JP3198842B2 - ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はスルフォロバス・アシド
カルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａ
ｌｄａｒｉｕｓ）由来のゲラニルゲラニル二リン酸合成
酵素活性物質を生産するためのＤＮＡ配列、そのＤＮＡ
配列による形質転換体ならびにその形質転換体を用いる
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性物質およびゲラ
ニルゲラニル二リン酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ゲラニルゲラニル二リン酸（以下、「Ｇ
ＧＤＰ」と略記することもある）は４つの二重結合を持
ち、８通りの幾何異性体がある。一方、ＧＧＤＰは生体
内でイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸の
縮合により生じ、カロチノイド、ジテルペン、ゴム等の
イソプレノイドの重要な生合成中間体である。その合成
酵素は細菌、植物、カビ、藻類に存在することが知られ
ている。遺伝子工学的手法を用いてＧＧＤＰ合成酵素の
遺伝子を適当な宿主に導入すればイソプレノイドの増産
が期待でき、また、ＧＧＤＰ合成酵素が遺伝子組換え法
により安価に供給できればＧＧＤＰ生産に利用できる。

【０００３】このような観点から細菌由来のＧＧＤＰ合
成酵素をコードする遺伝子およびその操作の研究、なら
びにその合成酵素の生産も試みられているが、２種由来
のものが知られているにすぎない。（光合成細菌ロドシ
ュードモナス・カプスラタＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｃａｐｕｓｕｌａｔａ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１５４，５８０−５９０ページ（１９８３）、植物
病原菌エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕ
ｒｅｄｏｖｏｒａ）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７
２，６７０４−６７１２ページ（１９９０））。これら
の生物由来ＧＧＤＰ合成酵素は不安定であり、たとえば
エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄ
ｏｖｏｒａ）由来の酵素は５５℃で速やかに失活してし
まう。（表３）

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＧＧＤＰ合成酵素をＧ
ＧＤＰの実用的な生産に利用するには、前記のような既
知遺伝子由来の酵素では不十分であり、さらに特に熱安
定性を有するＧＧＤＰ合成酵素を提供することが必要で
あろう。従って、本発明の目的は熱安定性ＧＧＤＰ合成
酵素をコードするＤＮＡを提供し、そのＤＮＡを使用す
る熱安定性ＧＧＤＰ合成酵素生産系を提供し、さらに本
来ＧＧＤＰを生産しない微生物（例えば大腸菌）をＧＧ
ＤＰを生産するように改質することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決すべく、高度好熱好酸性古細菌として知られている
スルフォロバス・アシドカルダリウス由来のＤＮＡから
ＧＧＤＰ合成酵素も産生することを見いだし、さらに対
応する遺伝子を遺伝子工学的手法で発現することに成功
し本発明を完成した。

【０００６】従って、前記課題は、本発明により提供す
るスルフォロバス・アシドカルダリウス由来のＧＧＤＰ
合成酵素をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを組み込んだ
組換えベクター、その組換えベクターによって遺伝子導
入した組換え微生物細胞およびその使用によって解決で
きる。

【０００７】

【発明の具体的な態様】本発明にいうＧＧＤＰ合成酵素
をコードするＤＮＡとは、それを適当な発現ベクターに
組み込んだとき、その合成酵素の遺伝子が発現できる単
位のＤＮＡ鎖からなり、実質的に同等の酵素活性物質を
コードするものをすべて包含する概念で用いている。そ
れらの具体的なものとしては、配列表の配列番号１で示
されるアミノ酸配列をコードするすべてのＤＮＡ配列を
挙げることができ、このようなアミノ酸配列をコード
し、その発現によって産生されるタンパク質が前記活性
を示す限り追加のアミノ酸を併せて（たとえば融合タン
パク質として）コードするものも含む。このようなＤＮ
Ａ配列の具体的なものとしては、配列表の配列番号１で
示されるようなＤＮＡ配列が挙げられる。

【０００８】本発明の遺伝子の１つの態様は、配列番
号：１のアミノ酸番号１のMet からアミノ酸番号３３０
のLys までのアミノ酸配列をコードするものである。し
かしながら、翻訳開始コドンに対応する１位のMet は発
現後プロセシングにおいては除去される場合があり、ま
た目的酵素を他のペプチドとの融合蛋白質として発現さ
せる場合にも存在しない。従って、本発明の遺伝子の他
の１つの態様は、配列番号：１のアミノ酸番号２のSer
からアミノ酸番号３３０のLys までのアミノ酸配列を含
む蛋白質をコードするものである。

【０００９】この遺伝子における具体例の１つは、配列
番号：１におけるヌクレオチド番号１又は４のＡからヌ
クレオチド番号９９０のＡまでのヌクレオチド配列を含
むものである。一般に、同種又は同属に属する微生物由
来の同種の活性を有する酵素であっても、例えば自然突
然変異、例えばヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠
失によりアミノ酸配列のわずかな相違を伴う酵素が存在
することが知られている。しかしながら、本明細書に詳
細に記載する方法によれば、配列番号：１に記載するア
ミノ酸配列と全く同一ではないアミノ酸配列を有する酵
素をコードする遺伝子であってもクローニングすること
ができる。この様な酵素は、配列番号：１に示すアミノ
酸配列に対して非常に高い相同性、例えば９５％以上、
さらには９８％以上の相同性を有するであろう。従って
本発明は、配列番号：１に示すアミノ配列を有するゲラ
ニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子のみ
ならず、スルフォロバス・アシドカルダリウス種に属す
る微生物に由来し、且つ配列番号：１に示すアミノ酸配
列に対して９５％以上、例えば９８％以上の相同性を有
するアミノ酸配列を有するゲラニルゲラニル二リン酸合
成酵素をコードする遺伝子も本発明に属する。

【００１０】１つの酵素において、いわゆる活性中心又
は活性領域及びそれを立体的に支持する部分以外の部分
においては、必ずしも特定のアミノ酸配列が必須ではな
く、この様な非必須領域においては、本来の酵素活性を
維持しながら，１〜少数のアミノ酸の置換、欠失及び／
又は付加等の修飾を行うことができることが知られてい
る。この様な修飾が可能なアミノ酸の数としては、常用
の遺伝子修飾技法、例えば変異原プローブを用いる部位
特定変異誘発により修飾が容易な範囲であり、例えばア
ミノ酸約２０個以上、例えばアミノ酸約１０個以下であ
る。さらに、制限酵素及び／又は連結酵素リガーゼを用
いてアミノ酸配列の置換、欠失及び／又は付加を行うこ
ともできる。

【００１１】従って本発明は、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列に対して、２０個以下、例えば１０個以下のア
ミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されたア
ミノ酸配列を有するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素
をコードする遺伝子に関する。本発明のＤＮＡは、詳細
については後述するようなそれ自体既知の方法によっ
て、各種微生物の寄託機関から入手可能なスルフォロバ
ス・アシドカルダリウスから調製することができ、目的
に応じて各種鎖長のものを提供できる。

【００１２】すなわち、本発明のＤＮＡは、スルフォロ
バス・アシドカルダリウスから染色体ＤＮＡを抽出し、
これを例えば制限酵素により適当な長さに切断し、この
断片をベクターに挿入することによりゲノム性ライブラ
リーを調製し、目的酵素の発現を検出することにより目
的とするＤＮＡを含有するベクターを選択することがで
きる。この具体的な方法は実施例中の例１．ａ）〜ｄ）
に記載する。

【００１３】さらに、本発明の遺伝子は、スルフォロバ
ス・アシドカルダリウスから抽出したｍＲＮＡに対して
合成されたｃＤＮＡを含んで成るライブラリーからクロ
ーニングすることができる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡラ
イブラリーの作製は常法に従って行うことができる。こ
のようなｃＤＮＡライブラリー又は前記のゲノム性ライ
ブラリーのスクリーニング方法としては、前記のごと
く、酵素の発現を検出する方法のほかに、本発明により
開示されるＤＮＡ配列の全部又は一部から設計されたプ
ローブを用いてそれとのハイブリダイゼーションにより
行うこともできる。

【００１４】さらには、本発明によりゲラニルゲラニル
二リン酸合成酵素をコードする特定のヌクレオチド配列
が開示されているから、そのヌクレオチド配列又は、そ
れに所望の修飾を加えたヌクレオチド配列を有するＤＮ
Ａを、化学合成により調製することができる。また、ゲ
ラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードするＤＮＡが
クローニングされているから、そのＤＮＡ又はその一部
分を鋳型として用いることにより、ゲラニルゲラニル二
リン酸合成酵素をコードする修飾されたＤＮＡを常法に
従って、例えば部位特定変異誘発やＰＣＲ法により合成
することもできる。

【００１５】また、本発明は前記ＤＮＡ配列を含んでい
る組換えベクターも提供する。かかる組換えベクターは
前記ＤＮＡ配列が担持するＧＧＤＰ合成酵素遺伝子を発
現調節するための機能を有するＤＮＡ配列も含む。宿主
に大腸菌を用いる場合を例にとれば、ＤＮＡからｍＲＮ
Ａを転写する過程とｍＲＮＡからタンパク質を翻訳する
過程など遺伝子の発現調節機能があることが知られてい
る。ｍＲＮＡの合成を調節するプロモーター配列とし
て、天然に存在する配列（たとえばｌａｃ，ｔｒｐ，ｂ
ｌａ，ｌｐｐ，ＰＬ，ＰＲ，ｔｅｔ，Ｔ３，Ｔ７など）
以外にも、それらの変異体（例えばｌａｃＵＶ５）や天
然にあるプロモーター配列を人工的に融合した（例えば
ｔａｃ，ｔｒｃなど）配列が知られており、本発明にも
使用できる。ｍＲＮＡからタンパク質を合成する能力を
調節する配列として、リボソームバインディングサイト
（ＧＡＧＧおよびその類似配列）配列と開始コドンであ
るＡＴＧまでの距離が重要であることは既知である。ま
た、３′側に転写終了を指令するターミネーター（例え
ば、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２を含むベクターがファルマシア社
から市販されている）が組換え体でのタンパク質合成効
率に影響する事はよく知られている。

【００１６】本発明の組換えベクターを調製するのに使
用できるベクターとしては、市販のものをそのまま用い
るか、または目的に応じて誘導した各種のベクターを挙
げることができる。例えば、ｐＭＢ１由来のレプリコン
を持つｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２７，ｐＫＫ２２３−
３，ｐＫＫ２３３−２，ｐＴｒｃ９９等や、コピー数が
向上するように改変したｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＵ
Ｃ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＨＳＧ２９８，ｐＨＳＧ３
９６等、またｐ１５Ａ由来のレプリコンを持つｐＡＣＹ
Ｃ１７７やｐＡＣＹＣ１８４等、さらにはｐＳＣ１０１
やＣｏｌＥ１やＲ１やＦ因子などに由来するのプラスミ
ドが挙げられる。

【００１７】また、プラスミド以外にも、λファージや
Ｍ１３ファージのようなウイルスベクターやトランスポ
ゾンによっても遺伝子導入が可能である。これらベクタ
ーについてはＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ
（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ発行）や
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌ
ｓ，Ｂ．Ｅ．Ｅｎｇｅｒ・Ｖａｌｋ，Ｗ．Ｊ．Ｂｒａｍ
ｍａｒ著Ｅｌｓｅｖｉｅｒ発行）や各社カタログに記載
されている。特に、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア社より
販売）は、選択マーカーのアンピシリン耐性遺伝子以外
に、プロモーター及び制御遺伝子としてＰｔｒｃ及びｌ
ａｃＩ^q 、リボソームバインディングサイトとしてＡＧ
ＧＡという配列、ターミネーターとしてｒｒｎＢＴ１Ｔ
２を持ち、ＧＧＤＰ合成酵素遺伝子の発現調節機能を持
つ、好ましいベクターとして挙げられる。

【００１８】これらのベクターへの、ＧＧＤＰ合成酵素
をコードするＤＮＡ断片および必要により前記酵素の遺
伝子を発現調節する機能を有するＤＮＡ断片の組み込み
は、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知方法で行う
ことができ、具体的には後述の方法に従うのが都合よ
い。こうして作製される発明のプラスミドの具体的なも
のとしては、ｐＧＧＰＳ１が挙げられる。

【００１９】このような組換えベクターで遺伝子導入で
きる微生物としてはエシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属などに属する微生物も利用することができる。こ
の形質転換も常法、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
発行）やＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．Ｉ〜III
（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ発行）な
どに記載された、ＣａＣｌ₂ 法やプロトプラスト法によ
り行うことができる。

【００２０】得られる本発明の形質転換体の代表的なも
のとしては、ｐＧＧＰＳ１／ＤＨ５αが挙げられる。以
上、エシュリヒア・コリーを用いて発現させる場合の発
現方法を具体的に記載したが、本発明によれば、ゲラニ
ルゲラニル二リン酸合成酵素をコードするＤＮＡは、常
法に従って常用の発現ベクターに挿入した後、宿主細
胞、例えば他の細菌を含めての原核性細胞、酵母等の単
細胞性宿主を含めての下等真核性細胞、カイコなどの高
等真核性細胞等を形質転換した後、これらの宿主細胞を
培養することにより、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵
素を製造することができる。

【００２１】これらの形質転換体または組換え微生物細
胞は、通常大腸菌の培養に用いられる培地で培養する
と、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ）合成酵素を
菌体内に蓄積する。菌体からのＧＧＤＰ合成酵素の採取
は、菌体を物理的または適当な細胞溶解性酵素の存在す
る環境下で処理して溶菌した後、細胞破砕物を除去し、
次いで、酵素の一般的な単離精製方法によって行うこと
ができる。細胞溶解性酵素としてはリゾチームを用いる
ことが好ましく、また物理的処理には超音波を用いるこ
とが好ましい。また５５℃程度の熱処理をすることによ
り、多くの大腸菌由来のタンパク質は不溶性の沈殿とし
て除去できる。酵素の単離精製には、ゲル濾過・イオン
交換、疎水性・逆相・アフィニティーなどの各種クロマ
トグラフィー処理や限外濾過法などを単独または組み合
わせて行えばよい。単離・精製工程を通じて、目的とす
る酵素の安定化を図るための安定剤として、たとえば、
β−メルカプトエタノールやジチオトレイトールなどの
還元剤、ＰＭＳＦやＢＳＡなどのプロテアーゼへの保護
剤、マグネシウムなどの金属イオンを処理液に共存させ
てもよい。

【００２２】前記ＧＧＤＰ合成酵素活性は、たとえば次
のように測定できるので、その酵素の単離・精製は、後
述の実施例１のｅ）で使用するアッセイ用反応液を用い
て、その酵素活性を確認しながら進めることが推奨でき
る。本発明はまた、ゲラニルゲラニル二リン酸の製造方
法も提供する。ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコ
ードするＤＮＡにより形質転換された宿主が、ゲラニル
ゲラニル二リン酸生合成経路における他の酵素をコード
するＤＮＡをも含有する場合には、前記形質転換体を培
養することにより、ゲラニルゲラニル二リン酸が合成さ
れる。従って、この生成されたゲラニルゲラニル二リン
酸を採取することができる。

【００２３】あるいは、本発明によればまた、前記形質
転換体を培養することによりゲラニルゲラニル二リン酸
合成酵素を発現させた後、単離されたこの酵素、又は酵
素含有物、例えば部分精製された酵素標品、酵素含有菌
体等をゲラニルゲラニル二リン酸合成のための基質、す
なわちイソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン
酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸のいずれ
かに作用させることによりゲラニルゲラニル二リン酸を
合成し、これを採取することもできる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明のＤＮＡ配列、プラスミド、形
質転換体の調製法の１例を記載するが、本発明の範囲は
これに限定されるものではない。例１ ．実験法は主として前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃ
ｌｏｎｉｎｇとＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇと宝酒造のカタ
ログに従った。酵素は主に宝酒造から購入した物を用い
た。逆層ＬＫＣ−１８薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）は、ワットマン株式会社から購入した物を、Ｋｉｅ
ｓｅｌｇｅｌ ６０薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
は、メルク社から購入した物を用いた。用いたスルフォ
ロバス・アシドカルダリウスはアメリカン タイプ カ
ルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）
に登録されている公知の菌株である。本研究にはＡＴＣ
Ｃ３３９０９株をもちいた。

【００２５】ａ）スルフォロバス・アシドカルダリウス
の染色体ＤＮＡの調製 ＡＴＣＣ３３９０９株をＡＴＣＣカタログに記載された
１７２３の培地で７０℃で培養した。染色体ＤＮＡはＷ
ｉｌｅｙ ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社発行のＣｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って調製した。

【００２６】ｂ）スルフォロバス・アシドカルダリウス
の遺伝子ライブラリーの作製 染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分限定分解し
たものを、０．５％アガロースで電気泳動した。３ｋｂ
ｐから６ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロースを分画
し、そこからＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ２．７μｇ
と脱リン酸化したプラスミドｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩ
分解物１．４μｇとをＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌
ＤＨ５αを形質転換し、−７０℃に保存した。以上の様
に作製したライブラリーをスクリーニングに用いた。

【００２７】ｃ）プラスミドｐＡＣＹＣ−ＩＢを保持し
た受容菌の作成 既知のエルウイニア・ウルドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕ
ｒｅｄｏｖｏｒａ）のｃｒｔＩ（フィトエン合成酵素
（ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子）とｃ
ｒｔＢ（フィトエン不飽和化酵素（ｐｈｙｔｏｅｎｅ
ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子）とを含むＳｎａＢＩ−
ＨｐａＩ断片２．８ｋｂｐ断片にＥｃｏＲＩリンカーを
結合させた後、制限酵素ＥｃｏＲＩで分解した。さら
に、脱燐酸化したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏ
ＲＩ分解物とＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＤＨ５α
を形質転換した。この組換えプラスミドを保持した受容
菌は、ＣａＣｌ₂ 法により作製した。

【００２８】ｄ）ＧＧＤＰ合成酵素遺伝子のスクリーニ
ング 上記方法ｂ）により構築したスルフォロバス・アシドカ
ルダリウスＤＮＡ由来のプラスミドＤＮＡを含む大腸菌
からアルカリ法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こ
のＤＮＡ１０ナノグラムを上記方法ｃ）により作製した
ｃｒｔＩｃｒｔＢを保持した大腸菌へ形質転換し、５０
μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。

【００２９】約４，０００の形質転換体から赤いコロニ
ーを目視にて検索し、１０個の活性のあるクローンを得
ることができた。その中の１クローンのプラスミドｐＧ
ＧＰＳ１を回収し挿入ＤＮＡに含まれる２．３ｋｂｐの
ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣ１１８にサブクローニング
し、ｃｒｔＩとｃｒｔＢを保持した大腸菌に再度導入し
たところ赤いコロニーが観察された。よってこのＨｉｎ
ｄＩＩＩ断片中にＧＧＤＰ合成酵素遺伝子が存在するこ
とが示されたので、この２．６ｋｂｐ断片のダイデオキ
シターミネーション法による塩基配列の決定を行なっ
た。

【００３０】その結果、この２．３ｋｂｐ断片には図１
で示されるような２個のオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ−１およびＯＲＦ−２）が存在していた。そこ
で下流のＯＲＦ−２を欠失したプラスミドｐＲＶ１１−
１を作成し方法ｅ）による活性の測定を行なった。 ｅ）ＧＧＤＰ合成酵素活性の測定 上記方法ｄ）により得られたプラスミドｐＲＶ１１−１
を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、５０μｇ／mlのアンピ
シリンを含む１００mlのＬＢ培地中で３７℃で一晩培養
した。集菌の後、８mlのＳｏｎｉｃ緩衝液中で超音波に
より細胞を破砕し、５５℃で６０分加熱した後１０，０
００×ｇで１０分間遠心処理を行なった。この上清をＧ
ＧＤＰ合成酵素活性の測定に用いた。

【００３１】１mlのアッセイ用反応液中で５５℃３０分
処理をした後、氷中で冷却し反応を止めた。反応産物
は、水飽和した３mlの１−ブタノールで抽出し、１−ブ
タノール中の放射活性によりＧＧＤＰ合成酵素活性測定
を行なった（表１）。得られたクローンはすべて熱安定
性なＧＧＤＰ合成酵素と予想される遺伝子を有すること
が示された。また、ｐＲＶ１１−１を含むクローンの抽
出物の測定によりＯＲＦ−１がＧＧＤＰ合成酵素遺伝子
であることが示された。（表１）

【００３２】

【表１】

【００３３】ｆ）ＧＧＤＰ合成酵素産物の解析 酵素合成によるポリプレニル二リン酸の酸性フォスファ
ターゼ処理は、Ｆｕｊｉｉらの方法（Ｆｕｊｉｉ ｅｔ
ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ７１２，７１６−７１８）に従った。酸性
フォスファターゼ処理後の加水分解物はペンタン抽出
し、アセトン／水（９／１）溶媒を用いた逆層ＬＫＣ−
１８薄層クロマトグラフィーおよびベンゼン／酢酸エチ
ル（９／１）溶媒を用いたＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０薄
層クロマトグラフィーにより分析した（図２）。組換え
体由来の放射活性のあるアルコールはあきらかにＧＧＤ
Ｐ誘導体の（ａｌｌ−Ｅ）ゲラニルゲラニオールである
ことが示された。

【００３４】よって、スルフォロバス・アシドカルダリ
ウスよりＧＧＤＰ合成酵素のクローニングが確認され
た。 ｇ）クローニングした遺伝子由来のＧＧＤＰ合成酵素の
部分精製 ＧＧＤＰ合成酵素遺伝子を持つ組換え大腸菌の破砕物の
蛋白質溶液に３０〜６０％の飽和硫酸アンモニウムによ
る沈殿を行ない、透析の後、緩衝液Ａで平衡化したＤＥ
ＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（１．０×１６cm）に吸
着させ、緩衝液Ａに０から０．８５Ｍの塩化ナトリウム
を含ませた直線濃度勾配による溶出を行なった。ＧＧＤ
Ｐ合成酵素画分を集め、緩衝液Ａ中で透析した後、緩衝
液Ａで平衡化したＭｏｎｏＱカラム（５×５０cm）に吸
着させ、緩衝液Ａに０から０．８５Ｍの塩化ナトリウム
を加えた直線濃度勾配による溶出を行なった。ＧＧＤＰ
合成酵素画分は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動の後クーマシーブリリアントブルー染色によっ
て解析した。

【００３５】これらの操作で比活性は８．７nmol／min
／mgタンパクになった。

【００３６】ｈ）クローニングした遺伝子由来のＧＧＤ
Ｐ合成酵素の基質特異性 表２で示されるアリル二リン酸を用いてクローニングし
た遺伝子由来のＧＧＤＰ合成酵素の基質特異性を調べ
た。ジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸および
（ａｌｌ−Ｅ）ファルネシル二リン酸が基質となること
がわかった。

【００３７】

【表２】

【００３８】ｉ）スルフォロバス・アシドカルダリウス
由来のＧＧＤＰ合成酵素の熱安定性 クローニングしたスルフォロバス・アシドカルダリウス
遺伝子由来のＧＧＤＰ合成酵素を熱処理してその残存活
性を調べた。６０℃１００分の処理で９５％以上の活性
が残っていた（図３）。 （Ｓｏｎｉｃ緩衝液の組成） ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ １０mM ＥＤＴＡ １mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７）５０mM （アッセイ用反応液（全溶１ml）の組成） １．９２ＧＢｑ／mmol〔１−１４Ｃ〕イソペンテニルピ
ロリン酸 ０．４８μＭ （ａｌｌ−Ｅ）ファルネシルピロリン酸 ２５μＭ ＭｇＣｌ₂ ５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH６．８）２０mM 無細胞抽出液 ０．３mg （緩衝液Ａ） ＥＤＴＡ １mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．７）１０mM

【００３９】

【表３】

【００４０】例２．ＧＧＤＰ合成酵素の製造 前記のプラスミドｐＧＧＰＳ１を鋳型して用い、次のプ
ライマー：ＧＧＰＰ−Ｉ ＢａｍＨＩ（２６mer.５′CG
C GGA TCC ATG AGT TAC TTT GACAA３′）（配列番号：
２） ＧＧＰＰ−Ｔ ＥｃｏＲＩ（２５mer.５′GG GAA TTC T
TA TTT TCT CCT TCT TA ３′）（配列番号：３） を用い、次の反応組成：

【００４１】

【表４】 を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことに
より、ＧＧＤＰ合成酵素をコードする遺伝子を増幅し
た。ＰＣＲ反応は、９０℃ ３０秒間、５０℃ ３０秒
間及び７２℃ １分間のサイクルを３０サイクル行っ
た。反応終了後、−８０℃にてエタノール沈澱を行い、
制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断した後、平滑末端化し、
さらに制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、約１kbp のＧＧＤ
Ｐ合成酵素をコードするＤＮＡ断片を得た。

【００４２】クローニング用発現ベクターとして市販の
プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２（ＮＥＢ社、米国）を用い
た。このプラスミドにおいてはｔａｃプロモーターの下
流にマルトース結合蛋白質（以下ＭＢＰと記載すること
もある）をコードするＤＮＡ断片（遺伝子名：ｍａｌ
Ｅ）が挿入されており、その下流に目的遺伝子（ＤＮ
Ａ）を挿入するためのクローニング部位が存在する。従
って、このクローニング部位に目的とするポリペプチド
をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を挿入して発現させれ
ば、ＭＢＰと目的ポリペプチドとの融合蛋白質が生成
し、これはＭＢＰに対して特異的なアミロースを固定し
たアフィニティー担体を用いるアフィニティークロマト
グラフィーにより一段階で精製することができる。

【００４３】プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２を制限酵素Ｈｉ
ｎｄIII により切断した後、平滑末端化し、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで切断した。次にこれを、前記のＧＧＤＰ合成
酵素をコードするＤＮＡ断片と連結することにより組換
えプラスミドｐＭａｌｃＧＧ１を得た。ライゲーション
及び平滑末端化には宝酒造社のライゲーションキット・
ブランディングキットを用いた。

【００４４】次にこの組換えプラスミドを用いて大腸菌
ＴＯＰＰｃｅｌｌ NO.２（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（受
容菌）を形質転換した。形質転換処理した細胞をＹＴプ
レート培地上で培養したところ６個のコロニーが生じ
た。これらのコロニーを２×ＹＴ培地中で液体培養し、
３７℃にて生育した菌体からプラスミドを調製し、Ｅｃ
ｏＲＶで切断して、その生成物のサイズを調べることに
より、組換プラスミドが正しく構成されていることを確
認した。なお、正しい組換プラスミドはＥｃｏＲＶによ
る切断により、５．１ kbpと２．５ kbpの２個のＤＮＡ
断片を生ずる。

【００４５】プラスミドｐＭａｌｃＧＧ１を用いて大腸
菌ｐＡＣＹＣ−ＩＢ／ＤＨ５α（Ｏｈｎｕｍａら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（２０）：４７
９２−４７９７）を形質転換し形質転換体ｐＭａｌｃＧ
Ｇ１，ｐＡＣＹＣ−ＩＢ／ＤＨ５αを得た。なお、大腸
菌ｐＡＣＹＣ−ＩＢ／ＤＨ５ａは、すでにプラスミドｐ
ＡＣＹＣ−ＩＢを含有しており、このｐＡＣＹＣ−ＩＢ
はゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）（炭素原子
数２０個）を２個連結してフィトエンに転換し、さらに
不飽和化する酵素をコードする遺伝子を含有しており、
且つそれを発現させるプラスミドである。

【００４６】次に、この形質転換体を１００mlのＬＢ培
地中で一夜培養した後、これを１ＬのＬＢ培地に接種
し、培養器中で３７℃にて、３００rpm の撹拌条件下で
培養した。菌体濃度がｋｌｅｔｔ＝３０〜４０に達した
時に１００mM ＩＰＴＧを１０ml添加して発現を誘導し
さらに４時間培養した。対照としてＩＰＴＧ添加直前の
培養液もサンプリングした。培養後、遠心分離により菌
体を集め、超音波により菌体を破砕した。ＩＰＴＧによ
り発現誘導を行った場合、及びＩＰＴＧにより発現誘導
を行わなかった場合の結果を図４にそれぞれＩＰＴＧ
（＋）及びＩＰＴＧ（−）として示す。この結果、約７
０kb付近の融合蛋白質がＩＰＴＧ（＋）画分に多く存在
することが確認された。なお、図４は、試料をＷｉｌｅ
ｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載の方法に従っ
て、Ｂｉｏ Ｒａｄのｍｉｎｉ ｐｒｏｔｅａｎ ｃｅ
ｌｌ装置を用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ｐａｇｅ）を行い、Ｐｒｏｍｅｇａ社の
ｇｅｌ ｄｒｙｉｎｇ ｋｉｔによりクマシーブリリア
ントブルーにより染色した後、ゲルを乾燥したものであ
る。次に、前記破砕物を遠心分離により上清画分と沈澱
画分とに分けた。これらの画分の上記ＳＤＳ−ｐａｇｅ
の結果を図４中、それぞれ「Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎｓｕ
ｐ．」及び「Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｐｐｔ．」として
示す。この結果、約７０kbの融合蛋白質が上清に多く移
行していることがわかった。次に、この上清を６０℃に
て１時間熱処理し、変性して沈澱した蛋白質を遠心分離
により除去した上清を得た。その分析結果を図４中「Ｓ
ｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｐ．（ｈ＋）」として示す。
不純物が除去され、融合蛋白質が濃縮されたことがわか
る。

【００４７】次にアフィニティークロマトグラフィーに
より融合蛋白質の精製を行った。精製は、前記の細胞上
清を０．４５μｍ又は０．２０μｍメンブランフィルタ
ーで濾過した後、濾液を１５mlのアミロースレジンを充
填したカラム（２．５×１０cm）に通し、プラスミドｐ
ＭＡＬ−ｃ２に付属するＮＥＢ社のプロトコールに従っ
て溶出を行った。次に、この溶出液を、ＰＤ−１０カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により脱塩した。こうして約
３．４mgの融合蛋白質を得た。こうして融合蛋白質を
得、さらに６０℃ １時間の熱処理を行った。熱処理前
の融合蛋白質及び熱処理後の融合蛋白質のＳＤＳ−ｐａ
ｇｅの結果を、それぞれ図４において「Ｆｕｓｉｏｎ」
及び「Ｆｕｓｉｏｎ（ｈ＋）」として示す。熱処理によ
り融合蛋白質の変性が生じていないことがわかる。

【００４８】次に、こうして得られた融合蛋白質をファ
クターＸａにより切断し、ＧＧＤＰ合成酵素を遊離せし
めた。これらのＳＤＳ−ｐａｇｅの結果を図４に、融合
蛋白質（未熱処理）を切断したものを「Ｆｕｓｉｏｎ
（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）」とし、切断後さらに６０℃ １
時間熱処理したものを「Ｆｕｓｉｏｎ（ｄｉｇｅｓｔｅ
ｄ）（ｈ＋）」として示す。この結果、ＧＧＤＰ合成酵
素が遊離したことが確認された。

【００４９】さらに、上記の各画分について、ＧＧＤＰ
合成酵素活性をＲＩトレース法により測定した。この測
定は、次の様にして行った。酵素２μｇ、５mM ＭｇＣ
ｌ₂、１０mM ＫＨ₂ ＰＯ₄ ／ＫＯＨ（pH５．８）、２
５μＭ基質（ＧＰＰまたは（ａｌｌ−Ｅ）−ＦＰＰまた
は（２Ｚ，６Ｅ）−ＦＰＰ）、４６３nM [¹⁴Ｃ] −ＩＰ
Ｐ（４Ｃｉ／mole）／１mlの溶液を５５℃で１時間反応
させ、３ml水飽和ブタノールで抽出し、１mlを放射活性
測定し、残りをジャガイモ酸性ホスファターゼ処理後ｎ
−ペンタン抽出してＴＬＣで生成物を分析した。

【００５０】この結果を図５に示す。前記プラスミドｐ
ＭａｌｃＧＧ１を用いて大腸菌ＪＭ１０５を形質転換
し、形質転換体ｐＭａｌｃＧＧ１／ＪＭ１０５を得た。
ＴＹＧＰＮ培地（２０ｇトリプトン、１０ｇ酵母エキ
ス、１０ml ８０％グリセロール、５ｇ Ｎａ₂ ＨＰＯ
₄、１０ｇ ＫＮＯ₃ ／Ｌ）を用い前記のようにして培
養した、４時間培養した（ｋｌｅｔｔ＝３２）後、ＩＰ
ＴＧにより発現の誘導を行い、さらに２６時間培養し
た。前記のごとくＭＢＰ−ＧＧＤＰ合成酵素融合蛋白質
の精製を行い、１Ｌの培地当り２１．８mgの精製融合蛋
白質が得られた。なお、この場合の培地を、ＭＢＰのみ
を発現している菌体（ｐＭＡＬ−ｃ２／ＪＭ１０９）の
培地と比較したところ、ＭＢＰ−ＧＧＤＰ合成酵素融合
蛋白質を生産した培地は明らかに赤〜えんじ色を呈し、
菌体もＭＢＰのみを発現した菌体に比べて赤褐色であっ
た。

【００５１】次に、ＭＢＰ−ＧＧＤＰ合成酵素融合蛋白
質のＧＧＤＰ合成酵素活性を、Ｇｒｉｎｄｅｙ−Ｎｉｃ
ｈｏｌ法（Ｇｒｉｎｄｅｙ ＆ Ｎｉｃｈｏｌ，Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７０，３３，１１４−１１
９）により無機リン酸を測定することにより測定した。
５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂ 、５０mM
ＮＨ₄ Ｃｌ、１０mM ２−メルカプトエタノール、５０
ｎモルＦＰＰ、５０ｎモルＩＰＰ及び被験酵素サンプル
を例えば２００μｇ加え、５５℃にて３時間反応せしめ
た後、０℃に冷却して反応を停止し、トリクロロ酢酸に
て蛋白質を変性除去後、ＮａＯＨで中和し、反応液中の
オルトリン酸とピロリン酸の量を測定することにより酵
素活性を求めた。結果を図６に示す。

【００５２】なお、発現プラスミドｐＭａｌｃＧＧ１中
のＧＧＤＰ合成酵素コード部分の塩基配列を決定したと
ころ、７２０位のヌクレオチドＡがＧに変っており、さ
らに７４０位のＡがＧに変化し、この結果２４７位のア
ミノ酸ＬｙｓがＡｒｇに変化していた。これはＰＣＲ中
に生じたものと推定される。また、発現クローニングプ
ラスミドとして、ｐＭＡＬ−ｃ２の代りにｐＧＥＸ−２
Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、上記と同様の実
験を行った場合、得られた発現プラスミドｐＧｌｕＴＧ
Ｇ１において、８２３位のヌクレオチドＡがＧに変化し
ており、この結果２７５位のＭｅｔがＶａｌに変化して
いた。この結果、２７５位に点変異を有するグルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼＧＧＤＰ合成酵素融合蛋白質
が得られた。このｐＧｌｕＴＧＧ１由来の融合蛋白質
も、ｐＭａｌｃＧＧ１由来のものと同様の酵素活性が見
られた。

【００５３】他方、発現クローニングプラスミドとし
て、ｐＭＡＬ−ｃ２の代りにｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）を用いて同じ実験を行った場合、得られ
た発現プラスミドｐＧｌｕＸＧＧ１においては変異は生
じておらず、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＧＧＤＰ合成酵素
融合蛋白質が得られた。このｐＧｌｕＸＧＧ１由来の融
合蛋白質も、ｐＭａｌｃＧＧ１由来のものと同様の酵素
活性が見られた。

【００５４】例３．ゲラニルゲラニル化合物の生産 前記発現プラスミドｐＭａｌｃＧＧ１，ｐＧｌｕＴＧＧ
１及びｐＧｌｕＸＧＧ１の発現生成物の融合蛋白質、及
び切断（消化生成物）を基質（ｐｒｉｍｅｒ）ゲラニル
二リン酸（ＧＰＰ）、（ａｌｌ−Ｅ）ファルネシル二リ
ン酸（〔ａｌｌ−Ｅ〕−ＦＰＰ）及び（２Ｚ，６Ｅ）フ
ァルネシル二リン酸（〔２Ｚ，６Ｅ〕−ＦＰＰ）に作用
させた場合の生成物を図７に示す。

【００５５】この図において、ＣはｐＧｌｕＴＧＧ１由
来の蛋白質を表わし、ＤはｐＧｌｕＸＧＧ１由来の蛋白
質を表わし、そしてＥはｐＭａｌｃＧＧ１由来の蛋白質
を表わす。また（ｆ）はアフィニティーカラムで精製し
た融合蛋白質を表わし、そして（ｄ）はアフィニティー
精製後、ｐＧｌｕＴＧＧ１についてはトロンビンでｐＧ
ｌｕＸＧＧ１とｐＭａｌｃＧＧ１についてはファクター
でそれぞれ切断（消化）処理した蛋白質溶液を用いて反
応させた反応生成物を表わす。

【００５６】

【発明の効果】本発明によれば、スルフォロバス・アシ
ドカルダリウス由来のＧＧＤＰ合成酵素をコードするＤ
ＮＡ配列が提供される。このようなＤＮＡ配列を発現ベ
クターに組み込み、適当な大腸菌を形質転換した組換え
微生物細胞は、安定な、特に熱安定なゲラニルゲラニル
二リン酸合成活性物質およびゲラニルゲラニル二リン酸
を生産する。

【００５７】この効果は、従来技術文献に未記載のスル
フォロバス・アシドカルダリウス染色体から前記ＤＮＡ
配列を調製することによって得られる。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌ
ｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ） 配列： ATG AGT TAC TTT GAC AAC TAT TTT AAT GAG ATT GTT AAT TCT GTA 45 Met Ser Tyr Phe Asp Asn Tyr Phe Asn Glu Ile Val Asn Ser Val 5 10 15 AAC GAC ATT ATT AAG AGC TAT ATA TCT GGA GAT GTT CCT AAA CTA 90 Asn Asp Ile Ile Lys Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Val Pro Lys Leu 20 25 30 TAT GAA GCC TCA TAT CAT TTG TTT ACA TCT GGA GGT AAG AGG TTA 135 Tyr Glu Ala Ser Tyr His Leu Phe Thr Ser Gly Gly Lys Arg Leu 35 40 45 AGA CCA TTA ATC TTA ACT ATA TCA TCA GAT TTA TTC GGA GGA CAG 180 Arg Pro Leu Ile Leu Thr Ile Ser Ser Asp Leu Phe Gly Gly Gln 50 55 60 AGA GAA AGA GCT TAT TAT GCA GGT GCA GCT ATT GAA GTT CTT CAT 225 Arg Glu Arg Ala Tyr Tyr Ala Gly Ala Ala Ile Glu Val Leu His 65 70 75

【００５９】 ACT TTT ACG CTT GTG CAT GAT GAT ATT ATG GAT CAA GAT AAT ATC 270 Thr Phe Thr Leu Val His Asp Asp Ile Met Asp Gln Asp Asn Ile 80 85 90 AGA AGA GGG TTA CCC ACA GTC CAC GTG AAA TAC GGC TTA CCC TTA 315 Arg Arg Gly Leu Pro Thr Val His Val Lys Tyr Gly Leu Pro Leu 95 100 105 GCA ATA TTA GCT GGG GAT TTA CTA CAT GCA AAG GCT TTT CAG CTC 360 Ala Ile Leu Ala Gly Asp Leu Leu His Ala Lys Ala Phe Gln Leu 110 115 120 TTA ACC CAG GCT CTT AGA GGT TTG CCA AGT GAA ACC ATA ATT AAG 405 Leu Thr Gln Ala Leu Arg Gly Leu Pro Ser Glu Thr Ile Ile Lys 125 130 135 GCT TTC GAT ATT TTC ACT CGT TCA ATA ATA ATT ATA TCC GAA GGA 450 Ala Phe Asp Ile Phe Thr Arg Ser Ile Ile Ile Ile Ser Glu Gly 140 145 150 CAG GCA GTA GAT ATG GAA TTT GAG GAC AGA ATT GAT ATA AAG GAG 495 Gln Ala Val Asp Met Glu Phe Glu Asp Arg Ile Asp Ile Lys Glu 155 160 165 CAG GAA TAC CTT GAC ATG ATC TCA CGT AAG ACA GCT GCA TTA TTC 540 Gln Glu Tyr Leu Asp Met Ile Ser Arg Lys Thr Ala Ala Leu Phe 170 175 180 TCG GCA TCC TCA AGT ATA GGC GCA CTT ATT GCT GGT GCT AAT GAT 585 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Gly Ala Leu Ile Ala Gly Ala Asn Asp 185 190 195 AAT GAT GTA AGA CTG ATG TCT GAT TTC GGT ACG AAT CTA GGT ATT 630 Asn Asp Val Arg Leu Met Ser Asp Phe Gly Thr Asn Leu Gly Ile 200 205 210

【００６０】 GCA TTT CAG ATT GTT GAC GAT ATC TTA GGT CTA ACA GCA GAC GAA 675 Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Ile Leu Gly Leu Thr Ala Asp Glu 215 220 225 AAG GAA CTT GGA AAG CCT GTT TTT AGT GAT ATT AGG GAG GGT AAA 720 Lys Glu Leu Gly Lys Pro Val Phe Ser Asp Ile Arg Glu Gly Lys 230 235 240 AAG ACT ATA CTT GTA ATA AAA ACA CTG GAG CTT TGT AAA GAG GAC 765 Lys Thr Ile Leu Val Ile Lys Thr Leu Glu Leu Cys Lys Glu Asp 245 250 255 GAG AAG AAG ATT GTC CTA AAG GCG TTA GGT AAT AAG TCA GCC TCA 810 Glu Lys Lys Ile Val Leu Lys Ala Leu Gly Asn Lys Ser Ala Ser 260 265 270 AAA GAA GAA TTA ATG AGC TCA GCA GAT ATA ATT AAG AAA TAC TCT 855 Lys Glu Glu Leu Met Ser Ser Ala Asp Ile Ile Lys Lys Tyr Ser 275 280 285 TTA GAT TAT GCA TAC AAT TTA GCA GAG AAA TAT TAT AAA AAT GCT 900 Leu Asp Tyr Ala Tyr Asn Leu Ala Glu Lys Tyr Tyr Lys Asn Ala 290 295 300 ATA GAC TCT TTA AAT CAA GTC TCC TCT AAG AGT GAT ATA CCT GGA 945 Ile Asp Ser Leu Asn Gln Val Ser Ser Lys Ser Asp Ile Pro Gly 305 310 315 AAG GCT TTA AAA TAT CTA GCT GAA TTT ACG ATA AGA AGG AGA AAA 990 Lys Ala Leu Lys Tyr Leu Ala Glu Phe Thr Ile Arg Arg Arg Lys 320 325 330 TAA 993 TER

【００６１】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成 配列： CGCGGATCCA TGAGTTACTT TGACAA 26

【００６２】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成 配列： GGGAATTCTT ATTTTCTCCT TCTTA 25

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤＮＡ配列が含まれるプラスミドｐＧ
ＧＰＳ１およびｐＲＶ１１−１の挿入ＤＮＡ断片とその
制限酵素地図である。Ｅ，ＨはそれぞれＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄIII 認識部位を示す。

【図２】本発明のＤＮＡ配列が含まれるプラスミド産物
が触媒した反応の生成物の解析結果である。パネルＡは
ＬＫＣ−１８ＴＬＣ、パネルＣはＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６
０ＴＬＣを用いたもの。パネルＣは、ＬＫＣ−１８ＴＬ
Ｃで展開した標準サンプルである。位置ａ，ｂ，ｃ，ｄ
およびｅは、それぞれゲラニオール、（ａｌｌ−Ｅ）フ
ァルネソール、（ａｌｌ−Ｅ）ゲラニルゲラニオール、
（２Ｚ，６Ｅ，１０Ｅ）ゲラニルゲラニオール、および
（ａｌｌ−Ｅ）デカプレノールに相当する。Ｏｒｉはス
ポットオリジン、Ｓ．Ｆ．は溶媒先端を示す。

【図３】本発明のＧＧＤＰ合成酵素の熱安定性を調べた
結果である。●、○、×、■および▲は、それぞれ６０
℃、７０℃、８０℃、９０℃および１００℃で処理した
結果を示す。

【図４】図４は、本発明のＧＧＤＰ合成酵素の製造の際
の各段階における生成物の純度を示す電気泳動の結果を
示す図面に代る写真である。

【図５】図５は、図４に示す各段階におけるＧＧＤＰ合
成酵素活性の測定結果を示すグラフである。

【図６】図６は、精製されたＭＢＰ−ＧＧＤＰ合成酵素
活性のＧｒｉｎｄｅｙ−Ｎｉｃｈｏｌ法による測定結果
を示すグラフである。

【図７】図７は、本発明の酵素を種々の基質に作用させ
た場合の生成物を表わすＴＬＣ展開のオートラジオグラ
ムであって、図面に代る写真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 竹内 由枝 愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自 動車株式会社内 (72)発明者 西野 徳三 宮城県仙台市青葉区南吉成２−15−３ (72)発明者 大沼 信一 宮城県仙台市青葉区川内川前丁46−１ レジデンス広瀬102号 (72)発明者 鈴木 学 宮城県仙台市青葉区川内追廻184 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/31 C12N 1/21 C12N 9/10 C12P 7/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
   配列を有するか、あるいは配列番号：１で示されるアミ
   ノ酸配列において20個以下のアミノ酸の置換、欠失及び
   ／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有し且つゲ
   ラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を維持している酵
   素をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 修飾されるアミノ酸の数が10個以下であ
   る、請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 前記酵素が配列表の配列番号１で示され
   るアミノ酸配列を有する請求項１又は２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１で示されるＤＮＡ配
   列からなる請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡとそのＤＮＡの発現調節を行う機能を有するＤＮＡ
   とを含んでなる組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換えベクターによって
   遺伝子導入された組換え微生物細胞。
7. 【請求項７】 宿主細胞がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ
   ｉｃｈｉａ）属に属する微生物細胞である請求項６記載
   の組換え微生物細胞。
8. 【請求項８】 請求項６又は７記載の組換え微生物細胞
   を培地で培養し、培養物からゲラニルゲラニル二リン酸
   合成酵素活性物質を採取することを特徴とする酵素該活
   性物質の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項６又は７に記載の組換え微生物細
   胞を培地で培養し、培養物からゲラニルゲラニル二リン
   酸を採取することを特徴とするゲラニルゲラニル二リン
   酸の製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項６もしくは７に記載の組換え微
    生物細胞の培養物又は請求項８の方法により得られた酵
    素活性物質を基質イソペンテニル二リン酸、ジメチルア
    ニル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン
    酸のいずれかに作用させることを特徴とするゲラニルゲ
    ラニル二リン酸の製造方法。