분해되어 분당 생산되는 fructose의 μmole 수를 의미한다. 표 1은 Leuconostoc lactis EG001 균주 유래의 글루칸수크라제 정제단계의 활성 및 회수율을 나타낸 결과이다.

[표 1]

	Total vol. (ml)	Total protein (mg)	Total activity (U)	Specific activity (U/mg)	Yield (%)	Purification (Fold)
Culture supernatant	4	12	6.8x10³	569.4	100	1
Ni-NTA affinity chromatography	1.3	3.25	4.2x10³	1291.2	61	2.3

실시예 4. 정제된 글루칸수크라제의 생화학적 특성

실시예 3의 Leuconostoc lactis EG001 균주로부터 정제된 글루칸수크라제의 최적 반응 조건을 알아보기 위해 DNS method에 의해 반응온도, pH의 영향을 조사하였다 (Gail Lorenz Miller, Analytical Chemistry, 31(3), 426-428). 효소반응은 실시예 3과 동일하게 수행하였으며, 최적 반응온도를 알아보기 위해 정제된 효소를 사용하여 10~50℃ 범위에서 5℃ 간격으로 상대적인 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 효소의 최적 반응온도는 30℃이며, 25℃~35℃에서 상대적으로 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 정제된 효소의 최적 pH를 결정하기 위해 표준 효소반응에서 각기 다른 완충용액을 사용하였다. 최적 pH 결정에 사용된 완충용액은 50mM sodium acetate buffer (pH 3-6), 50mM sodium phosphate buffer (pH 6-8), 그리고 50mM Tris-Cl buffer (pH 8-9)를 사용하였다. 각 pH buffer에서 상대적인 활성을 조사한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, pH 5에서 최대 활성을 나타내었으며, 산성 pH에서 비교적 안정하다는 것을 확인하였다.

또한 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 10~45℃ 범위에서 잔존 활성을 측정하였다. 각 지정된 온도에서 3시간 방치 후에 잔존 활성을 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 30℃ 이하에서 잔존 활성이 높게 남아있는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 미생물로부터 회수한 글루칸수크라제를 SDS-PAGE 후, CBB (Coomasie Brilliant Blue) 염색을 한 결과를 나타낸 사진이다(M: 분자량 마커이고, 레인 1: 과발현을 유도하지않은 whole cell, 레인 2: 과발현을 유도한 whole cell, 레인 3: 세포 추출액, 레인 4: Ni-NTA affinity chomatography로 정제한 효소).

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 미생물로부터 회수한 글루칸수크라제의 최적 온도를 확인한 그래프이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 미생물로부터 회수한 글루칸수크라제의 최적 pH를 확인한 그래프이다 (열린 사각형 : pH 3~6, 닫힌 사각형 : pH 6~8, 열린 삼각형 : pH 8~9).

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 미생물로부터 회수한 글루칸수크라제의 열에 대한 잔존활성(열안정성)을 확인한 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Glucansucrase Derived from Leuconostoc lactis and Method for Preparing the Same <130> P09-B043 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequnece of glucansucrase <400> 1 Leu Glu Asn Ala Thr Gln Val Arg Lys Lys Leu Tyr Lys Ala Gly Lys 1 5 10 15 Asn Trp Val Val Gly Gly Val Ile Thr Ala Gly Ala Ala Leu Ala Phe 20 25 30 Val Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala Asp Ser Asn Gln Asn Thr Thr 35 40 45 Gly Ser Gln Val Thr Val Thr Ala Pro Glu Ala Ala Ala Ser Ala Thr 50 55 60 Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Pro Thr Thr Ala Ala Ala Thr Thr Thr 65 70 75 80 Ala Ala Gln Ala Asp Thr Ser Ser Ala Thr Thr Pro Gln Pro Pro Val 85 90 95 Ala Pro Thr Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln Ala Gln Pro Ala Thr Thr 100 105 110 Ala Ala Thr Thr Glu Gln Pro Gln Gln Pro Ala Ala Asp Thr Thr Pro 115 120 125 Ala Pro Gln Thr Gly Tyr Val Glu Lys Ala Gly Ala Trp Tyr Tyr Val 130 135 140 Asn Ala Asp Gln Ser Tyr Ala Lys Gly Leu Thr Thr Ile Ala Gly His 145 150 155 160 Leu Gln Tyr Phe Asp Thr Thr Gly Arg Gln Thr Lys Gly Ala Tyr Val 165 170 175 Thr Glu Asn Gly Lys Thr Tyr Tyr Phe Asp Ala Asn Thr Gly Asn Ala 180 185 190 Leu Thr Gly Leu Gln His Val Ala Gly Gln Thr Val Ala Phe Asn Thr 195 200 205 Gln Gly Glu Gln Ile Phe Ser Asp Phe Tyr Thr Ala Ala Asp Gly Gln 210 215 220 Thr Tyr Tyr Phe Gly Thr Asn Gly Gln Ala Ala Val Gly Val Thr Ser 225 230 235 240 Ile Ala Gly His Asn Tyr Tyr Phe Asp Ala Ala Gly Gln Leu Lys Lys 245 250 255 Gly Tyr Ala Gly Glu Ile Asp Gly Gln Met Arg Thr Phe Asp Ala Thr 260 265 270 Thr Gly Gln Glu Val Ser Ala Thr Thr Ser Gln Ile Thr Glu Gly Leu 275 280 285 Thr Ala Gln Asn Asp Asp Tyr Thr Ala His Asn Ala Val His Ser Thr 290 295 300 Ala Ser Ala Asp Phe Asp Asn Leu Asp Gly Tyr Leu Thr Ala Ser Ser 305 310 315 320 Trp Tyr Arg Pro Thr Asp Ile Leu Arg Asp Gly Asn Lys Trp Glu Ala 325 330 335 Ser Thr Ala Thr Asp Met Arg Pro Ile Leu Ser Val Trp Trp Pro Asp 340 345 350 Lys Gln Thr Gln Val Asp Tyr Leu Asn Tyr Met Ser Gln Leu Gly Leu 355 360 365 Val Glu Asn Pro Thr Pro Tyr Thr Leu Gln Asp Asp Gln Val Ala Leu 370 375 380 Asn Lys Ala Ser Glu Thr Leu Gln Gln Ala Ile Glu Thr Lys Ile Gly 385 390 395 400 Leu Thr Asn Ser Thr Asp Trp Leu Lys Thr Ala Met Ala Asn Phe Ile 405 410 415 Thr Thr Gln Pro Gln Trp Asn Gln Thr Ser Glu Asp Pro Asn Ser Asp 420 425 430 His Leu Gln Lys Gly Ala Leu Thr Phe Val Asn Ser Pro Leu Thr Pro 435 440 445 Asp Thr Asn Ser Ala Phe Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro Ala Asn Gln 450 455 460 Thr Asn Thr Gln Asn Tyr Thr Val Asp Asn Ser Lys Gly Gly Tyr Glu 465 470 475 480 Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala 485 490 495 Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Tyr Leu Met Asn Phe Gly Ser Ile Thr 500 505 510 Ala Asn Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val 515 520 525 Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala Ala Asp Tyr Phe Lys 530 535 540 Ala Ala Tyr Gly Val Asp Lys Asn Asp Ala Thr Ala Asn Gln His Leu 545 550 555 560 Ser Ile Leu Glu Asp Trp Ser His Asn Asp Pro Leu Tyr Val Asn Asp 565 570 575 Phe Gly Asp Asn Gln Leu Thr Met Asp Asp Tyr Ala His Thr Gln Leu 580 585 590 Ile Trp Ser Leu Thr Lys Asn Ser Asp Ile Arg Gly Thr Met Gln Arg 595 600 605 Phe Met Asp Tyr Tyr Leu Val Asn Arg Ser Gln Asp Ser Thr Glu Asn 610 615 620 Thr Ala Thr Pro Asn Tyr Ser Phe Val Arg Ala His Asp Ser Glu Val 625 630 635 640 Gln Thr Val Ile Ala Gln Ile Val Ser Asp Leu His Pro Asp Val Glu 645 650 655 Asn Ser Leu Ala Pro Thr Thr Glu Gln Leu Leu Glu Ala Phe Lys Val 660 665 670 Tyr Asn Ala Asp Gln Lys Leu Ala Asp Lys Lys Tyr Thr Gln Tyr Asn 675 680 685 Met Pro Ser Ala Tyr Ala Met Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro 690 695 700 Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ala 705 710 715 720 Thr Lys Ser Pro Tyr Phe Asn Ala Ile Asp Thr Leu Leu Lys Ala Arg 725 730 735 Ile Gln Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ala Met Ala Val Asp Asn His Asp 740 745 750 Ile Leu Thr Ser Val Arg Tyr Gly Asn Gly Ala Met Thr Ala Thr Asp 755 760 765 Lys Gly Asp Ala Asp Thr Arg Thr Gln Gly Ile Gly Val Ile Ile Ser 770 775 780 Asn Asn Lys Asp Leu Ala Leu Gln Ala Gly Glu Thr Val Thr Leu His 785 790 795 800 Met Gly Ala Ala His Lys Lys Gln Ala Phe Arg Leu Leu Leu Gly Thr 805 810 815 Thr Gln Asp Gly Leu Asp Tyr Tyr Asn Thr Asp Asp Ala Pro Ile Arg 820 825 830 Tyr Thr Asp Asn Asn Gly Asp Leu Ile Phe Asn Ser Gln Asp Val Tyr 835 840 845 Gly Val Gln Asn Pro Gln Val Ser Gly Phe Leu Ala Val Trp Val Pro 850 855 860 Val Gly Ala Ser Ala Thr Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ser Asp Thr Thr 865 870 875 880 Ser His Thr Asp Gly Lys Thr Phe His Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser 885 890 895 Gln Val Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe Ala Thr Thr 900 905 910 Pro Asp Glu Tyr Thr Asn Ala Val Ile Ala Lys Asn Gly Ser Leu Phe 915 920 925 Lys Asp Trp Gly Val Thr Ser Phe Gln Leu Ala Pro Gln Tyr Arg Ser 930 935 940 Ser Thr Asp Thr Ser Phe Leu Asp Ser Ile Ile Gln Asn Gly Tyr Ala 945 950 955 960 Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Phe Gly Thr Pro Thr Lys Tyr Gly 965 970 975 Thr Val Asp Gln Leu Arg Asp Ala Ile Lys Ala Leu His Ala Ser Gly 980 985 990 Ile Gln Ala Ile Ala Asp Trp Val Pro Asp Gln Ile Tyr Asn Leu Pro 995 1000 1005 Gly Gln Glu Leu Ala Thr Val Thr Arg Thr Asn Ser Tyr Gly Asp Lys 1010 1015 1020 Asp Pro Asn Ser Asp Ile Glu Asn Ser Leu Tyr Val Ile Gln Ser Arg 1025 1030 1035 1040 Gly Gly Gly Gln Tyr Gln Ala Gln Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Ser Asp 1045 1050 1055 Leu Gln Ala Met Tyr Pro Ser Leu Phe Glu Thr Lys Gln Ile Ser Thr 1060 1065 1070 Asn Leu Pro Met Asp Pro Ser Thr Arg Ile Thr Glu Trp Ser Gly Lys 1075 1080 1085 Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Gln Gly Lys Gly Ala Gly Tyr Val Leu 1090 1095 1100 Lys Asp Ala Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr His Val Val Ser Asn Asn Asn 1105 1110 1115 1120 Asp Ala Thr Tyr Leu Pro Lys Gln Leu Thr Asn Asp Leu Ser Glu Thr 1125 1130 1135 Gly Phe Thr His Asp Asn Gln Gly Ile Ile Tyr Tyr Thr Leu Ser Gly 1140 1145 1150 Thr Arg Ala Gln Asn Ser Phe Val Gln Asp Asn Ser Gly Asn Tyr Tyr 1155 1160 1165 Tyr Phe Asp Asn Thr Gly His Leu Val Thr Gly Ala Gln Thr Ile Asn 1170 1175 1180 Thr His His Tyr Phe Phe Leu Pro Asn Gly Ile Glu Leu Met Gln Ala 1185 1190 1195 1200 Phe Phe Gln Asn Ala Asp Gly Ser Thr Ile Tyr Phe Asp Lys Arg Gly 1205 1210 1215 Gln Gln Val Tyr Asn Gln Tyr Ile Val Asp Gln Thr Gly Ala Ala Tyr 1220 1225 1230 Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Arg Met Ala Ile Asn Gly Phe Thr Asp Val 1235 1240 1245 Asp Gly His Arg Gln Tyr Phe Asp Gln Ser Gly His Gln Leu Lys Asp 1250 1255 1260 Gln Phe Met Thr Asp Thr Asn Gly His Val Tyr Tyr Phe Glu Ala Gly 1265 1270 1275 1280 Asn Gly Asn Met Ala Thr Tyr Arg Tyr Ala Gln Asn Ala Gln Gly Gln 1285 1290 1295 Trp Phe Tyr Leu Gly Gly Asp Gly Ile Ala Val Thr Gly Leu Gln Asn 1300 1305 1310 Ile Asn Gly Ala Asn Gln Tyr Phe Tyr Thr Asp Gly His Gln Ser Lys 1315 1320 1325 Gly Glu Phe Val Val Leu Thr Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Asp Ala Thr 1330 1335 1340 Thr Gly Asn Leu Val Val Gly Val Gln Gln Leu Asp Gly Lys Thr Tyr 1345 1350 1355 1360 Val Phe Thr Thr Ala Gly Ala Met Leu Thr Asn Gln Tyr Tyr Glu Leu 1365 1370 1375 Ala Ala Asp Gln Trp Leu His Leu Ser Ala Gln Gly Gln Ala Asp Thr 1380 1385 1390 Gly Leu Thr Thr Ile Gly Asp Gln Leu Gln Tyr Phe Gly Thr Asp Gly 1395 1400 1405 Val Gln Val Lys Gly Ala Phe Val Thr Asp Pro Ala Thr Gln Ala Thr 1410 1415 1420 Tyr Tyr Phe Asn Ala Thr Thr Gly Asp Ala Val Ala Asn Gln Tyr Phe 1425 1430 1435 1440 His Ile Lys Gly Asp Trp Tyr Leu Thr Asp Asp Asn Ala Arg Leu Val 1445 1450 1455 Lys Gly Phe Lys Val Val Asn Asn Lys Val Gln His Phe Asp Glu Thr 1460 1465 1470 Thr Gly Val Gln Thr Lys Ser Thr His Leu Thr Lys Ala Gln Lys Gln 1475 1480 1485 Tyr Ile Phe Asp His Asn Gly Asp Leu Val Asn Met 1490 1495 1500 <210> 2 <211> 4503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequcence of glucansucrase <400> 2 ttggaaaacg caacacaagt tagaaaaaaa ctttataaag ccggtaaaaa ctgggtcgtc 60 ggtggtgtca ttacagccgg tgctgcccta gcctttgtcg cgggagcaac gactgctgca 120 gctgatagta accaaaacac aactggttca caggtaacag tgacagcgcc agaagccgca 180 gcgtcagcga cgactacaac gacaacgaca acgccgacca ctgctgcagc aacaacgaca 240 gccgctcagg cagataccag tagtgcaacg acaccacaac cccctgtcgc gcccactaca 300 cctgtagcac caacacaggc acaacctgcc acaaccgcag caacgactga gcaaccgcaa 360 caaccagcag ctgacactac ccctgcccca caaactggct acgtggaaaa agctggggct 420 tggtactatg ttaatgctga tcaatcctat gcaaaaggct taacgaccat tgcgggtcac 480 ttacaatatt ttgataccac tggccgccaa acaaagggcg cctacgtcac agaaaacggc 540 aagacttact attttgacgc taacacgggt aacgccttga ctggcttgca acacgttgcc 600 ggtcaaactg tggctttcaa cacccaaggt gaacaaattt tcagcgactt ttacacggcc 660 gctgacggcc aaacttatta ttttggtacc aacggtcaag ctgcagtcgg tgtcacgagt 720 atcgctggtc acaattatta tttcgacgct gcgggtcaac tgaagaaagg ctatgctggc 780 gaaattgacg gccaaatgcg gacatttgat gccacaactg gtcaagaagt gtcagccacc 840 acgtcacaaa tcacggaagg tttgactgcc caaaatgacg actacacggc ccacaacgcc 900 gtgcatagca ctgccagtgc agactttgat aaccttgatg gttatttgac agcatcatct 960 tggtatcgtc caaccgacat tttgcgcgat ggtaacaagt gggaagcttc aacagccacg 1020 gacatgcgcc caattttgtc ggtttggtgg cctgataagc aaacccaggt cgactacttg 1080 aactacatgt cacaacttgg ccttgtcgaa 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Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 글루칸수크라제(glucansucrase).
제1항에 있어서, 상기 글루칸수크라제의 최적 pH는 4.5~6이고, 최적온도는 25℃~35℃인 것을 특징으로 하는 글루칸수크라제.
제1항의 글루칸수크라제(glucansucrase)를 코딩하는 유전자.
제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 유전자는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc Lactis) EG001 유래인 것을 특징으로 하는 유전자.
제3항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제3항의 유전자가 숙주 미생물의 염색체에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 글루칸수크라제 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제6항의 재조합 벡터가 숙주 미생물의 염색체에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 글루칸수크라제 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글루칸수크라제 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 대장균 (E · coli)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 E · coli BL21(DE3)/pET22b(+)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제7항 또는 제8항의 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 미생물로부터 글루칸수크라제(glucansucrase)를 회수하는 것을 특징으로 하는 글루칸수크라제의 제조방법.