JP3376838B2 - プレニル二リン酸合成酵素 - Google Patents

プレニル二リン酸合成酵素

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JP3376838B2
JP3376838B2 JP30750696A JP30750696A JP3376838B2 JP 3376838 B2 JP3376838 B2 JP 3376838B2 JP 30750696 A JP30750696 A JP 30750696A JP 30750696 A JP30750696 A JP 30750696A JP 3376838 B2 JP3376838 B2 JP 3376838B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ステロイド、ユビ
キノン、メナキノン、ドリコール、カロテノイド、プレ
ニル化蛋白質、動物ホルモン、植物ホルモンなどの生体
にとって重要な化合物の前駆体である直鎖状プレニル二
リン酸を合成する新規変異型酵素とその遺伝子、ヌクレ
オチド配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内で重要な機能を持つ物質のうち、
イソプレン（ｉｓｏｐｒｅｎｅ：２−メチル−１，３−
ブタジエン）を構成単位として生合成される物質は数多
い。これらの化合物はイソプレノイド（ｉｓｏｐｒｅｎ
ｏｉｄ）、テルペノイド（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）、テル
ペン（ｔｅｒｐｅｎｅ）とも呼ばれ、炭素数によりヘミ
テルペン（ｈｅｍｉｔｅｒｐｅｎｅ，Ｃ５）、モノテル
ペン（ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅ，Ｃ１０）、セスキテル
ペン（ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ，Ｃ１５）、ジテル
ペン（ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ，Ｃ２０）、セスタテルペン
（ｓｅｓｔｅｒｔｅｒｐｅｎｅ，Ｃ２５）、トリテルペ
ン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ，Ｃ３０）、テトラテルペン
（ｔｅｔｒａｔｅｒｐｅｎｅ，Ｃ４０）などに分類され
る。実際の生合成は、メバロン酸合成経路（ｍｅｖａｌ
ｏｎａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ）を経て、メバロン酸−５
−二リン酸が合成され、活性型イソプレン単位であるイ
ソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ：ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙ
ｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が合成されるところから
始まる。
【０００３】架空の前駆体物質として提唱されたイソプ
レン単位の真の姿は、結局、活性型イソプレン単位とい
われるイソペンテニル二リン酸であった。イソペンテニ
ル二リン酸の異性体であるジメチルアリル二リン酸（Ｄ
ＭＡＰＰ：ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ ｄｉｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ）は植物ホルモンのサイトカイニンとして知
られるイソペンテニルアデニンの反応基質に用いられも
するが、イソペンテニル二リン酸との縮合反応によって
ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ：ｇｅｒａｎｙｌｄｉｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ）、ネリル二リン酸（ｎｅｒｙｌ ｄｉｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ）、ファルネシル二リン酸（ＥＰＰ：
ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ゲラニ
ルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ：ｇｅｒａｎｙｌ ｇｅ
ｒａｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ゲラニルファ
ルネシル二リン酸（ＧＦＰＰ：ｇｅｒａｎｙｌ ｆａｒ
ｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヘキサプレニ
ル二リン酸（ＨｅｘＰＰ：ｈｅｘａｐｒｅｎｙｌ ｄｉ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヘプタプレニル二リン酸（Ｈｅ
ｐＰＰ：ｈｅｐｔａｐｒｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ）などの鎖状活性型イソプレノイドが合成されるこ
とが知られている。縮合反応にはＺ型とＥ型がありゲラ
ニル二リン酸はＥ型ネリル二リン酸はＺ型縮合産物であ
る。
【０００４】ファルネシル二リン酸やゲラニルゲラニル
二リン酸などでは全−Ｅ型が活性型と考えられるが、Ｚ
型縮合反応することによって天然ゴムやドリコール・バ
クトプレノール（ウンデカプレノール）や植物で見出だ
される各種ポリプレノールが合成される。これらは分子
内に持つピロリン酸と炭素骨格のリン酸エステル結合エ
ネルギーを用いて縮合反応していくと考えられ、反応副
産物としてはピロリン酸が生成すると考えられている。
【０００５】ファルネシル二リン酸やＧゲラニル二リン
酸が反応基質となり、細胞内シグナル伝達機構に重要な
Ｇ蛋白質に代表されるプレニル化蛋白質（ファルネシル
二リン酸・ゲラニルゲラニル二リン酸から）、アーキア
（ａｒｃｈａｅａ）の細胞膜脂質（ゲラニルゲラニル二
リン酸から）、ステロイド前駆体のスクアレン（ファル
ネシル二リン酸から）、カロテノイド前駆体のフィトエ
ン（ゲラニルゲラニル二リン酸から）が合成される。
６，７イソプレン単位のヘキサプレニル二リン酸、ヘプ
タプレニル二リン酸から１０イソプレン単位までのプレ
ニル二リン酸は電子伝達系で機能するユビキノンやメナ
キノン（ビタミンＫ２）の合成前駆体となる。
【０００６】さらに、これら活性型イソプレノイド生合
成を経由して次のような生命にとって重要且つ膨大な種
類の化合物が合成されている。一部分の化合物を列記し
ても、ヘミテルペンを合成前駆体とするものとしては植
物ホルモンのサイトカイニンやイソペンテニルアデノシ
ン修飾ｔＲＮＡがあり、モノテルペンのゲラニオールと
その異性体ネロールは薔薇油主成分の香料であり、楠抽
出物の樟脳は防虫剤である。セスキテルペンとしては昆
虫の幼若ホルモン（ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｈｏｒｍｏｎ
ｅ）、ジテルペンとしては植物ホルモンのジベレリンや
昆虫道しるべフェロモン（ｔｒａｉｌ ｐｈｅｒｏｍｏ
ｎｅ）、視色素前駆体や高度好塩古細菌の紫膜蛋白質結
合成分やビタミンＡとして機能するレチノール・レチノ
ールがある。
【０００７】さらに、トリテルペンのスクアレンを合成
前駆体として膨大な種類のステロイド系化合物が合成さ
れ、例えば動物の性ホルモンやビタミンＤ、昆虫の脱皮
ホルモンのエクダイソン、植物ホルモンのブラシノライ
ド、原形質膜成分などになる。種々の生物の色素・ビタ
ミンＡ前駆体であるテトラテルペンの各種カロテノイド
もまた、活性型イソプレノイド由来の重要な化合物であ
り、クロロフィル・フィオフェチン・トコフェロール
（ビタミンＥ・フィロキノン（ビタミンＫ１）もテトラ
テルペン由来の化合物である。
【０００８】アリル性（ａｌｌｙｌｉｃ）基質であるジ
メチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシ
ル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ゲラニルファ
ルネシル二リン酸などにイソペンテニル二リン酸を順次
縮合していく活性型イソプレノイド合成酵素はプレニル
二リン酸合成酵素と呼ばれ主要反応産物の最大鎖長の化
合物名に従って、例えば、ファルネシル二リン酸合成酵
素（ＦＰＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ）やゲラニルゲラニル二
リン酸合成酵素（ＧＧＰＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ）などと
呼ばれる。
【０００９】現在までにバクテリア、アーキア（ａｒｃ
ｈａｅａ）、真菌、植物、動物からファルネシル二リン
酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、ヘキ
サプレニル二リン酸合成酵素、ヘプタプレニル二リン酸
合成酵素、オクタプレニル二リン酸合成酵素、ノナプレ
ニル二リン酸合成酵素（ソラネシル二リン酸合成酵
素）、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素などの酵素の
精製、活性測定、遺伝子クローニング・塩基配列決定が
報告されている。
【００１０】産業的にも生命科学的にも重要かつ多岐に
わたる化合物合成の根本をなすこれら活性型イソプレノ
イド合成酵素は、一般的に不安定で取り扱いが困難であ
り、かつ比活性も低く工業的な利用価値が望めなかっ
た。ところが、ここ数年、好熱性のバクテリアやアーキ
アから耐熱性のプレニル二リン酸合成酵素が単離された
り、その遺伝子が取得され、酵素として利用可能な条件
が整ってきた。
【００１１】ファルネシル二リン酸合成酵素では中等度
好熱菌であるバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）から遺伝子が単離され中等度の耐熱性を有する酵素
が大腸菌を宿主細胞として製造された〔Ｔ．Ｋｏｙａｍ
ａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
１３，３５５−３６３、平成３年特許出願公開第２１９
９６１号〕。ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素におい
ては高度好熱性のスルホロバス・アシドカルダリウス
（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕ
ｓ）及びサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の遺伝子が単離され〔Ｓ．
−ｉ．Ｏｈｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７９２−１４７９７、
平成６年特許出願公開第３０８１９３号、平成７年特許
出願公開第２９４９５６号〕、耐熱性の高い酵素が製造
された。
【００１２】さらにファルネシル二リン酸合成酵素とゲ
ラニルゲラニル二リン酸合成酵素の機能をあわせもった
プレニル二リン酸合成酵素も高度好熱性のメタノバクテ
リウム・サーモオートトロピカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ
ｕｍ）より酵素及びそれをコードする遺伝子が単離され
〔Ａ．Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｄ．Ｐｏｕｌｔｅｒ（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１１００２−１
１００７，Ａ．Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｄ．Ｐｏｕｌｔｅｒ
（１９９４）ＡＲＣＨＩＶＥＳ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭ
ＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＳ ３１
４〕、酵素の耐熱性が明らかにされている。
【００１３】炭素数２０までのプレニル二リン酸を合成
する酵素はホモダイマーであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで反
応させるのは比較的容易で報告例も多いが、それを越え
る鎖長を持つプレニル二リン酸を合成する酵素はヘテロ
ダイマーあるいは脂質などの別の因子を必要とすると考
えられており、工業利用するには２種類のサブユニット
あるいは別の因子をうまく再構成する条件を見つけてい
かなければならないむずかしい面を持っていた。そこ
で、好熱性生物由来の安定で非活性の高いホモダイマー
型のプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を人工的
に改変し、より鎖長の長いプレニル二リン酸を合成でき
るホモダイマー型耐熱性プレニル二リン酸合成酵素を作
り出す技術が要求されていた。
【００１４】好熱性生物由来のプレニル二リン酸合成酵
素としては、これまでに、バシラス・ステアロサーモフ
ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）由来のＦＰＰ合成酵素とスルホロバス・
アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄ
ｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）のＧＧＰＰ合成酵素で改変され
た例がある。
【００１５】バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）ＦＰＰ合成酵素の変異型酵素とその遺伝子は、大腸
菌内でのエルウイニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ
ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）由来のｃｒｔＢ（フィトエン合成
酵素遺伝子）とＣｒｔＩ（フィトエン不飽和化、ｃｉ
ｓ：ｔｒａｎｓ異性化酵素遺伝子）と変異型バシラス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＦＰＰ合成酵素遺伝子
との共存によって生成されるリコペンによる菌体色変化
を指標にして選択された〔平成７年特許願第２５２５３
号〕。
【００１６】また、スルホロバス・アシドカルダリウス
（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕ
ｓ）のＧＧＰＰ合成酵素の変異型酵素とその遺伝子は、
ＨｅｘＰＰ合成酵素活性欠損の出芽酵母サッカロミセス
・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）のグリセロール代謝能を相補することを
指標にして選択された〔平成７年特許願２４７０４３
号〕。
【００１７】変異型スルホロバス・アシドカルダリウス
（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕ
ｓ）のＧＧＰＰ合成酵素遺伝子の塩基配列の情報から、
プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列解析から提唱
されている２つのアスパラギン酸リッチドメインのう
ち、アミノ末端側のアスパラギン酸リッチドメイン保存
配列Ｉ（Ｄ1Ｄ2Ｘ1(Ｘ2Ｘ3)Ｘ4Ｄ3）の５アミノ酸残基
上流に位置するアミノ酸残基が反応産物の鎖長制御に関
与することがわかり、反応産物鎖長を長くする目的をも
って反応生成物を制御する方法は発明されている〔平成
８年７月３日出願の「変異型プレニル二燐酸合成酵素」
と題する特許出願〕。その方法により製造した酵素では
変異前のプレニル二リン酸合成酵素より長鎖長の数種の
反応生成物を生じさせる。しかしながら、これら変異型
プレニル二リン酸合成酵素においても反応生成物の鎖長
の変化は、ヘキサプレニル二リン酸程度であり、さらに
長鎖長のプレニル二リン酸を生成させる方法は知られて
いない。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、プレ
ニル二リン酸合成酵素のアミノ酸残基を改変し、長鎖プ
レニル二リン酸合成酵素の製造方法を確立することにあ
る。より安定性の高い、あるいは比活性の高い等の工業
的に利用しやすい特性を有する新規酵素が得られれば、
ただちに、この方法に従いアミノ酸残基を改変すること
より、変異前のプレニル二リン酸合成酵素が有していた
特性を付与した長鎖プレニル二リン酸を生成する変異型
プレニル二リン酸合成酵素およびその遺伝子を得ること
が可能となる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】変異型スルホロバス・ア
シドカルダリウス（Ｓ． ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕ
ｓ）のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子の塩基
配列情報から、プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配
列解析から提唱されている２つのアスパラギン酸リッチ
ドメインのうち、アミノ末端側のアスパラギン酸リッチ
ドメイン保存配列Ｉ（Ｄ1Ｄ2Ｘ1(Ｘ2Ｘ3)Ｘ4Ｄ3）のＤ1
から５残基アミノ末端側のアミノ酸及び８残基アミノ末
端側のアミノ残基が反応産物の鎖長制御に関与すること
がわかった。
【００２０】従って本発明は、プレニル二リン酸合成酵
素のアミノ酸配列において、第二領域に存在するアスパ
ラギン酸リッチドメインＤ1Ｄ2Ｘ1(Ｘ2Ｘ3)Ｘ4Ｄ3（配
列中、Ｄ1、Ｄ2及びＤ3はアスパラギン酸を示し、Ｘ1、
Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は任意のアミノ酸を示し、そしてＸ2及
び／又はＸ3は存在しない場合がある）のＤ1から５残基
Ｎ−末端側に存在するアミノ酸がAla、Ser又はGlyによ
り置換されており、且つＤ1から８残基Ｎ−末端側に存
在するアミノ酸がGlyにより置換されているアミノ酸配
列を有する変異型プレニル二リン酸合成酵素を提供す
る。
【００２１】本発明は変異前のプレニル二リン酸合成酵
素が有していた特性を付与したゲラニルゲラニル二リン
酸、ゲラニルファルネシル二リン酸、ヘキサプレニル二
リン酸、ヘプタプレニル二リン酸、オクタプレニル二リ
ン酸、ノナプレニル二リン酸、デカプレニル二リン酸、
ウンデカプレニル二リン酸、ドデカプレニル二リン酸、
トリデカプレニル二リン酸、テトラデカプレニル二リン
酸、ペンタデカプレニル二リン酸、ヘキサデカプレニル
二リン酸等の炭素数２０以上のプレニル二リン酸を生成
する変異型プレニル二リン酸合成酵素を提供する。本発
明はさらに、上記ＤＮＡを含んで成る組換えベクター、
特に発現ベクターを提供する。
【００２２】本発明はまた、前記酵素をコードするＤＮ
Ａ又はＲＮＡを提供する。本発明はさらに、上記ベクタ
ーにより形質転換された宿主を提供する。本発明はま
た、前記の酵素を、イソペンテニル二リン酸、ジメチル
アリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リ
ン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸から成る群から選択さ
れる基質に作用せしめることを特徴とする炭素数２０以
上のプレニル二リン酸の製造方法を提供する。本発明は
さらに、前記の宿主を培養し、培養物から発現生成物を
採取することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか
１項に記載の酵素の製造方法を提供する。
【００２３】
【発明の実施の形態】プレニル二リン酸合成酵素（ヘテ
ロダイマーの場合は一方のサブユニット）のアミノ酸配
列には５つの保存領域があることが提唱されている
〔Ａ．Ｃｈｅｎｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３，ｐｐ．６００−６０７，１９９
４〕。また、これら５個の保存領域の内、第II領域中に
アスパラギン酸リッチドメイン保存配列Ｉ「Ｄ1Ｄ2Ｘ
1(Ｘ2Ｘ3)Ｘ4Ｄ3」（この配列中、Ｘ2Ｘ3は存在しない
場合がある）ことが知られている。なお、第Ｖ領域にも
「ＤＤＸＸＤ」で示されるアスパラギン酸リッチドメイ
ンが存在するが、本発明においてアミノ酸配列の改変部
位を特定するために用いるアスパラギン酸リッチドメイ
ンは第II領域に存在するものであり、第Ｖ領域に存在す
るアスパラギン酸リッチドメインIIに対して、アスパラ
ギン酸リッチドメインＩとして区別する。
【００２４】上記のごときアスパラギン酸リッチドメイ
ンを有するプレニル二リン酸合成酵素としては、ファル
ネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合
成酵素、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素、ヘプタプレ
ニル二リン酸合成酵素、オクタプレニル二リン酸合成酵
素、ノナプレニル二リン酸合成酵素、ウンデカプレニル
二リン酸合成酵素等が挙げられる。
【００２５】さらに具体的な例として、バシラス・ステ
アロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のファルネシル二リン酸合
成酵素、エセリシア・コーライ（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）のファルネシル二リン酸合成酵素、サッカ
ロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のファルネシル二リン酸合成酵
素、ラットのファルネシル二リン酸合成酵素、ヒトのフ
ァルネシル二リン酸合成酵素、ニューロスポラ・クラッ
サ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のゲラニル
ゲラニル二リン酸合成酵素、サッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）のヘキサプレニル二リン酸合成酵素、等があげられ
る。
【００２６】これらの内の幾つかの例として、プレニル
二リン酸合成酵素のアミノ酸配列における領域Ｉ〜Ｖ、
及び領域IIの中のアスパラギン酸リッチドメインＩ（わ
く内）を図１に示す。本発明は、これらアスパラギン酸
リッチドメインＩを有するプレニル二リン酸合成酵素に
適用することができる。
【００２７】本発明においては、プレニル二リン酸合成
酵素のアミノ酸配列において、第二領域に存在するアス
パラギン酸リッチドメインＤ1Ｄ2Ｘ1(Ｘ2Ｘ3)Ｘ4Ｄ
3（配列中、Ｄ1、Ｄ2及びＤ3はアスパラギン酸を示し、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4は任意のアミノ酸を示し、そして
Ｘ2及び／又はＸ3は存在しない場合がある）のＤ1から
５残基Ｎ−末端側に存在するアミノ酸がAla、Ser又はGl
yにより置換されており、且つＤ1から８残基Ｎ−末端側
に存在するアミノ酸がGlyにより置換されているアミノ
酸配列を有する変異型プレニル二リン酸合成酵素を提供
する。
【００２８】さらに、前記Ｘ2及び／又はＸ3が欠失され
ている更に修飾されたアミノ酸配列を有する変異型プレ
ニル二リン酸合成酵素を提供する。本発明の変異型プレ
ニル二リン酸合成酵素は、変異前のプレニル二リン酸合
成酵素が合成するプレニル二リン酸の鎖長よりも長いプ
レニル二リン酸を合成することができる。
【００２９】本発明においては、具体例として、高度好
熱性アーキアのスルホロバス・アシドカルダリウス（Ｓ
ｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）
のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子を出発材料
として用いる。スルホロバス・アシドカルダリウス（Ｓ
ｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）
はＡＴＣＣ Ｎｏ．３３９０９として、ＡＴＣＣより入
手することができる。この遺伝子のクローンニング方法
は特願平６−３１５５７２の明細書に詳細に記載されて
いる。また、ＧｅｎＢａｎｋ等の遺伝情報データベース
でもアクセッション番号Ｄ２８７４８で公開されてお
り、その配列をプローブに用いれば広く知られた方法に
よりクローニングできる。さらに、他のクローニング方
法の一例を本明細書に実施例１として記載すると共に、
その塩基配列を配列番号：２として示す。
【００３０】本発明においては、具体例として、配列番
号：１に示すスルホロバス・アシドカルダリウス由来の
プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において下記
のごとくアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する酵
素を挙げることができる。 変異酵素１：７４位のロイシン→グリシン及び７７位の
フェニルアラニン→アラニンの変化； 変異酵素２：７４位のロイシン→グリシン及び７７位の
フェニルアラニン→セリンの変化； 変異酵素３：７４位のロイシン→グリシン及び７７位の
フェニルアラニン→グリシンの変化。
【００３１】さらに、本発明においては具体例として、
好熱性細菌のバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）のファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子を出発材料
として用いる。バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）はＡＴＣＣ Ｎｏ．１０１４９として、ＡＴＣＣよ
り入手することができる。この遺伝子のクローンニング
方法は特開平５−２１９９６１の明細書に詳細に記載さ
れている。また、ＧｅｎＢａｎｋ等の遺伝情報データベ
ースでもアクセッション番号Ｄ１３２９３で公開されて
おり、その配列をプローブに用いれば広く知られた方法
によりクローニングできる。さらに、他のクローニング
方法の一例を本明細書に実施例２として記載すると共
に、その塩基配列を配列番号：４として示す。
【００３２】本発明においては、具体例として、配列番
号：３に示すバシラス・ステアロサーモフィラス由来の
プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において下記
のごとくアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する酵
素を挙げることができる。 変異酵素４：７８位のイソロイシン→グリシン及び８１
位のチロシン→グリシンの変化； 変異酵素５：７８位のイソロイシン→グリシン及び８１
位のチロシン→グリシンの変化及び８９位のプロリン、
９０位のセリンの欠失；
【００３３】変異酵素６：７８位のイソロイシン→グリ
シン及び８１位のチロシン→アラニンの変化； 変異酵素７：７８位のイソロイシン→グリシン及び８１
位のチロシン→アラニンの変化、並びに８９位のプロリ
ン及び９０位のセリンの欠失； 変異酵素８：７８位のイソロイシン→グリシン及び８１
位のチロシン→セリンの変化； 変異酵素９：７８位のイソロイシン→グリシン及び８１
位のチロシン→セリンの変化、並びに８９位のプロリン
及び９０位のセリンの欠失。
【００３４】酵素はその生来のアミノ酸配列に比べて１
又は少数個のアミノ酸の付加、除去、及び／又は置換に
よって修飾されている場合でもその本来の酵素活性を有
する場合があることが知られている。従って、本発明は
配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列に対して１又
は少数個、例えば５個まで、又は１０個までのアミノ酸
が置換、欠失及び／又は付加により変化しているアミノ
酸配列を有し、なお生来の機能を果たすことができる酵
素も包含する。本発明はまた、例えば配列番号：２又は
４に示すごときプレニル二リン酸合成酵素をコードする
塩基配列を有する核酸と常用の、例えば５０℃〜６５℃
にて６〜０．２×ＳＳＣのストリンジェンシー条件下で
ハイブリダイズする核酸にコードされており、プレニル
二リン酸合成酵素活性を有する蛋白質をも提供する。
【００３５】本発明はまた、上記の種々の変異型酵素を
コードする遺伝子及びそれを含むベクター、特に発現ベ
クター、及び該ベクターにより形質転換された宿主を提
供する。本発明の遺伝子（ＤＮＡ）は、例えば配列番
号：１又は３に示す生来のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡに部位特定突然変異誘発やＰＣＲ法等の定法に従っ
て変異を導入することにより容易に得ることができる。
さらに、一旦目的とする酵素のアミノ酸配列が定まれ
ば、それをコードする適当な塩基配列を決定することが
でき、常用のＤＮＡ合成法によりＤＮＡを化学合成する
こともできる。本発明はまた、前記のごときＤＮＡを含
んで成る発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換
された宿主、及びこれらの宿主を用いての本発明の酵素
又はペプチドの製造法を提供する。
【００３６】発現ベクターはその複製開始点、発現制御
配列等を含有するが、これらは宿主により異なる。宿主
としては、原核生物、例えば細菌、例えば大腸菌、バシ
ラス属細菌、例えばバシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｕ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、真核性微生物、例え
ば真菌、例えば酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属するサッカロミセス・セレ
ビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やピキア（Ｐｉ
ｃｈｉａ）属に属するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、糸状菌、例えばアスペルギル
ス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、動物細胞、例えばカ
イコの培養細胞、高等動物の培養細胞例えばＣＨＯ細胞
等が挙げられる。また、植物を宿主とすることも可能で
ある。
【００３７】本発明によれば、実施例に示すごとく、本
発明のＤＮＡにより形質転換した宿主を培養することに
より、培養物中に長鎖プレニル二リン酸を蓄積すること
ができ、これを採取することにより長鎖プレニル二リン
酸を製造することができる。本発明によればまた、本発
明の方法により製造した変異型プレニル二リン酸合成酵
素を基質イソペンテニル二リン酸及び各アリル性基質、
例えばジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸に作
用させることによっても長鎖プレニル二リン酸を製造す
ることができる。
【００３８】宿主に大腸菌を用いる場合を例に取れば、
ＤＮＡからｍＲＮＡを転写する過程とｍＲＮＡからタン
パク質を翻訳する過程などの遺伝子発現調節機能がある
ことが知られている。ｍＲＮＡの合成を調整するプロモ
ータ配列として、天然に存在する配列（例えばｌａｃ，
ｔｒｐ，ｂｌａ，ｌｐｐ，ＰL ，ＰR ，ｔｅｒ，Ｔ７，
Ｔ３など）以外にも、それらの変異体（例えばｌａｃＵ
Ｖ５）や天然にあるプロモーター配列を人工的に融合し
た（例えばｔａｃ，ｔｒｃなど）配列が知られており、
本発明にも使用できる。
【００３９】ｍＲＮＡからタンパクを合成する能力を調
節する配列として、リボソームバインディングサイト
（ＧＧＡＧＧ及びその類似配列）配列と開始コドンであ
るＡＴＧまでの距離が重要であることは既知である。ま
た３′側に転写終了を指令するターミネーター（例え
ば、ｒｒｎＰＴ1 Ｔ2 を含むベクターがファルマシア社
から市販されている）が組換え体でのタンパク質合成効
率に影響することはよく知られている。
【００４０】本発明の組換えベクターを調製するのに使
用できるベクターとしては、市販のものをそのまま用い
るか、または目的に応じて誘導した各種ベクターを挙げ
ることができる。例えば、ｐＭＢ１由来のｒｅｐｕｌｉ
ｃｏｎを持つｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２７，ｐＫＫ２２
３−３，ｐＫＫ２３３−２，ｐＴｒｃ９９等や、コピー
数が向上するように改変したｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，
ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＴＶ１１８Ｎ，ｐＴＶ
１１９Ｎ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＨＳＧ２９８，
ｐＨＳＧ３９６等、またｐ１５Ａ由来のｒｅｐｕｌｉｃ
ｏｎを持つｐＡＣＹＣ１１７やｐＡＣＹＣ１８４等、さ
らにはｐＳＣ１０１やＣｏｌＥ１やＲ１やＦ因子などに
由来Ｃ Ｉラスミドが挙げられる。さらに、より精製の
容易な融合蛋白質発現ベクター例えばｐＧＥＸ−２Ｔ，
ｐＧＥＸ−３ＸやｐＭａｌ−ｃ２のようなベクターも利
用でき本発明の出発材料として用いた遺伝子の例が特願
平６−３１５５７２に記載されている。
【００４１】また、プラスミド以外にも、λファージや
Ｍ１３ファージのようなウイルスベクターやトランスポ
ゾンによっても遺伝子導入が可能である。大腸菌以外の
微生物への遺伝子導入では、ｐＵＢ１１０（Ｓｉｇｍａ
社から販売）やｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造より販売）
などによるバシラス属への遺伝子導入が知られている。
これらベクターについてはMolecular Cloning （J. Sam
brook, E.F. Fritsch,T. Maniatis著Cold Spring Habor
Laboratory Press発行）やCloning Vector（P.H. Pouw
els, B.B. Bnger, Valk, W.J. Brammar著Elsevier発
行）や各社カタログに記載されている。
【００４２】これらのベクターへの、プレニル二リン酸
合成酵素をコードするＤＮＡ断片及び必要により前記酵
素の遺伝子を発現調節する機能を有するＤＮＡ断片の組
み込みは、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知の方
法で行うことができる。こうして作製される発明のプラ
スミドの具体的なものとしてはｐＢｓ−ＳａｃＧＧＰＳ
が挙げられる。
【００４３】このような組換えベクターで遺伝子導入で
きる微生物としてはエシェリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属に属する微生物も利用することができる。この形
質転換も常法、例えばMolecular Cloning （J. Sambroo
k, E.F. Fritsch, T. Maniatis著Cold Spring HaborLab
oratory Press発行）やDNA Cloning Vol. I〜III （D.
M. Glover 編IRL PRESS 発行）などに記載された、Ｃａ
Ｃｌ2 法やプロトプラスト法により行うことができる。
本発明の変異型酵素を製造するには、上記形質転換され
た宿主を培養し、その培養物から常法に従って、例えば
塩析、有機溶媒沈殿、ゲル濾過、アフィニティークロマ
トグラフィー、疎水クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー等により回収精製することができる。
【００４４】本発明はまた、本発明の酵素を用いてゲラ
ニルゲラニル二リン酸、ゲラニルファルネシル二リン
酸、ヘキサプレニル二リン酸、ヘプタプレニル二リン
酸、オクタプレニル二リン酸、ノナプレニル二リン酸、
デカプレニル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、ド
デカプレニル二リン酸、トリデカプレニル二リン酸、テ
トラデカプレニル二リン酸、ペンタデカプレニル二リン
酸、ヘキサデカプレニル二リン酸等の炭素数２０以上の
プレニル二リン酸を製造する方法を提供する。この方法
においては、媒体、特に水性媒体中で、本発明の酵素と
を反応せしめ、所望により反応媒体から目的とするプレ
ニル二リン酸を採取すればよい。
【００４５】酵素としては、精製酵素のみならず、種々
の段階まで半精製して得られる粗酵素、又は培養菌体も
しくは培養物等の酵素含有物でもよい。また、前記の酵
素、粗酵素又は酵素含有物を常法に従って固定した固定
化酵素であってもよい。基質としてはジメチルアリル二
リン酸または、ゲラニル二リン酸または、ファルネシル
二リン酸または、ゲラニルゲラニル二リン酸とイソペン
テニル二リン酸とが用いられる。反応媒体としては水又
は水性緩衝液例えばトリス緩衝液やリン酸緩衝液等が用
いられる。
【００４６】本発明で得られた変異型プレニル二リン酸
合成酵素製造法を用いれば、例えばより安定性が高く扱
いやすいアーキア由来のゲラニルゲラニル二リン酸、ゲ
ラニルファルネシル二リン酸、ヘキサプレニル二リン
酸、ヘプタプレニル二リン酸、オクタプレニル二リン
酸、ノナプレニル二リン酸、デカプレニル二リン酸、ウ
ンデカプレニル二リン酸、ドデカプレニル二リン酸、ト
リデカプレニル二リン酸、テトラデカプレニル二リン
酸、ペンタデカプレニル二リン酸、ヘキサデカプレニル
二リン酸等の炭素数２０以上プレニル二リン酸を生成す
る変異型プレニル二リン酸合成酵素を創出することが可
能となる。
【００４７】特許請求の範囲と明細書中で、アミノ酸残
基は以下の１文字表記または３文字表記の略号で示され
る。 Ａ；Ａｌａ；アラニン Ｃ；Ｃｙｓ；システイン Ｄ；Ａｓｐ；アスパラギン酸 Ｅ；Ｇｌｕ；グルタミン酸 Ｆ；Ｐｈｅ；フェニルアラニン Ｇ；Ｇｌｙ；グリシン Ｈ；Ｈｉｓ；ヒスチジン Ｉ；Ｉｌｅ；イソロイシン Ｋ；Ｌｙｓ；リジン Ｌ；Ｌｅｕ；ロイシン Ｍ；Ｍｅｔ；メチオニン Ｎ；Ａｓｎ；アスパラギン Ｐ；Ｐｒｏ；プロリン Ｑ；Ｇｌｎ；グルタミン Ｒ；Ａｒｇ；アルギニン Ｓ；Ｓｅｒ；セリン Ｔ；Ｔｈｒ；スレオニン Ｖ；Ｖａｌ；バリン Ｗ；Ｔｒｐ；トリプトファン Ｙ；Ｔｙｒ；チロシン
【００４８】アミノ酸残基の置換は、「置換前のアミノ
酸残基」「アミノ酸残基番号」「置換後のアミノ酸残
基」の順番で１文字表記のアミノ酸残基記号で表わし、
たとえば８１位のチロシン残基がメチオニン残基に置き
換わった変異はＹ８１Ｍと表す。また、アミノ酸残基の
欠失は、「欠失前のアミノ酸残基」「アミノ酸残基番
号」「−」で表し、例えば８１位のチロシンが欠失した
変異はＹ８１−と表す。
【００４９】
【実施例】本発明を実施例をあげて説明するが、本発明
は以下の実施例に限定されるものではない。実施例１．ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子を
含むプラスミドの作製 東洋紡績より市販されているプラ
スミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ＫＳ＋）の
ＨｉｎｄIII 部位にスルホロバス・アシドカルダリウス
（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕ
ｓ）由来のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（以下Ｓ
ａｃＧＧＰＳと略す）遺伝子をサブクローニングした。
このプラスミドＤＮＡをｐＢｓ−ＳａｃＧＧＰＳとす
る。ＳａｃＧＧＰＳ遺伝子は、平成６年１月３１日付け
で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−
１４０８９として国際寄託されエシェリシアコーライ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ｐＧＧＰＳ１／Ｄ
Ｈ５αより入手できる。
【００５０】また、ＳａｃＧＧＰＳ遺伝子の塩全基配列
は平成６年特許願０５３８０４号やShin-ichi Ohnuma e
t al. (1994) The Journal of Biological Chemistry V
ol.269, pp. 14792-14797または、ＧｅｎＢａｎｋなど
の遺伝情報データベースでアクセッション番号Ｄ２８７
４８として公開されており、スルホロバス・アシドカル
ダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄ
ａｒｉｕｓ）もＡＴＣＣ Ｎｏ．３３９０９としてＡＴ
ＣＣなどの各種微生物の寄託機関から入手可能なので、
通常の遺伝子クローニング法によってＳａｃＧＧＰＳ遺
伝子部分のＤＮＡを得ることができる。
【００５１】実施例２．ＳａｃＧＧＰＳ変異導入用オリ
ゴヌクレオチドの合成 ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子の変異導入は
まず、平成７年特許願第２４７０４３号の明細書中実施
例２に従って得られた変異型ＳａｃＧＧＰＳのうち、７
７位のフェニルアラニンがセリンに置換された変異型ゲ
ラニルゲラニル二リン酸合成酵素（Ｆ７７Ｓ）遺伝子が
組み込まれたプラスミドをもとに実施例３に示す方法で
変異を導入した。この変異型ゲラニルゲラニル二リン酸
合成酵素（Ｆ７７Ｓ）遺伝子は化学的な変異源処理によ
り作製されたが、この方法に以外にもＫｕｎｋｅｌ法あ
るいはＰＣＲ法といった既知の方法でも作製することが
できる。目的とする変異の導入のため下記のようなオリ
ゴヌクレオチドをデザインし合成した。
【００５２】プライマーＤＮＡ１（Ｌ７４Ｇ，Ｆ７７
Ｓ）： 5′GGTGCAGCAATTGAAGTTGGTCATACT3′（配列番
号：５） さらに、プライマーＤＮＡ１により変異を導入された遺
伝子をもとに実施例３に示す方法で変異を導入するため
に下記のようなオリゴヌクレオチドをデザイン合成し
た。 プライマーＤＮＡ２（Ｌ７４Ｇ，Ｆ７７Ａ）： 5′CATA
CTGCTACGCTTGTTCATGATG3′（配列番号：６） プライマーＤＮＡ３（Ｌ７４Ｇ，Ｆ７７Ｇ）： 5′CATA
CTGGTACGCTTGTTCATGATG3′（配列番号：７）
【００５３】これらは、ＳａｃＧＧＰＳの７４位のロイ
シン及び７７位のフェニルアラニンをコードするコドン
に変異が導入されるような目的に加えて新たに制限酵素
ＢｓｐＨＩの切断部位あるいは、ＭｕｎＩ切断部位が導
入されるような設計になっている。この、ＢｓｐＨＩ切
断部位の導入ではコドンの縮重のためＳａｃＧＧＰＳ遺
伝子がコードするアミノ酸配列は変化しない。これは、
ＳａｃＧＧＰＳ遺伝子の７４位のアミノ酸残基及び７７
位のアミノ酸残基に対するコドンに置換変異が導入され
ると同時にＢｓｐＨＩ切断部位あるいはＭｕｎＩ切断部
位が新しく作られるので、ＢｓｐＨＩ消化後あるいはＭ
ｕｎＩ消化後のアガロースゲル電気泳動で置換変異導入
されたプラスミドを検出するためのものである。これら
プライマーＤＮＡは以下の反応溶液中で３７度Ｃで３０
分間リン酸化をした後７０度Ｃで１０分間失活処理す
る。
【００５４】 １０pmol／μｌプライマーＤＮＡ ２μｌ １０ｘ Ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ １０mM ＡＴＰ １μｌ Ｈ２Ｏ ５μｌ Ｔ４ Ｐｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ １μｌ ただし、１０ｘ Ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは、
１０００mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（pH８．０）、１００mM
ＭｇＣｌ２、７０mM ＤＴＴ。
【００５５】実施例３．ＳａｃＧＧＰＳ遺伝子の置換変
異の導入 実施例２で作製した各プライマーＤＮＡを用いて、Ｋｕ
ｎｋｅｌ法によって変異型ＳａｃＧＧＰＳ遺伝子が組み
込まれたプラスミドに置換変異を導入した。Ｋｕｎｋｅ
ｌ法を行なうにあたっては、寶酒造から市販されている
Ｍｕｔａｎ−Ｋキットを用いた。実験手順もＭｕｔａｎ
−Ｋキット添付の実験書にしたがった。プラスミドの置
換変異は必ずしもＫｕｎｋｅｌ法である必要はなく、例
えば、ポリメラーゼ鎖反応法（ＰＣＲ）を用いる方法で
もまったく同じ結果を得ることができる。
【００５６】Ｍｕｔａｎ−Ｋキット中のエシェリシアコ
ーライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＣＪ２３６
をホストセルとしてプラスミドｐＢｓ−ＳａｃＧＧＰＳ
中のチミン塩基がデオキシウラシル塩基に置き換わった
一本鎖ＤＮＡを調製する。得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型
にして相補鎖合成用プライマーＤＮＡを下記のような反
応溶液により６５℃で１５分処理し３７℃で１５分静置
することによってアニーリングさせる。 一本鎖ＤＮＡ ０．６pmol Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １μｌ プライマーＤＮＡ溶液（実施例２） １μｌ Ｈ2 Ｏ 最終容積１０μｌにする
【００５７】ただし、Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅ
ｒは、２００mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（pH８．０）、１００
mM ＭｇＣｌ２、５００mM ＮａＣｌ、１０mMＤＴＴ。
さらに、２５μｌのＥｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅ
ｒ、６０ｕｎｉｔｓのエシェリシアコーライ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、１
ｕｎｉｔのＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加
え、２５℃で２時間相補鎖合成反応させる。ただし、Ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは、５０mMＴｒｉｓ−
Ｃｌ（pH８．０）、６０mM酢酸アンモニウム、５mM Ｍ
ｇＣｌ２、５mM ＤＴＴ、１mM ＮＡＤ、０．５mM ｄ
ＮＴＰ。反応後、３μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡ（pH８．
０）を加え、６５℃５分間処理することにより反応停止
させる。
【００５８】実施例４．ファルネシル二リン酸合成酵素
遺伝子を含むプラスミドの作製 プラスミドベクターｐＵＣ１１９のＫｐｎＩ，ＰｓｔＩ
部位にバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来
のファルネシル二リン酸合成酵素（以下ＢｓｔＦＰＳと
略す）遺伝子をサブクローニングした。このプラスミド
ＤＮＡをｐＥＸ１とする。ＢｓｔＦＰＳ遺伝子は、平成
３年９月２６日付けで工業技術生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−３５８１として国際寄託されたエシ
ェリシアコーライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０９（ｐＥＸ１）より入手できる。
【００５９】また、ＢｓｔＦＰＳ遺伝子の塩全基配列
は、特開平５−２１９９６１号または、ＧｅｎＢａｎｋ
などの遺伝情報データベースでアクセッション番号Ｄ１
３２９３として公開されており、バシラス・ステアロサ
ーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）もＡＴＣＣ Ｎｏ．１０１４９と
してＡＴＣＣなどの各種微生物の寄託機関から入手可能
なので、通常の遺伝子クローニング法によってＢｓｔＦ
ＰＳ遺伝子部分のＤＮＡを得ることができる。さらに、
バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のファ
ルネシル二リン酸合成酵素を大量発現させる目的でファ
ルマシアから市販されている発現ベクターｐＴｒｃ９９
ＡのＮｃｏＩ，ＨｉｎｄIII 部位にＢｓｔＦＰＳ遺伝子
を組み込んだ〔Ｔ．Ｋｏｙａｍａｅｔ ａｌ．（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３，３５５−３６３〕。
このプラスミドＤＮＡをｐＥＸ１１とする。
【００６０】実施例５．ＢｓｔＦＰＳ変異導入用オリゴ
ヌクレオチドの合成と置換変異の導入 ＢｓｔＦＰＳ遺伝子への変異の導入は実施例４で作製さ
れた発現ベクターｐＥＸ１１を用いてポリメラーゼ鎖反
応（ＰＣＲ）法で行った。変異を導入するために下記の
ようなオリゴヌクレオチドをデザインし合成した。 プライマーＤＮＡ４： 5′AAACAGACCATGGCGCTTTC 3′
（配列番号：８） プライマーＤＮＡ５： 5′CAGCCAAGCTTTTAATGGTC 3′
（配列番号：９） プライマーＤＮＡ６： 5′CTTTGATTCATGATGATTTG 3′
（配列番号：１０）
【００６１】プライマーＤＮＡ７： 5′ATCATCATGAATCA
AAGAAGACGTATGGCCCATTTC 3′（配列番号：１１） プライマーＤＮＡ８： 5′ATCATCATGAATCAAAGAGGCCGTAT
GGCCCATTTC 3′（配列番号：１２） プライマーＤＮＡ９： 5′ATCATCATGAATCAAAGAGCCCGTAT
GGCCCATTTC 3′（配列番号：１３） プライマーＤＮＡ１０： 5′ATGGACAACGATGATTTGCG 3′
（配列番号：１４） プライマーＤＮＡ１１： 5′CAAATCATCATGGATCAAAG 3′
（配列番号：１５）
【００６２】ポリメラーゼ鎖反応は宝酒造から市販され
ているＥｘＴａｑを用い、その取り扱い説明書に従い行
った。置換変異導入のために、プライマーＤＮＡ４とプ
ライマーＤＮＡ７、プライマーＤＮＡ４とプライマーＤ
ＮＡ８、プライマーＤＮＡ４とプライマーＤＮＡ９、及
びプライマーＤＮＡ５とプライマーＤＮＡ６のそれぞれ
の組み合わせでポリメラーゼ鎖反応をおこなった。反応
サイクルは９４度３０秒、５０度３０秒及び７２度１分
のサイクルを３５回繰り返した。この反応により生成し
たＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動し、目
的の長さを持つＤＮＡフラグメントをゲルを切り出すこ
とにより精製した。
【００６３】それぞれのプライマーの組み合わせからポ
リメラーゼ鎖反応により、生成したＤＮＡフラグメント
をそれぞれフラグメント１（プライマーＤＮＡ４とプラ
イマーＤＮＡ７）、フラグメント２（プライマーＤＮＡ
４とプライマーＤＮＡ８）、フラグメント３（プライマ
ーＤＮＡ４とプライマーＤＮＡ９）、及びフラグメント
４（プライマーＤＮＡ５とプライマーＤＮＡ６）とす
る。
【００６４】さらにフラグメント１，２及び３は制限酵
素ＮｃｏＩ及び制限酵素ＢｓｐＨＩで切断し、フラグメ
ント４は制限酵素ＨｉｎｄIII 及び制限酵素ＢｓｐＨＩ
で切断することによって、フラグメントの末端を整え、
フラグメント１とフラグメント４、フラグメント２とフ
ラグメント４、フラグメント３とフラグメント４をライ
ゲーションした。ライゲーションには宝酒造から市販さ
れているライゲーションキットを用いた。ライゲーショ
ンされたそれぞれのフラグメントをファルマシアから市
販されているプラスミドベクターｐＴｒｃ９９ＡのＮｃ
ｏＩ，ＨｉｎｄIII 部位に組み込んだ。また、置換変異
したｐＥＸ１１はＢｓｔＦＰＳコード領域において制限
酵素ＢｓｐＨＩで切断されるようになるが、遺伝暗号の
宿合によりこの部分のアミノ酸は置換されない。実施例
６に示す方法で形質導入を行った。
【００６５】それぞれのフラグメントと突然変異体の関
係を以下に示す。 フラグメント１とフラグメント４→１７８Ｇ，Ｙ８１Ｓ フラグメント２とフラグメント４→１７８Ｇ，Ｙ８１Ａ フラグメント３とフラグメント４→１７８Ｇ，Ｙ８１Ｇ それぞれの置換変異ｐＥＸ１１に対しさらにプライマー
ＤＮＡ１０とプライマーＤＮＡ１１をプライマーに用い
てポリメラーゼ鎖反応を行った。反応サイクルは、９４
℃３０秒、５４℃１５秒及び７２℃４分間のサイクルを
３０回繰り返した。その後アガロースゲル電気泳動によ
り目的の長さのＤＮＡフラグメントを精製、Ｋｌｅｎｏ
ｗ ＦｒａｇｍｅｎｔによりＤＮＡフラグメントの末端
を整え、さらにＴ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋ
ｉｎａｓｅを用いることによりリン酸化した後、セルフ
ライゲーションさせた。Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ及びＴ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓ
ｅは宝酒造から市販されているものをその説明書に従っ
て用いた。
【００６６】また、セルフライゲーションには前述のラ
イゲーションキットを用いた。それぞれの置換変異ＰＥ
Ｘ１１とプライマーＤＮＡ１０とプライマーＤＮＡ１１
を用いポリメラーゼ鎖反応により作製した欠失変異の関
係を以下に示す。 １７８Ｇ，Ｙ８１Ｓ→１７８Ｇ，Ｙ８１Ｓ，Ｐ８９−，
Ｓ９０− １７８Ｇ，Ｙ８１Ａ→１７８Ｇ，Ｙ８１Ａ，Ｐ８９−，
Ｓ９０− １７８Ｇ，Ｙ８１Ｇ→１７８Ｇ，Ｙ８１Ｇ，Ｐ８９−，
Ｓ９０− ここで作製された欠失変異体ｐＥＸ１１はもとの置換変
異ｐＥＸ１１と選別できるように置換変異を導入した際
に生じさせた制限酵素ＢｓｐＨＩの切断部位を除き、変
異前のｐＥＸ１１と同じになるようにしてある。
【００６７】実施例６．ＳａｃＧＧＰＳ及びＢｓｔＦＰ
Ｓ遺伝子の置換変異の導入された遺伝子を持つ形質転換
体の作製 実施例３及び実施例５により、作製したＤＮＡ溶液を用
いて下記のようにしてエシェリシアコーライ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−ＢｌｕｅへＣａＣ
ｌ2 法により形質転換した。別の方法、例えば、エレク
トロポーレーション法によっても同様の結果が得られ
る。宿主細胞もエシェリシアコーライ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ以外の細胞例え
ばＪＭ１０９等を用いても同様の結果が得られる。
【００６８】ＣａＣｌ2 法によって得られた形質転換体
は、形質転換体選択マーカーであるアンピシリン含有寒
天プレートにまき３７℃で一晩培養する。上記の様にし
て得られた形質転換体のうちＢｓｐＨＩ切断部位あるい
はＭｕｎＩ切断部位をＳａｃＧＧＰＳコード領域あるい
はＢｓｔＦＰＳコード領域に持つ置換変異型ｐＢｓ−Ｓ
ａｃＧＧＰＳプラスミドあるいは変異型ｐＥＸ１１プラ
スミドを選択した。欠失変異を導入した変異型ｐＥＸ１
１プラスミドはＢｓｔＦＰＳコード領域にＢｓｐＨＩ切
断部位を持たなくなった変異型ｐＥＸ１１プラスミドを
選択した。選択した置換変異型ｐＢｓ−ＳａｃＧＧＰＳ
プラスミドのＳａｃＧＧＰＳ遺伝子あるいは変異型ｐＥ
Ｘ１１プラスミドのＢｓｔＦＰＳ遺伝子の変異されるア
ミノ残基に対するコドン周辺の塩基配列をダイデオキシ
法によって決定し、目的の変異が導入されていることを
確認した。
【００６９】実施例７．変異型プレニル二リン酸合成酵
素の活性測定 実施例６で得られた９種の変異型及び１種の野生型Ｓａ
ｃＧＧＰＳ遺伝子、１種の野生型ＢｓｔＦＰＳ遺伝子を
含む、計１１種の形質転換体から下記の様にして粗酵素
液を調製した。２ｘＬＢ培地で一晩培養した形質転換体
を遠心により集菌し、菌体破砕用ｂｕｆｆｅｒ（５０mM
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（pH８．０）、１０mM β−メルカプ
トエタノール、１mM ＥＤＴＡ）に懸濁する。これを超
音波破砕処理し４℃１０，０００r.p.m.、１０分遠心処
理後の上清を５５℃で１時間熱処理しエシェリシアコー
ライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプレ
ニル二リン酸合成酵素活性を失活させた。
【００７０】これをさらに同条件で遠心処理し、その上
清を粗酵素抽出液とした。反応は下記の反応溶液で５５
℃１時間行なった。 〔１−14Ｃ〕−イソペンテニル二リン酸（１Ｃｉ／mol ） ２５nmol アリル性二リン酸（ゲラニル二リン酸） ２５nmol リン酸カリウム緩衝液（pH５．８） １０mM ＭｇＣｌ2 ５mM 酵素液 １００μｇ Ｈ2 Ｏで２００μｌにする。
【００７１】反応後、反応溶液に飽和ＮａＣｌを２００
μｌ添加し、さらに１mlの水飽和ブタノールを加え、撹
拌、遠心し、二相分離させる。得られたブタノール層８
００μｌに液体シンチレーター３mlを加えて、液体シン
チレーションカウンターにより放射活性を測定する。残
りのブタノール層は加温しながら窒素ガスを吹き付け溶
媒を蒸発させて０．５ml程度まで濃縮する。これに、メ
タノール２mlとポテト酸性フォスファターゼ溶液（２mg
／mlポテト酸性フォスファターゼ、０．５Ｍ酢酸ナトリ
ウム（pH４．７））１mlを加え３７℃で脱リン酸化反応
を行なう。
【００７２】つぎに、ｎ−ペンタン３mlで脱リン酸化さ
れた反応産物を抽出する。これを、窒素ガス吹き付けに
より溶媒を蒸発させて濃縮しこれをＴＬＣ（逆層ＴＬＣ
プレート：ＬＫＣ１８（Ｗｈａｔｍａｎ社製）、展開溶
媒：アセトン／水＝９／１あるいはアセトン／水＝１９
／１）により解析する。展開された脱リン酸化された反
応産物はバイオイメージアナライザーＢＡＳ２０００
（富士写真フィルム社製）によって放射活性の位置を決
定した。ＳａｃＧＧＰＳ遺伝子に変異導入した変異型プ
レニル二リン酸合成酵素の結果を図２に、ＢｓｔＦＰＳ
遺伝子に変異導入した変異型プレニル二リン酸合成酵素
２種類の結果を図３に示す。ＢｓｔＦＰＳ遺伝子に変異
導入した他の変異型プレニル二リン酸合成酵素の結果も
図３と同様であった。
【００７３】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起原： 生物名：スルホロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆ
ｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄ ｏｃａｌｄａｒｉｕｓ） 株名：ＡＴＣＣ３３９０９ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：アスパラギン酸リッチドメイン（Ａ
ｓｐ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ） 存在位置：８２−８６ Met Ser Tyr Phe Asp Asn Tyr Phe Asn Glu Ile Val Asn Ser Val Asn 5 10 15 Asp Ile Ile Lys Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Val Pro Lys Leu Tyr Glu 20 25 30 Ala Ser Tyr His Leu Phe Thr Ser Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Leu 35 40 45 Ile Leu Thr Ile Ser Ser Asp Leu Phe Gly Gly Gln Arg Glu Arg Ala 50 55 60 Tyr Tyr Ala Gly Ala Ala Ile Glu Val Leu His Thr Phe Thr Leu Val 65 70 75 80 His Asp Asp Ile Met Asp Gln Asp Asn Ile Arg Arg Gly Leu Pro Thr 85 90 95 Val His Val Lys Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Ile Leu Ala Gly Asp Leu 100 105 110 Leu His Ala Lys Ala Phe Gln Leu Leu Thr Gln Ala Leu Arg Gly Leu 115 120 125 Pro Ser Glu Thr Ile Ile Lys Ala Phe Asp Ile Phe Thr Arg Ser Ile 130 135 140 Ile Ile Ile Ser Glu Gly Gln Ala Val Asp Met Glu Phe Glu Asp Arg 145 150 155 160 Ile Asp Ile Lys Glu Gln Glu Tyr Leu Asp Met Ile Ser Arg Lys Thr 165 170 175 Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ser Ser Ser Ile Gly Ala Leu Ile Ala Gly 180 185 190 Ala Asn Asp Asn Asp Val Arg Leu Met Ser Asp Phe Gly Thr Asn Leu 195 200 205 Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Ile Leu Gly Leu Thr Ala Asp 210 215 220 Glu Lys Glu Leu Gly Lys Pro Val Phe Ser Asp Ile Arg Glu Gly Lys 225 230 235 240 Lys Thr Ile Leu Val Ile Lys Thr Leu Glu Leu Cys Lys Glu Asp Glu 245 250 255 Lys Lys Ile Val Leu Lys Ala Leu Gly Asn Lys Ser Ala Ser Lys Glu 260 265 270 Glu Leu Met Ser Ser Ala Asp Ile Ile Lys Lys Tyr Ser Leu Asp Tyr 275 280 285 Ala Tyr Asn Leu Ala Glu Lys Tyr Tyr Lys Asn Ala Ile Asp Ser Leu 290 295 300 Asn Gln Val Ser Ser Lys Ser Asp Ile Pro Gly Lys Ala Leu Lys Tyr 305 310 315 320 Leu Ala Glu Phe Thr Ile Arg Arg Arg Lys 325 330
【００７４】配列番号：２ 配列の長さ：９９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起原： 生物名：スルホロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆ
ｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄ ｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ） 株名：ＡＴＣＣ３３９０９ 配列の特徴：特徴を表わす記号：アスパラギン酸−ｒｉ
ｃｈドメインコード領域（Ａｓｐ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａ
ｉｎ ｃｏｄｉｎｇ） 存在位置：２４６−２５８ ATGAGTTACT TTGACAACTA TTTTAATGAG ATTGTTAATT CTGTAAACGA CATTATTAAG 60 AGCTATATAT CTGGAGATGT TCCTAAACTA TATGAAGCCT CATATCATTT GTTTACATCT 120 GGAGGTAAGA GGTTAAGACC ATTAATCTTA ACTATATCAT CAGATTTATT CGGAGGACAG 180 AGAGAAAGAG CTTATTATGC AGGTGCAGCT ATTGAAGTTC TTCATACTTT TACGCTTGTG 240 CATGATGATA TTATGGATCA AGATAATATC AGAAGAGGGT TACCCACAGT CCACGTGAAA 300 TACGGCTTAC CCTTAGCAAT ATTAGCTGGG GATTTACTAC ATGCAAAGGC TTTTCAGCTC 360 TTAACCCAGG CTCTTAGAGG TTTGCCAAGT GAAACCATAA TTAAGGCTTT CGATATTTTC 420 ACTCGTTCAA TAATAATTAT ATCCGAAGGA CAGGCAGTAG ATATGGAATT TGAGGACAGA 480 ATTGATATAA AGGAGCAGGA ATACCTTGAC ATGATCTCAC GTAAGACAGC TGCATTATTC 540 TCGGCATCCT CAAGTATAGG CGCACTTATT GCTGGTGCTA ATGATAATGA TGTAAGACTG 600 ATGTCTGATT TCGGTACGAA TCTAGGTATT GCATTTCAGA TTGTTGACGA TATCTTAGGT 660 CTAACAGCAG ACGAAAAGGA ACTTGGAAAG CCTGTTTTTA GTGATATTAG GGAGGGTAAA 720 AAGACTATAC TTGTAATAAA AACACTGGAG CTTTGTAAAG AGGACGAGAA GAAGATTGTC 780 CTAAAGGCGT TAGGTAATAA GTCAGCCTCA AAAGAAGAAT TAATGAGCTC AGCAGATATA 840 ATTAAGAAAT ACTCTTTAGA TTATGCATAC AATTTAGCAG AGAAATATTA TAAAAATGCT 900 ATAGACTCTT TAAATCAAGT CTCCTCTAAG AGTGATATAC CTGGAAAGGC TTTAAAATAT 960 CTAGCTGAAT TTACGATAAG AAGGAGAAAA TAA 993
【００７５】配列番号：３ 配列の長さ：２９７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起原 生物名：バシラス ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） 配列の特徴： 特徴を表わす記号：アスパラギン酸リッチドメイン（Ａ
ｓｐ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ） 存在位置：８６−９２ 配列： Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln Ala 5 10 15 Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly Pro Ala 20 25 30 Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Gly Lys Arg 35 40 45 Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp 50 55 60 Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile Glu Met Ile His Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Leu 85 90 95 Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Ala Met Ala 100 105 110 Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr 115 120 125 Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile 130 135 140 Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln 145 150 155 160 Ala Ala Asp Met Glu Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu 165 170 175 Glu Tyr Ile His Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val 180 185 190 His Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu 195 200 205 Leu Asp Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp 210 215 220 Asp Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val 225 230 235 240 Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Ser 245 250 255 Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala Ala Gln 260 265 270 Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu Ala Tyr Ile 275 280 285 Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His *** 290 295
【００７６】配列番号：４ 配列の長さ：８９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起原 生物名：バチラス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） 配列の特徴：特徴を表わす記号：アスパラギン酸−ｒｉ
ｃｈドメインコード領域（Ａｓｐ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａ
ｉｎ ｃｏｄｉｎｇ） 存在位置：２５６−２７６ 配列： GTGGCGCAGC TTTCAGTTGA ACAGTTTCTC AACGAGCAAA AACAGGCGGT GGAAACAGCG 60 CTCTCCCGTT ATATAGAGCG CTTAGAAGGG CCGGCGAAGC TGAAAAAGGC GATGGCGTAC 120 TCATTGGAGG CCGGCGGCAA ACGAATCCGT CCGTTGCTGC TTCTGTCCAC CGTTCGGGCG 180 CTCGGCAAAG ACCCGGCGGT CGGATTGCCC GTCGCCTGCG CGATTGAAAT GATCCATACG 240 TACTCTTTGA TCCATGATGA TTTGCCGAGC ATGGACAACG ATGATTTGCG GCGCGGCAAG 300 CCGACGAACC ATAAAGTGTT CGGCGAGGCG ATGGCCATCT TGGCGGGGGA CGGGTTGTTG 360 ACGTACGCGT TTCAATTGAT CACCGAAATC GACGATGAGC GCATCCCTCC TTCCGTCCGG 420 CTTCGGCTCA TCGAACGGCT GGCGAAAGCG GCCGGTCCGG AAGGGATGGT CGCCGGTCAG 480 GCAGCCGATA TGGAAGGAGA GGGGAAAACG CTGACGCTTT CGGAGCTCGA ATACATTCAT 540 CGGCATAAAA CCGGGAAAAT GCTGCAATAC AGCGTGCACG CCGGCGCCTT GATCGGCGGC 600 GCTGATGCCC GGCAAACGCG GGAGCTTGAC GAATTCGCCG CCCATCTAGG CCTTGCCTTT 650 CAAATTCGCG ATGATATTCT CGATATTGAA GGGGCAGAAG AAAAAATCGG CAAGCCGGTC 720 GGCAGCGACC AAAGCAACAA CAAAGCGACG TATCCAGCGT TGCTGTCGCT TGCCGGCGCG 780 AAGGAAAAGT TGGCGTTCCA TATCGAGGCG GCGCAGCGCC ATTTACGGAA CGCCGACGTT 840 GACGGCGCCG CGCTCGCCTA TATTTGCGAA CTGGTCGCCG CCCGCGACCA TTAA 894
【００７７】配列番号：５ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTGCAGCAA TTGAAGTTGG TCATACT 27
【００７８】配列番号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CATACTGCTA CGCTTGTTCA TGATG 25
【００７９】配列番号：７ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CATACTGGTA CGCTTGTTCA TGATG 25
【００８０】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAACAGACCA TGGCGCTTTC 20
【００８１】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGCCAAGCT TTTAATGGTC 20
【００８２】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTTGATTCA TGATGATTTG 20
【００８３】配列番号：１１ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCATCATGA ATCAAAGAAG ACGTATGGCC CATTTC 36
【００８４】配列番号：１２ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCATCATGA ATCAAAGAGG CCGTATGGCC CATTTC 36
【００８５】配列番号：１３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCATCATGA ATCAAAGAGC CCGTATGGCC CATTTC 36
【００８６】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGGACAACG ATGATTTGCG 20
【００８７】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAAATCATCA TGGATCAAAG 20
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、各種プレニル二リン酸合成酵素の領域
（Ｉ）〜（Ｖ）、並びにアスパラギン酸リッチドメイン
Ｉ、を示す図である。図中、配列はプレニル二リン酸合
成酵素のアミノ酸配列を示し、ＡＴＧＥＲＰＹＲＳはＡ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ、ＬＡ１５７７
８．ｐはＬｕｐｉｎａｓ ａｌｂｕｓ、ＣＡＧＥＲＤＩ
Ｓ．はＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、ＡＴＧＧＰＳ
ＲＰ．はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、
ＧＧＰＳ．ｐｅｐはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏ
ｃａｌｄａｒｉｕｓ、ＳＰＣＲＴ．ｐｅｐはＲｈｏｄｏ
ｂａｃｔｏｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、ＲＣＰＨＳＹ
ＮＧ．はＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒｃａｐｓｕｌａｔｕ
ｓ、ＥＨＣＲＴＳ．ｐｅはＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉ
ｃｏｌａ、ＭＸＣＲＴＮＯＤＡはＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ
ｔｈａｌｉａｎａ、ＮＣＡＬ３．ｐｅｐはＮｅｕｒｏ
ｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来のゲラニルゲラニル二リ
ン酸合成酵素を、ＢＳＦＤＰＳ．ｐｅはＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のファ
ルネシル二リン酸合成酵素を示す。それぞれのアミノ酸
配列の左側に記載されている数字は、それぞれのアミノ
酸配列のＮ末端の、それぞれのゲラニルゲラニル二リン
酸合成酵素におけるＮ末端側からの部位である。
【図２】図２はジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰ
Ｐ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リ
ン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰ
Ｐ）をそれぞれアリル性基質としたときの変異型Ｓａｃ
ＧＧＰＳ合成酵素反応物の脱リン酸化物の薄層クロマト
グラフィーによる展開パターンを示す図面代用写真であ
る。図中Ｏｒｉは展開のオリジン、Ｓ．Ｆ．はソルベン
トフロントを示す。それぞれのレーンの番号は１が野生
型ＳａｃＧＧＰＳ、２が変異型ＳａｃＧＧＰＳ（Ｌ７４
Ｇ，Ｆ７７Ｓ）、３が変異型ＳａｃＧＧＰＳ（Ｌ７４
Ｇ，Ｆ７７Ａ）、４が変異型ＳａｃＧＧＰＳ（Ｌ７４
Ｇ，Ｆ７７Ｇ）である。また、ＦＯＨはファルネソー
ル、ＧＧＯＨはゲラニルゲラニオールであり、それぞれ
ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸の脱
リン酸化より生成する。さらに長鎖長のプレニル二リン
酸の脱リン酸化により生成したプレニルアルコールも観
察される。
【図３】図３はジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リ
ン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン
酸をそれぞれアリル性基質としたときの変異型ＢｓｔＦ
ＰＳ合成酵素反応物の脱リン酸化物の薄層クロマトグラ
フィーによる展開パターンを示す図面代用写真である。
図中Ｏｒｉは展開のオリジン、Ｓ．Ｆ．はソルベントフ
ロントを示す。それぞれの変異型ＢｓｔＦＰＳ合成酵素
ごとに展開してある。図中ＢｓｔＦＰＳは野生型の酵素
を他はそれぞれの変異型酵素を示す。レーン番号は反応
に用いたアリル性プライマーを示し、１はジメチルアリ
ル二リン酸、２はゲラニル二リン酸、３はファルネシル
二リン酸、４はゲラニルゲラニル二リン酸を用い反応し
た。また、ＦＯＨはファルネソール、ＧＧＯＨはゲラニ
ルゲラニオールであり、それぞれファルネシル二リン
酸、ゲラニルゲラニル二リン酸の脱リン酸化より生成す
る。さらに長鎖長のプレニル二リン酸の脱リン酸化によ
り生成したプレニルアルコールも観察される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 大音 徳 愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自 動車株式会社内 (72)発明者 中根 弘之 愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自 動車株式会社内 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ. 271，Ｎｏ．31（1996．Ａｕｇ．）ｐ. 18831−18837 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ. 271，Ｎｏ．17（1996．Ａｐｒ．）ｐ. 10087−10095 生化学，Ｖｏｌ．68，Ｎｏ．７ （1996．Ｊｕｌ．）ｐ．645 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配
    列において、第二領域に存在するアスパラギン酸リッチ
    ドメインＤ1Ｄ2Ｘ1(Ｘ2Ｘ3)Ｘ4Ｄ3（配列中、Ｄ1、Ｄ2
    及びＤ3はアスパラギン酸を示し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ
    4は任意のアミノ酸を示し、そしてＸ2及び／又はＸ3は
    存在しない場合がある）のＤ1から５残基Ｎ−末端側に
    存在するアミノ酸がAla、Ser又はGlyにより置換されて
    おり、且つＤ 1 から８残基Ｎ−末端側に存在するアミノ
    酸がGlyにより置換されているアミノ酸配列を有する変
    異型プレニル二リン酸合成酵素。
  2. 【請求項２】 Ｘ2及び／又はＸ3が欠失している、さら
    に修飾されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の
    酵素。
  3. 【請求項３】 前記プレニル二リン酸合成酵素の反応産
    物が、ヘプタプレニル二リン酸、オクタプレニル二リン
    酸、ノナプレニル二リン酸、デカプレニル二リン酸、ウ
    ンデカプレニル二リン酸、ドデカプレニル二リン酸、ト
    リデカプレニル二リン酸、テトラデカプレニル二リン
    酸、ペンタデカプレニル二リン酸、ヘキサデカプレニル
    二リン酸である、請求項１又は２に記載の酵素。
  4. 【請求項４】 前記プレニル二リン酸合成酵素が、ホモ
    ダイマー型である請求項１〜３のいずれか１項に記載の
    酵素。
  5. 【請求項５】 前記プレニル二リン酸合成酵素が、アー
    キア由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵
    素。
  6. 【請求項６】 前記プレニル二リン酸合成酵素が、細菌
    由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素。
  7. 【請求項７】 前記プレニル二リン酸合成酵素が、スル
    ホロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocald
    arius）由来の請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵
    素。
  8. 【請求項８】 前記プレニル二リン酸合成酵素が、バシ
    ラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearotherm
    ophilus）由来の請求項１〜４のいずれか１項に記載の
    酵素。
  9. 【請求項９】 前記プレニル二リン酸合成酵素が、変異
    前のプレニル二リン酸合成酵素が有する特性を付与した
    請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵素。
  10. 【請求項１０】 前記プレニル二リン酸合成酵素が耐熱
    性酵素である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵
    素。
  11. 【請求項１１】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有
    するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の74位のロイシ
    ンがグリシンにより置換されており、且つ77位のフェニ
    ルアラニンがアラニン、セリン又はグリシンにより置換
    されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異
    型プレニル二リン酸合成酵素。
  12. 【請求項１２】 配列番号３：に示すアミノ酸配列を有
    するファルネシル二リン酸合成酵素の78位のイソロイシ
    ンがグリシンにより置換されており、且つ81位のチロシ
    ンがアラニン、セリン又はグリシンにより置換されてい
    る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型プレニ
    ル二リン酸合成酵素。
  13. 【請求項１３】 配列番号３：に示すアミノ酸配列を有
    するファルネシル二リン酸合成酵素の78位のイソロイシ
    ンがグリシンにより置換されており、且つ81位のチロシ
    ンがアラニン、セリン又はグリシンにより置換されてお
    り、そして、89位のプロリン及び90位のセリンを欠失さ
    せた、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型プレ
    ニル二リン酸合成酵素。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜13のいずれか１項に記載の
    酵素をコードするDNA。
  15. 【請求項１５】 請求項14記載のDNAから転写されるRN
    A。
  16. 【請求項１６】 請求項14記載のDNAを含んで成る組換
    えベクター。
  17. 【請求項１７】 請求項16記載の組換えベクターにより
    形質転換された宿主生物。
  18. 【請求項１８】 請求項17に記載の宿主を培養し、培養
    物から発現生成物を採取する事を特徴とする、請求項１
    〜13いずれか１項に記載の酵素製造方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜13のいずれか１項に記載の
    酵素又は請求項18に記載の方法により製造される酵素
    を、イソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン
    酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニ
    ルゲラニル二リン酸からなる群から選択される基質に作
    用せしめることを特徴とするプレニル二リン酸の製造方
    法。
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