JP3709435B2 - 改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体、グルカンの製造法 - Google Patents
改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体、グルカンの製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体およびグルカンの製造法に関し、詳しくはロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼの活性中心領域の一部を、同菌の異種のデキストランスクラーゼの活性中心領域と交換してなる改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体およびグルカンの製造法に関する。
本発明の改変デキストランスクラーゼを用いて製造されるグルカンは、α−１，３結合、α−１，４結合およびα−１，６結合の割合が、本来のものとは異なるという特性を有している。
【０００２】
【従来の技術】
グルカンは、デンプンやセルロース等のＤ−グルコースを構成単位とする多糖（デキストラン等）の総称であり、微生物や植物の細胞壁の主要構成成分として知られているものもある。
様々な構造を有するグルカンを生産するために、これまでは異なった構造のグルカンを生産する菌をスクリーニングし、それらの菌株を培養してグルカンの発酵生産を行う方法が採用されている。
また、ロイコノストック（Leuconostoc)属菌のデキストラン生産性向上を目的としてニトロソグアニン等を用いた変異処理も試みられている。さらには、ロイコノストック属菌やストレプトコッカス（Streptococcus)属菌によって産生されるデキストランスクラーゼ［EC 2.4.1.5］（以下、ＤＳと略記することがある。）あるいはグルコシルトランスフェラーゼ［EC 2.4.1.125］（以下、ＧＴＦと略記することがある。）をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、該酵素を生産させ、この酵素を用いてデキストランを生産することは研究室レベルで行われている。
【０００３】
ＤＳは、前記の微生物等により生産される分子量１６万前後の酵素で、基質であるスクロースを分解する反応を触媒し、フルクトースを遊離すると同時にグルコース部分を多糖またはオリゴ糖に転移して、α−１→６結合を主体とする高分子の水溶性α−Ｄ−グルカンであるデキストランを合成する酵素である。
また、ロイコノストック属菌由来のグルカン合成酵素には、水溶性のグルカンを合成する酵素の他に、α−１→３結合を主体とする非水溶性のグルカンを合成する酵素が存在し、いずれもＧＴＦと呼ばれている。複数のＧＴＦの作用で、固着性の強いムタンと呼ばれるグルカンを形成する。
本来のデキストランとは異なる構造を有するデキストランを得るには、これまでは目的の構造を有するデキストランを生産する菌株を、スクリーニングにより探し出すこと以外には有効な方法がなく、膨大な時間と労力を必要としていた。
【０００４】
ＤＳやＧＴＦによって生産されるグルカンの構造を変化させるために、これらの酵素をコードする遺伝子に、３’−末端のグルカン結合領域のデレーション処理を行い、該結合領域を異なる酵素同士で交換する、部位特異的変異法を用いて特定のアミノ酸残基を別のアミノ酸に置き換える等の処理を行い、変異酵素を作製することが行われている。
ここで、グルカン結合領域とは、カルボキシ末端の繰り返し構造を持った領域を言い、これをデレーション処理することによって、カルボキシ末端が短くなった酵素が生産されるのである。
【０００５】
しかし、上記した３’−末端のグルカン結合領域のデレーション処理や異なる酵素間での同領域の交換等の従来の方法では、生産するグルカンの構造をほとんど変えることはできなかった。これは、グルカン結合領域の役割が、単純にグルカンと結合するのみで、酵素反応自体には関与していないことが明らかとなったことからも裏付けられている。
また、部位特異的変異法では、生産するグルカンの構造をある程度変えることが可能であるが、構造を大きく変化させることは未だ成功していない。そのため、酵素の転移反応様式を決める部位が特定されておらず、生産物の構造制御を行うことは困難である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＳやＧＴＦにおいて、従来注目されていなかった重要な酵素の活性中心部位を探索し、これらの部位を異なる酵素同士で交換して改変酵素を得ることにより、生産されるグルカンの構造を大きく変えることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのスクロース・デキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのスクロース・デキストラン結合リシン部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼである。
請求項２記載の本発明は、ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのムタン結合部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのムタン結合部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼである。
請求項３記載の本発明は、ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのデキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのデキストラン結合リシン部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼである。
請求項４記載の本発明は、請求項１〜３のいずれかの改変デキストランスクラーゼをコードする遺伝子を挿入したベクターである。
請求項５記載の本発明は、請求項４のベクターで形質転換された遺伝子組み換え体である。
請求項６記載の本発明は、請求項１〜３のいずれかの改変デキストランスクラーゼを基質に作用させることを特徴とするグルカンの製造法である。
請求項７記載の本発明は、請求項５載の遺伝子組み換え体が生産する改変デキストランスクラーゼを基質に作用させることを特徴とするグルカンの製造法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の改変ＤＳは、ロイコノストック・メセンテロイデスのＤＳのムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位またはデキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のＤＳのムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位およびデキストラン結合リシン部位のうち対応する部位と交換してなるものである。すなわち、ＤＳのＮ末端側に存在するデキストランおよび／またはスクロースの結合に関与するリシンを含む部位、硫酸アンモニウム存在下でムタンに結合する部位およびその近傍を含む部位を、遺伝子組み換え技術により２種類のＤＳ酵素分子間で交換したキメラ酵素である。
【０００９】
本発明の改変ＤＳを得るには、まず改変していないＤＳをコードする遺伝子を取得する必要がある。具体的には、公知のロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）株、たとえばＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）、ＮＲＲＬ Ｂ−１２９９株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ３８１８１，ＡＦ０３０１２９）、ＮＲＲＬ Ｂ−１３５５株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＪ２５０１７２）、ＮＲＲＬ Ｂ−７４２ＣＢ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＦ２９４４６９）等およびＤＳ様遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）に塩基補完をして活性型ＤＳをコードするよう改変した遺伝子（K. Funane et al., Bioschi. Biotechnol, Biochem., 64(2000)29-38）を用いることができる。ここで、ＤＳ様遺伝子とは、ＤＳをコードする領域中に塩基の欠損が存在するためにフレームシフトが生じ、この欠損部分の直後（欠損個所から４塩基下流）に終止コドンが現れるため、通常のＤＳよりも分子量が３分の２程度と小さく、グルカン結合領域のすべてを欠損したタンパクをコードする遺伝子のことである。
【００１０】
ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の場合、まず改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを、舟根らの方法（K. Funane et al., Bioschi. Biotechnol, Biochem., 64(2000)29-38）に従って作製する。すなわち、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株を２％グルコースを含む培地（組成：２％グルコース，１．５％リン酸水素二カリウム，０．５％酵母エキス，０．２５％ペプトン，０．００５％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ，０．００１％ＮａＣｌを塩酸でｐＨ７．４に調整したもの）等で嫌気的に２５〜３０℃、好ましくは３０℃で、１２〜２４時間、好ましくは一晩培養する。
【００１１】
培養した該菌株からのゲノムＤＮＡの精製は、Wilsonらの方法（Wilson et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”(1987)2.4.1-2.4.2, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）に従って行う。すなわち、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株を２％グルコースを含む培地（組成：２％グルコース，１．５％リン酸水素二カリウム，０．５％酵母エキス，０．２５％ペプトン，０．００５％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ，０．００１％ＮａＣｌを塩酸でｐＨ７．４に調整したもの）５ｍｌに植菌し、嫌気的に３０℃で一晩培養する。
培養終了後、遠心分離により集菌し、これを１２ｍｇリゾチーム，１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ溶液５６７μｌを加え、３７℃で３時間インキュベートし、菌体を溶解（溶菌）する。さらに、１０％ＳＤＳを３０μｌと２０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫを３μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートする。
続いて、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ（１０％セチルトリメチルアンモニウムクロリド，０．７Ｍ ＮａＣｌ）８０μｌを加え、６５℃で１０分間インキュベート後、常法に従いフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、目的とするゲノムＤＮＡを回収する。
【００１２】
ＤＳをコードする遺伝子は、該遺伝子を有する菌株から上記の方法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼチェーンリアクション（以下、ＰＣＲと略記することがある。）法を行うことによっても取得することができる。ＰＣＲを行う際のプライマーは、たとえばロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）の場合、ＤＳ遺伝子の上流と下流について明らかになっている塩基配列を基に設計した３０ベース（塩基）前後の長さの１対を用いる。具体的には、配列表の配列番号１および２記載の１対のプライマーを用いる。また、プライマーとしては、適当な制限酵素認識部位、たとえば５’−末端側にＮｃｏＩ認識部位、３’−末端側にＸｈｏＩ認識部位を導入するように設計されたプライマー（配列表の配列番号３および４）を用いることもできる。
このとき行うＰＣＲについては、長鎖ＤＮＡの増幅に適したＤＮＡポリメラーゼ、たとえばTakara LATaq（タカラ酒造社製）等を用いて、常法に従って行うことができる。たとえば、ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングは５０℃で１分間、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で５分間のサイクルを３０回行う。
【００１３】
また、ＤＳをコードする遺伝子は、上記の方法の他に、ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断してから、ファージベクター等に挿入したゲノムＤＮＡライブラリーより得ることもできる。具体的には、たとえば制限酵素ＥｃｏＲＩでゲノムＤＮＡを完全に切断し、ＥｃｏＲＩ認識部位を有するファージであるλｇｔ１０（Stratagene社製）等にライゲーションした後、Gigapack II gold packaging extract （Stratagene社製）等と共にパッケージングする。
上記によって得られたゲノムＤＮＡ断片を組み込んだバクテリオファージが、ゲノムＤＮＡライブラリーである。これを、常法によってコンピテントセルとした大腸菌ＮＭ５１４株等にインフェクションし、形質転換した大腸菌を得る。
【００１４】
たとえば、大腸菌ＮＭ５１４株の場合、０．２％マルトース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むＴＢ培地（０．５％ＮａＣｌ，１％トリプトンをＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）に植菌し、３７℃で４〜６時間培養する。
培養後、該大腸菌をＮＺＹ固体培地（組成：０．５％ＮａＣｌ，０．２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．５％酵母エキス，１％ＮＺアミンをＮａＯＨでｐＨ７．５に調整したもの）に植菌し、３７℃で一晩培養する。培養後のプレートからコロニーを１つ取り、これを上記の０．２％マルトース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むＴＢ培地に接種して、３７℃で４〜６時間程度培養する。
【００１５】
培養後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）により沈殿した該大腸菌を集菌し、これをＯＤ600が０．５となるように１０ｍＭ ＭｇＳＯ4に懸濁し、これをコンピテントセルとする。この大腸菌懸濁液６００μｌに、上記で調製したロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片を含むλｇｔ１０等のバクテリオファージ１〜５μｌを加え、３７℃で１５分間保温する。
続いて、ＮＺＹ固体培地に２％アガーロースを添加したトップアガー４ｍｌを溶解した後に４８℃以下に冷却したものを加えて混合し、固まらないうちにＮＺＹ固体培地のプレートに重層する。トップアガーが固まった後、３０〜３７℃、好ましくは３７℃で、６〜１２時間、好ましくは８時間培養する。これにより得られたプラークは、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片を組み込んだλｇｔ１０等のバクテリオファージによるものであり、このプラークをナイロン膜等にトランスファーさせ、これをスクリーニングする。
【００１６】
スクリーニングは、次の手順で行う。まず、先に抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、一般的にＤＳ遺伝子を検出するために相同性のあるアミノ酸配列から設計したプライマー（配列表の配列番号５）およびロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）配列から設計したプライマー（配列表の配列番号６）を用いて、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法で増幅する。なお、配列番号５記載のプライマーについては、７番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に置換したものについても同様に用いることができる。ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９２〜９６℃、好ましくは９４℃で、３０秒〜１分間、好ましくは１分間、プライマーとのアニーリングは５０〜６０℃、好ましくは５０℃で、１〜２分間、好ましくは１分間、ポリメラーゼ伸長反応７０〜７６℃、好ましくは７２℃で、１〜２分間、好ましくは１分３０秒間のサイクルを２５〜３０回、好ましくは２５回行う。
こうして得たＰＣＲ増幅産物を、Dig DNA labeling and detection kit(Boehringer Mannheim社製）等を用いてジゴキシゲニンでラベルし、これをＤＮＡプローブとする。このＤＮＡプローブと同キット等を用いて、ナイロン膜等にトランスファーさせたプラークをスクリーニングすることにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）を含むクローンを得ることができる。
【００１７】
上記の方法で得られるロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）のクローンは、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、４０６７番目のアデニン（ａ）のところにＥｃｏＲＩ認識部位があるため、これより上流のＤＮＡ断片、すなわち４０６７番目のアデニン（ａ）以降が欠損している１〜４０６６番目までのＤＳ遺伝子の断片しか得られない。
このため、再びゲノムＤＮＡを鋳型として、４０６７番目より上流に位置する配列を基に設計したプライマー（配列表の配列番号８）と終止コドン（ｔａａ）の下流にＸｈｏＩ認識部位を導入するように設計されたプライマー（配列表の配列番号９）を用いてＰＣＲ法により増幅することにより、４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片を得た後、２つのＤＮＡ断片をつなげ、完全長のクローンとする必要がある。
【００１８】
すなわち、上記によって作製したＸｈｏＩ認識部位を導入した４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片については、制限酵素であるＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断してＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とした後、１〜４０６６番目までのＥｃｏＲＩ断片において塩基が欠損している３’−末端部分とつなげることによって、塩基の欠損を補う。
上記によって得られた１〜４０６６番目までのＥｃｏＲＩ断片と４０６７番目以降のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片で３’−末端部分を補ったものを、pBluescript SK+（Stratagene社製）等に制限酵素処理およびライゲーション処理を行うことにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）を含むクローンを得ることができる。
なお、ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９２〜９６℃、好ましくは９４℃で、３０秒〜１分間、好ましくは１分間、プライマーとのアニーリングは５０〜６０℃、好ましくは５０℃で、１〜２分間、好ましくは１分間、ポリメラーゼ伸長反応７０〜７６℃、好ましくは７２℃で、１〜２分間、好ましくは１分３０秒間のサイクルを２５〜３０回、好ましくは２５回行う。
【００１９】
得られたＤＳ遺伝子をプラスミド等のベクター（たとえばｐＥＴ２３ｄ（Novagen社製））に挿入した組み換えベクターを作製し、該組み換えベクターを大腸菌等の宿主に取り込ませて形質転換することにより、ＤＳ遺伝子を保持した遺伝子組み換え体が得られる。
組み換えプラスミドの調製は、得られたＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断した後、同じ制限酵素で切断したｐＥＴ２３ｄベクター（Novagen社製）等のベクターにライゲーションすることにより、完全なＤＳをコードするＤＮＡフラグメントを含む組み換えベクターを作製することができる。
【００２０】
また、鋳型とするＤＮＡによっては、塩基を補完する必要がある。たとえば、ＤＤＢＪにおいてアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０として登録されている塩基配列については、翻訳領域中に５塩基（ｃａｇａｔ）の欠損があり、フレームシフトが生じるため、通常の位置とは異なる位置に現れる終止コドンによって通常のＤＳの３分の２程度の長さしかコードされていない。このため、Ｃ末端の繰り返し配列であるグルカン結合領域すべてが、欠損したものとなる。
このような場合、欠損している塩基を補完する変異を導入することによって、フレームシフトが生じず、通常の長さの繰り返し構造を有するＤＳが得られる。このため、塩基の欠損がある場合には、欠損している塩基を補完する変異を導入することが好ましい。
【００２１】
上記の塩基を補完する変異を導入する場合には、塩基を補完した後に、組み換えベクターにライゲーションする。
塩基を補完した組み換えベクターの作製は、まず上記した方法により、塩基を補完していないＤＮＡフラグメントを含む組み換えベクターを作製する。次に、該組み換えベクターを鋳型として、配列表の配列番号１０記載のプライマーとＭｕｔａｎｔ−ｓｕｐｅｒ ｋｍキット（タカラ酒造社製）等のキットを用い、欠損している塩基を補完する変異を入れたＤＮＡ断片を作製し、該変異部分を含む部位を適当な制限酵素で切断し、これと塩基を補完していないＤＮＡフラグメントを含む組み換えベクターの相当する部分と交換することによって行う。
【００２２】
本発明において、交換導入するＤＳの活性中心領域としては、次の３種類が存在する。すなわち、ムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位およびデキストラン結合リシン部位である。
ＤＳのＮ末端活性中心領域中におけるスクロースおよびデキストランと結合するリシン残基を含むと考えられる部位は、酵素の種類によって多少異なるが、既に公知である（K. Funane et al., Oyo Toshitsu Kagaku., 42(1995)27-35 ）。たとえば配列表の配列番号１１に示すように、塩基を補完したＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）では、３２２番目のアミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ）から３４１番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）付近、３９１番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から４１０番目のセリン（Ｓｅｒ）付近である。
また、配列番号１２記載のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）では、３５５番目のアミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ）から３７４番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）付近、４２４番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から４４３番目のアラニン（Ａｌａ）付近である。
【００２３】
デキストランのみと結合するリシン残基を含むと考えられる部位も、酵素の種類によって多少異なるが、既に公知であり（K. Funane et al., Oyo Toshitsu Kagaku., 42(1995)27-35）、たとえば配列表の配列番号１１に示すように、塩基を補完したＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）では、９５７番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）から９７１番目のグリシン（Ｇｌｙ）付近、１０００番目のアラニン（Ａｌａ）から１０１９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）付近である。
また、ＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）では、配列表の配列番号１２に示すように、９７０番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）から９８４番目のグリシン（Ｇｌｙ）付近、１０１３番目のアラニン（Ａｌａ）から１０３２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）付近である。
【００２４】
Ｎ末端の活性中心領域におけるムタンと結合する部位も、同様に酵素の種類によって多少異なるが、既に公知であり（K. Funane et al., Bioschi. Biotechnol, Biochem., 62(1998)123-127）、たとえば配列表の配列番号１１記載のアミノ酸配列に示すように、塩基を補完したＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）では、２７８番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）から２９３番目のセリン（Ｓｅｒ）付近、６８１番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）から７０１番目のプロリン（Ｐｒｏ）付近、１０００番目のアラニン（Ａｌａ）から１００９番目のメチオニン（Ｍｅｔ）付近である。
また、配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列に示すように、ＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）では、３１１番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）から３２６番目のアラニン（Ａｌａ）付近、７０９番目のチロシン（Ｔｙｒ）から７２９番目のプロリン（Ｐｒｏ）付近、１０１３番目のアラニン（Ａｌａ）から１０２２番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）付近である。
【００２５】
上記の活性中心部位を、ロイコノストック・メセンテロイデスのＤＳと、同菌の異種のＤＳの間で交換して種々の改変ＤＳを作製する。
【００２６】
改変酵素群を作製するためには、置換すべきアミノ酸配列をコードする遺伝子を適当な制限酵素で切断した後、これを異種のＤＳまたはＧＴＦをコードする遺伝子を同じ制限酵素で切断した置換すべきアミノ酸配列をコードする遺伝子を除いた部分と互いに結合させることにより、他のＤＳ遺伝子に交換導入することができる。
適当な制限酵素認識部位が存在しない場合には、ＰＣＲ技術を応用することにより、コードするアミノ酸を変化させずに制限酵素部位を導入し、同様に遺伝子の交換導入を行うことができる。
また、公知のストレプトコッカス属菌由来のＧＴＦ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｍ１７３６１、Ｍ２９２９６、Ｍ１７３９１、Ｄ９０２１３、Ｍ３０９４３、Ｕ１２６４３、Ｍ６４１１１、Ｌ３５４９５、Ｌ３５９２８、Ｄ１３９２８、Ｍ２２０５４、Ｚ１１８７２、Ｚ１１８７３等）間での部分的交換、あるいはＤＳ遺伝子とＧＴＦ遺伝子間での部分的交換によって作製した改変ＤＳを用いても、本発明によるグルカンの生産を行うことができる。
【００２７】
他のＤＳ遺伝子のムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位および／またはデキストラン結合リシン部位と交換した改変ＤＳ遺伝子を、プラスミド等のベクター（たとえばｐＥＴ２３ｄ（Novagen社製））に挿入し、大腸菌（たとえばＢＬ２１（ＤＥ３））等の宿主に取り込ませることによって、形質転換された遺伝子組み換え体を得ることができる。この組み換え体を常法に従い適当な条件下で培養後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）等の固−液分離により微生物菌体を回収する。
回収した菌体を超音波処理等によって細胞破砕をした後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間）等を行い、改変されたＤＳを含む上清を回収し、これを粗酵素液とする。粗酵素液は、必要に応じて、常法による精製を行うことによって改変されたＤＳの精製物とすることもできる。
本発明においては、改変ＤＳ、特に遺伝子組み換え体から産生される改変ＤＳを用いてグルカンを製造するが、上記粗酵素液のまま用いてもよく、精製された改変ＤＳを使用してもよい。
【００２８】
得られた改変ＤＳ酵素液を用いてグルカンを製造する方法は通常の方法を適用すればよい。１例を示すと、改変ＤＳ粗酵素液を１０％スクロースを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）５０〜１００ｍｌ、好ましくは１００ｍｌに、緩衝液１００ｍｌあたり０．０５〜０．３Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上添加し、３０℃で一晩インキュベートする。インキュベート終了後、反応液と等量のエタノールを加え、沈殿した画分を遠心分離によって回収する。なお、１Ｕはスクロースを基質として、１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相当する還元糖を生じる酵素量である。
この沈殿を再び蒸留水に溶解させ、５０％エタノール沈殿を行う。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿を蒸留水に溶解した後、蒸留水に対して一晩透析を行い、得られたグルカン溶液を常法により凍結乾燥することにより、本発明のグルカンを得ることができる。
本発明のグルカンの製造方法によれば、本来のＤＳが生産するグルカンとは異なる構造を有するグルカンを安定的に生産することができる。
【００２９】
【実施例】
以下において、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（サイト１の交換）
配列表の配列番号１１記載のロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）アミノ酸配列の３０７番目のチロシン（Ｔｙｒ）から４７７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）と配列表の配列番号１２記載の同菌株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）アミノ酸配列の３４０番目のチロシン（Ｔｙｒ）から５１０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）の２つのスクロース・デキストラン結合リシン部位を含む領域をそれぞれサイト１と名づけ、これを交換導入することによって、改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを作製した。
【００３０】
（１）ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子を含むクローン作製
ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株について、改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを、舟根らの方法（K. Funane et al., Bioschi. Biotechnol, Biochem., 64(2000)29-38）に従って作製した。
まず、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株（ＮＲＲＬ社製）を２％グルコースを含む培地（組成：２％グルコース，１．５％リン酸水素二カリウム，０．５％酵母エキス，０．２５％ペプトン，０．００５％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ，０．００１％ＮａＣｌを塩酸でｐＨ７．４に調整したもの）５ｍｌに植菌し、嫌気的に３０℃で一晩培養した。
【００３１】
培養した該菌株からのゲノムＤＮＡの精製は、Wilsonらの方法（Wilson et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”(1987)2.4.1-2.4.2, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）に従って行った。すなわち、上記の培養終了後、遠心分離により集菌し、これを１２ｍｇリゾチーム，１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液５６７μｌを加え、３７℃で３時間インキュベートし、菌体を溶解（溶菌）した。さらに、１０％ＳＤＳを３０μｌと２０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫを３μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。
続いて、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ（１０％セチルトリメチルアンモニウムクロリド，０．７Ｍ ＮａＣｌ）８０μｌを加え、６５℃で１０分間インキュベート後、常法に従いフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、目的とするゲノムＤＮＡを回収した。
また、ＤＳをコードする遺伝子は、上記のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）で完全に切断してから、ＥｃｏＲＩ認識部位を有するファージであるλｇｔ１０（Stratagene社製）にライゲーションした後、Gigapack II gold pakaging extract（Stratagene社製）と共にパッケージングし、これをゲノムＤＮＡライブラリーとした。
【００３２】
大腸菌ＮＭ５１４株（Stratagene社製）をライゲーションし、該大腸菌を０．２％マルトース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むＴＢ培地（０．５％ＮａＣｌ，１％バクトトリプトンをＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）に植菌し、３７℃で４〜６時間培養した。培養後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌し、これをＯＤ600が０．５となるように１０ｍＭ ＭｇＳＯ4に懸濁し、コンピテントセルとしたものに、前記において調製したロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳをコードするＤＮＡフラグメントを導入したバクテリオファージを感染させ、形質転換した大腸菌を得た。該大腸菌をＮＺＹ固体培地で３７℃で８時間培養することによって得られたプラークを、ナイロン膜にトランスファーさせ、スクリーニングを行う。
【００３３】
スクリーニングは、次の手順で行った。ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）ＤＮＡをスクリーニングするために用いるＤＮＡプローブとしては、通常のＤＳの内部アミノ酸配列のうち、種間の相同性の高いものから設計したオリゴヌクレオチド（配列表の配列番号１３および１４、１５および１６）を用い、先に得たゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅したものを用いた。なお、配列番号１３記載のプライマーについては、６番目のチミン（ｔ）をグアニン（ｇ）に、１５番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に置換したものについても同様に用いることができた。配列番号１４記載のプライマーについては、４番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に置換したものについても同様に用いることができた。配列番号１５記載のプライマーについては、７番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に置換したものについても同様に用いることができた。ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングは５０℃で１分間、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で、１〜２分間で１分３０秒間のサイクルを２５回行った。
こうして得たＰＣＲ増幅産物を、Dig DNA labeling and detection kit(Boehringer Mannheim社製）を用いてジゴキシゲニンでラベルし、これをＤＮＡプローブとした。このＤＮＡプローブと同キット等を用いて、ナイロン膜（商品名：Hybond-N+、Amersham社製）にトランスファーさせたプラークをスクリーニングした。
【００３４】
次に、スクリーニングにより得られた５．２ｋｂと４．３ｋｂの２本のＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を、プラスミドpBluescript SK+（Stratagene社製）にライゲーションした。すなわち、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）で上記のＤＮＡ断片を処理した後、プラスミドの制限酵素サイトにライゲーション処理した。
これにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子を含むクローンを得た。
【００３５】
（２）同菌株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）遺伝子を含むクローン作製
ＤＤＢＪにアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４として登録されているロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子について、サイト１の交換に必要な制限酵素認識部位を作製するのに支障をきたした。しかも、該遺伝子については、他のＤＳやＧＴＦ間で相同性が高い部分に異なる箇所がいくつか見られた。このため、確認のために該遺伝子の塩基配列について、シークエンシングを行った。この結果、数カ所の塩基が異なっていることがわかった。このため、以下のサイト１の交換においては、配列表の配列番号７記載の塩基配列を用いて行った。
（１）と同様に、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株について、改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを得た後、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、形質転換した大腸菌を得た。該大腸菌をＮＺＹ固体培地で３７℃で８時間培養することによって得られたプラークを、ナイロン膜にトランスファーさせ、以下の手順でスクリーニングを行った。
【００３６】
すなわち、配列表の配列番号７記載のロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳのＤＮＡをスクリーニングするために用いるプライマーとしては、先に抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、一般的にＤＳ遺伝子を検出するために相同性のあるアミノ酸配列から設計したプライマー（配列表の配列番号５）およびロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）配列から設計したプライマー（配列表の配列番号６）を用い、ＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングは５０℃で１分間、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で、１〜２分間で１分３０秒間のサイクルを２５回行った。
こうして得たＰＣＲ増幅産物を、Dig DNA labeling and detection kit(Boehringer Mannheim社製）を用いてジゴキシゲニンでラベルし、これをＤＮＡプローブとした。このＤＮＡプローブと同キット等を用いて、ナイロン膜（商品名：Hybond-N+、Amersham社製）にトランスファーさせたプラークをスクリーニングした。
【００３７】
次に、スクリーニングにより得られた７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を、プラスミドpBluescript SK+（Stratagene社製）にライゲーションした。すなわち、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）で上記のＤＮＡ断片を処理した後、プラスミドのＥｃｏＲＩサイトに常法によりライゲーション処理した。
これにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）遺伝子を含むクローンを得た。
しかし、上記のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）遺伝子を含むクローンは、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、４０６７番目のアデニン（ａ）のところにＥｃｏＲＩ認識部位があるため、４０６７番目のアデニン（ａ）以降が欠損している１〜４０６６番目までのＤＳ遺伝子の断片しか得られなかった。
【００３８】
このため、再びゲノムＤＮＡを鋳型として、４０６７番目より上流に位置する配列を基に設計したプライマー（配列表の配列番号８）と終止コドンの下流にＸｈｏＩ認識部位を導入するように設計されたプライマー（配列表の配列番号９）を用いてＰＣＲ法により増幅することにより、４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングは５０℃で１分間、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で１分３０秒間のサイクルを２５回行った。
こうして得た４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片については、制限酵素であるＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）とＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断してＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とした後、塩基が欠損している３’−末端部分を補った。すなわち、上記によって作製したＸｈｏＩ認識部位を導入した４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片については、制限酵素であるＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）とＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断してＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とした後、１〜４０６６番目までのＥｃｏＲＩ断片において塩基が欠損している３’−末端部分とつなげることによって、塩基の欠損を補った。
【００３９】
上記によって得られた１〜４０６６番目までのＥｃｏＲＩ断片と４０６７番目以降のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片で３’−末端部分を補ったものを、pBluescript SK+（Stratagene社製）等に制限酵素処理およびライゲーション処理を行うことにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）を含むクローンを得た。
【００４０】
（３）組み換えプラスミドｐＤＳＲＳの調製
上記（２）で得たロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）遺伝子をpBluescript SK+（Stratagene社製）に結合したＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１７および１８記載の１対のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅してＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）の５’−末端より１４０８番目のｃまでのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲは、ＤＮＡの変性を９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングを５５℃で２分間、ポリメラーゼ伸長反応を７２℃で１分間のサイクルを３０回行った。これにより、遺伝子上流の余分な部分を取り除くと共に、ＮｃｏＩ認識部位を導入することができる。ＮｃｏＩ認識部位を導入すると、開始コドンのＡＴＧのすぐ後のシトシン（ｃ）がグアニン（ｇ）に置き換わり、アミノ酸配列についてもプロリン（Ｐｒｏ）からアラニン（Ａｌａ）に変わった。
【００４１】
このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｃｏＩ（ニッポンジーン社製）およびＳｐｅＩ（ニッポンジーン社製）で切断して得られたＤＮＡ断片と、ＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）およびＳｐｅＩ（ニッポンジーン社製）で切断した鋳型として用いたＤＮＡ断片とを、ＮｃｏＩ（ニッポンジーン社製）およびＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断したｐＥＴ２３ｄベクター（Novagen 社製）にライゲーションすることにより、完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）をコードするＤＮＡフラグメントを含む組み換えＤＮＡを作製し、これをｐＤＳＲＳと名づけた。
【００４２】
（４）組み換えプラスミドｐＤＳＲＴ５の調製
前記（１）で得たロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子をpBluescript SK+（Stratagene社製）に結合したＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１３および１４記載の１対のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅してＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲは、ＤＮＡの変性を９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングを５５℃で２分間、ポリメラーゼ伸長反応を７２℃で１分間のサイクルを３０回行った。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｃｏＩ（ニッポンジーン社製）およびＰｓｔＩ（ニッポンジーン社製）で切断し、ＮｃｏＩ−ＰｓｔＩフラグメントを作製した。
同様に、前記（１）で得たロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子をpBluescript SK+（Stratagene社製）に結合したＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１５および１６のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅してＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲは、上記と同様に行った。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｐｈＩ（ニッポンジーン社製）およびＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断し、ＳｐｈＩ−ＸｈｏＩフラグメントを作製した。
【００４３】
こうして得たＮｃｏＩ−ＰｓｔＩフラグメント、ＳｐｈＩ−ＸｈｏＩフラグメントおよび前記（１）で得たプラスミドpBluescript SK+（Stratagene社製）に組み込まれたＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子を、制限酵素ＰｓｔＩ（ニッポンジーン社製）およびＳｐｈＩ（ニッポンジーン社製）で切断した。これらのフラグメントを、制限酵素ＮｃｏＩ（ニッポンジーン社製）とＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断したｐＥＴ２３ｄベクター（Novagen社製）にライゲーション処理することにより、組み換えＤＮＡであるｐＤＳＲＴを作製した。
【００４４】
続いて、ｐＤＳＲＴを鋳型として、配列表の配列番号１０記載のプライマーとＭｕｔａｎｔ−ｓｕｐｅｒ ｋｍキット（タカラ酒造社製）を用い、欠損している５塩基（ｃａｇａｔ）を補完する変異を入れたＤＮＡ断片を作製した。
次に、該変異部分を含む部位を制限酵素ＳｐｈＩ（ニッポンジーン社製）およびＡｆｌＩＩ（ニッポンジーン社製）で切断し、０．３４７ｋｂのＳｐｈＩ−ＡｆｌＩＩ断片を作製した。これを、ｐＤＳＲＴの相当する部分である、配列表の配列番号１９記載の塩基配列の３００３番目のグアニン（ｇ）から３０５４番目のグアニン（ｇ）と交換し、これを５塩基（ｃａｇａｔ）の補完された組み換えＤＮＡであるｐＤＳＲＴ５とした。
【００４５】
（５）ＤＳ活性中心部位（サイト１）の交換導入
次に、こうして得たｐＤＳＲＳとｐＤＳＲＴ５について、ＤＳの活性中心の１つであるサイト１の交換導入を行った。
サイト１の交換を行うにあたり、ｐＤＳＲＳについては、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＫｐｎＩ認識部位を導入するために、１０１７番目のシトシン（ｃ）をグアニン（ｇ）に、１０２０番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に、１０２１番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）にする変異を導入した。
同様に、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＢｓｔＸＩ認識部位を導入するため、１５３３番目のシトシン（ｃ）をチミン（ｔ）に、１５３６番目のチミン（ｔ）をグアニン（ｇ）にする変異を導入した。
ｐＤＳＲＴ５については、すでに存在するＫｐｎＩ認識部位およびＢｓｔＸＩ認識部位を利用した。
【００４６】
ｐＤＳＲＳおよびｐＤＳＲＴ５について、それぞれ制限酵素ＫｐｎＩ（ニッポンジーン社製）およびＢｓｔＸＩ（ニッポンジーン社製）で切断した。切断後、生成した約５００ｂｐ断片とベクターＤＮＡを含む約７．５ｂｐ断片をそれぞれ抽出した後、常法により精製した。
ｐＤＳＲＴ５由来の５００ｂｐ断片をｐＤＳＲＳ由来の７．５ｂｐ断片にライゲーションすることにより作製した改変ｐＤＳＲＳをｐＳ１と名づけた。また、ｐＤＳＲＳ由来の５００ｂｐ断片をｐＤＳＲＴ５由来の７．５ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＴ５をｐＴ１と名づけた。
【００４７】
（６）ＤＳの酵素タンパクの発現
上記（５）で作製したｐＳ１とｐＴ１を、それぞれコンピテントセルとした大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen 社製）に取り込ませ、形質転換体である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を作製した。これをアンピシリン２００μｇ／ｍｌを含むLuria-Bertani平板培地で３７℃で９時間から一晩培養し、これをアンピシリン２００μｇ／ｍｌを含むLuria-Bertani培地３ｍｌを用いて３７℃で一晩振盪培養した。培養後、同培地１５０ｍｌに１：６０となるように培養後の培地を加えたのち、３７℃で２時間振盪培養した。
【００４８】
いったん培養を止め、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略記することがある。）（ワコー社製）を０．５ｍＭとなるように加え、さらに３０℃で８時間培養を続け、タンパクの生産誘導を行った。培養終了後、培養物を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）することにより菌体を沈殿として回収した。続いて、回収した菌体を３０％グリセリンを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）に懸濁し、超音波によって細胞破砕をした。細胞破砕後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）を行い、上清を回収し、これを粗酵素液とした。
なお、それぞれの粗酵素液に含まれている酵素タンパクについて、ｐＳ１から得られたものをＳ１、ｐＴ１から得られたものをＴ１とそれぞれ名づけた。
【００４９】
実施例２（サイト２の交換）
配列表の配列番号１１記載のロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）アミノ酸配列の６６８番目のリシン（Ｌｙｓ）から７４０番目のグリシン（Ｇｌｙ）と配列表の配列番号１２記載の同菌株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）アミノ酸配列の６９６番目のリシン（Ｌｙｓ）から７６８番目のグリシン（Ｇｌｙ）のムタン結合部位を含む領域をそれぞれサイト２と名づけ、これを交換導入することによって、改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを作製した。
【００５０】
実施例１で作製したｐＤＳＲＳとｐＤＳＲＴ５について、ＤＳの活性中心の１つであるサイト２の交換導入を行った。サイト２の交換導入以外は、すべて実施例１と同様に行った。
サイト２の交換を行うにあたり、ｐＤＳＲＳについては、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＤｒａＩ認識部位を導入するために、２０８５番目のシトシン（ｃ）をチミン（ｔ）にする変異を導入した。また、ＢａｌＩ認識部位については、すでに存在するものを利用した。
同様に、ｐＤＳＲＴ５については、配列表の配列番号１９記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＢａｌＩ認識部位を導入するため、２２１７番目のシトシン（ｃ）をチミン（ｔ）に、２２２０番目のグアニン（ｇ）をシトシン（ｃ）にする変異を導入した。
【００５１】
ｐＤＳＲＳおよびｐＤＳＲＴ５について、それぞれ制限酵素ＤｒａＩ（ニッポンジーン社製）およびＢａｌＩ（ニッポンジーン社製）で切断した。切断後、生成した約２００ｂｐ断片とベクターＤＮＡを含む約７．８ｂｐ断片をそれぞれ抽出した後、常法により精製した。
ｐＤＳＲＴ５由来の２００ｂｐ断片をｐＤＳＲＳ由来の７．８ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＳをｐＳ２と名づけた。また、ｐＤＳＲＳ由来の２００ｂｐ断片をｐＤＳＲＴ５由来の７．８ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＴ５をｐＴ２と名づけた。
実施例１と同様に、改変されたＤＳの酵素タンパクの発現を行い、サイト２を交換導入した粗酵素液を得た。なお、それぞれの粗酵素液に含まれている酵素タンパクについて、ｐＳ２から得られたものをＳ２、ｐＴ２から得られたものをＴ２とそれぞれ名づけた。
【００５２】
実施例３（サイト３の交換）
本実施例においては、配列表の配列番号１１記載のロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）アミノ酸配列の９０２番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から１１１８番目のリシン（Ｌｙｓ）と配列表の配列番号１２記載の同菌株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）アミノ酸配列の９１５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から１１３１番目のリシン（Ｌｙｓ）の２つのデキストラン結合リシン部位を含む領域をそれぞれサイト３と名づけ、これを交換導入した。
【００５３】
実施例１で作製したｐＤＳＲＳとｐＤＳＲＴ５について、ＤＳの活性中心の１つであるサイト３の交換導入を行った。サイト３の交換導入以外は、すべて実施例１と同様に行った。
サイト３の交換を行うにあたり、ｐＤＳＲＳについては、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＮｓｐＶ認識部位を導入するために、２７４８番目のアデニン（ａ）をグアニン（ｇ）にする変異を導入した。また、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＡｆｌＩＩ認識部位を導入するために、３３８８番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に、３３９０番目のグアニン（ｇ）をチミン（ｔ）に、３３９３番目のアデニン（ａ）をグアニン（ｇ）にする変異を導入した。
同様に、ｐＤＳＲＴ５については、配列表の配列番号１９記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＮｓｐＶ認識部位を導入するため、２７０９番目のアデニン（ａ）をグアニン（ｇ）にする変異を導入した。制限酵素ＡｆｌＩＩ認識部位については、すでに存在する部位を用いた。
【００５４】
ｐＤＳＲＳおよびｐＤＳＲＴ５について、それぞれ制限酵素ＮｓｐＶ（Stratagene社製）およびＡｆｌＩＩ（Stratagene社製）で切断した。切断後、生成した約６００ｂｐ断片とベクターＤＮＡを含む約７．４ｂｐ断片をそれぞれ抽出した後、常法により精製した。
ｐＤＳＲＴ５由来の６００ｂｐ断片をｐＤＳＲＳ由来の７．４ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＳをｐＳ３と名づけた。また、ｐＤＳＲＳ由来の６００ｂｐ断片をｐＤＳＲＴ５由来の７．４ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＴ５をｐＴ３と名づけた。
実施例１と同様に、改変ＤＳの酵素タンパクの発現を行い、サイト３を交換導入した粗酵素液を得た。なお、それぞれの粗酵素液に含まれている酵素タンパクについて、ｐＳ３から得られたものをＳ３、ｐＴ３から得られたものをＴ３とそれぞれ名づけた。
【００５５】
実施例４
実施例１〜３で調製した粗酵素液について、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記することがある。）およびウエスタンブロット分析を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Laemmliの方法（Laemmli, U. K., Nature, 227, 680-685）に従って行った。すなわち、電気泳動装置としてはミニスラブゲル電気泳動槽（アトー社製）を使用し、７．５％アクリルアミドゲル（ワコー社製）および０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス−グリシン緩衝液を用いて２０ｍＡで２時間電気泳動を行った。分子量マーカーとして、HMW Calibration kit for SDS Electrophoresis（Pharmacia社製）を用いた。
電気泳動終了後、ゲルをクマシー ブリリアントブルー（以下、ＣＢＢと略記することがある。）（Fluka社製）でタンパク質の泳動パターンを染色した。
【００５６】
また、ウエスタンブロット分析は、Towbinらの方法 (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354(1979))に従って行った。すなわち、電気泳動装置としてはミニスラブゲル電気泳動槽（アトー社製）を使用し、７．５％ゲル（ワコー社製）および０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス−グリシン緩衝液を用いて２０ｍＡで２時間電気泳動を行った。電気泳動終了後、同じ緩衝液を満たしたブロッティング装置（日本エイドー社製）にセットしブロッティングを行い、電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にトランスファーさせた。ブロッティングは室温で２．５ｍＡ／ｃｍ2で２０分間で行った。なお、ＰＶＤＦ膜は、あらかじめメタノールに数秒浸漬した後、２５ｍＭトリス，２０％メタノール，４０ｍＭ６−アミノカプロン酸（ｐＨ９．４）に浸漬した。
【００５７】
ブロッティング終了後、ＰＶＤＦ膜は、１％スキムミルクを含む２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）２０ｍｌに一晩浸漬した。次に、第１抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）を、０．５％スキムミルクを含む２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に１／１０００（ｖ／ｖ）となるように加え、これにＰＶＤＦ膜を１時間３０分浸漬した。続いて、スキムミルクを含まない２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）２０ｍｌで５分間洗浄し、これを４回繰り返した。
洗浄後、第２抗体をスキムミルクを含まない２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に１／３０００（ｖ／ｖ）となるように加え、これにＰＶＤＦ膜を１時間浸漬した。浸漬後、スキムミルクを含まない２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）２０ｍｌで５分間洗浄し、これを３回繰り返した。
【００５８】
なお、第１抗体としてはマウス抗グルコシルトランスフェラーゼ（日本大学（千葉県松戸市）の福島教授より供与）、第２抗体としてはペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（（γ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ−マウスＩｇＧ (ＢＲＬ社製））を用いた。
抗体と反応させたＰＶＤＦ膜は、生乾きした後、ECL Western blotting detection reagent（Amersham Pharmacia biotech社製）を用いて、hyperfilm （Amersham LIFE SCIENCE 社製）に感光した。
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後のタンパク質の泳動パターンを染色したものである。また、図２は、ウエスタンブロット分析の結果を示したものである。
【００５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、ｐＳ１から生産されたタンパクＳ１はｐＤＳＲＳより生産されたＤＳＲＳタンパクと、ｐＴ１から生産されたタンパクＴ１はｐＤＳＲＴ５より生産されたＤＳＲＴ５タンパクと分子量が同じであることが明らかとなった。Ｓ１の分子量は２００ｋＤａ、Ｔ１の分子量は２１０ｋＤａであった。
また、ｐＳ２から生産されたタンパクＳ２、ｐＳ３から生産されたタンパクＳ３、ｐＴ２から生産されたタンパクＴ２およびｐＴ３から生産されたタンパクＴ３についても、上記したＳ１とＴ１の場合と同様の結果であった。Ｓ２の分子量は２００ｋＤａ、Ｓ３の分子量は２００ｋＤａ、Ｔ２の分子量は２１０ｋＤａ、Ｔ３の分子量は２１０ｋＤａであった。
一方、ウエスタンブロット分析においても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と同様の傾向を示し、図中の矢印の位置にバンドが認められた。
【００６０】
実施例５
実施例１〜３で調製した粗酵素液２０ｍｌを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１０００ｍｌ中で一晩透析し、これを精製ＤＳとした。
この精製ＤＳ１５０μｌを、１２．５％スクロースを含む２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液１００μｌに添加し、３０℃で２０分〜１時間反応を行った。反応終了後、スクロースの分解によって生じる還元糖の増加をネルソン・ソモギー法（M. Somogyi, J. Biol. Chem., 160(1945)69-73)で測定し、これをスクロース分解活性とした。結果を第１表に示す。表中、ＤＳＲＳはｐＤＳＲＳから生産されたタンパク、ＤＳＲＴ５はｐＤＳＲＴ５から生産されたタンパクを、それぞれ表している。ＤＳ酵素１ユニット（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相当する還元糖を生産する酵素量である。
【００６１】
【表１】
第１表
【００６２】
第１表から明らかなように、発現させたすべての酵素タンパクについて、スクロース分解活性があることが明らかとなった。このうち、Ｓ１、Ｓ２およびＴ２については、ＤＳＲＳまたはＤＳＴＲ５とそれぞれ同等の活性を保持していた。しかし、Ｓ３についてはＤＳＲＳの２６％、Ｔ１についてはＤＳＲＴ５の１５％、Ｔ３についてはＤＳＴＲ５の４％程度に、活性が低下していることが明らかとなった。
【００６３】
実施例６
実施例５で透析を行い精製した各種ＤＳ０．０５〜０．３Ｕを、１０％スクロースを含む２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）緩衝液１００ｍＬ中で３０℃の恒温器でゆるく振盪させながら８時間反応を行った。
上記によって生成したグルカン（デキストラン）を５０％エタノールで沈殿させた後、これを遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分間）して回収した。次いで、この沈殿を蒸留水５０ｍｌに溶解し、さらに５０％エタノール沈殿を３回繰り返した。最後のグルカン水溶液を蒸留水２０ｍｌに対して一晩透析した。
透析終了後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、上清と沈殿に分けた。すなわち、上清を水溶性画分として、沈殿を非水溶性画分として、それぞれ凍結乾燥して重量を測定し、各ＤＳを作用させることによって得られたグルカンについて、水溶性画分と非水溶性画分の存在比率を算出した。結果を第２表に示す。
【００６４】
【表２】
第２表
【００６５】
第２表から明らかなように、ＤＳＲＳを作用させたグルカンまたはＤＳＲＴ５を作用させたグルカンと比較して、Ｓ１を作用させたグルカンおよびＴ１を作用させたグルカンともに水溶性画分が増えることが明らかとなった。
また、Ｓ２を作用させたグルカンは非水溶性画分が増加し、Ｔ２を作用させたグルカンは水溶性画分が増加していることが明らかとなった。
さらに、ＤＳＲＳを作用させたグルカンが主に水溶性グルカンであるのに対し、Ｓ３を作用させたグルカンは非水溶性画分が増加していることが明らかとなった。また、ＤＳＲＴ５を作用させたグルカンが主に非水溶性グルカンであるのに対し、Ｔ３を作用させたグルカンは主に水溶性グルカンであることが明らかとなった。
したがって、本発明のようにＤＳの活性中心部位を交換導入することによって、生産されるグルカンの性質を変化させることが可能であることが示された。
【００６６】
実施例７
実施例６で調製した各種グルカンについて、化学構造をメチル化分析法（W. S. York et al., Methods Enzymol., 118(1985)3-40）により、グルカンの結合様式の比率について分析した。
常法により凍結乾燥したグルカン１００〜１５０μｇを脱水ＤＭＳＯ（ワコー社製）０．５ｍｌに溶解した。グルカン溶解液にＮ2充填した後、７０℃で１時間インキュベートし、一晩攪拌した。次に、１５０μｍｏｌ Ｋ+ＤＭＳＯ-（水素化カリウムはアルドリッチ社製、ＤＭＳＯはワコー社製）を１００μｌ加え、２時間室温で攪拌した後、氷中で冷却し、１．５μｍｏｌ ＭｅＩ（関東化学）を１００μｌを加え、室温で一晩攪拌し、メチル化反応を行った。
蒸留水を０．５ｍｌ加えて反応をとめ、Ｎ2をバブリングすることにより、ＣＨ3Ｉを除去した。これを蒸留水１０００ｍｌに対して一晩透析し、常法に従って凍結乾燥した。
【００６７】
凍結乾燥したものに、２Ｍトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記することがある。）（ワコー社製）２５０μｌを加え、１２１℃で１時間加温した。加温終了後、直ちに冷却し、イソプロピルアルコール（ワコー社製）２５０μｌを加え、室温でエバポレートしてＴＦＡを除去すると共に、乾固した。
次に、５０％メタノール（ワコー社製）１００μｌを加え、１．５Ｍ ＮＨ4ＯＨ（ワコー社製）に１０ｍｇ／ｍｌ ＮａＢＤ4（シグマ化学社製）を溶解した溶解液を２００μｌ加え、室温で１時間放置した。
放置後、酢酸（ワコー社製）５０μｌを加え、さらに酢酸：メタノール（１：９）２００μｌを加え、混和した後に室温でエバポレートし、この操作を３回繰り返した。続いて、メタノール（ワコー社製）２００μｌを加え、室温でエバポレートし、この操作を３回繰り返した。これに、無水酢酸（ワコー社製）５０μｌを加えて１２１℃で３時間反応させた後、直ちに冷却した。冷却後、蒸留水５００μｌを加え、固体Ｎａ2ＣＯ3（ワコー社製）を泡が出なくなるまで加えた。
【００６８】
続いて、ＣＨ2Ｃｌ2（ワコー社製）５００μｌを加えて混和した後に生じた有機層を別の試験管へ移し、室温でエバポレートした。これをアセトン５００μｌに溶解し、再度室温でエバポレートした。エバポレート後、アセトン２０μｌに溶解したもののうち、１μｌを試料としてガスクロマトグラフィー（島津製作所製、ＧＣ−１４Ａ）を用いて分析した。このとき、分析用カラムとしてカラムＳＰ−２３３０（内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２μｍ）（スペルコ社製）を用い、カラム温度１７０℃で分離し、クロマトパック（島津製作所製、Ｃ−Ｒ１２６Ａ）で検出した。
また、ガスクロマトグラフィー質量分析（以下、ＧＣ／ＭＳと略記することがある。）についても、上記の試料１μｌを用いて行い、それぞれのピークに由来する物質について同定した。ＧＣ／ＭＳには、ＨＰ６８９０シリーズ ＧＣシステム、Benchtop Quadrupole Mass Spectrometer JEOL Automass SystemII（いずれもヒューレットパッカード社製）およびカラムＳＰ−２３３０（スペルコ社製）を用いた。
【００６９】
グルカンの結合様式の構成比率（％）についての結果を、第３表に示す。表中、T-Glcpは末端のグルコース残基、3-Glcpはα−１→３直鎖結合、4-Glcpはα−１→４直鎖結合、6-Glcpはα−１→６直鎖結合、3,6-Glcpはα−１→３，６分岐結合、4,6-Glcpはα−１→４，６分岐結合を表している。また、たとえばＳ−Ｓ１はＳ１を作用させることによって得られる水溶性画分に含まれるグルカン、Ｉ−Ｓ１はＳ１を作用させることによって得られる非水溶性画分に含まれるグルカンという意味である。
【００７０】
【表３】
第３表
−：痕跡程度
S-：水溶性画分
I-：非水溶性画分
【００７１】
この結果、Ｓ１グルカンの主成分である水溶性画分に含まれるＳ−Ｓ１グルカンは、ＤＳＲＳを作用させることによって得られるＤＳＲＳグルカンよりもα−１→６直鎖結合が増加する一方で、分岐結合が減少していることが明らかとなった。
また、Ｔ１グルカンの主成分である非水溶性画分Ｉ−Ｔ１グルカンは、ＤＳＲＴ５グルカンやＤＳＲＳグルカンとは全く異なり、ほとんどがα−１→４直鎖結合となり、α−１→３結合およびα−１→３，６分岐結合が減少していることが明らかとなった。
【００７２】
Ｓ２グルカンは、ＤＳＲＳグルカンよりもα−１→６直鎖結合がやや減少する一方で、α−１→４，６分岐結合が増加していることが明らかとなった。
また、Ｔ２グルカンは、ＤＳＲＴ５グルカンよりもα−１→６直鎖結合がやや減少するが、α−１→４直鎖結合がやや増加していることが明らかとなった。
Ｓ３グルカンは、α−１→６直鎖結合が減少するが、α−１→３直鎖結合が増加していることが明らかとなった。また、Ｔ３グルカンは、水溶性画分および非水溶性画分について、α−１→６直鎖結合およびα−１→３直鎖結合が減少するが、α−１→４直鎖結合が増加していることが明らかとなった。
【００７３】
以上のことから、改変ＤＳであるＳ１を作用させることによって得られるグルカンは、酵素活性中心部位の改変を行っていないＤＳＲＳやＤＳＲＴ５を作用させることによって得られる従来のグルカンとは糖の結合様式の割合が異なっているため、生産されるグルカンの構造自体も異なるものであることが明らかとなった。このＳ１グルカンは、従来のグルカンよりも水溶性が高いため、代用血漿やサイクロデキストラン等の製造に適したデキストランを安定的に生産できると考えられる。
さらに、改変ＤＳであるＴ１は、ほぼアミロースに近い構造のグルカンを生産することから、植物体からアミロースを調製するよりも純度の高いα−１→４直鎖結合のグルカンを、スクロースから１段階の反応で生産するのに有効であると考えられる。
【００７４】
改変ＤＳであるＳ２またはＴ２が生産するグルカンは、ＤＳＲＳやＤＳＲＴ５が生産するグルカンと比較して、糖の結合様式の割合がわずかに異なるため、グルカンの構造においてもわずかな変化が起こっているものと考えられる。
また、改変ＤＳであるＳ３およびＴ３は、ＤＳＲＳやＤＳＲＴ５が生産するグルカンと比べて、糖の結合様式の割合が異なった、かなり構造の異なるグルカンを生産することが明らかとなった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明によれば、ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼ（ＤＳ）のムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位またはデキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のＤＳのムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位およびデキストラン結合リシン部位のうち対応する部位と交換して作製した改変ＤＳと、この改変ＤＳをコードする遺伝子を挿入したベクター、該ベクターにより形質転換された遺伝子組み換え体が提供される。
さらに、改変ＤＳを基質に作用させることによって、糖の結合様式の割合が変化し、構造が改変されたグルカンを安定的に製造する方法が提供される。
また、改変ＤＳを作製する際に交換導入する部位をムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位およびデキストラン結合リシン部位の中から選択することにより、酵素反応生産物の構造や性質を大きく変化させることが可能で、様々な用途への応用が期待される。
【００７６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例４におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後のタンパク質の泳動パターンを示したものである。
【図２】 実施例４におけるウエスタンブロット分析の結果である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体およびグルカンの製造法に関し、詳しくはロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼの活性中心領域の一部を、同菌の異種のデキストランスクラーゼの活性中心領域と交換してなる改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体およびグルカンの製造法に関する。
本発明の改変デキストランスクラーゼを用いて製造されるグルカンは、α−１，３結合、α−１，４結合およびα−１，６結合の割合が、本来のものとは異なるという特性を有している。
【０００２】
【従来の技術】
グルカンは、デンプンやセルロース等のＤ−グルコースを構成単位とする多糖（デキストラン等）の総称であり、微生物や植物の細胞壁の主要構成成分として知られているものもある。
様々な構造を有するグルカンを生産するために、これまでは異なった構造のグルカンを生産する菌をスクリーニングし、それらの菌株を培養してグルカンの発酵生産を行う方法が採用されている。
また、ロイコノストック（Leuconostoc)属菌のデキストラン生産性向上を目的としてニトロソグアニン等を用いた変異処理も試みられている。さらには、ロイコノストック属菌やストレプトコッカス（Streptococcus)属菌によって産生されるデキストランスクラーゼ［EC 2.4.1.5］（以下、ＤＳと略記することがある。）あるいはグルコシルトランスフェラーゼ［EC 2.4.1.125］（以下、ＧＴＦと略記することがある。）をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、該酵素を生産させ、この酵素を用いてデキストランを生産することは研究室レベルで行われている。
【０００３】
ＤＳは、前記の微生物等により生産される分子量１６万前後の酵素で、基質であるスクロースを分解する反応を触媒し、フルクトースを遊離すると同時にグルコース部分を多糖またはオリゴ糖に転移して、α−１→６結合を主体とする高分子の水溶性α−Ｄ−グルカンであるデキストランを合成する酵素である。
また、ロイコノストック属菌由来のグルカン合成酵素には、水溶性のグルカンを合成する酵素の他に、α−１→３結合を主体とする非水溶性のグルカンを合成する酵素が存在し、いずれもＧＴＦと呼ばれている。複数のＧＴＦの作用で、固着性の強いムタンと呼ばれるグルカンを形成する。
本来のデキストランとは異なる構造を有するデキストランを得るには、これまでは目的の構造を有するデキストランを生産する菌株を、スクリーニングにより探し出すこと以外には有効な方法がなく、膨大な時間と労力を必要としていた。
【０００４】
ＤＳやＧＴＦによって生産されるグルカンの構造を変化させるために、これらの酵素をコードする遺伝子に、３’−末端のグルカン結合領域のデレーション処理を行い、該結合領域を異なる酵素同士で交換する、部位特異的変異法を用いて特定のアミノ酸残基を別のアミノ酸に置き換える等の処理を行い、変異酵素を作製することが行われている。
ここで、グルカン結合領域とは、カルボキシ末端の繰り返し構造を持った領域を言い、これをデレーション処理することによって、カルボキシ末端が短くなった酵素が生産されるのである。
【０００５】
しかし、上記した３’−末端のグルカン結合領域のデレーション処理や異なる酵素間での同領域の交換等の従来の方法では、生産するグルカンの構造をほとんど変えることはできなかった。これは、グルカン結合領域の役割が、単純にグルカンと結合するのみで、酵素反応自体には関与していないことが明らかとなったことからも裏付けられている。
また、部位特異的変異法では、生産するグルカンの構造をある程度変えることが可能であるが、構造を大きく変化させることは未だ成功していない。そのため、酵素の転移反応様式を決める部位が特定されておらず、生産物の構造制御を行うことは困難である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＳやＧＴＦにおいて、従来注目されていなかった重要な酵素の活性中心部位を探索し、これらの部位を異なる酵素同士で交換して改変酵素を得ることにより、生産されるグルカンの構造を大きく変えることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのスクロース・デキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのスクロース・デキストラン結合リシン部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼである。
請求項２記載の本発明は、ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのムタン結合部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのムタン結合部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼである。
請求項３記載の本発明は、ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのデキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのデキストラン結合リシン部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼである。
請求項４記載の本発明は、請求項１〜３のいずれかの改変デキストランスクラーゼをコードする遺伝子を挿入したベクターである。
請求項５記載の本発明は、請求項４のベクターで形質転換された遺伝子組み換え体である。
請求項６記載の本発明は、請求項１〜３のいずれかの改変デキストランスクラーゼを基質に作用させることを特徴とするグルカンの製造法である。
請求項７記載の本発明は、請求項５載の遺伝子組み換え体が生産する改変デキストランスクラーゼを基質に作用させることを特徴とするグルカンの製造法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の改変ＤＳは、ロイコノストック・メセンテロイデスのＤＳのムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位またはデキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のＤＳのムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位およびデキストラン結合リシン部位のうち対応する部位と交換してなるものである。すなわち、ＤＳのＮ末端側に存在するデキストランおよび／またはスクロースの結合に関与するリシンを含む部位、硫酸アンモニウム存在下でムタンに結合する部位およびその近傍を含む部位を、遺伝子組み換え技術により２種類のＤＳ酵素分子間で交換したキメラ酵素である。
【０００９】
本発明の改変ＤＳを得るには、まず改変していないＤＳをコードする遺伝子を取得する必要がある。具体的には、公知のロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）株、たとえばＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）、ＮＲＲＬ Ｂ−１２９９株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ３８１８１，ＡＦ０３０１２９）、ＮＲＲＬ Ｂ−１３５５株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＪ２５０１７２）、ＮＲＲＬ Ｂ−７４２ＣＢ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＦ２９４４６９）等およびＤＳ様遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）に塩基補完をして活性型ＤＳをコードするよう改変した遺伝子（K. Funane et al., Bioschi. Biotechnol, Biochem., 64(2000)29-38）を用いることができる。ここで、ＤＳ様遺伝子とは、ＤＳをコードする領域中に塩基の欠損が存在するためにフレームシフトが生じ、この欠損部分の直後（欠損個所から４塩基下流）に終止コドンが現れるため、通常のＤＳよりも分子量が３分の２程度と小さく、グルカン結合領域のすべてを欠損したタンパクをコードする遺伝子のことである。
【００１０】
ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の場合、まず改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを、舟根らの方法（K. Funane et al., Bioschi. Biotechnol, Biochem., 64(2000)29-38）に従って作製する。すなわち、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株を２％グルコースを含む培地（組成：２％グルコース，１．５％リン酸水素二カリウム，０．５％酵母エキス，０．２５％ペプトン，０．００５％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ，０．００１％ＮａＣｌを塩酸でｐＨ７．４に調整したもの）等で嫌気的に２５〜３０℃、好ましくは３０℃で、１２〜２４時間、好ましくは一晩培養する。
【００１１】
培養した該菌株からのゲノムＤＮＡの精製は、Wilsonらの方法（Wilson et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”(1987)2.4.1-2.4.2, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）に従って行う。すなわち、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株を２％グルコースを含む培地（組成：２％グルコース，１．５％リン酸水素二カリウム，０．５％酵母エキス，０．２５％ペプトン，０．００５％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ，０．００１％ＮａＣｌを塩酸でｐＨ７．４に調整したもの）５ｍｌに植菌し、嫌気的に３０℃で一晩培養する。
培養終了後、遠心分離により集菌し、これを１２ｍｇリゾチーム，１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ溶液５６７μｌを加え、３７℃で３時間インキュベートし、菌体を溶解（溶菌）する。さらに、１０％ＳＤＳを３０μｌと２０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫを３μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートする。
続いて、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ（１０％セチルトリメチルアンモニウムクロリド，０．７Ｍ ＮａＣｌ）８０μｌを加え、６５℃で１０分間インキュベート後、常法に従いフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、目的とするゲノムＤＮＡを回収する。
【００１２】
ＤＳをコードする遺伝子は、該遺伝子を有する菌株から上記の方法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼチェーンリアクション（以下、ＰＣＲと略記することがある。）法を行うことによっても取得することができる。ＰＣＲを行う際のプライマーは、たとえばロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）の場合、ＤＳ遺伝子の上流と下流について明らかになっている塩基配列を基に設計した３０ベース（塩基）前後の長さの１対を用いる。具体的には、配列表の配列番号１および２記載の１対のプライマーを用いる。また、プライマーとしては、適当な制限酵素認識部位、たとえば５’−末端側にＮｃｏＩ認識部位、３’−末端側にＸｈｏＩ認識部位を導入するように設計されたプライマー（配列表の配列番号３および４）を用いることもできる。
このとき行うＰＣＲについては、長鎖ＤＮＡの増幅に適したＤＮＡポリメラーゼ、たとえばTakara LATaq（タカラ酒造社製）等を用いて、常法に従って行うことができる。たとえば、ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングは５０℃で１分間、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で５分間のサイクルを３０回行う。
【００１３】
また、ＤＳをコードする遺伝子は、上記の方法の他に、ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断してから、ファージベクター等に挿入したゲノムＤＮＡライブラリーより得ることもできる。具体的には、たとえば制限酵素ＥｃｏＲＩでゲノムＤＮＡを完全に切断し、ＥｃｏＲＩ認識部位を有するファージであるλｇｔ１０（Stratagene社製）等にライゲーションした後、Gigapack II gold packaging extract （Stratagene社製）等と共にパッケージングする。
上記によって得られたゲノムＤＮＡ断片を組み込んだバクテリオファージが、ゲノムＤＮＡライブラリーである。これを、常法によってコンピテントセルとした大腸菌ＮＭ５１４株等にインフェクションし、形質転換した大腸菌を得る。
【００１４】
たとえば、大腸菌ＮＭ５１４株の場合、０．２％マルトース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むＴＢ培地（０．５％ＮａＣｌ，１％トリプトンをＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）に植菌し、３７℃で４〜６時間培養する。
培養後、該大腸菌をＮＺＹ固体培地（組成：０．５％ＮａＣｌ，０．２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．５％酵母エキス，１％ＮＺアミンをＮａＯＨでｐＨ７．５に調整したもの）に植菌し、３７℃で一晩培養する。培養後のプレートからコロニーを１つ取り、これを上記の０．２％マルトース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むＴＢ培地に接種して、３７℃で４〜６時間程度培養する。
【００１５】
培養後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）により沈殿した該大腸菌を集菌し、これをＯＤ600が０．５となるように１０ｍＭ ＭｇＳＯ4に懸濁し、これをコンピテントセルとする。この大腸菌懸濁液６００μｌに、上記で調製したロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片を含むλｇｔ１０等のバクテリオファージ１〜５μｌを加え、３７℃で１５分間保温する。
続いて、ＮＺＹ固体培地に２％アガーロースを添加したトップアガー４ｍｌを溶解した後に４８℃以下に冷却したものを加えて混合し、固まらないうちにＮＺＹ固体培地のプレートに重層する。トップアガーが固まった後、３０〜３７℃、好ましくは３７℃で、６〜１２時間、好ましくは８時間培養する。これにより得られたプラークは、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片を組み込んだλｇｔ１０等のバクテリオファージによるものであり、このプラークをナイロン膜等にトランスファーさせ、これをスクリーニングする。
【００１６】
スクリーニングは、次の手順で行う。まず、先に抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、一般的にＤＳ遺伝子を検出するために相同性のあるアミノ酸配列から設計したプライマー（配列表の配列番号５）およびロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）配列から設計したプライマー（配列表の配列番号６）を用いて、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法で増幅する。なお、配列番号５記載のプライマーについては、７番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に置換したものについても同様に用いることができる。ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９２〜９６℃、好ましくは９４℃で、３０秒〜１分間、好ましくは１分間、プライマーとのアニーリングは５０〜６０℃、好ましくは５０℃で、１〜２分間、好ましくは１分間、ポリメラーゼ伸長反応７０〜７６℃、好ましくは７２℃で、１〜２分間、好ましくは１分３０秒間のサイクルを２５〜３０回、好ましくは２５回行う。
こうして得たＰＣＲ増幅産物を、Dig DNA labeling and detection kit(Boehringer Mannheim社製）等を用いてジゴキシゲニンでラベルし、これをＤＮＡプローブとする。このＤＮＡプローブと同キット等を用いて、ナイロン膜等にトランスファーさせたプラークをスクリーニングすることにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）を含むクローンを得ることができる。
【００１７】
上記の方法で得られるロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）のクローンは、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、４０６７番目のアデニン（ａ）のところにＥｃｏＲＩ認識部位があるため、これより上流のＤＮＡ断片、すなわち４０６７番目のアデニン（ａ）以降が欠損している１〜４０６６番目までのＤＳ遺伝子の断片しか得られない。
このため、再びゲノムＤＮＡを鋳型として、４０６７番目より上流に位置する配列を基に設計したプライマー（配列表の配列番号８）と終止コドン（ｔａａ）の下流にＸｈｏＩ認識部位を導入するように設計されたプライマー（配列表の配列番号９）を用いてＰＣＲ法により増幅することにより、４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片を得た後、２つのＤＮＡ断片をつなげ、完全長のクローンとする必要がある。
【００１８】
すなわち、上記によって作製したＸｈｏＩ認識部位を導入した４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片については、制限酵素であるＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断してＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とした後、１〜４０６６番目までのＥｃｏＲＩ断片において塩基が欠損している３’−末端部分とつなげることによって、塩基の欠損を補う。
上記によって得られた１〜４０６６番目までのＥｃｏＲＩ断片と４０６７番目以降のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片で３’−末端部分を補ったものを、pBluescript SK+（Stratagene社製）等に制限酵素処理およびライゲーション処理を行うことにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）を含むクローンを得ることができる。
なお、ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９２〜９６℃、好ましくは９４℃で、３０秒〜１分間、好ましくは１分間、プライマーとのアニーリングは５０〜６０℃、好ましくは５０℃で、１〜２分間、好ましくは１分間、ポリメラーゼ伸長反応７０〜７６℃、好ましくは７２℃で、１〜２分間、好ましくは１分３０秒間のサイクルを２５〜３０回、好ましくは２５回行う。
【００１９】
得られたＤＳ遺伝子をプラスミド等のベクター（たとえばｐＥＴ２３ｄ（Novagen社製））に挿入した組み換えベクターを作製し、該組み換えベクターを大腸菌等の宿主に取り込ませて形質転換することにより、ＤＳ遺伝子を保持した遺伝子組み換え体が得られる。
組み換えプラスミドの調製は、得られたＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断した後、同じ制限酵素で切断したｐＥＴ２３ｄベクター（Novagen社製）等のベクターにライゲーションすることにより、完全なＤＳをコードするＤＮＡフラグメントを含む組み換えベクターを作製することができる。
【００２０】
また、鋳型とするＤＮＡによっては、塩基を補完する必要がある。たとえば、ＤＤＢＪにおいてアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０として登録されている塩基配列については、翻訳領域中に５塩基（ｃａｇａｔ）の欠損があり、フレームシフトが生じるため、通常の位置とは異なる位置に現れる終止コドンによって通常のＤＳの３分の２程度の長さしかコードされていない。このため、Ｃ末端の繰り返し配列であるグルカン結合領域すべてが、欠損したものとなる。
このような場合、欠損している塩基を補完する変異を導入することによって、フレームシフトが生じず、通常の長さの繰り返し構造を有するＤＳが得られる。このため、塩基の欠損がある場合には、欠損している塩基を補完する変異を導入することが好ましい。
【００２１】
上記の塩基を補完する変異を導入する場合には、塩基を補完した後に、組み換えベクターにライゲーションする。
塩基を補完した組み換えベクターの作製は、まず上記した方法により、塩基を補完していないＤＮＡフラグメントを含む組み換えベクターを作製する。次に、該組み換えベクターを鋳型として、配列表の配列番号１０記載のプライマーとＭｕｔａｎｔ−ｓｕｐｅｒ ｋｍキット（タカラ酒造社製）等のキットを用い、欠損している塩基を補完する変異を入れたＤＮＡ断片を作製し、該変異部分を含む部位を適当な制限酵素で切断し、これと塩基を補完していないＤＮＡフラグメントを含む組み換えベクターの相当する部分と交換することによって行う。
【００２２】
本発明において、交換導入するＤＳの活性中心領域としては、次の３種類が存在する。すなわち、ムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位およびデキストラン結合リシン部位である。
ＤＳのＮ末端活性中心領域中におけるスクロースおよびデキストランと結合するリシン残基を含むと考えられる部位は、酵素の種類によって多少異なるが、既に公知である（K. Funane et al., Oyo Toshitsu Kagaku., 42(1995)27-35 ）。たとえば配列表の配列番号１１に示すように、塩基を補完したＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）では、３２２番目のアミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ）から３４１番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）付近、３９１番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から４１０番目のセリン（Ｓｅｒ）付近である。
また、配列番号１２記載のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）では、３５５番目のアミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ）から３７４番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）付近、４２４番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から４４３番目のアラニン（Ａｌａ）付近である。
【００２３】
デキストランのみと結合するリシン残基を含むと考えられる部位も、酵素の種類によって多少異なるが、既に公知であり（K. Funane et al., Oyo Toshitsu Kagaku., 42(1995)27-35）、たとえば配列表の配列番号１１に示すように、塩基を補完したＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）では、９５７番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）から９７１番目のグリシン（Ｇｌｙ）付近、１０００番目のアラニン（Ａｌａ）から１０１９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）付近である。
また、ＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）では、配列表の配列番号１２に示すように、９７０番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）から９８４番目のグリシン（Ｇｌｙ）付近、１０１３番目のアラニン（Ａｌａ）から１０３２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）付近である。
【００２４】
Ｎ末端の活性中心領域におけるムタンと結合する部位も、同様に酵素の種類によって多少異なるが、既に公知であり（K. Funane et al., Bioschi. Biotechnol, Biochem., 62(1998)123-127）、たとえば配列表の配列番号１１記載のアミノ酸配列に示すように、塩基を補完したＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）では、２７８番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）から２９３番目のセリン（Ｓｅｒ）付近、６８１番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）から７０１番目のプロリン（Ｐｒｏ）付近、１０００番目のアラニン（Ａｌａ）から１００９番目のメチオニン（Ｍｅｔ）付近である。
また、配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列に示すように、ＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）では、３１１番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）から３２６番目のアラニン（Ａｌａ）付近、７０９番目のチロシン（Ｔｙｒ）から７２９番目のプロリン（Ｐｒｏ）付近、１０１３番目のアラニン（Ａｌａ）から１０２２番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）付近である。
【００２５】
上記の活性中心部位を、ロイコノストック・メセンテロイデスのＤＳと、同菌の異種のＤＳの間で交換して種々の改変ＤＳを作製する。
【００２６】
改変酵素群を作製するためには、置換すべきアミノ酸配列をコードする遺伝子を適当な制限酵素で切断した後、これを異種のＤＳまたはＧＴＦをコードする遺伝子を同じ制限酵素で切断した置換すべきアミノ酸配列をコードする遺伝子を除いた部分と互いに結合させることにより、他のＤＳ遺伝子に交換導入することができる。
適当な制限酵素認識部位が存在しない場合には、ＰＣＲ技術を応用することにより、コードするアミノ酸を変化させずに制限酵素部位を導入し、同様に遺伝子の交換導入を行うことができる。
また、公知のストレプトコッカス属菌由来のＧＴＦ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｍ１７３６１、Ｍ２９２９６、Ｍ１７３９１、Ｄ９０２１３、Ｍ３０９４３、Ｕ１２６４３、Ｍ６４１１１、Ｌ３５４９５、Ｌ３５９２８、Ｄ１３９２８、Ｍ２２０５４、Ｚ１１８７２、Ｚ１１８７３等）間での部分的交換、あるいはＤＳ遺伝子とＧＴＦ遺伝子間での部分的交換によって作製した改変ＤＳを用いても、本発明によるグルカンの生産を行うことができる。
【００２７】
他のＤＳ遺伝子のムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位および／またはデキストラン結合リシン部位と交換した改変ＤＳ遺伝子を、プラスミド等のベクター（たとえばｐＥＴ２３ｄ（Novagen社製））に挿入し、大腸菌（たとえばＢＬ２１（ＤＥ３））等の宿主に取り込ませることによって、形質転換された遺伝子組み換え体を得ることができる。この組み換え体を常法に従い適当な条件下で培養後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）等の固−液分離により微生物菌体を回収する。
回収した菌体を超音波処理等によって細胞破砕をした後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間）等を行い、改変されたＤＳを含む上清を回収し、これを粗酵素液とする。粗酵素液は、必要に応じて、常法による精製を行うことによって改変されたＤＳの精製物とすることもできる。
本発明においては、改変ＤＳ、特に遺伝子組み換え体から産生される改変ＤＳを用いてグルカンを製造するが、上記粗酵素液のまま用いてもよく、精製された改変ＤＳを使用してもよい。
【００２８】
得られた改変ＤＳ酵素液を用いてグルカンを製造する方法は通常の方法を適用すればよい。１例を示すと、改変ＤＳ粗酵素液を１０％スクロースを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）５０〜１００ｍｌ、好ましくは１００ｍｌに、緩衝液１００ｍｌあたり０．０５〜０．３Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上添加し、３０℃で一晩インキュベートする。インキュベート終了後、反応液と等量のエタノールを加え、沈殿した画分を遠心分離によって回収する。なお、１Ｕはスクロースを基質として、１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相当する還元糖を生じる酵素量である。
この沈殿を再び蒸留水に溶解させ、５０％エタノール沈殿を行う。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿を蒸留水に溶解した後、蒸留水に対して一晩透析を行い、得られたグルカン溶液を常法により凍結乾燥することにより、本発明のグルカンを得ることができる。
本発明のグルカンの製造方法によれば、本来のＤＳが生産するグルカンとは異なる構造を有するグルカンを安定的に生産することができる。
【００２９】
【実施例】
以下において、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（サイト１の交換）
配列表の配列番号１１記載のロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）アミノ酸配列の３０７番目のチロシン（Ｔｙｒ）から４７７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）と配列表の配列番号１２記載の同菌株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）アミノ酸配列の３４０番目のチロシン（Ｔｙｒ）から５１０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）の２つのスクロース・デキストラン結合リシン部位を含む領域をそれぞれサイト１と名づけ、これを交換導入することによって、改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを作製した。
【００３０】
（１）ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子を含むクローン作製
ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株について、改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを、舟根らの方法（K. Funane et al., Bioschi. Biotechnol, Biochem., 64(2000)29-38）に従って作製した。
まず、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株（ＮＲＲＬ社製）を２％グルコースを含む培地（組成：２％グルコース，１．５％リン酸水素二カリウム，０．５％酵母エキス，０．２５％ペプトン，０．００５％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．００１％ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ，０．００１％ＮａＣｌを塩酸でｐＨ７．４に調整したもの）５ｍｌに植菌し、嫌気的に３０℃で一晩培養した。
【００３１】
培養した該菌株からのゲノムＤＮＡの精製は、Wilsonらの方法（Wilson et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”(1987)2.4.1-2.4.2, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）に従って行った。すなわち、上記の培養終了後、遠心分離により集菌し、これを１２ｍｇリゾチーム，１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液５６７μｌを加え、３７℃で３時間インキュベートし、菌体を溶解（溶菌）した。さらに、１０％ＳＤＳを３０μｌと２０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫを３μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。
続いて、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ（１０％セチルトリメチルアンモニウムクロリド，０．７Ｍ ＮａＣｌ）８０μｌを加え、６５℃で１０分間インキュベート後、常法に従いフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、目的とするゲノムＤＮＡを回収した。
また、ＤＳをコードする遺伝子は、上記のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）で完全に切断してから、ＥｃｏＲＩ認識部位を有するファージであるλｇｔ１０（Stratagene社製）にライゲーションした後、Gigapack II gold pakaging extract（Stratagene社製）と共にパッケージングし、これをゲノムＤＮＡライブラリーとした。
【００３２】
大腸菌ＮＭ５１４株（Stratagene社製）をライゲーションし、該大腸菌を０．２％マルトース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むＴＢ培地（０．５％ＮａＣｌ，１％バクトトリプトンをＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）に植菌し、３７℃で４〜６時間培養した。培養後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌し、これをＯＤ600が０．５となるように１０ｍＭ ＭｇＳＯ4に懸濁し、コンピテントセルとしたものに、前記において調製したロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳをコードするＤＮＡフラグメントを導入したバクテリオファージを感染させ、形質転換した大腸菌を得た。該大腸菌をＮＺＹ固体培地で３７℃で８時間培養することによって得られたプラークを、ナイロン膜にトランスファーさせ、スクリーニングを行う。
【００３３】
スクリーニングは、次の手順で行った。ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）ＤＮＡをスクリーニングするために用いるＤＮＡプローブとしては、通常のＤＳの内部アミノ酸配列のうち、種間の相同性の高いものから設計したオリゴヌクレオチド（配列表の配列番号１３および１４、１５および１６）を用い、先に得たゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅したものを用いた。なお、配列番号１３記載のプライマーについては、６番目のチミン（ｔ）をグアニン（ｇ）に、１５番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に置換したものについても同様に用いることができた。配列番号１４記載のプライマーについては、４番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に置換したものについても同様に用いることができた。配列番号１５記載のプライマーについては、７番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に置換したものについても同様に用いることができた。ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングは５０℃で１分間、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で、１〜２分間で１分３０秒間のサイクルを２５回行った。
こうして得たＰＣＲ増幅産物を、Dig DNA labeling and detection kit(Boehringer Mannheim社製）を用いてジゴキシゲニンでラベルし、これをＤＮＡプローブとした。このＤＮＡプローブと同キット等を用いて、ナイロン膜（商品名：Hybond-N+、Amersham社製）にトランスファーさせたプラークをスクリーニングした。
【００３４】
次に、スクリーニングにより得られた５．２ｋｂと４．３ｋｂの２本のＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を、プラスミドpBluescript SK+（Stratagene社製）にライゲーションした。すなわち、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）で上記のＤＮＡ断片を処理した後、プラスミドの制限酵素サイトにライゲーション処理した。
これにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子を含むクローンを得た。
【００３５】
（２）同菌株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）遺伝子を含むクローン作製
ＤＤＢＪにアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４として登録されているロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子について、サイト１の交換に必要な制限酵素認識部位を作製するのに支障をきたした。しかも、該遺伝子については、他のＤＳやＧＴＦ間で相同性が高い部分に異なる箇所がいくつか見られた。このため、確認のために該遺伝子の塩基配列について、シークエンシングを行った。この結果、数カ所の塩基が異なっていることがわかった。このため、以下のサイト１の交換においては、配列表の配列番号７記載の塩基配列を用いて行った。
（１）と同様に、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株について、改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを得た後、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、形質転換した大腸菌を得た。該大腸菌をＮＺＹ固体培地で３７℃で８時間培養することによって得られたプラークを、ナイロン膜にトランスファーさせ、以下の手順でスクリーニングを行った。
【００３６】
すなわち、配列表の配列番号７記載のロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳのＤＮＡをスクリーニングするために用いるプライマーとしては、先に抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、一般的にＤＳ遺伝子を検出するために相同性のあるアミノ酸配列から設計したプライマー（配列表の配列番号５）およびロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）配列から設計したプライマー（配列表の配列番号６）を用い、ＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングは５０℃で１分間、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で、１〜２分間で１分３０秒間のサイクルを２５回行った。
こうして得たＰＣＲ増幅産物を、Dig DNA labeling and detection kit(Boehringer Mannheim社製）を用いてジゴキシゲニンでラベルし、これをＤＮＡプローブとした。このＤＮＡプローブと同キット等を用いて、ナイロン膜（商品名：Hybond-N+、Amersham社製）にトランスファーさせたプラークをスクリーニングした。
【００３７】
次に、スクリーニングにより得られた７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を、プラスミドpBluescript SK+（Stratagene社製）にライゲーションした。すなわち、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）で上記のＤＮＡ断片を処理した後、プラスミドのＥｃｏＲＩサイトに常法によりライゲーション処理した。
これにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）遺伝子を含むクローンを得た。
しかし、上記のＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）遺伝子を含むクローンは、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、４０６７番目のアデニン（ａ）のところにＥｃｏＲＩ認識部位があるため、４０６７番目のアデニン（ａ）以降が欠損している１〜４０６６番目までのＤＳ遺伝子の断片しか得られなかった。
【００３８】
このため、再びゲノムＤＮＡを鋳型として、４０６７番目より上流に位置する配列を基に設計したプライマー（配列表の配列番号８）と終止コドンの下流にＸｈｏＩ認識部位を導入するように設計されたプライマー（配列表の配列番号９）を用いてＰＣＲ法により増幅することにより、４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲについては、ＤＮＡの変性は９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングは５０℃で１分間、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で１分３０秒間のサイクルを２５回行った。
こうして得た４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片については、制限酵素であるＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）とＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断してＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とした後、塩基が欠損している３’−末端部分を補った。すなわち、上記によって作製したＸｈｏＩ認識部位を導入した４０６７番目以降のＤＳ遺伝子のＤＮＡ断片については、制限酵素であるＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン社製）とＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断してＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とした後、１〜４０６６番目までのＥｃｏＲＩ断片において塩基が欠損している３’−末端部分とつなげることによって、塩基の欠損を補った。
【００３９】
上記によって得られた１〜４０６６番目までのＥｃｏＲＩ断片と４０６７番目以降のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片で３’−末端部分を補ったものを、pBluescript SK+（Stratagene社製）等に制限酵素処理およびライゲーション処理を行うことにより、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ遺伝子（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）を含むクローンを得た。
【００４０】
（３）組み換えプラスミドｐＤＳＲＳの調製
上記（２）で得たロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）遺伝子をpBluescript SK+（Stratagene社製）に結合したＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１７および１８記載の１対のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅してＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）の５’−末端より１４０８番目のｃまでのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲは、ＤＮＡの変性を９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングを５５℃で２分間、ポリメラーゼ伸長反応を７２℃で１分間のサイクルを３０回行った。これにより、遺伝子上流の余分な部分を取り除くと共に、ＮｃｏＩ認識部位を導入することができる。ＮｃｏＩ認識部位を導入すると、開始コドンのＡＴＧのすぐ後のシトシン（ｃ）がグアニン（ｇ）に置き換わり、アミノ酸配列についてもプロリン（Ｐｒｏ）からアラニン（Ａｌａ）に変わった。
【００４１】
このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｃｏＩ（ニッポンジーン社製）およびＳｐｅＩ（ニッポンジーン社製）で切断して得られたＤＮＡ断片と、ＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）およびＳｐｅＩ（ニッポンジーン社製）で切断した鋳型として用いたＤＮＡ断片とを、ＮｃｏＩ（ニッポンジーン社製）およびＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断したｐＥＴ２３ｄベクター（Novagen 社製）にライゲーションすることにより、完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）をコードするＤＮＡフラグメントを含む組み換えＤＮＡを作製し、これをｐＤＳＲＳと名づけた。
【００４２】
（４）組み換えプラスミドｐＤＳＲＴ５の調製
前記（１）で得たロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子をpBluescript SK+（Stratagene社製）に結合したＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１３および１４記載の１対のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅してＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲは、ＤＮＡの変性を９４℃で１分間、プライマーとのアニーリングを５５℃で２分間、ポリメラーゼ伸長反応を７２℃で１分間のサイクルを３０回行った。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｃｏＩ（ニッポンジーン社製）およびＰｓｔＩ（ニッポンジーン社製）で切断し、ＮｃｏＩ−ＰｓｔＩフラグメントを作製した。
同様に、前記（１）で得たロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株の完全なＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子をpBluescript SK+（Stratagene社製）に結合したＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１５および１６のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅してＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲは、上記と同様に行った。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｐｈＩ（ニッポンジーン社製）およびＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断し、ＳｐｈＩ−ＸｈｏＩフラグメントを作製した。
【００４３】
こうして得たＮｃｏＩ−ＰｓｔＩフラグメント、ＳｐｈＩ−ＸｈｏＩフラグメントおよび前記（１）で得たプラスミドpBluescript SK+（Stratagene社製）に組み込まれたＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）遺伝子を、制限酵素ＰｓｔＩ（ニッポンジーン社製）およびＳｐｈＩ（ニッポンジーン社製）で切断した。これらのフラグメントを、制限酵素ＮｃｏＩ（ニッポンジーン社製）とＸｈｏＩ（ニッポンジーン社製）で切断したｐＥＴ２３ｄベクター（Novagen社製）にライゲーション処理することにより、組み換えＤＮＡであるｐＤＳＲＴを作製した。
【００４４】
続いて、ｐＤＳＲＴを鋳型として、配列表の配列番号１０記載のプライマーとＭｕｔａｎｔ−ｓｕｐｅｒ ｋｍキット（タカラ酒造社製）を用い、欠損している５塩基（ｃａｇａｔ）を補完する変異を入れたＤＮＡ断片を作製した。
次に、該変異部分を含む部位を制限酵素ＳｐｈＩ（ニッポンジーン社製）およびＡｆｌＩＩ（ニッポンジーン社製）で切断し、０．３４７ｋｂのＳｐｈＩ−ＡｆｌＩＩ断片を作製した。これを、ｐＤＳＲＴの相当する部分である、配列表の配列番号１９記載の塩基配列の３００３番目のグアニン（ｇ）から３０５４番目のグアニン（ｇ）と交換し、これを５塩基（ｃａｇａｔ）の補完された組み換えＤＮＡであるｐＤＳＲＴ５とした。
【００４５】
（５）ＤＳ活性中心部位（サイト１）の交換導入
次に、こうして得たｐＤＳＲＳとｐＤＳＲＴ５について、ＤＳの活性中心の１つであるサイト１の交換導入を行った。
サイト１の交換を行うにあたり、ｐＤＳＲＳについては、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＫｐｎＩ認識部位を導入するために、１０１７番目のシトシン（ｃ）をグアニン（ｇ）に、１０２０番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に、１０２１番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）にする変異を導入した。
同様に、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＢｓｔＸＩ認識部位を導入するため、１５３３番目のシトシン（ｃ）をチミン（ｔ）に、１５３６番目のチミン（ｔ）をグアニン（ｇ）にする変異を導入した。
ｐＤＳＲＴ５については、すでに存在するＫｐｎＩ認識部位およびＢｓｔＸＩ認識部位を利用した。
【００４６】
ｐＤＳＲＳおよびｐＤＳＲＴ５について、それぞれ制限酵素ＫｐｎＩ（ニッポンジーン社製）およびＢｓｔＸＩ（ニッポンジーン社製）で切断した。切断後、生成した約５００ｂｐ断片とベクターＤＮＡを含む約７．５ｂｐ断片をそれぞれ抽出した後、常法により精製した。
ｐＤＳＲＴ５由来の５００ｂｐ断片をｐＤＳＲＳ由来の７．５ｂｐ断片にライゲーションすることにより作製した改変ｐＤＳＲＳをｐＳ１と名づけた。また、ｐＤＳＲＳ由来の５００ｂｐ断片をｐＤＳＲＴ５由来の７．５ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＴ５をｐＴ１と名づけた。
【００４７】
（６）ＤＳの酵素タンパクの発現
上記（５）で作製したｐＳ１とｐＴ１を、それぞれコンピテントセルとした大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen 社製）に取り込ませ、形質転換体である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を作製した。これをアンピシリン２００μｇ／ｍｌを含むLuria-Bertani平板培地で３７℃で９時間から一晩培養し、これをアンピシリン２００μｇ／ｍｌを含むLuria-Bertani培地３ｍｌを用いて３７℃で一晩振盪培養した。培養後、同培地１５０ｍｌに１：６０となるように培養後の培地を加えたのち、３７℃で２時間振盪培養した。
【００４８】
いったん培養を止め、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略記することがある。）（ワコー社製）を０．５ｍＭとなるように加え、さらに３０℃で８時間培養を続け、タンパクの生産誘導を行った。培養終了後、培養物を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）することにより菌体を沈殿として回収した。続いて、回収した菌体を３０％グリセリンを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）に懸濁し、超音波によって細胞破砕をした。細胞破砕後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）を行い、上清を回収し、これを粗酵素液とした。
なお、それぞれの粗酵素液に含まれている酵素タンパクについて、ｐＳ１から得られたものをＳ１、ｐＴ１から得られたものをＴ１とそれぞれ名づけた。
【００４９】
実施例２（サイト２の交換）
配列表の配列番号１１記載のロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）アミノ酸配列の６６８番目のリシン（Ｌｙｓ）から７４０番目のグリシン（Ｇｌｙ）と配列表の配列番号１２記載の同菌株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）アミノ酸配列の６９６番目のリシン（Ｌｙｓ）から７６８番目のグリシン（Ｇｌｙ）のムタン結合部位を含む領域をそれぞれサイト２と名づけ、これを交換導入することによって、改変していないＤＳ遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡを作製した。
【００５０】
実施例１で作製したｐＤＳＲＳとｐＤＳＲＴ５について、ＤＳの活性中心の１つであるサイト２の交換導入を行った。サイト２の交換導入以外は、すべて実施例１と同様に行った。
サイト２の交換を行うにあたり、ｐＤＳＲＳについては、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＤｒａＩ認識部位を導入するために、２０８５番目のシトシン（ｃ）をチミン（ｔ）にする変異を導入した。また、ＢａｌＩ認識部位については、すでに存在するものを利用した。
同様に、ｐＤＳＲＴ５については、配列表の配列番号１９記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＢａｌＩ認識部位を導入するため、２２１７番目のシトシン（ｃ）をチミン（ｔ）に、２２２０番目のグアニン（ｇ）をシトシン（ｃ）にする変異を導入した。
【００５１】
ｐＤＳＲＳおよびｐＤＳＲＴ５について、それぞれ制限酵素ＤｒａＩ（ニッポンジーン社製）およびＢａｌＩ（ニッポンジーン社製）で切断した。切断後、生成した約２００ｂｐ断片とベクターＤＮＡを含む約７．８ｂｐ断片をそれぞれ抽出した後、常法により精製した。
ｐＤＳＲＴ５由来の２００ｂｐ断片をｐＤＳＲＳ由来の７．８ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＳをｐＳ２と名づけた。また、ｐＤＳＲＳ由来の２００ｂｐ断片をｐＤＳＲＴ５由来の７．８ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＴ５をｐＴ２と名づけた。
実施例１と同様に、改変されたＤＳの酵素タンパクの発現を行い、サイト２を交換導入した粗酵素液を得た。なお、それぞれの粗酵素液に含まれている酵素タンパクについて、ｐＳ２から得られたものをＳ２、ｐＴ２から得られたものをＴ２とそれぞれ名づけた。
【００５２】
実施例３（サイト３の交換）
本実施例においては、配列表の配列番号１１記載のロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２Ｆ株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：ＡＢ０２００２０）アミノ酸配列の９０２番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から１１１８番目のリシン（Ｌｙｓ）と配列表の配列番号１２記載の同菌株のＤＳ（ＤＤＢＪアクセッション・ナンバー：Ｕ８１３７４）アミノ酸配列の９１５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から１１３１番目のリシン（Ｌｙｓ）の２つのデキストラン結合リシン部位を含む領域をそれぞれサイト３と名づけ、これを交換導入した。
【００５３】
実施例１で作製したｐＤＳＲＳとｐＤＳＲＴ５について、ＤＳの活性中心の１つであるサイト３の交換導入を行った。サイト３の交換導入以外は、すべて実施例１と同様に行った。
サイト３の交換を行うにあたり、ｐＤＳＲＳについては、配列表の配列番号７記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＮｓｐＶ認識部位を導入するために、２７４８番目のアデニン（ａ）をグアニン（ｇ）にする変異を導入した。また、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＡｆｌＩＩ認識部位を導入するために、３３８８番目のチミン（ｔ）をシトシン（ｃ）に、３３９０番目のグアニン（ｇ）をチミン（ｔ）に、３３９３番目のアデニン（ａ）をグアニン（ｇ）にする変異を導入した。
同様に、ｐＤＳＲＴ５については、配列表の配列番号１９記載の塩基配列において、コードするアミノ酸を変異させることなく制限酵素ＮｓｐＶ認識部位を導入するため、２７０９番目のアデニン（ａ）をグアニン（ｇ）にする変異を導入した。制限酵素ＡｆｌＩＩ認識部位については、すでに存在する部位を用いた。
【００５４】
ｐＤＳＲＳおよびｐＤＳＲＴ５について、それぞれ制限酵素ＮｓｐＶ（Stratagene社製）およびＡｆｌＩＩ（Stratagene社製）で切断した。切断後、生成した約６００ｂｐ断片とベクターＤＮＡを含む約７．４ｂｐ断片をそれぞれ抽出した後、常法により精製した。
ｐＤＳＲＴ５由来の６００ｂｐ断片をｐＤＳＲＳ由来の７．４ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＳをｐＳ３と名づけた。また、ｐＤＳＲＳ由来の６００ｂｐ断片をｐＤＳＲＴ５由来の７．４ｂｐ断片にライゲーションすることによって作製した改変ｐＤＳＲＴ５をｐＴ３と名づけた。
実施例１と同様に、改変ＤＳの酵素タンパクの発現を行い、サイト３を交換導入した粗酵素液を得た。なお、それぞれの粗酵素液に含まれている酵素タンパクについて、ｐＳ３から得られたものをＳ３、ｐＴ３から得られたものをＴ３とそれぞれ名づけた。
【００５５】
実施例４
実施例１〜３で調製した粗酵素液について、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記することがある。）およびウエスタンブロット分析を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Laemmliの方法（Laemmli, U. K., Nature, 227, 680-685）に従って行った。すなわち、電気泳動装置としてはミニスラブゲル電気泳動槽（アトー社製）を使用し、７．５％アクリルアミドゲル（ワコー社製）および０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス−グリシン緩衝液を用いて２０ｍＡで２時間電気泳動を行った。分子量マーカーとして、HMW Calibration kit for SDS Electrophoresis（Pharmacia社製）を用いた。
電気泳動終了後、ゲルをクマシー ブリリアントブルー（以下、ＣＢＢと略記することがある。）（Fluka社製）でタンパク質の泳動パターンを染色した。
【００５６】
また、ウエスタンブロット分析は、Towbinらの方法 (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354(1979))に従って行った。すなわち、電気泳動装置としてはミニスラブゲル電気泳動槽（アトー社製）を使用し、７．５％ゲル（ワコー社製）および０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス−グリシン緩衝液を用いて２０ｍＡで２時間電気泳動を行った。電気泳動終了後、同じ緩衝液を満たしたブロッティング装置（日本エイドー社製）にセットしブロッティングを行い、電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にトランスファーさせた。ブロッティングは室温で２．５ｍＡ／ｃｍ2で２０分間で行った。なお、ＰＶＤＦ膜は、あらかじめメタノールに数秒浸漬した後、２５ｍＭトリス，２０％メタノール，４０ｍＭ６−アミノカプロン酸（ｐＨ９．４）に浸漬した。
【００５７】
ブロッティング終了後、ＰＶＤＦ膜は、１％スキムミルクを含む２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）２０ｍｌに一晩浸漬した。次に、第１抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）を、０．５％スキムミルクを含む２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に１／１０００（ｖ／ｖ）となるように加え、これにＰＶＤＦ膜を１時間３０分浸漬した。続いて、スキムミルクを含まない２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）２０ｍｌで５分間洗浄し、これを４回繰り返した。
洗浄後、第２抗体をスキムミルクを含まない２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に１／３０００（ｖ／ｖ）となるように加え、これにＰＶＤＦ膜を１時間浸漬した。浸漬後、スキムミルクを含まない２０ｍＭトリス−塩酸，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）２０ｍｌで５分間洗浄し、これを３回繰り返した。
【００５８】
なお、第１抗体としてはマウス抗グルコシルトランスフェラーゼ（日本大学（千葉県松戸市）の福島教授より供与）、第２抗体としてはペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（（γ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ−マウスＩｇＧ (ＢＲＬ社製））を用いた。
抗体と反応させたＰＶＤＦ膜は、生乾きした後、ECL Western blotting detection reagent（Amersham Pharmacia biotech社製）を用いて、hyperfilm （Amersham LIFE SCIENCE 社製）に感光した。
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後のタンパク質の泳動パターンを染色したものである。また、図２は、ウエスタンブロット分析の結果を示したものである。
【００５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、ｐＳ１から生産されたタンパクＳ１はｐＤＳＲＳより生産されたＤＳＲＳタンパクと、ｐＴ１から生産されたタンパクＴ１はｐＤＳＲＴ５より生産されたＤＳＲＴ５タンパクと分子量が同じであることが明らかとなった。Ｓ１の分子量は２００ｋＤａ、Ｔ１の分子量は２１０ｋＤａであった。
また、ｐＳ２から生産されたタンパクＳ２、ｐＳ３から生産されたタンパクＳ３、ｐＴ２から生産されたタンパクＴ２およびｐＴ３から生産されたタンパクＴ３についても、上記したＳ１とＴ１の場合と同様の結果であった。Ｓ２の分子量は２００ｋＤａ、Ｓ３の分子量は２００ｋＤａ、Ｔ２の分子量は２１０ｋＤａ、Ｔ３の分子量は２１０ｋＤａであった。
一方、ウエスタンブロット分析においても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と同様の傾向を示し、図中の矢印の位置にバンドが認められた。
【００６０】
実施例５
実施例１〜３で調製した粗酵素液２０ｍｌを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）１０００ｍｌ中で一晩透析し、これを精製ＤＳとした。
この精製ＤＳ１５０μｌを、１２．５％スクロースを含む２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液１００μｌに添加し、３０℃で２０分〜１時間反応を行った。反応終了後、スクロースの分解によって生じる還元糖の増加をネルソン・ソモギー法（M. Somogyi, J. Biol. Chem., 160(1945)69-73)で測定し、これをスクロース分解活性とした。結果を第１表に示す。表中、ＤＳＲＳはｐＤＳＲＳから生産されたタンパク、ＤＳＲＴ５はｐＤＳＲＴ５から生産されたタンパクを、それぞれ表している。ＤＳ酵素１ユニット（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相当する還元糖を生産する酵素量である。
【００６１】
【表１】
第１表
第１表から明らかなように、発現させたすべての酵素タンパクについて、スクロース分解活性があることが明らかとなった。このうち、Ｓ１、Ｓ２およびＴ２については、ＤＳＲＳまたはＤＳＴＲ５とそれぞれ同等の活性を保持していた。しかし、Ｓ３についてはＤＳＲＳの２６％、Ｔ１についてはＤＳＲＴ５の１５％、Ｔ３についてはＤＳＴＲ５の４％程度に、活性が低下していることが明らかとなった。
【００６３】
実施例６
実施例５で透析を行い精製した各種ＤＳ０．０５〜０．３Ｕを、１０％スクロースを含む２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）緩衝液１００ｍＬ中で３０℃の恒温器でゆるく振盪させながら８時間反応を行った。
上記によって生成したグルカン（デキストラン）を５０％エタノールで沈殿させた後、これを遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分間）して回収した。次いで、この沈殿を蒸留水５０ｍｌに溶解し、さらに５０％エタノール沈殿を３回繰り返した。最後のグルカン水溶液を蒸留水２０ｍｌに対して一晩透析した。
透析終了後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、上清と沈殿に分けた。すなわち、上清を水溶性画分として、沈殿を非水溶性画分として、それぞれ凍結乾燥して重量を測定し、各ＤＳを作用させることによって得られたグルカンについて、水溶性画分と非水溶性画分の存在比率を算出した。結果を第２表に示す。
【００６４】
【表２】
第２表
第２表から明らかなように、ＤＳＲＳを作用させたグルカンまたはＤＳＲＴ５を作用させたグルカンと比較して、Ｓ１を作用させたグルカンおよびＴ１を作用させたグルカンともに水溶性画分が増えることが明らかとなった。
また、Ｓ２を作用させたグルカンは非水溶性画分が増加し、Ｔ２を作用させたグルカンは水溶性画分が増加していることが明らかとなった。
さらに、ＤＳＲＳを作用させたグルカンが主に水溶性グルカンであるのに対し、Ｓ３を作用させたグルカンは非水溶性画分が増加していることが明らかとなった。また、ＤＳＲＴ５を作用させたグルカンが主に非水溶性グルカンであるのに対し、Ｔ３を作用させたグルカンは主に水溶性グルカンであることが明らかとなった。
したがって、本発明のようにＤＳの活性中心部位を交換導入することによって、生産されるグルカンの性質を変化させることが可能であることが示された。
【００６６】
実施例７
実施例６で調製した各種グルカンについて、化学構造をメチル化分析法（W. S. York et al., Methods Enzymol., 118(1985)3-40）により、グルカンの結合様式の比率について分析した。
常法により凍結乾燥したグルカン１００〜１５０μｇを脱水ＤＭＳＯ（ワコー社製）０．５ｍｌに溶解した。グルカン溶解液にＮ2充填した後、７０℃で１時間インキュベートし、一晩攪拌した。次に、１５０μｍｏｌ Ｋ+ＤＭＳＯ-（水素化カリウムはアルドリッチ社製、ＤＭＳＯはワコー社製）を１００μｌ加え、２時間室温で攪拌した後、氷中で冷却し、１．５μｍｏｌ ＭｅＩ（関東化学）を１００μｌを加え、室温で一晩攪拌し、メチル化反応を行った。
蒸留水を０．５ｍｌ加えて反応をとめ、Ｎ2をバブリングすることにより、ＣＨ3Ｉを除去した。これを蒸留水１０００ｍｌに対して一晩透析し、常法に従って凍結乾燥した。
【００６７】
凍結乾燥したものに、２Ｍトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記することがある。）（ワコー社製）２５０μｌを加え、１２１℃で１時間加温した。加温終了後、直ちに冷却し、イソプロピルアルコール（ワコー社製）２５０μｌを加え、室温でエバポレートしてＴＦＡを除去すると共に、乾固した。
次に、５０％メタノール（ワコー社製）１００μｌを加え、１．５Ｍ ＮＨ4ＯＨ（ワコー社製）に１０ｍｇ／ｍｌ ＮａＢＤ4（シグマ化学社製）を溶解した溶解液を２００μｌ加え、室温で１時間放置した。
放置後、酢酸（ワコー社製）５０μｌを加え、さらに酢酸：メタノール（１：９）２００μｌを加え、混和した後に室温でエバポレートし、この操作を３回繰り返した。続いて、メタノール（ワコー社製）２００μｌを加え、室温でエバポレートし、この操作を３回繰り返した。これに、無水酢酸（ワコー社製）５０μｌを加えて１２１℃で３時間反応させた後、直ちに冷却した。冷却後、蒸留水５００μｌを加え、固体Ｎａ2ＣＯ3（ワコー社製）を泡が出なくなるまで加えた。
【００６８】
続いて、ＣＨ2Ｃｌ2（ワコー社製）５００μｌを加えて混和した後に生じた有機層を別の試験管へ移し、室温でエバポレートした。これをアセトン５００μｌに溶解し、再度室温でエバポレートした。エバポレート後、アセトン２０μｌに溶解したもののうち、１μｌを試料としてガスクロマトグラフィー（島津製作所製、ＧＣ−１４Ａ）を用いて分析した。このとき、分析用カラムとしてカラムＳＰ−２３３０（内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２μｍ）（スペルコ社製）を用い、カラム温度１７０℃で分離し、クロマトパック（島津製作所製、Ｃ−Ｒ１２６Ａ）で検出した。
また、ガスクロマトグラフィー質量分析（以下、ＧＣ／ＭＳと略記することがある。）についても、上記の試料１μｌを用いて行い、それぞれのピークに由来する物質について同定した。ＧＣ／ＭＳには、ＨＰ６８９０シリーズ ＧＣシステム、Benchtop Quadrupole Mass Spectrometer JEOL Automass SystemII（いずれもヒューレットパッカード社製）およびカラムＳＰ−２３３０（スペルコ社製）を用いた。
【００６９】
グルカンの結合様式の構成比率（％）についての結果を、第３表に示す。表中、T-Glcpは末端のグルコース残基、3-Glcpはα−１→３直鎖結合、4-Glcpはα−１→４直鎖結合、6-Glcpはα−１→６直鎖結合、3,6-Glcpはα−１→３，６分岐結合、4,6-Glcpはα−１→４，６分岐結合を表している。また、たとえばＳ−Ｓ１はＳ１を作用させることによって得られる水溶性画分に含まれるグルカン、Ｉ−Ｓ１はＳ１を作用させることによって得られる非水溶性画分に含まれるグルカンという意味である。
【００７０】
【表３】
第３表
S-：水溶性画分
I-：非水溶性画分
【００７１】
この結果、Ｓ１グルカンの主成分である水溶性画分に含まれるＳ−Ｓ１グルカンは、ＤＳＲＳを作用させることによって得られるＤＳＲＳグルカンよりもα−１→６直鎖結合が増加する一方で、分岐結合が減少していることが明らかとなった。
また、Ｔ１グルカンの主成分である非水溶性画分Ｉ−Ｔ１グルカンは、ＤＳＲＴ５グルカンやＤＳＲＳグルカンとは全く異なり、ほとんどがα−１→４直鎖結合となり、α−１→３結合およびα−１→３，６分岐結合が減少していることが明らかとなった。
【００７２】
Ｓ２グルカンは、ＤＳＲＳグルカンよりもα−１→６直鎖結合がやや減少する一方で、α−１→４，６分岐結合が増加していることが明らかとなった。
また、Ｔ２グルカンは、ＤＳＲＴ５グルカンよりもα−１→６直鎖結合がやや減少するが、α−１→４直鎖結合がやや増加していることが明らかとなった。
Ｓ３グルカンは、α−１→６直鎖結合が減少するが、α−１→３直鎖結合が増加していることが明らかとなった。また、Ｔ３グルカンは、水溶性画分および非水溶性画分について、α−１→６直鎖結合およびα−１→３直鎖結合が減少するが、α−１→４直鎖結合が増加していることが明らかとなった。
【００７３】
以上のことから、改変ＤＳであるＳ１を作用させることによって得られるグルカンは、酵素活性中心部位の改変を行っていないＤＳＲＳやＤＳＲＴ５を作用させることによって得られる従来のグルカンとは糖の結合様式の割合が異なっているため、生産されるグルカンの構造自体も異なるものであることが明らかとなった。このＳ１グルカンは、従来のグルカンよりも水溶性が高いため、代用血漿やサイクロデキストラン等の製造に適したデキストランを安定的に生産できると考えられる。
さらに、改変ＤＳであるＴ１は、ほぼアミロースに近い構造のグルカンを生産することから、植物体からアミロースを調製するよりも純度の高いα−１→４直鎖結合のグルカンを、スクロースから１段階の反応で生産するのに有効であると考えられる。
【００７４】
改変ＤＳであるＳ２またはＴ２が生産するグルカンは、ＤＳＲＳやＤＳＲＴ５が生産するグルカンと比較して、糖の結合様式の割合がわずかに異なるため、グルカンの構造においてもわずかな変化が起こっているものと考えられる。
また、改変ＤＳであるＳ３およびＴ３は、ＤＳＲＳやＤＳＲＴ５が生産するグルカンと比べて、糖の結合様式の割合が異なった、かなり構造の異なるグルカンを生産することが明らかとなった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明によれば、ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼ（ＤＳ）のムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位またはデキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のＤＳのムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位およびデキストラン結合リシン部位のうち対応する部位と交換して作製した改変ＤＳと、この改変ＤＳをコードする遺伝子を挿入したベクター、該ベクターにより形質転換された遺伝子組み換え体が提供される。
さらに、改変ＤＳを基質に作用させることによって、糖の結合様式の割合が変化し、構造が改変されたグルカンを安定的に製造する方法が提供される。
また、改変ＤＳを作製する際に交換導入する部位をムタン結合部位、スクロース・デキストラン結合リシン部位およびデキストラン結合リシン部位の中から選択することにより、酵素反応生産物の構造や性質を大きく変化させることが可能で、様々な用途への応用が期待される。
【００７６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例４におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後のタンパク質の泳動パターンを示したものである。
【図２】 実施例４におけるウエスタンブロット分析の結果である。
Claims (7)
- ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのスクロース・デキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのスクロース・デキストラン結合リシン部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼ。
- ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのムタン結合部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのムタン結合部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼ。
- ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのデキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのデキストラン結合リシン部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼ。
- 請求項１〜３のいずれかの改変デキストランスクラーゼをコードする遺伝子を挿入したベクター。
- 請求項４のベクターで形質転換された遺伝子組み換え体。
- 請求項１〜３のいずれかの改変デキストランスクラーゼを基質に作用させることを特徴とするグルカンの製造法。
- 請求項５記載の遺伝子組み換え体が生産する改変デキストランスクラーゼを基質に作用させることを特徴とするグルカンの製造法。
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