JPH09107974A - 耐熱性ゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新たな耐熱性ゲラニルゲラニル二燐酸合成酵
素の提供。 【解決手段】 サーマス・サーモフィラス（Thermus
thermophilus）由来の耐熱性ゲラニルゲラニル二燐酸合
成酵素、並びにその製造方法及び使用方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なゲラニルゲラ
ニル二燐酸合成酵素及びその製造方法、該酵素をコード
する遺伝子系、並びに該酵素を用いるゲラニルゲラニル
二燐酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】さまざまな鎖長のイソプレノイド（基本
骨格（Ｃ₅ Ｈ₈ ）_n をもつ物質の総称）が知られている
が、中でもＣ₂₀の鎖長のゲラニルゲラニル二燐酸（gera
nylgeranyl diphosphate：ＧＧＰＰ）は種々の有用な生
理活性を有するテルペノイド類のほかビタミンＡ，Ｋ，
Ｅ類の原料としても工業的利用価値が高い。このような
工業的利用価値の高いＧＧＰＰは化学合成法により製造
されているが、収率が極めて低いため、非常に高価であ
る。

【０００３】一方、イソペンテニル二燐酸（isopenteny
l diphosphate ：ＩＰＰ）とアリル性二燐酸を原料とし
て種々の鎖長のイソプレノイドを合成する酵素、プレニ
ルトランスフェラーゼが知られている。中でも、ゲラニ
ルゲラニル二燐酸合成酵素は主としてＧＧＰＰを合成す
る。従ってこの酵素反応を利用してＧＧＰＰの収率を高
めることができればＧＧＰＰを安価に製造できることが
期待される。特にこの酵素反応ではトランス体しか合成
されず副産物として分離が難しいシス体も合成されてし
まう化学合成法に対し酵素法はメリットがある。

【０００４】これまでに、ＧＧＰＰ合成酵素（geranylg
eranyl diphosphate synthase ：ＧＧＰＳ）の遺伝子と
しては、植物病原菌であるエルウィニア・ウレドポラ
（Erwinia uredovora ）、土壌細菌であるミキソコッ
カス・キサンサス（Myxococcus xanthus ）、アカパンカ
ビ ニューロスポーラ・クラッサ（Neurospora crass
a）由来のものなどが知られており、そのうちいくつか
は大腸菌で発現されている。しかし、いずれも耐熱性を
有していないため酵素活性の安定性が悪く工業的に長期
安定的に使用できるものでなく、より安定な酵素への要
望があった。

【０００５】このような要望に答えるものとして高度好
熱性古細菌スルフォロバス・アシドカルダリウス（Sulf
olobus acidcardarius ）由来のＧＧＰＰ合成酵素がす
でに報告されている。しかしながら、スルフォロバス・
アシドカルダリウス（Sulfolobus acidcardarius ) 由
来の酵素はこれまでのものに比べ安定性が高いが、酵素
の比活性が低いという問題点がある。また、温度安定性
が高いものとしてメタン生成古細菌メタノバクテリウム
・サーモアートトロピカム（Methanobacterium thermoau
totrophicum ）由来のＧＧＰＰ合成酵素も報告されてい
る。この報告においては、菌体当たりの酵素生産量は少
なく実用的ではない。

【０００６】このように、工業的に使用可能なゲラニル
ゲラニル二燐酸合成酵素はなく、実用的な酵素の開発が
望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、安定
性が高く、工業的に長期安定的に使用可能な耐熱性を有
するゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素及びその製造方
法、そのための遺伝子系、並びに該酵素を用いるゲラニ
ルゲラニル二燐酸の製造方法を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的を達
成すべく鋭意検討を重ねた結果、より酵素活性が高く、
副産物の生成の少ないＧＧＰＰ合成酵素遺伝子をThermu
s thermophilusより取得し、それをたとえば大腸菌な
どの微生物に導入し酵素を大量発現させ、本発明を完成
するに至った。

【０００９】従って、本発明は、第１に配列番号：１に
示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に対して１〜複
数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他のアミノ酸に
よる置換により修飾されたアミノ酸配列を有する、ゲラ
ニルゲラニル二燐酸合成酵素を提供するものである。本
発明は第２に、上記ゲラニルゲラニル二燐酸をコードす
るＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る任意のベクター、特に
発現ベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿
主を提供するものである。

【００１０】本発明は第３に、上記の宿主を培養し、該
培養物から前記のゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素を採
取することを特徴とするゲラニルゲラニル二燐酸合成酵
素の製造方法を提供するものである。本発明は第４に、
前記の酵素を、炭素原子数が１５個以下のプレニル二燐
酸１種又は複数種に作用せしめることを特徴とするゲラ
ニルゲラニル二燐酸の製造方法を提供するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明によれば、耐熱性微生物で
あるサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilu
s）の染色体からＤＮＡを調製する。サーマス・サーモ
フィラス種に属するいずれの株を用いてもよいが、例え
ば自由に分譲が受けられるＡＴＣＣ２７６３４株を用い
ることができる。染色体ＤＮＡを常法に従って調製した
後、適当な制限酵素により切断し、適当なベクターに挿
入することによりＤＮＡライブラリーを作製する。ＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングは、既知のゲラニルゲ
ラニル二燐酸合成酵素のアミノ酸配列に基いて設計すれ
ばよい。この具体的な方法は実施例１に示す。

【００１２】本発明の酵素の典型的なアミノ酸配列は配
列番号：１に示す通りであるが、アミノ酸配列が修飾さ
れていてもよい。酵素はその生来のアミノ酸配列に比べ
て１又は少数個のアミノ酸の付加、除去、及び／又は置
換によって修飾されている場合でもその本来の酵素活性
を有する場合があることが知られている。従って、本発
明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するペ
プチド数の他に、配列番号１に示されるアミノ酸配列に
対して１又は少数個、例えば５個まで、又は１０個又は
２０個又は３０個までのアミノ酸が置換、欠失及び／又
は付加により変化しているアミノ酸配列を有し、なお生
来の機能を果すことができる酵素をも包含する。

【００１３】本発明はまた、上記の種々の変異型酵素を
コードする遺伝子及びそれを含むベクター、特に発現ベ
クター、及び該ベクターにより形質転換された宿主を提
供する。本発明の遺伝子（ＤＮＡ）は、例えば配列番
号：１に示す生来のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに
部位特定変異誘発やＰＣＲ法等の常法に従って変異を導
入することにより容易に得ることができる。

【００１４】本発明の遺伝子の塩基配列は典型的には配
列番号：１に示す塩基配列を有するもの、及び上記の種
々のアミノ酸配列をコードするものであるが、さらに、
配列番号：１に示す塩基配列に対して例えば、６０℃、
１５時間、ハイブリダイゼーション媒体（５×ＳＳＣ、
ブロッキング剤１％（ｗ／ｖ）、Ｎ−ラウロイルサルコ
シン０．１％（ｗ／ｖ）及びＳＤＳ０．０２％（ｗ／
ｖ）；但し、２０×ＳＳＣの組成は、１Ｌ中ＮａＣｌ
３mol 、クエン酸ナトリウム０．３mol の水溶液）のハ
イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、且つ
ゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素活性を有するポリペプ
チドをコードしているＤＮＡも本発明に含まれる。

【００１５】一旦目的とする酵素のアミノ酸配列が定ま
れば、それをコードする適当な塩基配列を決定すること
ができ、常用のＤＮＡ合成法によりＤＮＡを化学合成す
ることもできる。本発明はまた、前記のごときＤＮＡを
含んで成る発現ベクター、該発現ベクターにより形質転
換された宿主、及びこれらの宿主を用いての本発明の酵
素又はペプチドの製造方法を提供する。

【００１６】発現ベクターはその複製開始点、発現制御
配列等を含有するが、これらは宿主により異る。宿主と
しては、原核性生物、例えば細菌、例えば大腸菌、バシ
ラス属細菌、例えばバシラス・ズブチリス（Bacillus
Subtilis）、真核性微生物、例えば真菌、例えば酵母、
例えばサッカロミセス（Saccharomyces ）属に属すサッ
カロミセス・セレビシエー（Ｓ．cerevisiae）やピキア
（Pichia）属に属するピキア・パストリス（Pichia pa
storis）、糸状菌、例えばアスペルギルス（Aspergillu
s ）属のアスペルギルス・オリゼー（Ａ．oryzae）、ア
スペルギルス・ニガー（Ａ．niger ）、動物細胞、例え
ばカイコの培養細胞、高等動物の培養細胞、例えばＣＨ
Ｏ細胞、等が挙げられる。また植物を宿主とすることも
可能である。

【００１７】宿主に大腸菌を用いる場合を例にとれば、
ＤＮＡからｍＲＮＡを転写する過程とｍＲＮＡからタン
パク質を翻訳する過程など遺伝子の発現調節機能がある
ことが知られている。ｍＲＮＡの合成を調節するプロモ
ーター配列として、天然に存在する配列（たとえばｌａ
ｃ，ｔｒｐ，ｂｌａ，ｌｐｐ，Ｐ_L ，Ｐ_R ，ｔｅｒ，Ｔ
３，Ｔ７など）以外にも、それらの変異体（例えばｌａ
ｃＵＶ５）や天然にあるプロモーター配列を人工的に融
合した（例えばｔａｃ，ｔｒｃなど）配列が知られてお
り、本発明にも使用できる。

【００１８】ｍＲＮＡからタンパク質を合成する能力を
調節する配列として、リボソームバインディングサイト
（ＧＡＧＧおよびその類似配列）配列と開始コドンであ
るＡＴＧまでの距離が重要であることは既知である。ま
た、３′側に転写終了を指令するターミネーター（例え
ば、ｒｒｎＰＴ₁ Ｔ₂ を含むベクターがファルマシア社
から市販されている）が組換え体でのタンパク質合成効
率に影響する事はよく知られている。

【００１９】本発明の組換えベクターを調製するのに使
用できるベクターとしては、市販のものをそのまま用い
るか、または目的に応じて誘導した各種のベクターを挙
げることができる。例えば、ｐＭＢ１由来のｒｅｐｌｉ
ｃｏｎを持つｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２７，ｐＫＫ２２
３−３，ｐＫＫ２３３−２，ｐＴｒｃ９９等や、コピー
数が向上するように改変したｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，
ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ，ｐＨＳＧ２９８，ｐＨＳＧ３９６等、またｐ１５Ａ
由来のｒｅｐｌｉｃｏｎを持つｐＡＣＹＣ１７７やｐＡ
ＣＹＣ１８４等、さらにはｐＳＣ１０１やＣｏｌＥ１や
Ｒ１やＦ因子などに由来するプラスミドが挙げられる。
さらに、より精製の容易な融合蛋白質発現ベクター例え
ばｐＧＥＸ−２Ｔ，ｐＧＥＸ−３ＸやｐＭａｌ−ｃ２の
ようなベクターも利用できる。

【００２０】また、プラスミド以外にも、λファージや
Ｍ１３ファージのようなウイルスベクターやトランスポ
ゾンによっても遺伝子導入が可能である。大腸菌以外の
微生物への遺伝子導入では、ｐＵＢ１１０（ Sigma社か
ら販売）やｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造より販売）など
によるバシラス（Bacillus）属への遺伝子導入が知られ
ている。これらベクターについてはMolecular Cloning
(J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis著 Cold Spring
Harbor Laboratory Press発行）やCloning Vector (P.
H.Pouwels, B.E.Enger.Valk, W.J.Brammar著Elsevier発
行）や各社カタログに記載されている。

【００２１】特に、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア社より
販売）は、選択マーカーのアンピシリン耐性遺伝子以外
に、プロモーター及び制御遺伝子としてＰｔｒｃ及びｌ
ａｃＩ^q 、リボソームバインディングサイトとしてＡＧ
ＧＡという配列、ターミネーターとしてｒｒｎＰＴ₁ Ｔ
₂ を持ち、ＨＤＰ合成酵素遺伝子の発現調節機能を持
つ、好ましいベクターとして挙げられる。

【００２２】これらのベクターへの、ゲラニルゲラニル
二燐酸合成酵素をコードするＤＮＡ断片および必要によ
り前記酵素の遺伝子を発現調節する機能を有するＤＮＡ
断片の組み込みは、適当な制限酵素とリガーゼを用いる
既知方法で行うことができる。こうして作製される発明
のプラスミドの具体的なものとしてはｐＴＥ３，ｐＴＥ
７，ｐＴＥ２０が挙げられる。

【００２３】このような組換えベクターで遺伝子導入で
きる微生物としてはエシェリヒアコリー（Escherichia
coli）、バシラス（Bacillus）属などに属する微生物も
利用することができる。この形質転換も常法、たとえば
Molecular Cloning (J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Mani
atis著 Cold Spring Harbor Laboratory Press発行）や
DNA Cloning Vol.Ｉ〜111 （D.M.Glover編 IRL PRESS発
行）などに記載された、ＣａＣｌ₂ 法やプロトプラスト
法により行うことができる。

【００２４】本発明の酵素を製造するには、上記の形質
転換された宿主を培養し、その培養物から常法に従っ
て、例えば塩析、有機溶剤沈澱、ゲル濾過、アフィニテ
ィクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー等により回収精製することが
できる。本発明はまた、本発明の酵素を用いてゲラニル
ゲラニル二燐酸を製造する方法を提供する。この方法に
おいては、媒体、特に水性媒体中で、本発明の酵素とイ
ソペンテニル二燐酸およびジメチルアリル二燐酸等のア
リル性イソプレノイドを反応せしめ、所望により反応媒
体から目的とするゲラニルゲラニル二燐酸を採取すれば
よい。酵素としては、精製酵素のみならず、種々の段階
まで半精製して得られる粗酵素、又は培養菌体もしくは
培養物等の酵素含有物でもよい。また、前記の酵素、粗
酵素又は酵素含有物を常法に従って固定した固定化酵素
であってもよい。

【００２５】基質としては、目的とするゲラニルゲラニ
ル二燐酸の炭素数に炭素原子数が少ない例えば、５〜１
５個のイソプレニル二燐酸とイソペンテニル二燐酸とが
用いられる。反応媒体としては水又は水性緩衝液、例え
ばリン酸緩衝液等が用いられる。

【００２６】

【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例１ ．ゲラニルゲラニル二燐酸をコードするＤＮＡ
のクローニング （１）サーマス・サーモフィラスの染色体ＤＮＡの調製 サーマス・サーモフィラスＡＴＣＣ ２７６３４株をＡ
ＴＣＣに記載された６９７の培地で７５℃で培養した。
次いで、染色体を、 Currentprotocols in Molecular B
iologyに従って調製した。

【００２７】（２）オリゴヌクレオチドの作製 既知のプレニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列スル
フォロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidoc
ardarius）のGGPS、エルウィニア・ウレドボラ（Erwini
a uredovora ）のGGPS、ニューロスポラ・クラッサ
（Neurospora crassa）のGGPSの配列をもとに表１のオ
リゴヌクレオチドを設計した。サーマス（Thermus ）属
の遺伝子は一般的にＧＣ含量が高いことが知られている
ことから、コドンはできる限り、ＧＣを優先的に選ん
だ。オリゴヌクレオチドはPERKIN ELMER社製ＤＮＡ合成
機モデル３７３Ａで作製した。

【００２８】

【表１】

【００２９】（３）ジェノミックサザンハイブリダイゼ
ーション サーマス・サーモフィラスＨＢ８株のゲノムＤＮＡ １
μｇを４種類の制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄIII ，
ＳａｃＩ，ＳｔｕＩ）でそれぞれを完全に消化後、０．
８％アガロースゲルで電気泳動しナイロンメンブレン
（ Amasham社製）にトランスファーした。トランスファ
ーの方法は、Current protocols in Molecular Biology
に従った。次に作製したプライマー１および２を BOEHR
INGER MANNHEIM社製のＤＩＧラベリングキットを使用し
ラベルし、プローブとして用いた。ハイブリダイゼーシ
ョンは BOEHRINGER MANNHEIM社のマニュアルに従い６０
℃で行った。こうしてジェノミックサザンハイブリダイ
ゼーションにより染色体ＤＮＡを解析したところＳａｃ
Ｉ又は、ＳｔｕＩで消化したものは１．５kbp 付近に強
いシグナルが、また、ＢａｍＨＩ又は、ＨｉｎｄIII で
消化したものについては６kbp 付近に強いシグナルが見
られた。

【００３０】（４）サーマス・サーモフィラスの遺伝子
のライブラリーの作製 染色体ＤＮＡ １μｇをＳａｃＩまたは、ＳｔｕＩでそ
れぞれ消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動
し、１．５kbp 付近のＤＮＡ断片を切り出した。次にＧ
ＥＮＥＣＬＥＮII（BIO101社製）で使用説明書に従いゲ
ルより１．５kbp 付近の大きさのＤＮＡを回収し、精製
した。このようにして得られた断片をｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔII（STRATAGENE社製）のＳａｃＩあるいはＳｍａ
Ｉにクローニングし、それらを常法により、大腸菌ＪＭ
１０９に形質転換し２種類のライブラリーを作製した
（ＳａｃＩライブラリー、ＳｔｕＩライブラリー）。

【００３１】（５）コロニーハイブリダイゼーションと
配列決定 表１記載のプライマー１をBOEHRINGER MANNHEIM 社製の
ＤＩＧラベリングキットでラベルして、上記２種類のラ
イブラリーより目的の遺伝子をスクリーニングした。ハ
イブリダイゼーションの温度は、６０℃で行い、 BOEHR
INGER MANNHEIM社のマニュアルに従い、コロニーハイブ
リダイゼーションを行った。それぞれ約２０００個のコ
ロニーをスクリーニングして、約５０個のポジティブコ
ロニーを得た。ポジティブコロニーから調製したプラス
ミドＤＮＡをDye Terminator法により反応させ３７３Ａ
シークエンサー（PERKIN ELMER社製）で常法に従い、配
列決定を行った。

【００３２】配列決定の結果、ＳａｃＩライブラリーよ
りスクリーニングされたＳａｃＩ断片を含むプラスミド
とＳｔｕＩライブラリーよりスクリーニングされたＳｔ
ｕＩ断片を含むプラスミドは約１４０bp重なる部分があ
り、その配列をつなげると、約１kbp のオープンリーデ
ィングフレームが存在していた。その遺伝子から予想さ
れるアミノ酸配列は、プレニルトランスフェラーゼに共
通に保存されている配列を保持していた。

【００３３】（６）オープンリーディングフレームのＰ
ＣＲクローニング オープンリーディングフレームを完全な長さでクローニ
ングするために、表２記載の配列のオリゴヌクレオチド
を作製した。このプライマーには、発現プラスミドｐＴ
ｒｃ９９Ａに、クローニングすることを考慮に入れて、
オープンリーディングフレームの配列の前後に制限酵素
部位を入れた。

【００３４】

【表２】

【００３５】次いでサーマス・サーモフィラスＨＢ８株
のジェノミックＤＮＡを鋳型として用い、表３記載の反
応液を用いてThermal cycler（PERKIN ELMER社製）によ
りＰＣＲ反応を行った。

【００３６】

【表３】

【００３７】９４℃にて３０秒、６０℃にて３０秒、７
２℃にて１分間、３５サイクルの後、７２℃で７分間反
応させた。反応液を０．８％アガロースゲルで電気泳動
し、目的の長さの約１kbp のＤＮＡ断片を、ＧＥＮＥＣ
ＬＥＮII（BIO101社製）で使用説明書に従い、精製し
た。精製したＤＮＡ断片はＮｃｏＩ及びＳａｌＩで消化
し、市販のライゲーションキット（宝酒造製）によりｐ
Ｔｒｃ９９Ａに連結した。この組み換えプラスミドはＣ
ａＣｌ₂ 法に準じて大腸菌ＪＭ１０９に導入処理し、得
られた大腸菌をＬＢ培地で３７℃にて培養した。次にプ
レート上で生育したコロニーを５０μｇ／mlのアンピシ
リンを含む２ml ＬＢ液体培地にて培養し、さらにプラ
スミドをCurrent protocols in Molecular Biologyのア
ルカリＳＤＳ法により調製し、組換えプラスミドが作製
できていることをシークエンシングにより確認した。作
製した組換えプラスミドはｐＴＥ３と命名した。

【００３８】実施例２．ゲラニルゲラニル二燐酸合成酵
素の発現 既知のエルウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredovor
a ）のｃｒｔＩ（フィトエン合成酵素遺伝子）とｃｒｔ
Ｂ（フィトエン不飽和化酵素遺伝子）とを含むプラスミ
ドｐＡＣＹＣ−ＩＢを保持した大腸菌は、ゲラニルゲラ
ニル二燐酸合成酵素遺伝子を含むプラスミドを共存させ
ると大腸菌が赤くなることが知られている（J.B.C. 26
9, 20, 14792-14797 (1994)) 。この性質を利用すれ
ば、ｐＴＥ３がゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素の活性
があるかどうか確認することができる。実施例１で得ら
れた組み換えプラスミドｐＴＥ３をｐＡＣＹＣ−ＩＢ／
ＤＨ５αに常法により、形質転換した。その結果その形
質転換体は、赤色を示したので、ゲラニルゲラニル二燐
酸合成酵素活性があることが判明した。

【００３９】ｐＴＥ３を用い大腸菌ＪＭ１０５コンピテ
ントセルに形質転換した。得られた形質転換株を５０μ
ｇ／mlのアンピシリンを含む２０mlのＬＢ培地中３７℃
で一夜培養した後、１ＬのＬＢ培地に接種し、菌体濃度
が、ｋｌｅｔｔ値＝４０〜５０になるまで培養した。次
に、１００mM ＩＰＴＧを１００ml添加しさらに、４時
間培養し、培養後、菌体を集菌し、１００mlの５０mM
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．０）、１０mM ２−メルカプ
トエタノール、１mM ＥＤＴＡ溶液に懸濁した。得られ
た菌体懸濁液を超音波破砕機（TOMY社製）に供し、菌体
を破砕し、５５℃で１時間保温することにより、大腸菌
由来のプロテアーゼを失活させた後遠心分離（８，００
０rpm ×１０min ）し、その上清をＧＧＰＰ合成反応に
用いた。活性測定は、ＲＩトレース法（J.Biochem., 11
3 , 355-363, (1993))を用い、表４に示す反応液組成に
より行った。

【００４０】

【表４】

【００４１】すなわち、上記の反応液を５５℃で８０分
間反応させた後、飽和ＮａＣｌ溶液を１ml加え、３mlの
エーテルを用い、未反応の基質を抽出した。さらに反応
液を３mlブタノールで抽出し、ジャガイモ酸性フォスフ
ァターゼ処理後ペンタン抽出して、ＴＬＣで生成物を分
析した。ＴＬＣは、逆層ＬＫＣ−１８薄層クロマトグラ
フィー（ワットマン社製）を使用し、アセトン／水（９
／１）で展開した。この結果を図１に示す。

【００４２】図１から明らかな通り、本発明の酵素は、
試験したいずれの基質からもゲラニルゲラニル二燐酸を
合成することが判明した。実施例３ ．ゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素の融合蛋白
質を介しての製造 （１）グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合蛋白質プ
ラスミドの作製 市販の融合蛋白質ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ Pharmacia
社製）を用いて、組み換えプラスミドを作製した。実施
例１−（６）記載のＰＣＲ産物を宝酒造社製ブランティ
ングキットを用いて、末端平滑化して、ｐＧＥＸ−２Ｔ
のＳｍａＩ部位にライゲーションした。ブランティング
とライゲーションは宝酒造のマニュアルに従った。得ら
れた反応液を常法により、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
した。３７℃にて生育した形質転換体を２ml ５０μｇ
／mlアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミ
ドをアルカリＳＤＳ法により調製して、組換えプラスミ
ドが作製できていることを配列決定により確認した。作
製した組換えプラスミドはｐＴＥ７と命名した。

【００４３】ｐＴＥ７およびｐＴＥ２０もｐＴＥ３と同
様にして、ｐＡＣＹＣ−ＩＢ／ＤＨ５αに常法により、
形質転換したところその形質転換体は、赤色を示したの
で、ゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素活性があることが
確認された。 （２）グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合蛋白質の
精製 実施例３−（１）で得られたｐＴＥ７も実施例２と同様
にして酵素の大量発現を行なった。すなわちｐＴＥ７を
用い、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、得られた形質転
換体を５０μｇ／mlアンピシリンを含む ２０mlのＬＢ
培地中３７℃で一夜培養したあと、これを１ＬのＬＢ培
地に接種し、菌体濃度が、ｋｌｅｔｔ値＝４０〜５０に
なるまで培養した。次に１００mM ＩＰＴＧを１００ml
添加しさらに、４時間培養した。培養後、１mlの培養液
より菌体を遠心分離により集菌し（１４，０００rpm 、
１０min ）、Current protocols in Molecular Biology
の記載の方法に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS-page）に供した。その結果約７０kD付
近に融合蛋白質が発現していることが確認された。

【００４４】残りの約１Ｌの培養液も同様にして遠心分
離し（８，０００rpm 、１０min ）菌体を集菌し、得ら
れたCurrent protocols in Molecular Biologyに記載の
PBSbuffer ５０mlに懸濁した。その懸濁液を超音波破
砕機（ＴＯＭＹ製）に供し、菌体を破砕後、遠心分離
（４℃、１２，０００rpm ）により上清画分と沈殿画分
に分けた。

【００４５】このようにして得られた上清画分５０mlを
グルタチオンセファロース４Ｂ（ Pharmacia社製）を充
填したカラムに吸着させ、グルタチオンセファロース４
Ｂに付属する Pharmaciaのプロトコールに従って溶出
し、酵素精製を行った。溶出液２．５mlはさらにＰＤ−
１０カラム（ Pharmacia社製）を用い脱塩した。こうし
て得られた融合蛋白質（０．５mg／ml）をトロンビン
（ BOEHRINGER MANNHEIM社製）２unitと反応させること
により（室温、一晩）切断し、ＧＧＰＳを遊離させた。
グルタチオンセファロース４Ｂで精製した各溶出フラク
ションと、トロンビンで切断後のサンプルを前記のサン
プルと同様に、SDS-pageを行い精製されていることを確
認した。

【００４６】（４）グルタチオンＳトランスフェラーゼ
融合蛋白質の活性測定 遊離した蛋白の酵素活性をGrindey-Nichol法（ Grindey
& Nichol, Anal.Biochem., 33, 114-119 (1970)) によ
りオルト燐酸とピロ燐酸を測定することにより測定し
た。すなわち表５に示す反応溶液で、７０℃、１時間反
応させた後、

【００４７】

【表５】

【００４８】３００μｌの水飽和フェノールを加えよく
撹拌することによって、反応を停止し、遠心し（１４，
０００rpm 、５min ）その上清８００μｌをGrindey-Ni
chol法で反応溶液中のオルト燐酸とピロ燐酸の量を測定
した。Grindey-Nichol法によるこの精製酵素の比活性
は、２６０nmol／min ・mgとなった。

【００４９】また、この酵素をＲＩトレース法で酵素活
性を測定した。 １Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH８．５） １０μｌ ０．５mM ＤＭＡＰＰ又はＧＰＰ又はＦＰＰ ５０μｌ ０．５mM 〔¹⁴Ｃ〕−ＩＰＰ（１ci／mol ） ５０μｌ ０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂ １０μｌ Ｅｎｚｙｍｅ ２μｇ 滅菌水 ２００μｌ ７０℃で３０min 反応後、２００μｌの飽和食塩水、１
ml水飽和１−ブタノールを加え、室温で１５，０００rp
m １min 遠心した。ジャガイモ酸性フォスファターゼを
加え、１晩３７℃で保温した。５０μｌのＧＧＯＨを加
え、３mlのペンタンで抽出後、ＴＬＣで生成物を分析し
た。ＴＬＣは逆層ＬＫＣ−１８薄層クロマトグラフィー
（ワットマン社製）を使用し、アセトン／水（９／１）
で展開した。

【００５０】比活性は１０６nmol／min ／mgだった。 （５）Ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ融合蛋白質プラスミドの作製 市販の融合蛋白質ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（INVITROG
EN社製）を用いて、組み換えプラスミドを作製した。実
施例３−（１）記載のｐＴＥ７Ｅ制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＳａｌＩにより酵素処理し、得られたＤＮＡ断片を
ｐＴｒｃＨｉｓＢのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩの部位にライ
ゲーションした。ライゲーション液を用い常法により、
大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質
転換した。得られた形質転換体を２ml ＬＢ培地にて培
養し、プラスミドをアルカリＳＤＳ法により調製し組換
えプラスミドが作製できていることをシークエンシング
により確認した。このようにして作製した組換えプラス
ミドはｐＴＥ２０と命名した。

【００５１】（６）Ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ融合蛋白質の発現 ｐＴＥ２０を用い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２０
mlのＬＢ培地中３７℃で一夜培養した後、これを５０μ
ｇ／mlアンピシリンを含む１ＬのＬＢ培地に接種し菌体
濃度が、ｋｌｅｔｔ値＝４０〜５０になるまで培養し
た。次に１００mMＩＰＴＧを１００ml添加して、さらに
４時間培養した。実施例３−（４）と同様にＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動（SDS-page）により発現酵素
の解析を行った。その結果約４０kD付近に融合蛋白質が
発現していることが判明した。

【００５２】すなわち、培養液１mlを遠心分離（１４，
０００rpm 、１０min ）により集菌し、Current protoc
ols in Molecular Biologyの記載の方法に従い、SDS-pa
ge（テフコ社製）に供し、クマシーブリリアンブルーに
より染色した後、 BIO RAD社製ゲルドライヤーでゲルを
乾燥させた。

【００５３】

【発明の効果】サーマス・サーモフィラス由来の耐熱性
のＧＧＰＰ合成酵素遺伝子がクローニングされたことに
より、従来にない、安定で活性の高い酵素を大量に生産
させることができる。

【００５４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１０３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 ATG GTG CCC GCG CCC GAG ACC ATC CGG CAG GCC CTC CAA GAA AGG CTC 48 Met Val Pro Ala Pro Glu Thr Ile Arg Gln Ala Leu Gln Glu Arg Leu 1 5 10 15 ATC GCC CGC CTG GAC CAC ACC GAC CCC CTT TAC CGG GAC CTC CTC CAG 96 Ile Ala Arg Leu Asp His Thr Asp Pro Leu Tyr Arg Asp Leu Leu Gln 20 25 30 GAC TAC CCG AGA CGG GGG GGA AAG ATG CTC CGG GGC CTT CTC ACC GTG 144 Asp Tyr Pro Arg Arg Gly Gly Lys Met Leu Arg Gly Leu Leu Thr Val 35 40 45 TAC AGC GCC CTG GCC CAC GGG GCG CCC TTG GAA GCG GGC CTC GAG ACC 192 Tyr Ser Ala Leu Ala His Gly Ala Pro Leu Glu Ala Gly Leu Glu Thr 50 55 60 GCG ACC GCC CTG GAG CTC TTC CAG AAC TGG GTC CTG GTC CAC GAC GAC 240 Ala Thr Ala Leu Glu Leu Phe Gln Asn Trp Val Leu Val His Asp Asp 65 70 75 80 ATT GAG GAC GGC TCC GAG GAG CGC CGG GGC CGG CCC GCC CTC CAC CGT 288 Ile Glu Asp Gly Ser Glu Glu Arg Arg Gly Arg Pro Ala Leu His Arg 85 90 95

【００５５】 CTC CAC CCC ATG CCC CTG GCC CTG AAC GCG GGG GAC GCC ATG CAC GCC 336 Leu His Pro Met Pro Leu Ala Leu Asn Ala Gly Asp Ala Met His Ala 100 105 110 GAG ATG TGG GGC CTC CTC GCG GAA GGC CTC GCC CGG GGG CTT TTC CCC 384 Glu Met Trp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Leu Ala Arg Gly Leu Phe Pro 115 120 125 CCG GAG GTC CTC TTG GAG TTC CAC GAG GTG GTG CGC CGC ACC GCC TAC 432 Pro Glu Val Leu Leu Glu Phe His Glu Val Val Arg Arg Thr Ala Tyr 130 135 140 GGT CAG CAC CTG GAC CTC CTC TGG ACC CTC GGT GGG ACC TTT GAC CTG 480 Gly Gln His Leu Asp Leu Leu Trp Thr Leu Gly Gly Thr Phe Asp Leu 145 150 155 160 AGG CCG GAG GAC TAC TTC CGC ATG GTG GCC CAC AAG GCC GTC TAC TAC 528 Arg Pro Glu Asp Tyr Phe Arg Met Val Ala His Lys Ala Val Tyr Tyr 165 170 175 ACC GCC GTG GTC CCC CTG CGC CTC GGG GTC CTT CTC GTC GGG AAG ACC 576 Thr Ala Val Val Pro Leu Arg Leu Gly Val Leu Leu Val Gly Lys Thr 180 185 190 CCG CCC GCC GCC TAC GAG GAG GGG GGG CTT AGG CTG GGG ACG GCC TTC 624 Pro Pro Ala Ala Tyr Glu Glu Gly Gly Leu Arg Leu Gly Thr Ala Phe 195 200 205 CAG ATC GTG GAC GAC GTC TTG AAC CTG GAA GGG GGG GAG GCC TAC GGG 672 Gln Ile Val Asp Asp Val Leu Asn Leu Glu Gly Gly Glu Ala Tyr Gly 210 215 220 AAG GAA AGG ACC GGG GAC CTC TAC GAG GGC AAG CGC ACC CTG ATC CTC 720 Lys Glu Arg Thr Gly Asp Leu Tyr Glu Gly Lys Arg Thr Leu Ile Leu 225 230 235 240

【００５６】 CTC CGC TTC CTG GAG GAG ACC CCG CCC GAG GAA AGA GCC CGG GAG GCG 768 Leu Arg Phe Leu Glu Glu Thr Pro Pro Glu Glu Arg Ala Arg Glu Ala 245 250 255 AAG CCC GAG GCG GAG GTA GGT TGG CTT CTG GAA AGG CTC CTC GCC TCG 816 Lys Pro Glu Ala Glu Val Gly Trp Leu Leu Glu Arg Leu Leu Ala Ser 260 265 270 AGG GCC CTG GCC TGG GAC AAG GCG GAG GCC AAG CGC CTC CAG GCC GAG 864 Arg Ala Leu Ala Trp Asp Lys Ala Glu Ala Lys Arg Leu Gln Ala Glu 275 280 285 GGC CTC GCC CTC CTG GAG GCC GCC TTC CAG GAC CTC CCG GGA AGG AGG 912 Gly Leu Ala Leu Leu Glu Ala Ala Phe Gln Asp Leu Pro Gly Arg Arg 290 295 300 CCT GGA CCA CCT CCG CGG TCT CCT CGC CGC TTT GGT GGA GCG CAG GGC 960 Pro Gly Pro Pro Pro Arg Ser Pro Arg Arg Phe Gly Gly Ala Gln Gly 305 310 315 320 ATA ATG GGG CCA TGC AGG GGG TGC GCT TCC GGG TCA TCA CCG CCA ACG 1008 Ile Met Gly Pro Cys Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ser Ser Pro Pro Thr 325 330 335 ACC CCG ACA TCC TCC AAG AGC GCC TGA 1035 Thr Pro Thr Ser Ser Lys Ser Ala 340 345

【００５７】配列番号：２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 MTCAGRAGRG GGYTSCCCAC AGTC 24

【００５８】配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 MTSGCSTTCC AGVTSGTCGA CGAC 24

【００５９】配列番号：４ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 TAAAGTGTAA GCCATGGTGC C 21

【００６０】配列番号：５ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GAAGGCCGTC GACGAAGCGG T 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はプラスミドｐＴＥ３から発現されたゲラ
ニルゲラニル二燐酸合成酵素（ＧＧＰＳ）が基質ファル
ネシル二燐酸（ＦＰＰ：２）又はジメチルアリル二燐酸
（ＤＭＡＰＰ：１）をイソペンテニル二燐酸（ＩＰＰ）
に作用して生成した産物を解析した薄層クロマトグラフ
図であり、図面に代る写真である。ＦＯＨはファルネソ
ール、ＧＧＯＨはゲラニルゲラニオールを示す。

【図２】図２は、本発明のゲラニルゲラニル二燐酸合成
酵素（ＧＧＰＳ）をグルタチオンＳトランスフェラーゼ
との融合蛋白質として発現させた後、トロンビン処理
し、ＧＧＰＳ部分を精製した酵素を基質であるジメチル
アリル二燐酸（ＤＭＡＰＰ：１）、ゲラニル二燐酸（Ｇ
ＰＰ：２）又はファルネシル二燐酸（ＦＰＰ：３）をイ
ソペンテニル二燐酸（ＩＰＰ）とに作用させ、生成物を
解析した薄層クロマトグラフ図であり、図面に代る写真
である。ＧＯＨはゲラニオール、ＦＯＨはファルネソー
ル、ＧＧＯＨはゲラニルゲラニオールを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示すアミノ酸配列、又は
   該アミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸の付加、
   除去及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾され
   たアミノ酸配列を有する、ゲラニルゲラニル二燐酸合成
   酵素。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のゲラニルゲラニル二燐
   酸をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡを含んで成る発
   現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の発現ベクターにより形
   質転換された宿主。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のゲラニルゲラニル二燐
   酸合成酵素の製造方法であって、請求項４に記載の宿主
   を培養し、該培養物から該酵素を採取することを特徴と
   する方法。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のゲラニルゲラニル二燐
   酸を炭素原子数１５個以下のプレニル二燐酸１種又は複
   数種に作用せしめることを特徴とする、ゲラニルゲラニ
   ル二燐酸の製造方法。