DE69733939T2

DE69733939T2 - Mutierte prenyldiphoshatsynthasen

Info

Publication number: DE69733939T2
Application number: DE69733939T
Authority: DE
Inventors: Chikara Toyota-shi Ohto; Hiroyuki Toyota-shi NAKANE; Tokuzo Sendai-shi NISHINO; Shinichi Aoba-ku OHNUMA; Kazutake Sendai-shi HIROOKA
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1996-11-05
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-10-30
Also published as: JP3376838B2; EP0877811B1; JPH10136984A; US6316216B1; DE69733939D1; WO1998020138A1; EP0877811A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige mutierte Enzyme, welche lineare Prenyldiphosphate synthetisieren, die Vorläufer für Verbindungen sind, die wichtig für Organismen sind, wie etwa Steroide, Ubichinone, Dolichole, Karotenoide, prenylierte Proteine, Tierhormone, Pflanzenhormone und ähnliche, und auf ein Gen und die Herstellung der Enzyme.
STAND DER TECHNIK
Viele Substanzen mit wichtigen Funktionen in Organismen werden unter Verwendung von Isopren (2-Methyl-1,3-butadien) als ein Baustein biologisch synthetisiert. Diese Verbindungen werden ebenfalls Isoprenoide, Terpenoide oder Terpene genannt und werden in Abhängigkeit von der Anzahl der Kohlenstoffatome in Hemiterpene (C5), Monoterpene (C10), Sesquiterpene (C15), Diterpene (C20), Sesterterpene (C25), Triterpene (C30), Tetraterpene (C40) usw. klassifiziert. Die biologische Synthese beginnt mit dem Mevalonatweg, durch welchen Mevalonsäure-5-diphosphat synthetisiert wird, gefolgt durch die Synthese von Isopentenyldisphosphat (IPP), welches eine aktive Isopreneinheit ist.
Als die tatsächliche Einheit der Isopreneinheit, die als ein mutmaßlicher Vorläufer vorgeschlagen wurde, wurde Isopentenyldiphosphat gefunden, die sogenannte aktive Form der Isopreneinheit. Während Dimethylallydiphosphat (DMAPP), ein Isomer von Isopentenyldiphosphat, als ein Substrat in der Reaktion von Isopentenyladenin verwendet wird, welches als ein Zytokinin-Pflanzenhormon bekannt ist, ist ebenfalls bekannt, dass es eine Kondensationsreaktion mit Isopentenyldiphosphat durchläuft, um lineare aktive Isoprenoide zu synthetisieren, wie etwa Geranyldiphosphat (GPP), Neryldiphosphat, Farnesyldiphosphat (FPP), Geranylgeranyldiphosphat (GGPP), Geranylfarnesyldiphosphat (GFPP), Hexaprenyldiphosphat (HexPP), Heptaprenyldiphosphat (HepPP) und ähnliche. Es gibt bei der Kondensationsreaktion den Z-Typ und den E-Typ. Geranyldiphosphat ist ein Produkt der Kondensation vom E-Typ und Neryldiphosphat der Kondensation vom Z-Typ.
Obwohl der all-E-Typ als die aktive Form bei Farnesyldiphosphat und Geranylgeranyldiphosphat angesehen wird, führt die Kondensationsreaktion vom Z-Typ zu der Synthese verschiedener Polyprenole, die in Naturkautschuk, Dolicholen, Bactoprenolen (Undecaprenolen) und Pflanzen gefunden werden. Von ihnen wird angenommen, dass sie die Kondensationsreaktion unter Verwendung der Phosphatesterbindungsenergie des Pyrophosphats und des im Molekül vorhandenen Kohlenstoffrückgrats durchlaufen, und Pyrophosphat als das Nebenprodukt der Reaktion herstellen.
Farnesyldiphosphat oder Geranylgeranyldiphosphat dienen als ein Reaktionssubstrat, das zu der Synthese von prenylierten Proteinen (aus Farnesyldiphosphat oder Geranylgeranyldiphosphat) führt, repräsentiert durch das G-Protein, das wichtig bei dem Mechanismus der Signaltransduktion der Zelle ist; Zellmembranlipiden (aus Geranylgeranyldiphosphat) von Archaebakterien; Squalen (aus Farnesyldiphosphat), welches ein Vorläufer von Steroiden ist; und von Phytoen (aus Geranylgeranyldiphosphat), welches ein Vorläufer von Karotenoiden ist. Prenyldiphosphate aus Hexaprenyldiphosphat und Heptaprenyldiphosphat mit sechs bzw. sieben Isopreneinheiten bis zu Prenyldiphosphate mit zehn Isopreneinheiten dienen als Vorläufer für die Synthese von Ubichinon und Menachinon (Vitamin K2), die im Elektronentransportsystem beteiligt sind.
Ferner kann über die biologische Synthese dieser Aktivform-Isoprenoide eine große Zahl von Verbindungen, die lebenswichtig sind, synthetisiert werden. Um nur einige zu nennen, gibt es dort Pflanzenhormone, Zytokinine und Isopentenyladenosin-modifizierte tRNS, welche Hemiterpene als Vorläufer für ihre Synthese nutzen, Monoterpengeraniole und ihre Isomere von Nerol, welche die Hauptbestandteile des Rosenölduftstoffs sind und ein Kampferbaumextrakt, Kampfer, welches ein Insektizid ist. Sesquiterpene enthalten juvenile Hormone von Insekten, Diterpene enthalten das Pflanzenhormon Gibberellin, Spurenpheromone von Insekten und Retinole und Retinale, die als Vorläufer für braune Pigmente dienen, Bindungsbestandteile der Purpurmembranproteine von extrem halophilen Mikroorganismen und Vitamin A.
Ferner wurde unter Verwendung von Squalen, welches ein Triterpen ist, eine große Vielzahl von Steroidverbindungen synthetisiert, einschließlich z.B. tierische Sexualhormone, Vitamin D, Ecdyson, welches ein Paarungshormon von Insekten ist, das Pflanzenhormon Brassinolid und die Bestandteile der Plasmamembran. Verschiedene Karotenoide aus Tetraterpenen, die Vorläufer für verschiedene Pigmente von Organismen und Vitamin A sind, sind ebenfalls wichtige Verbindungen, die aus aktiven Isoprenoiden abgeleitet werden. Verbindungen, wie etwa Chlorophyll, Pheophytin, Tocopherol (Vitamin E) und Phyllochinon (Vitamin K1) werden ebenfalls von Tetraterpenen abgeleitet.
Die aktiven Isoprenoidsynthasen, die nacheinander Isopentenyldiphosphate mit derartigen allylischen Substraten wie Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat, Farnesyldiphosphat, Geranylgeranyldiphosphat, Geranylfarnesyldiphosphat usw. kondensieren, werden Prenyldiphosphatsynthasen genannt, und werden ebenfalls auf der Grundlage der maximalen Kettenlänge ihres Hauptreaktionsprodukts bezeichnet, z.B. Farnesyldiphosphatsynthase (FPP-Synthase), Geranylgeranyldiphosphatsynthase (GGPP-Synthase) usw.
Es gibt Berichte über die Reinigung, die Aktivitätsmessung, die Genklonierung und die Nucleotidsequenzierung von Enzymen, wie etwa
Farnesyldiphosphatsynthase,
Geranylgeranyldiphosphatsynthase,
Hexaprenyldiphosphatsynthase,
Heptaprenyldiphosphatsynthase,
Octaprenyldiphosphatsynthase,
Nonaprenyldiphosphatsynthase
(Solanesyldiphosphatsynthase),
Undecaprenyldiphosphatsynthase und ähnliche, aus Bakterien, Archaebakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren.
Diese aktiven Isoprenoidsynthasen, die die Grundlage für die Synthese einer großen Vielzahl von Verbindungen bilden, die sowohl in der Industrie als auch auf dem Gebiet der Biowissenschaften wichtig sind, haben aufgrund ihrer unstabilen Beschaffenheit und ihrer geringen spezifischen Aktivitäten nur einen geringen praktischen Nutzen bei industriellen Anwendungen. Jedoch wurde durch die Isolation der Gene der thermostabilen Prenyldiphosphatsynthasen aus thermophilen Bakterien und Archaebakterien und der für diese Enzyme kodierenden Gene, ihre Erhältlichkeit als Enzyme erhöht.
Mit Bezug auf die Farnesyldiphosphatsynthase, wurde ein Gen aus einem moderaten Thermophilen, Bacillus stearothermophilus, isoliert und ein Enzym mit moderater Thermostabilität wurde unter Verwendung von Escherichia coli als Wirtszelle hergestellt [T. Koyama et al. (1993) J. Biochem., 113: 355–363; ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 5(1993)-219961]. Hinsichtlich der Geranylgeranyldiphosphatsynthase wurde ein Gen aus einem extremen Thermophilen, wie etwa Sulfolobus acidocaldarius und Thermus thermophilus isoliert [S.-I. Ohnuma et al., (1994) J. Biol. Chem., 269: 14792:14797; ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 7(1995)-308193, und ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 7(1995)-294956] und Enzyme mit extremer Thermostabilität wurden hergestellt.
Ferner wurde mit Bezug auf die Prenyldiphosphatsynthase mit den Funktionen sowohl der Farnesyldiphosphatsynthase als auch der Geranygeranyldiphosphatsynthase, das Enzym und das dafür kodierende Gen aus dem extremen thermophilen Methanobacterium thermoautotrophicum isoliert [A. Chen und D. Poulter (1993) J. Biol. Chem., 268: 11002–11007; A. Chen und D. Poulter (1994) ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS 314], und die Thermostabilität des Enzyms wurde gezeigt.
Die Enzyme, die Prenyldiphosphate mit bis zu 20 Kohlenstoffen synthetisieren, sind Homodimere, welche relativ leicht in vitro reagieren, worüber es viele Berichte gibt. Jedoch wird angenommen, dass die Enzyme, die Prenyldiphosphate mit längerer Kettenlänge synthetisieren Heterodimere sind, oder dass die Enzyme vielleicht andere Faktoren, wie etwa Lipide, erfordern, und folglich war es für ihre industrielle Anwendung notwendig und schwierig Bedingungen zu finden, die die Reorganisation der zwei Untereinheiten ermöglichen, oder andere Faktoren.
Folglich wurde eine Technologie erwünscht, die die Herstellung der thermostabilen Prenyldiphosphatsynthasen vom Homodimer-Typ ermöglichen, die Prenyldiphosphate mit einer längeren Kettenlänge synthetisieren können, durch künstliche Modifizierung von Aminosäuresequenzen der thermostabilen Prenyldiphosphatsynthasen vom Homodimer-Typ, abgeleitet aus thermophilen Organismen.
Mit Bezug auf die aus thermophilen Organismen abgeleiteten Prenyldiphosphatsynthasen gibt es Berichte über die Modifikation der FPP-Synthase, die aus Bacillus stearothermophilus stammt, und der GGPP-Synthase, die aus Sulfolobus acidocaldarius stammt.
Der mutierte Typ der aus Bacillus stearothermophilus stammenden FPP-Synthase wurde auf der Grundlage der Farbänderung der Zelle verursacht durch Lycopen ausgewählt, dass bei Koexistenz in Escherichia coli von crtB (das Gen der Phytoensynthase) und crtI (das Gen der Phytoenunsaturas) und cis:trans-Isomerase abgeleitet aus Erwinia uredovora und dem Gen der mutierten FPP-Synthase, abgeleitet aus Bacillus stearothermophilus hergestellt wurde [japanische Patentanmeldung Nr. 7(1995)-25253].
Ferner wurden das mutierte Enzym der GGPP-Synthase und ihr Gen, das aus Sulfolobus acidocaldarius stammt, auf der Grundlage der Fähigkeit der Komplementierung des Glycerin-Metabolismus der HexPP-Synthase Mangelmutante von Saccharomyces cerevisiea ausgewählt [japanische Patentanmeldung Nr. 7(1995)-247043].
Aus der Information des Gens der GGPP-Synthase der Mutante von Sulfolobus acidocaldarius wurde gefunden, dass von den zwei Asp-reichen Domänen, die auf der Grundlage der Analyse der Aminosäuresequenzen der Prenyldiphosphatsynthasen vorgeschlagen wurden, der Aminosäurerest lokalisiert an der fünften Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asp-reichen konservierten Sequenz I (DDXX(XX)D) verantwortlich für die Steuerung der Kettenlänge des Reaktionsprodukts ist. Folglich wurde ein Verfahren erfunden, dass das Reaktionsprodukt zum Zwecke der Erhöhung der Kettenlänge des Reaktionsprodukts steuert [eine japanische Patentanmeldung eingereicht am 3. Juli 1996 unter dem Titel „Eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase"]. Die Enzyme, hergestellt unter Verwendung des Verfahrens ermöglichen die Herstellung verschiedener Reaktionsprodukte, die eine höhere Kettenlänge als die der entsprechenden aktiven Prenyldiphosphatsynthasen haben. Jedoch ist selbst in diesen mutierten Prenyldiphosphatsynthasen die Änderung in der Kettenlänge des Reaktionsprodukts höchstens bis zu einem Niveau von Hexaprenyldiphosphat und es waren keine Verfahren bekannt, die die Produktion von Prenyldiphosphaten mit längerer Kettenlänge erlauben.
Marrero P. F. et al., JBC, Vol. 267, Nr. 30, S. 21873–21878 bezieht sich auf die ortsgerichtete Mutagenese der Aspartatreste in dem hochkonservierten DDXX(XX)D-Motiv der FPP-Synthase der Ratte, die teilweise in verschiedenen Enzymkinetiken resultiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Langketten-Prenyldiphosphatsynthasen durch die Modifizierung von Aminosäureresten von Prenyldiphosphatsynthasen zu etablieren. Wenn einmal ein Enzym mit einer besser für die industrielle Anwendung geeigneten Eigenschaft, wie etwa höhere Stabilität, höhere spezifische Aktivität usw. erhalten wurde, ist es möglich, durch Modifikation der Aminosäurereste der Enzyme schnell mutierte Prenyldiphosphatsynthasen und deren Gene zu erhalten, die langkettige Prenyldiphosphate herstellen, und die die Eigenschaften der entsprechenden natürlichen Prenyldiphosphatsynthase beibehalten.
Aus der Information über die Nucleotidsequenz des mutierten Gens der Geranylgeranyldiphosphatsynthase von Sulfolobus acidocaldarius wurde gefunden, dass von den zwei Asp-reichen Domänen, die auf der Grundlage der Analyse der Aminosäuresequenzen von Prenyldiphosphatsynthasen vorgeschlagen wurden, die Aminosäure lokalisiert an der fünften Position in der N-terminalen Richtung und der Aminosäurerest and der achten Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asp-reichen Domäne I (DDXX(XX)D) bei der Steuerung der Kettenlänge der Reaktionsprodukte beteiligt sind.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase zur Verfügung, die Prenyldiphosphat mit nicht weniger als 20 Kohlenstoffen erzeugt, die eine modifizierte Aminosäuresequenz einer Prenyldiphosphatsynthase hat, wobei ein in dem Bereich II vorhandener Aminosäurerest an der achten Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asp-reichen Domäne DDXX(XX)D (wobei die Sequenz X jede Aminosäure bezeichnet und die zwei X in den Klammern nicht vorhanden sein können) mit einer anderen Aminosäure substituiert wurde, oder sowohl der Aminosäurereste an der fünften Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus und ein Aminosäurerest an der achten Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asp-reichen Domäne durch eine andere Aminosäure substituiert wurde. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine wie vorher definierte mutierte Prenyldiphosphatsynthase mit einer weiter modifizierten Aminosäuresequenz zur Verfügung, wobei eine Aminosäure an der zweiten Position in der N-terminalen Richtung und/oder eine Aminosäure an der dritten Position in der N-terminalen Richtung vom D der C-terminalen Seite der Asp-reichen Domäne DDXXXXD deletiert wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase zur Verfügung, die die Eigenschaft der entsprechenden natürlichen Prenyldiphosphatsynthase beibehält und die Prenyldiphosphat mit nicht weniger als 20 Kohlenstoffen produziert, wie etwa Geranylgeranyldiphosphat, Geranylfarnesyldiphosphat, Hexaprenyldiphosphat, Heptaprenyldiphophat, Octaprenyldiphosphat, Nonaprenyldiphosphat, Decaprenyldiphosphat, Undecaprenyldiphosphat, Dodecaprenyldiphosphat, Tridecaprenyldiphosphat, Tetradecaprenyldiphosphat, Pentadecaprenyldiphosphat und Hexadecaprenyldiphosphat und ähnliche.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor mit der vorher erwähnten DNS zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine DNS oder RNS zur Verfügung, die das vorherige Enzym kodieren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen mit dem vorhergehenden Vektor transformierten Wirt zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Herstellung von Prenyldiphosphaten mit nicht weniger als 20 Kohlenstoffen zur Verfügung, dadurch gekennzeichnet, dass das vorhergehende Enzym mit einem Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isopentenyldiphoshpat, Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat, Farnesyldiphosphat und Geranylgeranyldiphosphat in Kontakt gebracht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Herstellung des mutierten Enzyms zur Verfügung, wobei das Verfahren die Schritte der Kultivierung des vorher erwähnten Wirts und die Ernte des Expressionsprodukts aus der Kultur umfasst.
KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist ein Vergleich, der die Bereich (I) bis (V) der Asp-reichen Domäne I verschiedener Prenyldiphosphaten zeigt. In der Figur stellt die Sequenz die Aminosäuresequenz von Prenyldiphosphate dar und ATGERPYRS ist die aus Arabidopsis thaliana stammende Geranylgeranlydiphosphatsynthase, LA15778.p die aus Lupinas albus, CAGERDIS die aus Capsicum annuum, ATGGPSRP die aus Arabidopsis thaliana, GGPS.pep die aus Sulfolobus acidocaldarius, SPCRT.pep die aus Rhodobactor sphaeroides, RCPHSYNG die aus Rhodobactor capsulatus, EHCRTS.pe die aus Erwinia herbicola, MXCRTNODA die aus Myxococcus thaliana, NCAL3.pep die aus Neurospora crassa, und BSFDPS.pe ist eine aus Bacillus stearothermophilus stammende Farnesyldiphosphatsynthase. Die an der linken Seite jeder Aminosäuresequenz angegebene Nummer stellt die Nummer der N-terminalen Position jeder Aminosäuresequenz gezählt vom N-Terminus jeder Geranylgeranyldiphosphatsynthase dar.
Die 2 zeigt eine Fotografie eines Profils einer Dünnschichtchromatographie erhalten von den dephosphorylierten Reaktionsprodukten der mutierten SacGGPS-Synthase, wenn jeweils Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), Geranyldiphosphat (GPP), Farnesyldiphosphat (FPP) und Geranylgeranyldiphosphat (GGPP) als das allylische Substrat verwendet wurden. In der Figur stellt Ori. den Ursprung der Entwicklung dar und S. F. stellt die Lösungsmittelfront dar. Die Spur 1 zeigt ein Ergebnis des Wildtyps SacGGPS; Spur 2 für die Mutante SacGGPS (L74G, F77S), Spur 3 für die Mutante SacGGPS (L74G, F77A), und Spur 4 für die Mutante SacGGPS (L74G, F77G).
FOH ist Farnesol und GGOH ist Geranylgeraniol, welche bei er Dephosphorylierung von Farnesyldiphosphat bzw. Geranylgeranyldiphosphat produziert werden. Ferner werden Prenylalkohol, der durch die Dephosphorylierung eines längerkettigen Prenylphosphats hergestellt wurde, beobachtet.
Die 3 zeigt eine Fotografie eines Profils einer Dünnschichtchromatographie, erhalten von den dephosphorylierten Reaktionsprodukten der mutierten BstFPS-Synthase, wenn jeweils Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat, Farnesyldiphosphat und Geranylgeranyldiphosphat als die allylischen Substrate verwendet wurden. In der Figur stellt Ori. den Entwicklungsursprung und S. F. stellt die Lösungsmittelfront dar. Die Entwicklung wurde für jede mutierte BstFPS-Synthase durchgeführt. In der Figur stellt BstFPS das Wildtypenzym und die anderen die mutierten Enzyme dar. Die Spurnummern zeigen die in der Reaktion verwendeten allylischen Primer (Substrate) an, und Dimethylallyldiphosphat wurde in Spur 1; Geranyldiphosphat in Spur 2; Farnesyldiphosphat in Spur 3 und Geranylgeranyldiphosphat in Spur 4 verwendet.
FOH ist Farnesol und GGOH ist Geranylgeraniol, welche bei der Dephosphorylierung von Farnesyldiphosphat bzw. Geranylgeranyldiphosphat erzeugt werden. Ferner wird Prenylalkohol, der durch die Dephosphorylierung von längerkettigen Prenylphosphat erzeugt wurde, beobachtet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Es wurde vorgeschlagen, dass es fünf konservierte Bereiche in der Aminosäuresequenz einer Prenyldiphosphatsynthase (eine Untereinheit in dem Fall eines Heterodimers) gibt [A. Chen et al., Protein Science Vol. 3, Seiten 600–607, 1999]. Es ist ebenfalls bekannt, dass von den fünf konservierten Regionen es eine Asp-reiche Domäne mit einer konservierten Sequenz I [DDXX(XX)D] (die zwei X in den Klammern können nicht vorhanden sein) im Bereich II gibt. Obwohl es ebenfalls eine Asp-reiche Domäne im Bereich V gibt, die als „DDXXD" bezeichnet wird, ist die zur Spezifizierung des modifizierten Bereichs der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung verwendete Asp-reiche Domäne diejenige, die im Bereich II vorhanden ist, und diese Domäne wird als die Asp-reiche Domäne I im Vergleich zu der in dem Bereich V vorhandenen Asp-reichen Domäne II bezeichnet.
Als die Prenyldiphosphatsynthasen mit der vorher beschriebenen Asp-reichen Domäne können
Farnesyldiphosphatsynthase,
Geranylgeranyldiphosphatsynthase,
Hexaprenyldiphosphatsynthase,
Heptaprenyldiphosphatsynthase,
Octaprenyldiphosphatsynthase,
Nonaprenyldiphosphatsynthase,
Undecaprenyldiphosphatsynthase und ähnliche genannt werden.
Spezifischere Beispiele enthalten die Farnesyldiphosphatsynthase von Bacillus stearothermophilus, die Farnesyldiphosphatsynthase von Escherichia coli, die Farnesyldiphosphatsynthase von Saccharomyces cerevisiae, die Farnesyldiphosphatsynthase der Ratte, die Farnesyldiphosphatsynthase des Menschen, die Geranylgeranyldiphosphatsynthase von Neurospora crassa, die Hexaprenyldiphosphatsynthase von Saccharomyces cerevisiae und ähnliche.
Mittels des Beispiels einiger von diesen werden die Bereiche I bis V der Aminosäuresequenzen der Prenyldiphosphatsynthasen und die Asp-reiche Domäne I (im Kasten) in dem Bereich II in der 1 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung kann bei jeder Prenyldiphosphatsynthase mit der Asp-reichen Domäne I angewandt werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase mit einer modifizierten Aminosäuresequenz einer Prenyldiphosphatsynthase zur Verfügung gestellt, wobei ein in dem Bereich II vorhandener Aminosäurerest an der achten Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asp-reichen Domäne DDXX(XX)D (wobei die Sequenz X jede Aminosäure bezeichnet und die zwei X in den Klammern nicht vorhanden sein können) mit einer anderen Aminosäure substituiert wurde, oder sowohl der Aminosäurerest an der fünften Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus als auch der Aminosäurerest an der achten Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asp-reichen Domäne durch eine andere Aminosäure substituiert wurde.
Ferner wird eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase mit einer weiter modifizierten Aminosäuresequenz zur Verfügung gestellt, wobei der Aminosäurerest an der zweiten Position in der N-terminalen Richtung und/oder der Aminosäurerest an der dritten Position in der N-terminalen Richtung vom D der C-terminalen Seite der Asp-reichen Domäne DDXXXXD deletiert (entfernt) wurde.
Die erfindungsgemäß mutierte Prenyldiphosphatsynthase kann ein Prenyldiphosphat mit einer längeren Kettenlänge synthetisieren als das durch die entsprechende natürliche Prenyldiphosphatsynthase synthetisierte Prenyldiphosphat.
Erfindungsgemäß wird beispielsweise das Gen der Geranylgeranyldiphosphatsynthase eines extrem thermophilen Archaebakteriums, Sulfolobus acidocaldarius, als das Ausgangsmaterial verwendet. Sulfolobus acidocaldarius ist von der ATCC als ATCC Nr. 33909 erhältlich. Das Verfahren für die Klonierung des Gens wurde ausführlich in der ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 6(1994)-315572 beschrieben. Es wurde ebenfalls mit der Eintragsnummer D28748 in einer genetischen Informationsdatenbank, wie etwa GenBank, beschrieben. Unter Verwendung der Sequenz kann es durch ein herkömmliches, in dem Stand der Technik bekanntes Verfahren kloniert werden. Ein Beispiel anderer Klonierungsverfahren wird in dem Beispiel 1 hierin veranschaulicht und eine Nucleotidsequenz wird in der SEQ ID Nr.: 2 gezeigt.
Erfindungsgemäß werden beispielhaft Enzyme mit Aminosäuresequenzen erwähnt, wobei die folgenden Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Prenyldiphosphatsynthase, die aus Sulfolobus acidocaldarius stammt, wie in der SEQ ID Nr.: 1 angegeben, substituiert wurden.
Mutiertes Enzym 1: Änderungen von Leu an Position 74 zu Gly und Phe an Position 77 zu Ala;
Mutiertes Enzym 2: Änderungen von Leu an Position 74 zu Gly und Phe an Position 77 zu Ser;
Mutiertes Enzym 3: Änderungen von Leu an Position 74 zu Gly und Phe an Position 77 zu Gly.
Erfindungsgemäß wird beispielsweise das Gen der Farnesyldiphosphatsynthase eines thermophilen Bakteriums, Bacillus stearothermophilus, als das Ausgangsmaterial verwendet. Bacillus stearothermophilus ist erhältlich von der ATCC als ATCC Nr. 10149. Das Verfahren für die Klonierung des Gens wurde ausführlich in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 5(1993)-219961 beschrieben. Es wurde ebenfalls mit der Hinterlegungsnummer D13293 in einer genetischen Informationsdatenbank, wie etwa GenBank offenbart. Unter Verwendung der Sequenz kann es in einem herkömmlichen dem Stand der Technik bekannten Verfahren kloniert werden. Ein Beispiel für ein anderes Klonierungsverfahrens wird in Beispiel 2 veranschaulicht und seine Nucleotidsequenz wird in der SEQ ID Nr.: 4 gezeigt.
Erfindungsgemäß werden beispielhaft Enzyme erwähnt, die Aminosäuresequenzen haben, wobei die folgenden Aminosäuresequenzen in der Aminosäuresequenz der aus Bacillus stearothermophilus stammenden Prenyldiphosphatsynthase wie in der SEQ ID Nr.: 3 dargestellt substituiert wurden:
Mutiertes Enzym 4: Änderungen von Ile an Position 78 zu Gly und Tyr an Position 81 zu Gly;
Mutiertes Enzym 5: Änderungen von Ile an Position 78 zu Gly und Tyr an Position 81 zu Gly und Deletion von Pro an Position 89 und Ser an Position 90;
Mutiertes Enzym 6: Änderungen von Ile an Position 78 zu Gly und Tyr an Position 81 zu Ala;
Mutiertes Enzym 7: Änderungen von Ile an Position 78 zu Gly und Tyr an Position 81 zu Ala und Deletion von Pro an Position 89 und Ser an Position 90;
Mutiertes Enzym 8: Änderungen von Ile an Position 78 zu Gly und Tyr an Position 81 zu Ser;
Mutiertes Enzym 9: Änderungen von Ile an Position 78 zu Gly und Tyr an Position 81 zu Ser und Deletion von Pro an Position 89 und Ser an Position 90.
Es ist bekannt, dass ein Enzym manchmal seine ursprüngliche enzymatische Aktivität aufweisen kann, selbst wenn es durch Addition, Entfernung und/oder Ersetzung einer oder mehrerer Aminosäuren im Vergleich zu der ursprünglichen Aminosäuresequenz modifiziert wurde. Daher beabsichtigt die vorliegende Erfindung diejenigen Enzyme zu umfassen, die durch Addition, Deletion und/oder Substitution einer oder mehrerer, z.B. bis zu fünf oder bis zu 10 Aminosäuren, verglichen mit der Aminosäuresequenz wie in den SEQ ID Nr.: 1 oder 3 dargestellt, modifiziert sind und weiterhin ihre ursprüngliche Funktion ausüben können.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein durch eine Nukleinsäure kodiertes Protein zur Verfügung, das z.B. mit einer Nukleinsäure, die eine Basensequenz hat, die für eine Prenyldiphosphatsynthase kodiert, wie in der SEQ ID Nr.: 2 oder 4 dargestellt, unter herkömmlichen Bedingungen wie etwa einer stringenten Bedingung von 6 bis 0,2 × SSC bei 50 bis 65°C hybridisieren kann, wobei das Protein eine Aktivität einer Prenyldiphosphatsynthase hat.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Gene zur Verfügung, die für verschiedene vorher erwähnte mutierte Enzyme kodieren, die Vektoren, die diese Gene enthalten, insbesondere Expressionsvektoren, und die durch diese Vektoren transformierten Wirte. Das Gen (DNS) der vorliegenden Erfindung kann leicht erhalten werden, z.B. durch Einbringen von Mutationen in die DNS, die die ursprüngliche Aminosäuresequenz, wie in den SEQ ID Nr.: 1 oder 3 dargestellt, kodiert, unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens, wie etwa ortsgerichtete Mutagenese, PCR und ähnliche.
Ferner kann, wenn einmal die Aminosäuresequenz des gewünschten Enzyms bestimmt wurde, eine entsprechende, dafür kodierende Nucleotidsequenz bestimmt werden und die DNS kann chemisch in Übereinstimmung mit einem herkömmlichen Verfahren der DNS-Synthese synthetisiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Expressionsvektoren zur Verfügung, die DNS wie die vorher erwähnte umfassen, die Wirte, transformiert durch die Expressionsvektoren, und ein Verfahren für die Herstellung von Enzymen oder Peptiden der vorliegenden Erfindung unter Verwendung dieser Wirte.
Expressionsvektoren enthalten einen Ursprung der Replikation, expressionsregulierende Sequenzen usw. und sie können in Abhängigkeit vom Wirt differieren. Als die Wirte sind Prokaryoten, z.B. Bakterien wie etwa Escherichia coli, Bakterien der Gattung Bacillus, wie etwa Bacillus subtilis, und eukaryotische Mikroorganismen, z.B. Pilze, wie etwa Hefe, z.B. die Gattung Saccharomyces, wie etwa Saccharomyces cerevisiae, und die Gattung Pichia, wie etwa Pichia pastoris, Schimmelpilze der Gattung Aspergillus, wie etwa Aspergillus niger, tierische Zellen, z.B. die kultivierten Zellen der Seidenraupe, kultivierte Zellen höherer Tiere, wie etwa CHO-Zellen, und ähnliche, zu erwähnen. Ferner können Pflanzen ebenfalls als Wirt verwendet werden.
Wie in den Beispielen dargestellt, können erfindungsgemäß, durch Kultivierung des durch die erfindungsgemäße DNS transformierten Wirts, langkettige Prenyldiphosphate in dem Kulturmedium akkumuliert werden, welche geerntet werden können, um langkettige Prenyldiphosphate zu erzeugen. Ferner kann ein erfindungsgemäß langkettiges Prenyldiphosphat ebenfalls durch in Kontakt bringen mit der mutierten Prenyldiphosphatsynthase, erzeugt durch das erfindungsgemäße Verfahren, mit dem Substrat Isopentenyldiphosphat und jedem allylischen Substrat, wie etwa Dimethylallyldiphosphat und Geranyldiphosphat, erzeugt werden.
Wenn z.B. Escherichia coli als der Wirt verwendet wird, ist bekannt, dass der Wirt regulatorische Funktionen für das Gen während des Stadiums der Transkription von mRNS aus DNS und bei der Transkription von Protein aus mRNS hat. Als die Promotorsequenz, die die mRNS-Synthese reguliert, sind zusätzlich zu den natürlich auftretenden Sequenzen (z.B. lac, trp, bla, lpp, P_L, P_R, ter, T7, T3 usw.) ihre Mutanten (z.B. lac UV5) und die Sequenzen (wie etwa tac, trc, usw.), in welche ein natürlich auftretender Promotor künstlich fusioniert ist, bekannt, und sie können für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Es ist bekannt, dass der Abstand zwischen der Sequenz der Ribosombindungsstelle (GGAGG und ähnliche Sequenzen davon) und dem Initiationskodon ATG wichtig als eine Sequenz zur Regulierung der Fähigkeit der Synthese von Protein aus mRNS ist. ES ist ebenfalls gut bekannt, dass ein Terminator (z.B. ein Vektor mit rrn PT₁ T₂, kommerziell erhältlich von Pharmacia), der die Transkriptionstermination am 3'-Ende steuert, die Effizienz der Proteinsynthese durch eine Rekombinante beeinflusst.
Als die Vektoren, die für die Herstellung von erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren verwendet werden können, können kommerziell erhältliche Vektoren verwendet werden wie sie sind, oder verschiedene Vektoren können erwähnt werden, die in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung induziert werden. Z.B. können erwähnt werden pBR322, pBR327, pKK223-3, pKK233-2, pTrc99 und ähnliche, die ein aus pMB1 abgeleitetes Replikon haben; pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 und ähnliche, die verändert wurden, um die Kopienanzahl zu erhöhen; oder pACYC177, pACYC184 und ähnliche, die ein aus p15A stammendes Replikon haben; und ferner Plasmide abgeleitet aus pSC101, ColE1, R1, F-Faktor und ähnliche. Ferner können ein Fusionsprotein exprimierende Vektoren, die eine leichtere Reinigung ermöglichen, wie etwa pGEX-2T, pGEX-3X, und pMal-c2 verwendet werden. Ein Beispiel für das als Ausgangsmaterial der vorliegenden Erfindung verwendete Gen, wurde in der japanischen Patentanmeldung Nr. 6(1994)-315572 beschrieben.
Ferner können zusätzlich zu den Plasmiden, virale Vektoren, wie etwa der λ-Phage oder der M13-Phage oder Transposons für das Einbringen von Genen verwendet werden. Bezüglich des Einbringens des Gens in andere Mikroorganismen als Escherichia coli, ist das Einbringen von Genen in Organismen der Gattung Bacillus durch pUB110 (kommerziell erhältlich von Sigma) oder pHY300PLK (kommerziell erhältlich von Takara Shuzo) bekannt. Diese Vektoren werden in „Molecular Cloning" (J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und „Cloning Vector" (P. H. Pouwels, B. B. Bnger, Valk, und W. J. Brammar, Elsevier) und Katalogen der Hersteller beschrieben.
Die Integration des für die Prenyldiphosphatsynthase kodierenden DNS-Fragments und, wo erforderlich, des DNS-Fragments mit der Funktion der Regulation der Expression des Gens des Enzyms in diese Vektoren, kann durch ein herkömmliches Verfahren unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms und einer Ligase durchgeführt werden. Beispiele für die derartig konstruierten Plasmide enthalten z.B. pBs-SacGGPS.
Als die für das direkte Einbringen von Genen durch derartige rekombinante Vektoren geeignete Mikroorganismen, können Escherichia coli und Mikroorganismen der Gattung Bacillus verwendet werden. Eine derartige Transformation kann ebenfalls unter Verwendung des CaCl₂-Verfahrens und des Protoplastenverfahrens wie in „Molecular Cloning" (J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und „DNA Cloning" Vol. I bis III (D. M. Clover ed., IRL PRESS) usw. beschrieben, durchgeführt werden.
Um das erfindungsgemäße mutierte Enzym zu erzeugen, wird ein vorher beschriebener transformierter Wirt kultiviert und die Kultur wird einem herkömmlichen Verfahren mit Aussalzen, Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und ähnlichem unterzogen, um das Enzym zu gewinnen und zu reinigen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung von Prenyldiphosphaten mit nicht weniger als 20 Kohlenstoffen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms zur Verfügung, wie etwa Geranylgeranyldiphosphat, Geranylfarnesyldiphosphat, Hexaprenyldiphosphat, Heptaprenyldiphosphat, Octaprenyldiphosphat, Nonaprenyldiphosphat, Decaprenyldiphosphat, Undecaprenyldiphosphat, Dodecaprenyldiphosphat, Tridecaprenyldiphosphat, Tetradecaprenyldiphosphat, Pentadecaprenyldiphosphat und Hexadecaprenyldiphosphat und ähnliche,. In diesem Verfahren reagiert das erfindungsgemäße Enzym in ein Medium, spezifisch einem wässrigen Medium, und dann, wie erwünscht, werden die erwünschten Prenyldiphosphate aus dem Reaktionsmedium geerntet.
Als das Enzym kann nicht nur ein gereinigtes Enzym sondern ebenfalls ein rohes Enzym verwendet werden, das in verschiedenen Stadien halbgereinigt ist, oder enzymhaltige Produkte, wie etwa eine Mischung der kultivierten Masse eines Mikroorganismus oder kultivierter Substanzen. Alternativ können immobilisierte Enzyme hergestellt gemäß dem herkömmlichen Verfahren aus dem Enzym, dem rohen Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt verwendet werden.
Als das Substrat können Dimethylallyldiphosphate oder Geranyldiphosphat, Farnesyldiphosphat oder Geranygeranyldiphosphat und Isopentenyldiphosphate verwendet werden. Als das Reaktionsmedium kann Wasser oder eine wässrige Pufferlösung, z.B. Tris-Puffer oder Phosphatpuffer und ähnliche verwendet werden.
Unter Verwendung des durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Verfahrens zur Herstellung der mutierten Prenyldiphosphatsynthase kann eine mutierte Prenyldiphosphatsynthase abgeleitet aus einem Archaebakterium erzeugt werden, die stabiler ist und Prenyldiphosphat mit nicht weniger als 20 Kohlenstoffen erzeugt, wie etwa Geranylgeranyldiphosphat, Geranylfarnesyldiphosphat, Hexaprenyldiphosphat, Heptaprenyldiphosphat, Octaprenyldiphosphat, Nonaprenyldiphosphat, Decaprenyldiphosphat, Undecaprenyldiphosphat, Dodecaprenyldiphosphat, Tridecaprenyldiphosphat, Tetradecaprenyldiphosphat, Pentadecaprenyldiphosphat und Hexadecaprenyldiphosphat und ähnliche.
In den Ansprüchen und der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden Aminosäurereste durch den Einbuchstabencode oder Dreibuchstabencode wie im Folgenden beschrieben bezeichnet:
A; Ala; Alanin
C; Cys; Cystein
D; Asp; Asparaginsäure
E; Glu; Glutaminsäure
F; Phe; Phenylalanin
G; Gly; Glycin
H; His; Histidin
I; Ile; Isoleucin
K; Lys; Lysin
L; Leu; Leucin
M; Met; Methionin
N; Asn; Asparagin
P; Pro; Prolin
Q; Gln; Glutamin
R; Arg; Arginin
S; Ser; Serin
T; Thr; Threonin
V; Val; Valin
W; Trp; Tryptophan
Y; Tyr; Tyrosin
Die Substitution der Aminosäure wird in der Reihenfolge „der Aminosäurerest vor Substitution", „die Nummer der Position des Aminosäurerestes" und „Aminosäurerest nach Substitution" und durch den Einbuchstabencode für Aminosäuren bezeichnet. Z.B. wird die Mutation, in der ein Tyr-Rest an der Position 81 durch einen Met-Rest substituiert wird als Y81M dargestellt. Ferner wird die Deletion eines Aminosäurerests durch „der Aminosäurerest vor Deletion", „die Nummer der Position des Aminosäurerestes" und „–" bezeichnet. Z.B. wird die Deletion von Tyr an der Position 81 als Y81– bezeichnet.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf spezifische Beispiele erläutert, aber sie dürfen nicht so ausgelegt werden, dass sie die Erfindung auf irgendeine Art und Weise begrenzen.
Beispiel 1: Konstruktion eines Plasmids, das das Gen der Geranylgeranyldiphosphatsynthase enthält
Das Gen der aus Sulfolobus acidocaldarius stammenden Geranylgeranyldiphosphatsynthase (hiernach bezeichnet als SacGGPS), wurde in die HindIII-Stelle des Plasmidvektors pBluescript II (KS+), kommerziell erhältlich von Toyobo Co. LTD, subkloniert. Die Plasmid-DNS wurde als pBs-SacGGPS bezeichnet. Das SacGGPS-Gen ist erhältlich aus Escherichia coli pGGPS1/DH5α, das am 31. Januar 1994 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Ibaraki, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4982 international hinterlegt wurde.
Ebenfalls wurde die gesamte Nucleotidsequenz des SacGGPS-Gens in der japanischen Patentanmeldung Nr. 6(1994)-315572, Shin-ichi Ohnuma et al. (1994), The Journal of Biological Chemistry Vol. 269: 114792–14797, oder in einer genetischen Informationsdatenbank, wie etwa GenBank, unter der Hinterlegungsnummer D28748 veröffentlicht. Da Sulfolobus acidocaldarius ebenfalls von verschiedenen Hinterlegungsstellen von Mikroorganismen, wie etwa ATCC usw. (als ATCC Nr. 33909) erhältlich ist, kann die DNS des Genbereichs von SacGGPS durch das herkömmliche Genklonierungsverfahren erhalten werden.
Beispiel 2: Synthese von Oligonucleotiden für das Einbringen von Mutationen
Das Einbringen von Mutationen in die Geranylgeranyldiphosphatsynthase wurde zunächst durch Einbringen von Mutationen durch Verfahren wie in Beispiel 3 durchgeführt, unter Verwendung eines Plasmids, das darin ein mutiertes Geranylgeranyldiphosphatsynthasegen (F77S) enthält, in welchem Phe an der Position 77 durch Ser in der Mutante SacGGPS substituiert wurde, erhalten in Übereinstimmung mit Beispiel 2 der Beschreibung der japanischen Patentanmeldung Nr. 7(1995)-247043. Dieses mutierte Geranylgeranyldiphosphatsynthasegen wurde durch eine chemische Mutagenisierungsbehandlung konstruiert, aber andere Verfahren, wie etwa das Kunkel-Verfahren oder ein PCR-Verfahren, kann zur Konstruktion des Gens verwendet werden.
Für das Einbringen der erwünschten Mutationen wurden die folgenden Oligonucleotide entworfen und synthetisiert.
Primer DNS 1 (L74G, F77S):
5'GGTGCAGCAATTGAAGTTGGTCATACT 3' (SEQ ID Nr.: 5)
Für das Einbringen von Mutationen durch das Verfahren beschrieben in Beispiel 3 unter Verwendung des Gens, in welchem Mutationen durch die Primer DNS 1 eingefügt wurde, wurden die folgenden Oligonucleotide entworfen und synthetisiert.
Primer DNS 2 (L74G, F77A):
5'CATACTGCTACGCTTGTTCATGATG 3' (SEQ ID Nr.: 6)
Primer DNS 3 (L74G, F77G):
5'CATACTGGTACGCTTGTTCATGATG 3' (SEQ ID Nr.: 7).
Diese wurden nicht nur für den Zweck alleine des Einbringens von Mutationen in das Kodon entworfen, das für Leu an der Position 74 und Phe an der Position 77 von SacGGPs kodiert, sonder ebenfalls um die Spaltstelle des Restriktionsenzyms BspHI oder die von MunI einzubringen.
Das Einbringen der BspHI-Spaltstelle verändert nicht die durch das SacGGPS-Gen kodierte Aminosäuresequenz aufgrund der Kodondegenerierung. Dies ist für den Nachweis des Plasmids mit einer darin eingebrachten Mutation durch Agarosegel-Elektrophorese nach Verdau mit BspHi oder MunI gedacht, da eine BspHI-Spaltstelle oder eine MunI-Spaltstelle gleichzeitig mit der Einfügung der Substitutions-Mutation in die zu den Aminosäureresten an der Position 74 und dem Aminosäurerest an der Position 77 entsprechenden Kodons eingebracht wird.
Diese Primer DNS wurde einer Phosphorelierungsbehandlung bei 37°C für 30 Minuten in der im Folgenden gezeigten Reaktionslösung unterworfen, gefolgt durch Denaturierung bei 70°C für 10 Minuten:

10 pmol/μl Primer DNS 2 μl

10 × Kinasepuffer 1 μl

10 mM ATP 1 μl

H₂O 5 μl

T4-Polynucleotidkinase 1 μl

wobei der 10 × Kinasepuffer 1000 mM Tris-Cl (pH 8,0), 100 mM MgCl₂ und 70 mM DTT enthält.
Beispiel 3: Das Einbringen der Substitutions-Mutation des SacGGPS-Gens
Unter Verwendung der in Beispiel 2 konstruierten Primer-DNS wurden Substitutions-Mutationen in das Plasmid gemäß dem Kunkel-Verfahren eingeführt, in welchem die Mutante des SacGGPs-Gens eingeführt wurde. Ein Mutan-K Reagenziensatz, kommerziell erhältlich von Takara Shuzo, wurde für die Durchführung des Kunkel-Verfahrens verwendet. Das experimentelle Vorgehen war wie in der Reagenziensatzbeschreibung erläutert. Die Substitutions-Mutation des Plasmids muss nicht notwendigerweise durch das Kunkel-Verfahren durchgeführt werden. Z.B. können identische Ergebnisse durch ein Verfahren unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten werden.
Unter Verwendung von Escherichia coli CJ236 in dem Mutan-K Reagenziensatz als die Wirtszelle, wurde eine einzelsträngige DNS hergestellt, in welchem eine Thyminbase in dem Plasmid pBs-SacGGPs durch eine Deoxyuracilbase ersetzt wurde.
Eine derartig erhalten einzelsträngige DNS wird als eine Matrize bei der Reaktion mit einer Primer DNS für die Synthese eines komplementären Strangs verwendet und in der folgenden Reaktionslösung bei 65°C für 15 behandelt und dann durch Stehenlassen bei 37°C für 15 Minuten annealed:

Einzelsträngige DNS 0,6 pmol

Annealingpuffer 1 μl

Primer-DNS-Lösung (Beispiel 2) 1 μl

H₂O auf ein Endvolumen von 10 μl

wobei die Annealingpufferlösung 200 mM Tris-Cl (pH 8,0), 100 mM MgCl₂, 540 mM NaCl und 10 mM DTT enthält.
Ferner wurden 25 μl der Verlängerungspufferlösung, 60 Einheiten von Escherichia coli DNS-Ligase und 1 Einheit T4-DNS-Polymerase zugegeben, um die komplementären Stränge bei 25°C für 2 Stunden zu synthetisieren. Die Verlängerungspufferlösung ist 50 mM Tris-Cl (pH 8,0), 60 mM Ammoniumacetat, 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM NAD und 0,5 mM dNTP.
Nach Beendigung der Reaktion wird 3 μl 0,2 M EDTA (pH 8,0) dazugegeben und einer Behandlung bei 65°C für 5 Minuten unterzogen, um die Reaktion zu beenden.
Beispiel 4: Konstruktion eines Plasmids mit dem Gen der Farnesyldiphosphatsynthase
Das aus Bacillus stearothermophilus stammende Gen der Farnesyldiphosphatsynthase (hiernach als BstFPS bezeichnet) wurde in die KpnI- und PstI-Stellen des Plasmidvektors pUC119 subkloniert. Diese Plasmid-DNS wurde als pEX1 bezeichnet. Das BstFPS-Gen ist erhältlich aus Escherichia coli JM109 (pEX1), das am 26. September 1991 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Ibaraki, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3581 international hinterlegt wurde.
Ebenfalls wurde die gesamte Nucleotidsequenz des BstFPS-Gens in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 5(1993)-219961 oder einer genetischen Informationsdatenbank, wie etwa GenBank, unter der Hinterlegungsnummer D1329 veröffentlicht, und Bacillus stearothermophilus ist ebenfalls von verschiedenen Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen erhältlich, wie etwa ATCC usw. (als ATCC Nr. 10149), die DNS des Genbereiches von BstFPS kann durch das herkömmliche Genklonierungsverfahren erhalten werden. Ferner wurde für den Zweck einer Herstellung im großen Maßstab von aus Bacillus stearothermophilus stammender Farnesyldiphosphatsynthase, das Gen in die NcoI- und HindIII-Stellen des Expressionsvektors pTrc99A, kommerziell erhältlich von Pharmacia [T. Koyama et al. (1993) J. Biochem. 113: 355–363 integriert. Dieses Plasmid wurde als pEX11 bezeichnet.
Beispiel 5: Synthese der Oligonucleotide für das Einbringen von BstFPs-Mutationen und das Einbringen von Substitutions-Mutationen
Das Einbringen von Mutationen in das BstFPS-Gen wurde durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCR) unter Verwendung des Expressionsvektors pEX11, konstruiert im Beispiel 4, durchgeführt. Um die Mutationen einzubringen, wurden die folgenden Oligonucleotide entworfen und synthetisiert.
Primer DNS 4: 5'AAACAGACCATGGCGCTTTC 3' (SEQ ID Nr.: 8)
Primer DNS 5: 5'CAGCCAAGCTTTTAATGGTC 3' (SEQ ID Nr.: 9)
Primer DNS 6: 5'CTTTGATTCATGATGATTTG 3' (SEQ ID Nr.: 10)
Primer DNS 7: 5'ATCATCATGAATCAAAGAAGACGTATGGCCCATTTC 3' (SEQ ID Nr.: 11)
Primer DNS 8: 5'ATCATCATGAATCAAAGAGGCCGTATGGCCCATTTC 3' (SEQ ID Nr.: 12)
Primer DNS 9: 5'ATCATCATGAATCAAAGAGCCCGTATGGCCCATTTC 3' (SEQ ID Nr.: 13)
Primer DNS 10: 5'ATGGACAACGATGATTTGCG 3' (SEQ ID Nr.: 14)
Primer DNS 11: 5'CAAATCATCATGGATCAAAG 3' (SEQ ID Nr.: 15).
Die Polymerasekettenreaktion wurde unter Verwendung von ExTaq durchgeführt, kommerziell erhältlich von Takara Shuzo gemäß den Herstelleranweisungen. Um Substitutions-Mutationen einzuführen, wurde jede Kombination der Primer DNS 4 und Primer DNS 7, Primer DNS 4 und Primer DNS 8, Primer DNS 4 und Primer 9 oder Primer DNS 5 und Primer DNS 6 eingesetzt, um die Polymerasekettenreaktion durchzuführen.
Der Reaktionszyklus, der 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und eine Minute bei 72°C umfasste, wurde 35 mal wiederholt. Die aus der Reaktion resultierenden DNS-Fragmente wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und dann durch Ausschneiden derjenigen DNS-Fragmente gereinigt, die die erwünschte Länge hatten.
Die durch die Polymerasekettenreaktion für jede der Kombinationen der Primer erhaltenen DNS-Fragmente wurden jeweils als Fragment 1 (Primer 4 und Primer 7), Fragment 2 (Primer 4 und Primer 8), Fragment 3 (Primer 4 und Primer 9) und Fragment 4 (Primer 5 und Primer 6) bezeichnet.
Ferner wurden die Fragmente 1, 2 und 3 mit dem Restriktionsenzym NcoI und dem Restriktionsenzym BspHI geschnitten, und das Fragment 4 wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII und dem Restriktionsenzym BspHI geschnitten, um die Enden der Fragmente einzustellen und dann wurden das Fragment 1 und Fragment 4, Fragment 2 und Fragment 4 und Fragment 3 und Fragment 4 einer Ligation unterzogen. Für die Ligation wurde der von Takara Shuzo kommerziell erhältliche Ligationsreagenziensatz eingesetzt. Jedes der ligierten Fragmente wurde in die NcoI- und HindIII-Stellen des Plasmidvektors pTrc99A integriert. Obwohl das Substitutions-mutierte pEX11 mit dem Restriktionsenzym BspHI in dem BstFPS-kodierenden Bereich geschnitten werden kann, wird die Aminosäure an dieser Stelle aufgrund der Degeneration des genetischen Codes nicht ersetzt. Die resultierenden DNS wurden in die Wirtszellen durch das in Beispiel 6 gezeigte Verfahren eingebracht.
Das Verhältnis zwischen jedem Fragment und der Mutante wird im Folgenden gezeigt:
Fragment 1 und Fragment 4 → I78G, Y81S
Fragment 2 und Fragment 4 → I78G, Y81A
Fragment 3 und Fragment 4 → I78G, Y81G
Für jede Substitutions-Mutation wurden pEX11, Primer DNS 10 und Primer DNS 11 weiterhin für die Durchführung einer Polymerasekettenreaktion verwendet. Der Reaktionszyklus, der 30 Sekunden bei 94°C, 15 Sekunden bei 54°C und vier Minuten bei 72°C umfasste, wurde 30 mal wiederholt. Dann wurden die DNS-Fragmente mit den erwünschten Längen durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und die Enden der DNS-Fragmente wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments eingestellt. Sie wurden dann unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und dann einer Selbst-Ligation unterworfen. Das Klenow-Fragment und die T4- Polynucleotidkinase, kommerziell erhältlich von Takara Shuzo, wurden gemäß den Herstelleranweisungen verwendet.
Der vorher erwähnte Ligationsreagenziensatz wurde für die Selbst-Ligation verwendet. Das Verhältnis zwischen jeder Substitutions-Mutation pEX11 und der durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der Primer DNS 10 und DNS 11 konstruierten Deletionsmutationen ist im Folgenden gezeigt:
I78G, Y81S → I78G, Y81S, P89–, S90–
I78G, Y81A → I78G, Y81A, P89–, S90–
I78G, Y81G → I78G, Y81G, P89–, S90–
Die derartig konstruierten Deletionsmutanten von pEX11 sind identisch mit den Substitutionmutanten pEX11, außer dass die vorhergehenden die Spaltstelle des Restriktionsenzyms BspHI haben, welche zum Zeitpunkt des Einbringens der Substitutions-Mutationen gebildet wurde, so dass die Deletionsmutanten von pEX11 von der ursprünglichen Substitutionsmutante pEX11 unterschieden werden können.
Beispiel 6: Konstruktion einer Transformante mit eingebrachten Genen der Substitutionsmutante von SacGGPS und BstFPS
Die gemäß Beispiel 3 und Beispiel 5 hergestellten DNS Lösungen wurden für die Transformation von Escherichia coli XL1-Blue durch das CaCl₂-Verfahren verwendet. Ein alternatives Verfahren, wie etwa Elektroporation, ergibt ähnliche Ergebnisse. Eine andere Wirtszelle als Escherichia coli XL1-Blue ergibt ebenfalls ein ähnliches Ergebnis.
Die Transformante, z.B. JM109 usw., erhalten durch das CaCl₂-Verfahren wurde auf eine Agarplatte mit Ampicillin geimpft, ein selektierbare Marker für Transformanten, und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Von den wie vorher erhaltenen Transformanten wurden das Substitutionsmutantenplasmid pBs-SacGGPS oder das mutierte Plasmid pEX11, die eine Spaltstelle von BspHI oder MunI in der SacGGPS kodierenden Region oder der BstFPS kodierenden Region haben, ausgewählt. Als das mutierte pEX11-Plasmid, in welchem die Deletionsmutation eingebracht wurde, wurde das mutierte pEX11-Plasmid, das keine BspHI-Spaltstelle in dem BstFPS kodierenden Bereich hat, ausgewählt.
Die Nucleotidsequenz in der Nachbarschaft des mutierten Aminosäurerestes des SacGGPS-Gens des ausgewählten Substitutionsmutantenplasmids pBs-SacGGPS oder des BstFPS-Gens des mutierten pEX11-Plasmids wurde durch das Dideoxyverfahren bestimmt, wodurch das Einbringen der erwünschten Mutation bestätigt wurde.
Beispiel 7: Messung der Aktivität der mutierten Prenyldiphosphatsynthase
Ungereinigte Enzymlösungen wurden wie folgt aus einer Gesamtheit von 11 Transformanten mit 9 mutierten SacGGPS-Genen, einem Wildtyp-SacGGPS-Gen und einem Wildtyp-BstFPS-Gen, die in Beispiel 6 erhalten wurden, erzeugt.
Die über Nacht in 2 × LB-Medium kultivierten Transformanten wurden zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, und dann wurden die Zellen in dem Lysepuffer (50 mM Tris-Cl (pH 8,0), 10 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA) suspendiert. Sie wurden durch Ultraschall lysiert und dann bei 4°C bei 10.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Der erhaltenen Überstand wurde bei 55°C für 1 Stunde behandelt, um die aus Escherichia coli stammenden Prenyldiphosphatsynthasen zu inaktivieren.
Sie wurden weiterhin unter der gleichen Bedingung zentrifugiert und die erhaltenen Überstände wurden als ein Rohenzymextrakt verwendet. Die Reaktion wurde bei 55°C für 1 Stunde in der folgenden Reaktionslösung durchgeführt:

[1-¹⁴C]-Isopentenyldiphosphat (1 Ci/mol) 25 nmol

Allylisches Diphosphat (Geranyldiphosphat) 25 nmol

Kaliumphosphatpuffer (pH 5,8) 50 mM

MgCl₂ 5 mM

Enzymlösung 100 μg

H₂O auf 200 μl
Nach der Reaktion wurden 200 μl gesättigte NaCl-Lösung zu der Reaktionslösung gegeben und 1 ml wassergesättigtes Butanol wurde zugegeben, welches dann geschüttelt, zentrifugiert und in zwei Phasen separiert wurde. Zu 800 μl erhaltener Butanolschicht wurden 3 ml eines Flüssigscintilators zugegeben und dann die Radioaktivität wurde durch den Flüssigscintilationszähler gemessen. Der Rest der Butanolschicht wurde durch Einleiten von Stickstoffgas darin verdampft, während die Schicht erwärmt wurde, um auf ein Volumen von etwa 0,5 ml konzentriert zu werden. Zu dem Konzentrat wurden 2 ml Methanol und 1 ml saure Phosphataselösung von der Kartoffel zugegeben (2 mg/ml saure Phosphatase von der Kartoffel, 0,5 M Natriumacetat (pH 4,7)), um die Phosphorylierungsreaktion bei 37°C durchzuführen.
Nachfolgend wurde das dephosphorylierte Reaktionsprodukt mit 3 ml n-Pentan extrahiert. Diese wurde durch Verdampfen des Lösungsmittels durch Einleiten von Stickstoffgas darin konzentriert, welches dann durch TLC (Umkehrphase-TLC-Platte: LKC18 (Watman), Entwicklungsmittel: Aceton/Wasser = 9/1 oder Aceton/Wasser = 19/1) analysiert wurde. Das dephosphorylierte Reaktionsprodukt wurde entwickelt und mit dem Bio Image Analyzer BAS2000 (Fuji Photo Film) analysiert, um die Lokalisierung der Radioaktivität zu bestimmen. Das Ergebnis der mutierten Prenyldiphosphatsynthase, deren Genmutation eingeführt wurde, wird in der 2 gezeigt. Das Ergebnis der zwei mutierten Prenyldiphosphatsynthasen, bei denen die Genmutationen eingeführt wurden, wird in der 3 gezeigt. Das Ergebnis bezüglich der anderen mutierten Prenyldiphosphatsynthasen, in welchen Mutationen in dem BstFPS-Gen eingeführt wurden, war das gleiche wie in 3.
Angabe zur Hinterlegung von Mikroorganismen

Name der internationalen Hinterlegungsstelle: National Institue of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology
Anschrift: 1-3, Higashi, 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305 Japan

(1) Escherichia coli pGGPS1/DH5α

Hinterlegungsnummer: FERM BP-4982
Hinterlegungsdatum: 31. Januar 1994

(2) Escherichia coli JM109 (pEX1)

Hinterlegungsnummer: FERM BP-3581
Hinterlegungsdatum: 26. September 1991

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Mutierte Prenyldiphosphatsynthase, die Prenyldiphosphat mit nicht weniger als 20 Kohlenstoffen erzeugt, die eine modifizierte Aminosäuresequenz einer Prenyldiphosphatsynthase hat, wobei ein in dem zweiten Bereich vorhandener Aminosäurerest an der achten Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asp-reichen Domäne DDXX(XX)D (wobei die Sequenz X jede Aminosäure bezeichnet und die zwei X in den Klammern nicht vorhanden sein können) mit einer anderen Aminosäure substituiert wurde, oder beide Aminosäurereste an der fünften Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus und ein Aminosäurerest an der achten Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asp-reichen Domäne wurde durch eine andere Aminosäure substituiert.
Enzym nach Anspruch 1, mit einer weiter modifizierten Aminosäuresequenz, wobei eine Aminosäure an der zweiten Position in der N-terminalen Richtung und/oder eine Aminosäure an der dritten Position in der N-terminalen Richtung vom D der C-terminalen Seite der Asp-reichen Domäne DDXXXXD deletiert wurde.
Enzym nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reaktionsprodukte der Prenyldiphosphatsynthase Farnesyldiphosphat, Geranylgeranyldiphosphat, Geranylfarnesyldiphosphat, Hexaprenyldiphosphat, Heptaprenyldiphophat, Octaprenyldiphosphat, Nonaprenyldiphosphat, Decaprenyldiphosphat, Undecaprenyldiphosphat, Dodecaprenyldiphosphat, Tridecaprenyldiphosphat, Tetradecaprenyldiphosphat, Pentadecaprenyldiphosphat und Hexadecaprenyldiphosphat sind.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Prenyldiphosphatsynthase vom Homodimertyp ist.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Prenyldiphosphatsynthase aus einem Archae stammt.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Prenyldiphosphatsynthase aus einem Bakterium stammt.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Prenyldiphosphatsynthase aus Sulfolobus acidocaldarius stammt.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Prenyldiphosphatsynthase aus Bacillus stearothermophilus stammt.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Prenyldiphosphatsynthase die Eigenschaften der entsprechenden, natürlichen Prenyldiphosphatsynthase beibehält.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Prenyldiphosphatsynthase ein thermostabiles Enzym ist.
Mutierte Prenyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Leu an der Position 74 und Phe an der Position 77 der Geranylgeranyldiphosphatsynthase mit der in der SEQ ID Nr. 1 festgesetzten Aminosäuresequenz, durch eine andere Aminosäure substituiert wurde.
Mutierte Prenyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Ile an der Position 78 und Tyr and der Position 81 der Farnesyldiphosphatsynthase mit der in der SEQ ID Nr. 3 festgesetzten Aminosäuresequenz, durch eine andere Aminosäure substituiert wurde.
Mutierte Prenyldiphosphatsynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Ile an der Position 78 und Tyr an der Position 81 der Farnesyldiphosphatsynthase mit der in der SEQ ID Nr. 3 festgesetzten Aminosäuresequenz, durch eine andere Aminosäure substituiert wurde, und Pro an der Position 89 und Ser an der Position 90 der Farnesyldiphosphatsynthase deletiert wurde.
DNS, die für ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 13 kodiert.
RNS, transkribiert von der DNS nach Anspruch 14.
Rekombinanter Vektor mit einer DNS nach Anspruch 14.
Wirtsorganismus, transformiert mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 16, wobei der Wirtsorganismus kein menschliches Wesen ist.
Verfahren für die Herstellung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 13 mit den Schritten der Kultivierung von Wirtszellen transformiert mit einem Expressionsvektor die eine DNS umfasst, die für das Enzym kodiert, und Ernten des exprimierten Enzyms aus der Kultur.
Verfahren für die Herstellung von Prenyldiphosphat mit nicht weniger als 20 Kohlenstoffen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder ein Enzym hergestellt gemäß dem Verfahren des Anspruchs 18, mit einem Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isopentenyldiphosphat, Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat, Farnesyldiphosphat und Geranylgeranyldiphosphat in Kontakt gebracht wird.