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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein wie in Anspruch 1 definiertes
Verfahren, um neuartige, mutierte Enzyme herzustellen, welche lineare
Prenyldiphosphate synthetisieren, die Vorläufer von Verbindungen sind,
die wichtig für
Lebewesen sind, wie etwa Steroide, Ubichinone, Dolichole, Carotenoide,
prenylierte Proteine, tierische Hormone, pflanzliche Hormone und ähnliche,
oder ein Gen davon usw.
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2. Verwandter Stand der
Technik
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Von
den Substanzen mit wichtigen Funktionen im Körper werden viele Substanzen
unter Verwendung von Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) als Baustein
biologisch synthetisiert. Diese Verbindungen werden Isoprenoide,
Terpenoide oder Terpene genannt, und werden in Abhängigkeit
von der Anzahl der Kohlenstoffatome in Hemiterpene (C5), Monoterpene
(C10), Sesquiterpene (C15), Diterpene (C20), Sesterterpene (C25),
Triterpene (C30), Tetraterpene (40) usw. klassifiziert. Die tatsächliche
Synthese beginnt mit dem Mevalonatweg über den Mevalonsäure-5-diphosphat
synthetisiert wird, gefolgt durch die Synthese von Isopentenyldiphosphat (IPP),
welches eine aktive Isopreneinheit ist.
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Die
Identität
der Isopreneinheit, die als ein mutmaßlicher Vorläufer vorgeschlagen
wurde, wurde als IPP bestätigt,
die sogenannte aktive Isopreneinheit. Dimethylallyldiphosphat (DMAPP),
ein Isomer von IPP, welches als ein Substrat bei der Reaktion von
Isopentenyladenin verwendet wird, welches als ein Cytokinin bekannt
und eines der Pflanzenhormone ist, ist ebenfalls dafür bekannt,
eine Kondensationsreaktion mit IPP zu durchlaufen, um lineare aktive
Isoprenoide, wie etwa Geranyldiphosphat (GP), Neryldiphosphat, Farnesyldiphosphat
(FPP), Geranylgeranyldiphosphat (GGPP), Geranylfarnesyldiphosphat
(GFPP), Hexaprenyldiphosphat (HexPP), Heptaprenyldiphosphat (HepPP)
und ähnliche
zu synthetisieren.
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Es
gibt Kondensationsreaktionen vom Z-Typ und vom E-Typ. GPP ist ein Produkt der E-Typ-Kondensation
und Neryldiphosphat ist ein Produkt der Z-Typ-Kondensation. Obwohl
der all-E-Typ als die aktive Form bei FPP und GGPP angesehen wird,
führen
die Kondensationsreaktionen vom Z-Typ zu der Synthese von verschiedenen
Polyprenolen, die in Naturkautschuk, Dolicholen, Baktoprenolen (Undecaprenolen)
und Pflanzen gefunden werden. Von ihnen wird angenommen, dass sie
die Kondensationsreaktion unter Verwendung der Phosphatesterbindungsenergie
des Pyrophosphats und/oder des in dem Molekül vorhandenen Kohlenstoffgerüsts durchlaufen,
um Pyrophosphat und/oder Phosphat als die Nebenprodukte der Reaktion
zu erzeugen.
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FPP
oder GGPP dient als ein Reaktionssubstrat, das zu der Synthese von
prenylierten Proteinen führt (aus
FPP oder GGPP), repräsentiert
durch G-Proteine, die wichtig beim Mechanismus der Signaltransduktion in
der Zelle sind; Zellmembranlipide (aus GGPP) von Archaebakterien;
Squalen (aus FPP), welches ein Vorläufer von Steroiden ist; und
Phytoen (aus GGPP), welches ein Vorläufer von Carotenoid ist. Prenyldiphosphate
aus HexPP und HepPP mit sechs bzw. sieben Isopreneinheiten bis zu
Prenyldiphosphaten mit zehn Isopreneinheiten dienen als der Vorläufer für die Synthese
von Ubichinon und Menachinon (Vitamin K2), die in dem Elektronentransportsystem
wirken.
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Ferner
wurden über
die Biosynthese dieser Isoprenoide in der Aktivform die folgenden
pflanzlichen Verbindungen, die lebenswichtig sind, synthetisiert.
Um nur einige zu nennen, gibt es dort Pflanzenhormone von Cytokininen
und Isopentenyladenosin-modifizierte tRNS, die Hemiterpene als ihre
Vorläufer
für die
Synthese nutzen, Monoterpengeraniol und seine Nerolisomere, die
die Hauptbestandteile des Rosenölduftstoffs sind,
und der Kampferextrakt des Kampferbaumes, welcher ein Insektizid
ist. Sesquiterpene enthalten Juvenilhormone von Insekten, Diterpene
enthalten das Pflanzenhormon Gibberellin, Spurenpheromone von Insekten,
und Retinole und Retinale, die als Vorläufer für visuelle Pigmente dienen,
Bindungsbestandteile der Purpurmembranproteine von halophilen Archaebakterien,
und Vitamin A.
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Ferner
wurde unter Verwendung von Squalen, einem Triterpen, eine Vielzahl
von Steoridverbindungen synthetisiert, einschließlich z.B. tierische Sexualhormone,
Vitamin D, Ecdyson, welches ein Paarungshormon der Insekten ist,
ein Pflanzenhormon, Brassinolid, und Bestandteile der Plasmamembranen.
Verschiedene Carotenoide aus Tetraterpenen, die Vorläufer für verschiedene
Pigmente von Organismen und Vitamin A sind, sind ebenfalls wichtige
Verbindungen, die aus aktiven Isoprenoiden abgeleitet werden. Verbindungen,
wie etwa Chlorophyll, Pheophytin, Tocopherol (Vitamin E) und Phyllochinon
(Vitamin K1) werden ebenfalls von Tetraterpenen abgeleitet.
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Die
aktiven Isoprenoidsynthasen, die nacheinander IPP mit derartigen
allylischen Substraten DMAPP, GPP, FPP, GGPP, GFPP und ähnlichen
kondensieren, werden Prenyldiphosphatsynthasen genannt, und werden
ebenfalls auf der Grundlage der maximalen Kettenlänge des
Hauptreaktionsprodukts benannt, z.B. Farnesyldiphosphatsynthase
(FPP-Synthase), Geranygeranyldiphosphatsynthase (GGPP-Synthase)
usw. Es gibt Berichte über
die Reinigung, die Aktivitätsmessung,
die Genklonierung und die Nucleotidsequenzierung von Enzymen, wie
etwa Farnesyldiphosphatsynthase, Geranylgeranyldiphosphatsynthase,
Hexaprenyldiphosphatsynthase, Heptaprenyldiphosphatsynthase, Octaprenyldiphosphatsynthase,
Nonaprenyldiphosphatsynthase (Solanesyldiphosphatsynthase), Undecaprenyldiphosphatsynthase,
und ähnliche,
aus Bakterien, Archaebakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren.
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Diese
aktiven Isoprenoidsynthasen, die die Grundlage für die Synthese einer großen Vielfalt
von Verbindungen bilden, die sowohl in der Industrie als auch auf
dem Gebiet der Biowissenschaften wichtig sind, haben aufgrund ihres
instabilen Charakters und den geringen spezifischen Aktivitäten nur
geringe Aufmerksamkeit hinsichtlich ihrer industriellen Anwendungen
auf sich gezogen. Jedoch wurde durch die Isolation der Gene der
FPP-Synthase und GGPP-Synthase
von termophilen Bakterien und Archaebakterien (A. Chen und D. Poulter
(1993) J. Biol. Chem. 268: 11002–11007, T. Koyama et al. (1993)
J. Biochem. 113: 355–363,
S.-I, Ohnuma et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 14792–14797),
die Verfügbarkeit
der Enzyme erhöht.
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Die
Enzyme, die Prenyldiphosphate mit 20 bis 25 Kohlenstoffen synthetisieren,
sind Homodimere und reagieren relativ einfach in vitro, wie in vielen
Berichten veröffentlicht.
Jedoch wird angenommen, dass die Enzyme, die Prenyldiphosphate mit
Kettenlängen
synthetisieren, die die vorher erwähnten übersteigen, Heterodimere sind
oder zusätzliche
Faktoren, wie etwa ein Lipid oder ähnliches, benötigen. Daher
war es notwendig, um ihre industrielle Anwendung zu verwirklichen,
optimale Bedingungen zu finden, die die Wiedervereinigung von zwei
Sorten von Untereinheiten ermöglichen,
oder zusätzliche
Faktoren zu finden, was ein schwierige Herausforderung war.
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Daher
gab es eine Notwendigkeit für
eine Technologie, die es ermöglicht
thermostabile Prenyldiphosphatsynthasen vom Homodimertyp durch künstliche
Veränderung
der Aminosäuresequenz
der Prenyldiphosphatsynthasen vom Homodimertyp herzustellen, die
Prenyldiphosphate mit einer längeren
Kettenlänge
synthetisieren, die stabil sind und eine hohe spezifische Aktivität haben
und aus einem thermophilen Organismus stammen.
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Für die aus
thermophilen Organismen stammenden Prenyldiphosphatsynthasen gibt
es zur Zeit Beispiele einer veränderten
FPP-Synthase, die aus Bacillus stearothermophilus stammt, und einer
GGPP-Synthase, die aus Sulfolobus acidocaldarius stammt. Das mutierte
Enzym der FPP-Synthase aus Bacillus stearothermophilus und ihr Gen,
wurden ausgewählt
auf der Grundlage eines Farbumschwungs des Organismus durch Lycopen,
erzeugt durch die Koexistenz von crtB (das Gen der Phytoensynthase)
und crtI (das Gen der Phytoendesaturase, cis:trans-Isomerase), die
aus Erwinia uredovora stammen, und dem Gen der FPP-Synthase des
mutierten B. stearothermophilus in Escherichia coli. Die GGPP-Synthase
und ihre Mutante und ihr Gen aus S. acidocaldarius wurden auf der
Grundlage der Aktivität
der Komplementierung der Glycerol-metabolischen Aktivität der HexPP-Synthase
defizienten knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae.
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Das
Koexistenzverfahren der CrtB und CrtI-Gene von E. uredovora kann
nicht für
das Screening der Reaktionsprodukte des mutierten Enzyms, die länger als
GGPP sind, verwendet werden, und das Screening-Verfahren unter Verwendung
der Komplementierungsaktivität
der HexPP-Synthase defizienten knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae
kann nicht für
den spezifischen Nachweis der Reaktionsprodukte verwendet werden,
die länger
als HexPP sind. Diese genetischen Screening-Verfahren sind für die Klonierung
der Gene der mutierten Prenyldiphosphatsynthasen mit den Syntheseaktivitäten von
GGPP, GFPP und HexPP geeignet, aber können nicht systematisch die
Kettenlänge
der Reaktionsprodukte der Prenyldiphosphatsynthasen mit der Absicht
der Verlängerung
der Kettenlänge
der Reaktionsprodukte kontrollieren. Eine Regel für diesen
Zweck ist ebenfalls nicht bekannt.
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Ohnuma,
S.-I.; J. Biol. Chem., Vol. 217, Nr. 17 Seiten 10087–10095,
(1996) ist eine Veröffentlichung, in
der die Veränderung
der katalytischen Aktivität
der Farnesyldiphosphatsynthase aus B. stearothermophilus durch Substitution
der Aminosäuren
Leucin 34 zu Valin, Tyrosin 81 zu Histidin und Valin 157 zu Alanin
beschrieben wird.
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In
EP-A-0 733 709 wird eine ungerichtete Mutagenese einer Farnesyldiphosphatsynthase
beschrieben, wobei verschiedene Aminosäurereste beschrieben werden,
deren Substitution zu einer Kettenverlängerung des Reaktionsprodukts
führt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
ist eine Aufgabe der Erfindung eine Regel für die systematische Kontrolle
der Kettenlänge
der Reaktionsprodukte durch Modifizierung der Aminosäurereste
von Prenyldiphosphatenzymen zu etablieren. Ein neues Enzym, das
stabiler ist oder eine höhere
spezifische Aktivität
hat und für
industrielle Anwendungen geeigneter ist, würde es ermöglichen, unmittelbar ein mutiertes
Enzym oder sein Gen zu erhalten, das Prenyldiphosphat mit einer
längeren
Kettenlänge
durch Modifikation der Aminosäurereste
auf der Grundlage der vorher erwähnten Regel
synthetisiert.
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Durch
die Informationen über
die Nucleotidsequenz des Gens der GGPP-Synthase des mutierten S. acidocaladarius,
wurde klargestellt, dass von den zwei vorgeschlagenen Asp-reichen
Domänen
auf der Grundlage der Analyse der Aminosäuresequenz der Prenyldiphosphatsynthase,
der Aminosäurerest
lokalisiert an der fünften
Position aufwärts
von der Asp-reichen Domäne
der konservierten Sequenz I (DDXX(XX)D) an der aminoterminalen Seite
an der Kontrolle der Kettenlänge
der Reaktionsprodukte beteiligt ist.
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Daher
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren nach Anspruch 1 zur
Verfügung.
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In
der vorliegenden Erfindung können
Prenyldiphosphate mit 20 Kohlenstoffen oder mehr erzeugt werden,
dadurch gekennzeichnet, dass das vorher erwähnte Enzym in Kontakt mit einem
Substrat ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Isopentenyldiphosphat, Dimethylallyldiphosphat,
Geranyldiphosphat, Farnesyldiphosphat und Geranylgeranyldiphosphat
gebracht wird.
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KURZE ERLÄUTERUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die 1 ist
eine Grafik, die die enzymatische Aktivität der erhaltenen 19 mutierten
Typen der BstFPSs (B. stearothermophilus FPP-Synthase) und einer
BstFPS vom Wildtyp (Probenname Y) zeigt. „Primer: DMAPP" zeigt an, dass DMAPP
als das allylische Substrat verwendet wurde, „Primer: GPP" zeigt an, dass GPP
als das allylische Substrat verwendet wurde, und „Primer:
FPP" zeigt an, dass
FPP als das allylische Substrat verwendet wurde. In den A bis W
bezeichneten Proben, wird der Name der Aminosäure nach Einfügen der
Substitution an der Position 81 durch die Einbuchstabenbezeichnung
angegeben.
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Die 2 zeigt
eine Fotographie eines Entwicklungsmusters der TLC des dephosphorylierten Produkts
der Reaktion der mutierten BstFPS, wenn DMAPP als das allylische
Substrat verwendet wurde. Y81A bis Y81Y stellen Aminosäuresubstitutionsmutationen
dar.
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Die 3 zeigt
eine Fotographie eines Entwicklungsmusters der TLC des dephosphorylierten
Produkts der Reaktion der mutierten BstFPS, wenn GPP als das allylische
Substrat verwendet wurde. Y81A bis Y81Y stellen Aminosäuresubstitutionsmutationen
dar.
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Die 4 zeigt
eine Fotographie eines Entwicklungsmusters der TLC des dephosphorylierten
Produkts der Reaktion der mutierten BstFPS, wenn EPP als das allylische
Substrat verwendet wurde. Y81A bis Y81Y stellen Aminosäuresubstitutionsmutationen
dar.
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Die 5 ist
eine Grafik, die die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität und der
Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten
zeigt, wenn DMAPP als das allylische Substrat verwendet wird.
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Die 6 ist
eine grafische Darstellung, die die Beziehung zwischen der enzymatischen
Aktivität
und den Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten zeigt, wenn
GPP als das allylische Substrat verwendet wurde.
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Die 7 ist
eine Grafik, die die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität und den
Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten
zeigt, wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde.
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Die 8 ist
eine Grafik, die die Beziehung zwischen der mittleren Kettenlänge der
Reaktionsprodukte und den Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten
zeigt, wenn DAMPP als das allylische Substrat verwendet wurde.
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Die 9 ist
eine Grafik, die die Beziehung zwischen der mittleren Kettenlänge der
Reaktionsprodukteund dem Molekulargewicht der Aminosäureseitenketten
zeigt, wenn GPP als das allylische Substrat verwendet wurde.
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Die 10 ist
eine Grafik, die die Beziehung zwischen der mittleren Kettenlänge der
Reaktionsprodukteund den Molekulargewichten der Aminosäureseitenketten
zeigt, wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde.
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Die 11 ist
eine Grafik, die die Bereiche (I) bis (VII) von verschiedenen Prenyldiphosphatsynthasen und
Asp-reichen Domänen
und die Aminosäure
(Sternchen) lokalisiert an der fünften
Position in der N-terminalen Richtung von ihrem Ende zeigt. In der
Figur stellt die Sequenz die Aminosäuresequenz der Farnesyldiphosphatsynthase
dar, 1 ist eine aus Bacillus stearothermophilus stammende, 2 stammt
aus Escherichia coli, 3 aus Saccharomyces cerevisiae, 4 aus einer
Ratte und 5 aus einem Menschen.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG
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Es
wurde vorgeschlagen, dass es sieben konservierte Bereiche in den
Aminosäuresequenzen
von Prenyldiphosphatsynthasen (einer Untereinheit in dem Fall eines
Heterodimers) gibt (A. Chem et al., Proteine Science Vol. 3, Seiten
600–607,
1994). Es ist ebenfalls bekannt, dass von den fünf konservierten Bereichen, der
Bereich II eine Asp-reiche Domäne
mit einem konservierten Bereich I [DDXX(XX)D] (wobei die zwei X
in den Klammern nicht vorhanden sein können) enthält. Obwohl es ebenfalls eine
Asp-reiche Domäne
im Bereich IV gibt, ist die zur Spezifizierung des modifizierten
Bereichs der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz
verwendete Asp-reiche Domäne
im Bereich II vorhanden, wobei die Domäne als die Asparaginsäure reiche
Domäne
I im Vergleich zu der im Bereich VI vorhandenen Asparaginsäure reichen
Domäne
II bezeichnet wird.
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Als
Prenyldiphosphatsynthasen mit der vorher beschriebenen Asp-reichen
Domäne
können
Farnesyldiphosphatsynthase, Geranylgeranyldiphosphatsynthase, Hexaprenyldiphsophatsynthase,
Heptaprenyldiphosphatsynthase, Octaprenyldiphosphatsynthase, Nonaprenyldiphosphatsynthase,
Undecaprenyldiphosphatsynthase usw., erwähnt werden. Spezifischere Beispiele
enthalten Farnesyldiphosphatsynthase von Bacillus stearothermophilus,
Farnesyldiphosphatsynthase von Escherichia coli, Farnesyldiphosphatsynthase
von Saccharomyces cerevisiae, Farnesyldiphosphatsynthase von der
Ratte, Farnesyldiphosphatsynthase vom Menschen, Geranylgeranyldiphosphatsynthase
von Neurospora crassa, Hexaprenyldiphosphatsynthase von Saccharomyces
cerevisiae und ähnliche.
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Als
Beispiel einiger davon werden in der 11 die
Bereiche I bis VII und die Asp-reiche Domäne I (im Kasten) im Bereich
II der Aminosäuresequenz
von Farnesyldiphosphatsynthasen gezeigt.
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Die
vorliegende Erfindung kann bei Prenyldiphosphatsynthasen mit diesen
Asparaginsäure
reichen Domänen
I angewendet werden.
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Erfindungsgemäß wird der
Aminosäurerest
lokalisiert an der fünften
Position in der N-terminalen Richtung vom D des N-Terminus der Asparaginsäure reichen
Domäne „DDXX(XX)D" (wobei die zwei
X in den Klammern nicht vorhanden sein können) durch eine andere Aminosäure substituiert.
Diese Aminosäure
wird durch ein Sternchen in der 11 angezeigt.
Die Aminosäure
nach der Substitution kann jede natürlich auftretende Aminosäure sein,
die unterschiedlich zu der ursprünglichen
Aminosäure
ist. Als ein derartiges Beispiel wird ein Enzym erwähnt, mit
einer Aminosäuresequenz
in welcher die Aminosäure
Tyrosin an der Position 81 in der SEQ ID Nr. 1 durch eine natürlich auftretende
Aminosäure
substituiert wurde.
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Viele
mutierte Prenyldiphosphatsynthasen, wie in der vorliegenden Erfindung
definiert, können
ein Prenyldiphosphat mit einer längeren
Kettenlänge
als das durch die natürliche
Prenyldiphosphatsynthase synthetisierte synthetisieren. Z.B. können einige
Farnesyldiphosphatsynthasen, die ein Farnesyldiphosphat mit 15 Kohlenstoffen
synthetisieren, wenn sie in ein mutiertes Enzym modifiziert werden,
Hexaprenyldiphosphat mit 30 Kohlenstoffen synthetisieren.
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Ferner
kann, wenn einmal die Aminosäuresequenz
des erwünschten
Enzyms bestimmt wurde, eine geeignete Nucleotidsequenz davon bestimmt,
und die DNS in einem herkömmlichen
Verfahren der DNS-Synthese chemisch synthetisiert werden.
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Expressionsvektoren
enthalten einen Ursprung der Replikation, die Expression regulierende
Sequenzen usw., aber sie können
mit dem Wirt differieren. In Bezug auf die Wirte können Prokaryoten,
z.B. Bakterien, wie etwa Escherichia coli und die Gattung Bacillus,
wie etwa Bacillus subtilis, als euch Eukaryoten, z.B. Pilze, wie
etwa Hefe, z.B. Gattung Saccharomyces, wie etwa Saccharomyces cerevisiae,
Gattung Pichia, wie etwa Pichia pastoris, filamentöse Pilze,
z.B. Gattung Aspergillus, wie etwa Aspergillus oryzae oder Aspergillus
niger, tierische Zellen, z.B. kultivierte Zellen der Seidenraupe,
kultivierte Zellen höherer
Tiere, wie etwa CHO-Zellen, und ähnliche
genannt werden. Ferner können
Pflanzen als der Wirt verwendet werden.
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Wie
in den Beispielen gezeigt, können
erfindungsgemäß während der
Kultivierung des durch die DNS transformierten Wirts langkettige
Prenyldiphosphate, wie etwa GGPP, GFPP, HexPP und ähnliche
im Kulturmedium akkumulieren, welche gewonnen werden, um ihre entsprechenden
Diphosphate zu erzeugen. Ferner können langkettige Diphosphate
ebenfalls durch in Kontakt bringen der erfindungsgemäß hergestellten
mutierten Prenyldiphosphatsynthase mit dem Substrat Isopentenyldiphosphat
und einem Allylsubstrat, wie etwa Farnesyldiphosphat, hergestellt
werden.
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Wenn
Escherichia coli als der Wirt verwendet wird, ist bekannt, dass
der Wirt regulatorische Funktionen für das Gen während des Stadiums der Transkription
von mRNS aus DNS und bei der Translation von Protein aus mRNS hat.
Als die Promotorsequenz, die die mRNS-Synthese reguliert, sind zusätzlich zu
den natürlich
auftretenden Sequenzen (z.B. lac, trp, bla, lpp. PL,
PR, ter, T3, T7, usw.) ihre Mutanten (z.B.
lacUV5) und die Sequenzen (wie etwa tac, trc, usw.), in welche ein
natürlich
auftretender Promotor künstlich
fusioniert ist, bekannt, und sie können für die vorliegende Erfindung
verwendet werden.
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Es
ist bekannt, dass der Abstand zwischen der Sequenz der Ribosomenbindungsstelle
(GAGG und dazu ähnliche
Sequenzen) und dem Initiationskodon ATG wichtig als eine Sequenz
zur Regulierung der Fähigkeit
der Synthese von Protein aus mRNS ist. Es ist ebenfalls gut bekannt,
dass ein Terminator (z.B. ein Vektor mit rrnPT1 T2, kommerziell
erhältlich
von Pharmacia), der die Transkriptionstermination am 3'-Ende steuert, die
Effizienz der Proteinsynthese durch eine Rekombinante beeinflusst.
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Als
Vektoren, die für
die Herstellung von rekombinanten Vektoren verwendet werden könne, können verschiedene
Vektoren erwähnt
werden, die in Abhängigkeit
von ihrer beabsichtigten Verwendung abgeleitet werden. Z.B. können erwähnt werden
pBR322, pBR327, pKK223-3, pKK233-3, pTrc99 und ähnliche, mit einem von pMB1
abgeleiteten Replikon; pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N, pTV119N,
pBluescript, pHSG298, pHSG396 und ähnliche, mit einer Veränderung
zur Erhöhung
der Kopienanzahl; oder pACYC177, pACYC184 und ähnliche, mit einem von p15A
abgeleiteten Replikon; und ferner von pSC101, ColEl, R1, F-Faktor
und ähnliche
abgeleitete Plasmide. Ferner können
Fusionsproteine exprimierende Vektoren verwendet werden, die eine
leichtere Reinigung ermöglichen,
wie etwa pGEX-2T, pGEX-3X, pMal-c2. Ein Beispiel für das als
Ausgangsmaterial der vorliegenden Erfindung verwendete Gen wird
in der japanischen Patentanmeldung Nr. 6-315572 beschrieben.
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Ferner
können
zusätzlich
zu Plasmiden, virale Vektoren, wie etwa der λ-Phage oder der M13-Phage oder
Transposons für
die Einführung
von Genen verwendet werden. Bezüglich
der Einführung
des Gens in andere Mikroorganismen als Escherichia coli ist die
Geneinführung
in Organismen der Gattung Bacillus durch pHY300PLK (Takara Shuzo)
bekannt. Diese Vektoren werden in Molecular Cloning (J. Sambrook,
E. F. Fritsch, und T. Maiatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press)
und Cloning Vector (P. H. Pouwles, B. E. Enger, Valk, und W. J.
Brammar, Elsevier) und Katalogen vieler Hersteller beschrieben.
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pTrc99
ist besonders bevorzugt, da es, zusätzlich zu dem selektierbaren
Marker des Ampicillinresistenzgens, einen Promotor, regulatorische
Gene, wie etwa Ptrc und lacIq, die Sequenz
AGGA als Ribosombindungsstelle, rrnPT1T2 als Terminator und eine Funktion der Regulierung
der Genexpression der FPP-Synthase hat.
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Die
Integration des für
die Prenyldiphosphatsynthase kodierenden DNS-Fragments und, wo erforderlich,
des DNS-Fragments
mit der Funktion der regulierten Expression des Gens des Enzyms
in diesen Vektoren, kann durch ein herkömmliches Verfahren unter Verwendung
eines geeigneten Restriktionsenzyms und einer Ligase durchgeführt werden.
Spezifische Beispiele für
die derartig konstruierten Plasmide umfassen z.B. pTV118N-Bst FPS.
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Als
die für
die Integration von Genen durch derartige rekombinante Vektoren
geeignete Mikroorganismen können
Escherichia coli und Mikroorganismen der Gattung Bacillus verwendet
werden. Eine derartige Transformation kann ebenfalls unter Verwendung
des CaCl2-Verfahrens und des Protoplastenverfahrens
wie in Molecular Cloning (J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis,
Cold Spring Harbor Laboratory Press) und DNA Cloning Vol. I to III
(D. M. Clover ed., IRL PRESS) beschrieben, durchgeführt werden.
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Um
das wie in der vorliegenden Erfindung definierte mutierte Enzym
zu erzeugen, wird ein wie vorher beschriebener, transformierter
Wirt kultiviert und dann wird die Kultur einem Verfahren mit Aussalzen,
Ausfällen
mit einem organischen Lösungsmittel,
Gelchromatographie, Affinitätschromatographie,
hydrophobe Interaktionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie
und ähnlichem
unterzogen, um das Enzym zu gewinnen und zu reinigen.
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Als
das Enzym kann nicht nur das gereinigte Enzym sondern ebenfalls
das rohe Enzym verwendet werden, das halb bis zu verschiedenen Stadien
gereinigt wird, oder eine Mischung der kultivierten Biomasse eines
Mikroorganismus kann verwendet werden. Alternativ können immobilisierte
Enzyme, hergestellt gemäß einem
herkömmlichen
Verfahren aus den Enzymen, dem rohen Enzym oder einem Produkt, das
das Enzym enthält,
hergestellt werden.
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Als
das Substrat können
Prenyldiphosphate und Isopentenyldiphosphate mit 5 bis 20, bevorzugt
5 Kohlenstoffen weniger als die Anzahl des erwünschten Prenyldiphosphats verwendet
werden. Als das Reaktionsmedium können Wasser oder eine wässrige Pufferlösung, z.B.
Tris-Puffer oder Phosphat-Puffer, und ähnliche, verwendet werden.
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Unter
Verwendung des durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Systems
für die
Regulierung der Kettenlänge
des Reaktionsprodukts von Prenyldiphosphatsynthase, kann Prenyldiphosphat
mit längerer
Kettenlänge,
dessen Synthese bisher nur mit dem Enzym vom Heterodimertyp möglich war,
unter Verwendung einer mutierten Prenyldiphosphatsynthase vom Homodimertyp
synthetisiert werden, die einfacher zu Handhaben ist. Ferner kann
durch die Modifizierung des Aminosäurerestes lokalisiert an der
fünften
Position stromaufwärts
von der Asparaginsäure
reichen Domäne
I der entsprechenden Untereinheit mit der Asparaginsäure reichen
Domäne
der Prenyldiphosphatsynthase vom Heterodimertyp unter Verwendung
des vorher erwähnten Systems,
die Schaffung eines mutierten Enzyms erwartet werden, das Prenyldiphosphate
mit verlängerten Ketten
synthetisiert.
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In
den Ansprüchen
und der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Aminosäurereste durch
die Einbuchstabencodes oder die Dreibuchstabencodes dargestellt.:
A;
Ala; Alanin
C; Cys; Cystin
D; Asp; Asparaginsäure
E;
Glu; Glutaminsäure
F;
Phe; Phenylalanin
G; Gly; Glycin
H; His; Histidin
I;
Ile; Isoleucin
K; Lys; Lysin
L; Leu; Leucin
M; Met;
Methionin
N; Asn; Asparagin
P; Prl; Prolin
Q; Gln;
Glutamin
R; Arg; Arginin
S; Ser; Serin
T; Thr; Threonin
V;
Val; Valin
W; Trp; Tryptophan
Y; Tyr; Tyrosin
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Die
Substitution der Aminosäure
wird in der Reihenfolge "der
Aminosäurerest
vor Substitution", "die Nummer des Aminosäurerestes" und „Aminosäurerest
nach Substitution" bezeichnet.
Z.B. wird die Mutation, in welcher ein Tyrosinrest an der Position
81 durch ein Methioninrest ausgetauscht wird, als Y81M dargestellt.
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die spezifischen Beispiele
erläutert,
aber sie dürfen nicht
als Beschränkung
der Erfindung auf irgendeine Art und Weise ausgelegt werden.
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Beispiel 1: Konstruktion
eines Plasmids, das das Gen der FPP-Synthase enthält
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Das
Gen der aus Bacillus stearothermophilus stammenden FPP-Synthase
(hiernach als BstFPS bezeichnet), wurde an die NcoI-HindIII-Stelle
des Plasmidvektors pTV118N, kommerziell erhältlich von Takara Shuzo, unterkloniert.
Die Plasmid-DNS wurde als pTV118N-BstFPS bezeichnet. Das BstFPS-Gen
ist erhältlich aus
Escherichia coli JM109 (pEX1), das international am 26. September
1991 beim National Institute of Bioscience and Human Technology,
Agency of Industrial Science and Technology in Ibalaki, Japan unter
der Hinterlegungsnummer FERM BP-3581
hinterlegt wurde. Ebenfalls wurde die gesamte Nucleotidsequenz des BstFPS-Gens
in der japanischen Patentanmeldung 3(1991)-253788, T. Koyama et
al., (1993) J. Biochem. 113: 355–363 oder in einer genetischen
Informationsdatenbank, wie etwa GenBank, unter der Eintragungsnummer D13293
veröffentlicht.
Da Bacillus stearothermophilus ebenfalls von verschiedenen Hinterlegungsstellen
für Mikroorganismen,
wie etwa ATCC usw. erhältlich
ist, kann die DNS des Gens des BstFPS-Bereichs durch ein herkömmliches
Genklonierungsverfahren erhalten werden.
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Beispiel 2: Synthese der
Oligonucleotide für
das Einfügen
von Mutationen
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Für das Einfügen von
Mutationen in das Gen der FPP-Synthese
wurden die folgenden Oligonucleotide entworfen und synthetisiert:
Primer
DNS (Y81X): 5'GAT
CCA TAC GNN NTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3' (SEQ ID Nr.: 2)
Primer DNS (Y81N):
5'GAT CCA TAC GAA
CTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3' (SEQ
ID Nr.: 3)
Primer DNS (Y81I): 5'GAT CCA TAC GAT TTC TTT GAT TCA TGA
TGA TTT G3' (SEQ
ID Nr.: 4)
Primer DNS (Y81M): 5'GAT CCA TAC GAT GTC TTT GAT TCA TGA
TGA TTT G3' (SEQ
ID Nr.: 5)
Primer DNS (Y81F): 5'GAT CCA TAC GTT CTC TTT GAT TCA TGR
TGA TTT G3' (SEQ
ID Nr.: 6)
Primer DNS (Y81P): 5'GAT CCA TAC GCC GTC TTT GAT TCA TGA
TGA TTT G3' (SEQ
ID Nr.: 7)
Primer DNS (Y81V): 5'GAT CCA TAC GGT GTC TTT GAT TCA TGA
TGA TTT G3' (SEQ
ID Nr.: 8)
-
Sie
sind dafür
entworfen, die Spaltstelle des Restriktionsenzyms BspHI (5'TCATGA3') als auch Mutationen
in das Codon neu einzufügen,
das für
den Aminosäurerest
an der Position 81 von BstFPS kodiert. Das Einbringen der Spaltstelle
von BspHI ändert
die durch das BstFPS-Gen kodierte Aminosäuresequenz aufgrund der Regeneration
der Codons nicht. Dies wird verwendet, um substitutionsmutierte
Plasmide mittels Agarosegel-Elektrophorese
nach Verdau mit BspHI nachzuweisen, da die Einführung der Mutation durch Substitution des
Aminosäurerest
an der Position 81 des BstFPS-Gens gleichzeitig eine neue BspHI-Spaltstelle
erzeugt.
-
Diese
Primer DNS wurden einer Phosphorylierung bei 37°C für 30 Minuten in dem unten gezeigten Reaktionsmedium
unterzogen, gefolgt durch Denaturierung bei 70°C für 10 Minuten.
10
pmol/μl
Primer DNS | 2 μl |
10 × Kinasepuffer | 1 μl |
10
mM ATP | 1 μl |
H2O | 5 μl |
T4
Polynucleotidkinase | 1 μl |
in welchem der 10 × Kinasepuffer 1000 mM Tris-Cl
(pH 8,0), 100 mM MgCl
2 und 70 mM DTT ist.
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Beispiel 3: Einfügen von
Substitutionsmutationen in das Codon entsprechend Aminosäurerest
an der Position 81 des BstFPS-Gens
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Unter
Verwendung jeder im Beispiel 2 konstruierten Primer-DNS wurden Substitutionsmutationen
in das in Beispiel 1 hergestellte Plasmid gemäß dem Verfahren von Kunkel
eingeführt.
Das kommerziell erhältliche
Mutan-K-Reagenziensatz
von Takara Shuzo wurde verwendet, um das Verfahren von Kunkel durchzuführen. Das
experimentelle Vorgehen wurde in der Reagenziensatzbeilage beschrieben.
Die Substitutionsmutation des Plasmids muss nicht durch das Verfahren
von Kunkel durchgeführt
werden. Z.B. kann das gleiche Ergebnis durch ein Verfahren unter
Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten werden.
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Unter
Verwendung von Escherichia coli CJ236 in dem Mutan-K-Reagenziensatz
als die Wirtszelle, wurde eine einzelsträngige DNS erhalten, in welcher
die Thyminbase im Plasmid pTV118N-BstFPS durch die Deoxyuracilbase
ersetzt wurde.
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Die
derartig erhaltene einzelsträngige
DNS wurde als Matrize in einer Reaktion verwendet, in welchem eine
Primer-DNS für
die Synthese eines komplementären
Stranges in der folgenden Reaktionslösung bei 65°C für 15 Minuten behandelt und
dann durch Stehenlassen bei 37°C
für 15
Minuten annealt wird:
Einzelsträngige DNS | 0,6
pmol |
Annealing-Pufferlösung | 1 μl |
Primer
DNS-Lösung
(Beispiel 2) | 1 μl |
H2O um ein Endvolumen von 10 μl zu ergeben | |
in welchem die Annealing-Pufferlösung 200
mM Tris-Cl (pH 8,0), 100 mM MgCl
2, 500 mM
NaCl und 10 mM DTT ist.
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Ferner
wurden 25 μl
einer Verlängerungspufferlösung, 60
Einheiten der Escherichia coli DNS-Ligase und 1 Einheit der T4-DNS-Polymerase
zugegeben, um bei 25°C
für 2 Stunden
einen komplementären
Strang zu synthetisieren. Die Verlängerungspufferlösung ist
50 mM Tris-Cl (ph 8,0), 60 mM Ammoniumacetat, 5 mM MgCl2,
5 mM DTT, 1 mM NAD und 0,5 mM dNTP.
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Nachdem
die Reaktion vorbei ist, wurden 3 μl 0,2 M EDTA (pH 8,0) dazugegeben
und einer Behandlung bei 65°C
für 5 Minuten
unterzogen, um die Reaktion zu beenden.
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Beispiel 4: Konstruktion
einer Rekombinante mit einem Gen von welchem Substitutionsmutationen
in das Codon entsprechend dem Aminosäurerest an der Position 81
des BstFPS-Gens einfügt
wurde
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In Übereinstimmung
mit Beispiel 3 wurde die konstruierte DNS-Lösung verwendet, um Escherichia
coli DH5α durch
das CaCl2-Verfahren zu transformieren. Ein
alternatives Verfahren, wie etwa die Elektroporation, ergibt ähnliche
Ergebnisse.
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Die
durch das CaCl2-Verfahren erhaltene Transformante
wurde auf einer Agarplatte mit Ampicillin, einem selektierbaren
Marker für
die Transformanten, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
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Unter
den wie vorher erhaltenen Transformanten wurden diejenigen mit dem
substitutionsmutierten pTV118N-BstFPS-Plasmid,
die eine BspHI-Spaltstelle in dem BstFPS kodierenden Bereich haben,
ausgewählt.
Die Nucleotidsequenz in der Nachbarschaft des Codons, das dem Aminosäurerest
an der Position 81 des BstFPS-Gens des ausgewählten substitutionsmutierten
pTV118N-BstFPS-Plasmid
entspricht, wurde durch das Dideoxyverfahren bestimmt. Im Ergebnis
wurden pTV118N-BstFPs-Plasmide mit den folgenden 19 substitutionsmutierten
BstFPS-Genen erhalten:
Mutation | Codon |
Y81A | GCT |
Y81C | TGC |
Y81D | GAC |
Y81E | GAA |
Y81F | TTC |
Y81G | GGT |
Y81H | CAC |
Y81I | ATT |
Y81K | AAG |
Y81L | CTC |
Y81M | ATG |
Y81N | AAC |
Y81P | CCG |
Y81Q | CAA |
Y81R | AGG |
Y81S | TCG |
Y81T | ACA |
Y81V | GTG |
Y81W | TGG |
Y81Y
(Wildtyp) | TAC |
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Beispiel 5: Messung der
Aktivität
der mutierten BstFPS
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Rohe
Enzymlösungen
wurden wie folgt aus den in Beispiel 4 erhaltenen 20 Transformanten
mit 19 mutierten BstFPS-Genen und einem Wildtyp-BstFPS-Gen hergestellt.
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Die über Nacht
in dem 2 × LB-Medium
kultivierte Transformante wurde zur Ernte der Zellen zentrifugiert,
und dann wurden die Zellen in dem Puffer für die Zellhomogenisierung (50
mM Tris-Cl (pH 8,0), 10 mM β-Mercaptoethanol,
1 mM EDTA) suspendiert. Dies wurde durch Ultraschall homogenisiert
und dann bei 4°C bei
10.000 U/min für
10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wurde bei 55°C
für 30
Minuten behandelt, um die Aktivität der aus Escherichia coli
stammenden Prenyldiphosphatsynthase zu inaktivieren. Dies wurde
weiter unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und der erhaltenen Überstand
wurde als ein roher Enzymextrakt bei einer Reaktion bei 55°C für 15 Minuten
in der folgenden Reaktionslösung
verwendet:
[1-14C]-IPP (1 Ci/mol) | 25
nmol |
Allylisches
Substrat (DMAPP oder GPP oder FPP) | 25
nmol |
Tris-Cl
(pH 8,5) | 50
nM |
MgCl2 | 5
mM |
NH4Cl | 50
mM |
β-Mercaptoethanol | 50
mM |
Enzymlösung | 50 μg |
H2O um 1 ml zu ergeben | |
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Nachdem
die Reaktion vorüber
ist, wurden 3 ml Butanol zugegeben, um das Reaktionsprodukt in eine Butanolschicht
zu extrahieren. 1 ml der erhaltenen Butanolschicht wurde in 3 ml
eines Flüssigszintillators
gegeben, um die Aktivität
durch einen Szintillationszähler
zu messen. Das Ergebnis wird in der 1 gezeigt. Die
Y81P BstFPs-Mutante wies nur eine geringe enzymatische Aktivität auf, was
von der Tatsache ableitbar ist, dass nur der Prolinaminosäurerest
aus der Iminosäure
abgeleitet wird und daher nicht in der Lage ist, die Form einer α-Helix oder
einer β-Faltblattstruktur
anzunehmen, wodurch signifikant die wesentliche höhere Struktur
des Enzyms selbst geändert
wird.
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Das
Lösungsmittel
wird vom Rückstand
der Butanolschicht durch Einspülen
von Stickstoffgas unter Erwärmung
der Schicht verdampft, um auf 0,5 ml konzentriert zu werden. Zu
dem Konzentrat wurden zwei ml Ethanol und ein ml einer Lösung der
sauren Phosphatase aus der Kartoffel (2 mg/ml Phosphatase aus der
Kartoffel, 0,5 M Natriumacetat (pH 4,7)), um die Dephosphorylierungsreaktion
bei 37°C
durchzuführen.
Nachfolgend wurde das dephosphorylierte Reaktionsprodukt mit 3 ml
n-Pentan extrahiert. Dieses wurde durch Verdampfen des Lösungsmittels
durch Einspülen
von Stickstoffgas verdampft, welches dann durch TLC (Umkehrphase-TLC-Platte:
LKC18 (Whatman), Entwicklungsmittel: Aceton/Wasser = 9/1) analysiert.
Das entwickelte dephosphorylierte Reaktionsprodukt wurde durch den
Bio Image Analyzer BAS2000 (Fuji Photo Film) analysiert, um die
Lokalisierung und die relative Radioaktivität zu bestimmen. Wenn das Mengenverhältnis aller
Reaktionsprodukte gleich ist, wird das Verhältnis der Radioaktivität FPP :
GGPP : GFPP : HexPP = 2 : 3 : 4 5. Das Ergebnis, wenn DMAPP als
das allylische Substrat verwendet wurde, wird in der 2 gezeigt,
wenn GPP als das allylische Substrat verwendet wurde, wird in der 3 gezeigt
und wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde, wird in
der 4 gezeigt.
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Beispiel 6: Verhältnis des
substitutionsmutierten Aminosäurerestes
zu der Kettenlänge
des Reaktionsprodukts
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Die 1 und
die 4 zeigen, dass wenn die Reaktion unter Verwendung
von FPP als das allylische Substrat durchgeführt wurde, die meisten der
mutierten BstFPS IPP zu Prenyldiphosphaten mit höherer Kettenlänge als
GGPP umwandeln. Zu diesem Zeitpunkt hatten die Substitutionsmutanten,
in welchem die Seitenketten der Aminosäuren derartig kleine Moleküle wie Glycin,
Alanin und Serin sind, eine höhere
Aktivität, während die
Substitutionsmutanten, in welchem die Seitenketten der Aminosäuren große Wildtypmoleküle wie Tyrosin
und Tryptophan sind, eine geringere Aktivität zeigten.
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Dann
wurde die enzymatische Aktivität
gegen die Molekulargewichte der Seitenketten (5, 6 und 7)
mit Bezug auf den Aminosäurerest
an Position 81 aufgetragen. Jedoch wurde das Enzym der Y81P-Substitutionsmutante,
in welchem die enzymatische Funktion verloren ging, weggelassen.
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Im
Ergebnis wurde klar gezeigt, dass wenn die Molekulargewichte der
Seitenketten gering sind, die Aktivität dazu neigt anzusteigen (7).
Die Tendenz wurde ebenfalls beobachtet, selbst wenn andere Parameter
als das Molekulargewicht der Seitenketten, das die Größe des Aminosäurerests
darstellt, wie etwa die zugängliche
Oberfläche,
d.h. ein Parameter der exponierten Oberfläche des Aminosäurerests
[C. Chothia (1976) J. Mol. Biol. 195: 1–14, B. Lee und F. M. Richads
(1971) J. Mol. Biol. 55: 379-400, S. Miller et al. (1987) J. Mol.
Biol. 196: 641), und ähnliche
verwendet wurden.
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Es
gab bisher sehr wenige Berichte darüber, die anzeigten, dass die
Kettenlänge
des Reaktionsprodukts bei der Untersuchung des Mechanismus der Katalyse
von FPP-Synthase
durch das Einbringen von ortsgerichteten Mutationen ohne Screening,
wie etwa durch das Einbringen von ungerichteten Mutationen, verändert wurde.
Die Tatsache, dass das Einfügen
einer einzelnen ortsgerichteten Mutation eine dynamische Kontrolle
der Kettenlänge
des Reaktionsprodukts ermöglicht,
wie durch die vorliegende Erfindung ermöglicht, war völlig unerwartet.
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Aus
den 5 und 6 ist ersichtlich, dass wenn
DMAPP und GPP als das allylische Substrat verwendet wurden, es keine
signifikante Beziehung zwischen dem Molekulargewicht des substitutionsmutierten Aminosäurerestes
und der enzymatischen Aktivität
gab. Es wird angenommen, dass dies aufgrund der Tatsache ist, dass
wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wird, die Reaktionsspezifität des Wildtypenzyms sich
direkt als die enzymatische Aktivität widerspiegelt. Die Spezifität, die DMAPP
und GPP als das allylische Substrat verwendet, ist dem Wildtypenzym
eigen und daher ist die Analyse einer Tendenz beim Parameter der enzymatischen
Aktivität
alleine schwierig.
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Daher
wurde der erwartete Wert der Kettenlänge des Reaktionsprodukt, d.h.
die mittlere Kettenlänge, durch
die folgende Formel erhalten: (erwarteter Wert der Kettenlänge eines
Reaktionsprodukts) = (Anteil an FPP) × 15 + (Anteil an GGPP) × 20 + (Anteil
GFPP) × 25
+ (Anteil HexPP) × 30
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Die
erhaltenen erwarteten Werte für
die Kettenlänge
des Reaktionsprodukts wurden gegen die Molekulargewichte der Seitenketten
der Aminosäuren
an der Position 81 aufgetragen. Jedoch wurde das mutierte Enzym
mit der Y81P-Substitution, bei welchem die enzymatische Funktion
verloren ging, ausgeschlossen. Es wurde aus diesen Figuren gefunden,
dass die erwarteten Werte der Kettenlänge des Reaktionsprodukts höher wurden,
so wie das Molekulargewicht der Seitenkette des Aminosäurerests
an der Position 81 geringer wurde, selbst wenn das allylische Substrat
DMAPP oder GPP ist.
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Wenn
eine ähnliche
Auftragungsanalyse unter Verwendung einer weiteren Eigenschaft des
Aminosäurerests
an der Position 81 durchgeführt
wurde, wie etwa die Hopp & Woods-Skala
als ein Parameter für
die Hydrophobizität
(J. E. Coligan et al. (1995) Current Protocols in Protein Science,
John Wiley & Sons,
Inc.), wurde, wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde,
keine reguläre
Tendenz in Bezug auf den erwarteten Wert der Kettenlänge des
Reaktionsprodukts oder der enzymatischen Aktivität gefunden. Überdies, selbst
wenn Parameter, wie etwa die Leichtigkeit der Einnahme der α-Helixstruktur
(J. E. Coligan et al. (1995) Current Protocols in Protein Science,
John Wiley & Sons,
Inc.) oder die Leichtigkeit der Einnahme der β-Faltblattstruktur (J. E. Coligan
et al. (1995) Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc.) verwendet
werden, wurden keine deutlichen Beziehungen hinsichtlich des erwarteten
Werts der Kettenlänge
des Reaktionsprodukts oder der enzymatischen Aktivität beobachtet,
wenn FPP als das allylische Substrat verwendet wurde. Es wurde zum
ersten Mal durch die vorliegende Erfindung klargestellt, dass der
für die
Bestimmung der Kettenlänge
des Reaktionsprodukts verantwortliche Faktor die Größe der Seitenkette
des Aminosäurerests
lokalisiert 5 Aminosäurereste
stromabwärts
von der Asparaginsäure
reichen Domäne
I (DDXX(XX)D) ist.
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