CN114958800B

CN114958800B - 一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN114958800B
Application number: CN202210723212.7A
Authority: CN
Inventors: 齐欣; 陈相永; 宋新文; 耿亮; 辛文
Original assignee: Beijing Quanshijin Biotechnology Co ltd; Beijing Maidao Biopharmaceutical Manufacturing Co ltd
Current assignee: Beijing Quanshijin Biotechnology Co ltd; Beijing Maidao Biopharmaceutical Manufacturing Co ltd
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2042-06-24
Also published as: CN114958800A

Abstract

本发明公开一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体及其应用。首先公开Taq DNA聚合酶突变体在SEQ ID NO.1所示的序列，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母‑数字‑字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：Y81H、K82N、V310I、L619A。进一步公开其在包含血液或血液制品的样品体系的PCR领域中的应用。本发明Taq DNA聚合酶突变体改变了构象，提高其在PCR体系中对血液的耐受能力，可用于血液直扩PCR，简化了操作步骤，具有广阔的应用前景。

Description

一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种耐受血液或者血液制品抑制的TaqDNA聚合酶突变体及其应用。

背景技术

PCR(Polymerase Chain Reaction)技术是用来放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，自1986年被提出以来，分子生物学及其它相关学科依赖于此技术迅速发展。TaqDNA聚合酶是第一代热稳定性的聚合酶，它解决了大肠杆菌聚合酶耐热性差、每次反应后都要补充的缺点，完成了DNA的自动扩增，使PCR技术变成了一种便利、普遍实用的分子生物学技术。

随着分子生物学技术的发展，PCR技术已被广泛应用于基因表达、分子克隆、测序、疾病检测和治疗、法医学调查、农业生物学技术等过程中，检测的基因模板可能来自于人体或动物体组织、唾液、粪便、痰液或土壤中，因其模板的复杂性，提取模板往往步骤繁多，操作复杂，也可能会引入污染，造成假阴性或假阳性，对于实验影响很大，因此，用样本作为模板直接进行扩增是逐渐成为较为主流的测试方法。在宏基因组扩增实验中，样品与环境中可能带来一些污染与化学制剂影响，导致扩增效果不理想；另外，血液及组织样品中也存在一些抑制物对聚合酶活性也存在抑制作用，因此，直扩的方法对于DNA聚合酶的抗抑制性有较高的要求，野生型Taq DNA聚合酶在此类PCR实验中表现不稳定。

Taq DNA聚合酶属于聚合酶家族A，是一个单体酶，全长832个氨基酸，与大肠杆菌聚合酶I有很高的结构同源性。目前野生型Taq DNA聚合酶对于全血的耐受浓度为0.1～1％，它的N端截短体Klentaq对于血液的耐受程度有一定的提升。但是Klentaq的耐受力仍然不能满足直扩试剂盒的需求，因此我们需要对野生型聚合酶进行突变，提升聚合酶对全血的耐受程度。

酶进化是指利用定向进化技术对工具酶进行改造，旨在提高酶的催化活力、酶的稳定性及对环境的适应能力。定向进化是通过模拟酶在自然界中的进化方法，在核酸序列上引入随机突变，获得突变体文库。通过定向选择的方法，筛选出性质得到优化的目标酶。目前对于突变体文库的筛选主要采用分级筛选法和高通量筛选法，主要采用平板或多孔筛选板为主要筛选工具，常用HPLC测定酶活或酶标仪进行光谱分析进行筛选，筛选通量较小。定向进化的突变文库模拟自然界的进化过程，往往会构将庞大的突变体文库。传统的筛选方式相对于较大的筛选文库意味着巨大的工作量和较低的筛选效率。

同时，聚合酶更加不适用于上述两种筛选方法。不同于聚合酶，其他催化酶底物与产物成分较为均一，通过荧光光谱可以直接检测底物活性从而检测酶活。聚合酶的底物与产物都不能通过简单的一步法进行测量，所以不能直观得到酶活数据，因此需要特殊的方法对酶活进行检测。分隔式自我复制(Compartmentilized Self-Replication,CSR)技术是针对聚合酶的高通量筛选技术，主要原理是将聚合酶在大肠杆菌系统中表达出来，采用油包水乳化液体系将细菌菌体分离，油包水体系中包含有复制所需的缓冲环境与底物，但不另外添加聚合酶与模板，根据聚合酶序列设计引物，使每一个油包水液滴形成一个微型PCR体系。油包水体系分离、分散且稳定，微型体系之间不会相互影响，聚合酶只复制自身的编码基因，形成一个环路反馈。在这个复制过程中，没有活性的突变体酶不能对自我复制进行催化，有催化活性的突变体则将自身DNA通过链式聚合反应指数级放大，在后续的产物收集过程中被富集到。CSR技术的优势在于单次可筛选大量的有活性的聚合酶突变体，其筛选通量可达10⁹个/样品。

在聚合酶参与的PCR(链式聚合反应)中，常常因为样品及外部环境原因，掺入一些抑制聚合酶的反应物，导致PCR过程不能顺利进行，最终产物量不能满足需求，所以在进行PCR反应前需要对样品进行预处理，如临床血液基因组检测等。因此对于像血液或者血液制品(如血浆)这样特殊的样本直扩对于聚合酶的抗抑制能力有了很高的要求。而目前的CSR技术是在筛选出有活性的聚合酶的基础上，再对以上的抑制物进行耐受的检测，即二次筛选，这就造成了CSR后期的工作强度大大增加。

因此，需要对CSR技术进行改进以得到对血液或血液制品具有较高抗抑制性的TaqDNA聚合酶突变体。

发明内容

本发明的一个目的在于提供耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体，其可以耐受较高浓度的血液或血液制品，可直接应用于体外诊断或血液直扩试剂盒中，简化操作步骤。

本发明的另一个目的在于提供上述Taq DNA聚合酶突变体的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明首先提供了一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：Y81H(81位酪氨酸突变为组氨酸)、K82N(82位赖氨酸突变为天冬酰胺)、V310I(310位缬氨酸突变为异亮氨酸)、L619A(619位赖氨酸突变为丙氨酸)。

本发明通过随机突变野生型Taq DNA聚合酶的全长序列，保证每次突变的效率为0.5～1％，通过CSR压力筛选，发现了四个有意义的突变位点Y81H、K82N、V310I、L619A。当四个位点同时突变得到的Taq DNA聚合酶突变体在血液直扩实验中有明显优于野生型TaqDNA聚合酶的表现。本发明利用CSR的酶活筛选过程中直接添加压力筛选，并将该筛选压力由CSR先筛选出具有活性的聚合酶后进行表达、纯化后再进行的二次筛选，提前到了CSR过程中对大量的突变体进行酶活和压力筛选同时进行，从而得到了更高的筛选效率与成功率，经改造后的聚合酶可以耐受较高浓度的血液或血液制品，可直接应用于血液直扩PCR试剂盒中，简化操作步骤。

在本发明具体的实施方式中，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示序列具有80％同一性的具有Taq DNA聚合酶活性的氨基酸序列；优选具有85％同一性，更优选具有90％同一性，最优选的，具有95％同一性。

本发明进一步提供了编码上述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。

在本发明具体的实施方式中，所述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。需要说明的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列也可以是由SEQ ID NO.4所示的野生型Taq DNA聚合酶核苷酸序列突变一个或多个核苷酸形成同义突变得到同样可编码本发明所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列的核苷酸序列，也可以是SEQ ID NO.3的同义序列。

本发明还提供一种包含本发明上述核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供一种包含本发明上述核苷酸序列或重组载体的重组微生物。

本发明进一步提供上述Taq DNA聚合酶突变体、核苷酸序列、重组载体或重组微生物在PCR领域中的应用。

优选的，所述应用为在包含血液或血液制品的样品体系的PCR领域中的应用(即血液直扩PCR)。

在本发明的具体的实施方式中，所述包含血液或血液制品的样品体系中血液体积浓度可以为10％～40％。

在本发明中，所述血液制品可以为血浆。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的由CSR压力筛选得到的Taq DNA聚合酶突变体，通过取代野生型TaqDNA聚合酶的1个或多个氨基酸从而改变了聚合酶的氨基酸序列，影响了聚合酶的构象，提高了聚合酶在PCR体系中对全血的耐受能力，可以耐受较高浓度的血液或血液制品如血浆，在血液体积浓度高达40％的样品体系中依然保有较高的酶活，可以用作血液直扩PCR试剂盒中的酶制剂，简化了操作步骤，具有广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为CSR筛选后巢式PCR结果；其中，泳道1为DNA Marker(Plus DNAMarker，购于Transgen Biotech)，泳道2为巢式PCR产物，条带为目的基因大小片段。

图2野生型Taq DNA聚合酶(简称为WT Taq)与Taq DNA聚合酶突变体(简称为突变体Taq)的SDS-PAGE图；其中，泳道1为蛋白Marker(BlueII Protein Marker，购于Transgen Biotech)，泳道3和4分别为WT Taq DNA聚合酶和纯化得到的Taq DNA聚合酶突变体。

图3为野生型Taq DNA聚合酶(简称为WT Taq)与Taq DNA聚合酶突变体(简称为突变体Taq)对血液的耐受程度的对比；其中，1：正常体系(扩增体系中不含血液)的以人gDNA为模板的WT Taq的PCR产物；2：扩增体系中含有5％血液的以人gDNA为模板的WT Taq的PCR产物；3：扩增体系中含有20％血液的人gDNA为模板的WT Taq的PCR产物；4：扩增体系中含有40％血液的人gDNA为模板的WT Taq的PCR产物；5：正常体系(扩增体系中不含血液)的人gDNA为模板的突变体Taq的PCR产物；6：扩增体系中含有5％血液的人gDNA为模板的突变体Taq的PCR产物；7：扩增体系中含有20％血液的人gDNA为模板的突变体Taq的PCR产物；8：扩增体系中含有40％血液的人gDNA为模板的突变体Taq的PCR产物。

图4为野生型Taq DNA聚合酶(简称为WT Taq)与Taq DNA聚合酶突变体(简称为突变体Taq)对血浆的耐受程度的Actin扩增效果(qPCR法)对比。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

试验例1Taq DNA聚合酶突变体的获得

一、突变体文库的构建

通过随机突变野生型Taq DNA聚合酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)的全长序列，保证每次突变的效率为0.5～1％，并对Taq DNA聚合酶进行随机突变的改造，得到突变体文库，具体步骤如下：

1、pET-21a-Taq克隆质粒的构建

根据SEQ ID NO.4序列设计引物，需在引物上添加限制性酶切位点，引物序列如表1所示。以SEQ ID NO.4所示序列为模板进行PCR反应，得到PCR产物，将PCR产物进行胶回收后用BamH I\XhoI(购自Transgen Biotech)双酶切消化后，与线性化载体(pET-21a，BamHI\XhoI双酶切消化)连接，转化至Trans1-T1感受态(购自Transgen Biotech)中，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜培养。第二天挑取平板上的单克隆菌落，进行质粒提取，送测序正确后确定为pET-21a-Taq克隆质粒。

表1引物序列

2、易错PCR

以pET-21a-Taq克隆质粒作为模板，采用MnCl₂诱导，利用非保真DNAPolymerase酶(简称非保真Taq，购自TransGen Biotech)和表2中所述引物进行易错PCR扩增，得到PCR产物。其中，扩增体系如表3所示，扩增步骤为：94℃ 5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 2min30s，共30个循环；72℃ 10min，结束。

表2引物序列

表3易错PCR扩增体系

将PCR产物进行胶回收后用BamH I\XhoI(购自TransGen Biotech)双酶切消化后，与线性化载体(pET-21a，BamH I\XhoI双酶切消化)连接，转化至Trans1-T1感受态(购自TransGen Biotech)中，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜培养。第二天收集平板上的菌落，进行质粒提取，即为突变体文库。

二、表达Taq DNA聚合酶

将突变体文库转化进表达感受态细胞BL21(DE3)中，冰上孵育半小时后42℃热激30s，加入SOC培养基孵育1小时后涂平板，37℃过夜孵育。第二天收集所有菌落至LB培养基中，37℃220rpm悬浮培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG诱导5小时以表达Taq DNA聚合酶突变体，进一步进行CSR压力筛选。

三、CSR压力筛选

一)CSR油包水体系的制作

1、3000rpm离心15min，去掉上清液，收集菌体，用与LB培养基等体积的1×TaqBuffer轻柔重悬菌体。

2、重复步骤1，用1/10LB培养基体积的10×Taq Buffer重悬，测量OD₆₀₀，估算细胞数量(OD₆₀₀＝1的细胞浓度约为8×10⁸个细胞/ml)。

3、在冰上准备水相CSR混合液，如表4所示，包括10×Taq Buffer悬起的菌液，1μMTaq-F和Taq-R，0.25mM dNTP，稀释至不同浓度的血浆或者全血样本，终浓度为1×10⁹个细胞/ml的菌体。

表4水相CSR混合液

注：0％表示水相CSR混合液中不含血液，10％表示水相CSR混合液中含10％的血液(400μl水相CSR混合液中含40μl血液)，20％表示水相CSR混合液中含20％的血液(400μl水相CSR混合液中含80μl血液)，30％表示水相CSR混合液中含30％的血液(400μl水相CSR混合液中含120μl血液)，40％表示水相CSR混合液中含40％的血液(400μl水相CSR混合液中含160μl血液)。

4、准备油相CSR混合物，矿物油作为液相，包含4.5％(v/v)Span 80，0.4％(v/v)Tween-80，0.05％(v/v)Triton X-100，在室温下持续搅动。因为油相不好用枪头吸取，可以把墙头尖剪掉一点，每次制备体积>50ml，油相CSR混合物可在黑暗环境中储存1个月。

5、将200μl的水相CSR混合液逐滴加入400μl的油相CSR混合液中，控制每滴体积在5～10μl，每5s一滴，容器需预冷，以1000rpm的速度持续搅动。

6、加入最后一滴后持续搅拌5min，溶液粘稠，发白浑浊，得到乳化液(即CSR油包水体系)。

二)CSR

7、将乳化液转入PCR管中，每管50μl，加入2滴矿物油防止蒸发。

8、进行PCR反应，95℃加热5min，用于破菌及破坏背景中的其他酶活性，然后进行如下20个循环：94℃1min、60℃1min、72℃5min，得到PCR产物。循环结束后，PCR产物应保持浑浊乳白色，覆盖的矿物油保持清澈。如果有水相出现，则表明存在一些原因导致乳化不稳定，如搅拌不充分等。

9、将PCR产物收集起来，转入1.5ml的EP管中，室温12000g离心10min。

10、出现两个液体层，移除上层的油脂层，将下层的浑浊液体转入干净的EP管中。

11、1：1加入氯仿/异丙醇/苯酚(24：1：25)的混合溶液，震荡20s，直到底部的浑浊溶液溶解。

12、16000g离心2min，将上层含有DNA的水相层移入新的EP管中。

13、1：1加入氯仿，震荡几秒，16000g离心2min，除去残留的苯酚，将水相层移出。

14、PCR纯化试剂盒或磁珠回收以纯化水相层中的CSR产物。

15、加入2μl的Dpn I，37℃消化1h，得到消化后的CSR产物。

三)提取

16、使用1～10μl的消化后的CSR产物作为模板进行巢式PCR反应，得到巢式PCR产物。其中，引物如表1所示(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)，为减少Taq酶引入的随机突变，使用保真性更高的Pfu酶进行扩增(2×EasyPfu PCR SuperMix，购自TransGen Biotech)。扩增体系如表5所示，扩增步骤为：94℃ 5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 2min30s，共30个循环；72℃ 10min，结束。

表5巢式PCR扩增体系

17、用1％的琼脂糖凝胶进行巢式PCR产物的验证，结果如图1所示，筛选得到有条带的巢式PCR产物。

18、将产物送测序检查突变位点。

经测序得到编码Taq DNA聚合酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

四)表达与纯化

将编码Taq DNA聚合酶突变体的基因进行双酶切(BamH I/Xho I)后与线性化载体(pET-21a，BamH I\XhoI双酶切消化)连接，转化至Trans1-T1感受态(购自TransGenBiotech)中，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜培养。第二天挑取平板上的单克隆菌落，进行质粒提取，送测序正确后确定为pET-21a-Taq突变体克隆质粒。将突变体克隆质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞(购自TransGen Biotech)后，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃过夜培养。第二天挑取平板上的单克隆菌落，进行扩大培养。将单菌落接种于10ml LB培养基中，37℃220rpm培养至OD600为1左右，接种到1L的LB培养基中，37℃220rpm培养至OD600为0.6左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG。37℃诱导5h，离心收集菌体。菌体破碎后离心收集上清液，即为Taq DNA聚合酶突变体的粗提液，将粗提液进行亲和层析，收集得到纯化后的产物，即得到Taq DNA聚合酶突变体。

利用SDS-PAGE进行检测，结果如图2所示，泳道1为蛋白Marker(Blue IIProtein Marker，购于TransGen Biotech)，泳道3和4分别为WT Taq DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶突变体。

Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)相比序列中具有如下多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：Y81H(81位酪氨酸突变为组氨酸)、K82N(82位赖氨酸突变为天冬酰胺)、V310I(310位缬氨酸突变为异亮氨酸)、L619A(619位赖氨酸突变为丙氨酸)，即所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

试验例2Taq DNA聚合酶突变体的活性与抗抑制性的检测

一、验证Taq DNA聚合酶突变体的活性与抗抑制性

以人gDNA为模板，在PCR体系中加入不同浓度的血液作为抑制剂，利用Taq DNA聚合酶突变体(简称为突变体Taq)或野生型Taq DNA聚合酶(简称为WT Taq)进行PCR扩增，以验证血液对于Taq DNA聚合酶突变体的活性与抗抑制性，其中，扩增体系如表6所示，扩增步骤为：94℃ 5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 2min30s，共30个循环；72℃ 10min，结束。结果如图3所示，表明野生型Taq DNA聚合酶不能耐受较高浓度的血液，Taq DNA聚合酶突变体可耐受高至40％终浓度的抑制体系。

表6突变体Taq与WT Taq对人gDNA的PCR扩增体系

注：0％表示正常体系(扩增体系中不含血液)，10％表示扩增体系中含10％的血液(25μl扩增体系中含2.5μl血液)，20％表示扩增体系中含20％的血液(25μl扩增体系中含5μl血液)，30％表示扩增体系中含30％的血液(25μl扩增体系中含7.5μl血液)，40％表示扩增体系中含40％的血液(25μl扩增体系中含10μl血液)。

二、验证Taq DNA聚合酶突变体的活性与抗抑制性II

以人gDNA为模板，在qPCR体系中加入不同浓度的血液作为抑制剂，利用Taq DNA聚合酶突变体(简称为突变体Taq)或野生型Taq DNA聚合酶(简称为WT Taq)对Actin基因进行qPCR扩增，以验证血液对Taq DNA聚合酶突变体的活性与抗抑制性，qPCR扩增体系如表7所示，扩增引物如表8所示，扩增循环步骤为：94℃ 5min，94℃ 5s、60℃ 30s，共45个循环，结束。结果如图4所示，表明WT Taq的活性被血液抑制，突变体Taq的活性未受到影响。

表7突变体Taq与WT Taq扩增人gDNA中Actin的qPCR体系

注：0％表示正常体系(扩增体系中不含血液)，10％表示扩增体系中含10％的血液(20μl扩增体系中含2.0μl血液)，20％表示扩增体系中含20％的血液(20μl扩增体系中含4μl血液)，30％表示扩增体系中含30％的血液(20μl扩增体系中含6.0μl血液)，40％表示扩增体系中含40％的血液(20μl扩增体系中含8μl血液)。

表8扩增引物序列

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京脉道生物药品制造有限公司

北京全式金生物技术股份有限公司

<120> 一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体及其应用

<130> JLP22I0585A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 2

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

His Asn Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Ile Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Ala Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 3

<211> 2496

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcgtggta tgctgccgct tttcgaaccg aaaggtcgtg ttctgctggt ggacggccac 60

cacctggctt atcgcacctt ccacgcgttg aaaggcctga ctaccagccg cggcgagccg 120

gttcaagcag tatatggttt tgctaaaagc ctgctgaaag ctctgaaaga agatggtgac 180

gccgttatcg tagtatttga cgcaaaagcc ccgtctttcc gtcacgaagc ctacggcggt 240

aaaaatgcag gtcgcgctcc gactccggaa gacttcccgc gtcaacttgc cctgatcaaa 300

gagctggtag atctgctggg ccttgcccgt ctggaagttc cgggttacga agctgatgat 360

gttctggcaa gcctcgcgaa gaaagccgaa aaagaaggct acgaagtccg tatcctgacc 420

gctgacaagg atctgtatca gctgctgtcc gatcgcatcc acgcgctgca cccggaaggt 480

tatctgatca ctcctgcttg gctgtgggaa aagtacggcc tgcgtccgga tcagtgggca 540

gattaccgtg ccctgaccgg cgatgaatct gacaacctgc ctggtgttaa aggcatcggt 600

gagaaaacgg cgcgtaaatt actggaggaa tggggctctc tggaagcgct gctgaaaaac 660

ctggaccgtc tgaagccggc gattcgtgaa aaaatccttg ctcacatgga tgatctgaaa 720

ctgtcctggg atctggcaaa ggtacgcacc gatttgccac tggaagttga tttcgccaaa 780

cgtcgtgaac cggaccgtga acgtctgcgt gcattcctgg aacgcctgga attcggtagc 840

ttgctgcacg aattcggcct gctggaaagt ccaaaagccc tggaggaagc gccgtggccg 900

ccgccggaag gcgcctttgt tggtttcatt ctgagccgta aagaaccgat gtgggctgat 960

ctgctggcac tggcagccgc acgtggcggc cgtgtacacc gtgccccgga accgtacaaa 1020

gccctgcgtg acctgaaaga agcacgtggc ctgctggcta aagacctgtc agtactcgca 1080

ctgcgtgaag gtctgggtct gccgccaggt gacgacccga tgctgctggc gtacctgctg 1140

gacccgtcta acactacgcc ggagggtgta gcccgccgct acggcggcga gtggactgaa 1200

gaagctggcg aacgtgcggc gctcagcgaa cgcctgtttg cgaacctgtg gggccgtctg 1260

gaaggcgaag aacgtcttct gtggctgtat cgcgaagttg aacgtccgct gtctgcggtt 1320

ctggcgcaca tggaagctac tggcgtacgt ctggacgtgg cttatctgcg tgcgctgtct 1380

cttgaagttg ccgaagaaat tgcacgtctg gaggcggaag tatttcgtct ggctggccac 1440

ccgttcaacc tgaactcccg tgaccagctg gaacgtgtac tgttcgacga actgggtctg 1500

ccggctattg gtaaaaccga aaaaaccggc aaacgttcca cctcagctgc tgtgctggaa 1560

gcgctgcgcg aagcccaccc tatcgtcgaa aagatcctgc agtatcgtga actgaccaaa 1620

ctgaaaagta cctacatcga ccctctcccg gacctgatcc acccacgtac tggtcgcctg 1680

cacacccgtt ttaaccagac cgcaaccgcg actggtcgcc tgagcagctc tgacccgaac 1740

ctgcagaaca tcccggtccg tactccgctg ggccagcgta tccgccgtgc atttatcgcc 1800

gaagaaggtt ggctgctcgt ggcgctggac tattcgcaga tcgaacttcg cgtgcgagca 1860

cacctgtctg gtgacgagaa ccttattcgt gtttttcagg aaggtcgtga catccatacc 1920

gaaaccgcta gttggatgtt cggcgtaccg cgtgaagcag tagatccact gatgcgtcgt 1980

gcggcaaaaa ccatcaactt cggtgttctg tacggcatgt ctgcacatcg tctgagccag 2040

gaactggcga ttccgtacga agaagcccag gcgttcattg aacgttactt ccagagcttt 2100

ccgaaggtgc gtgcttggat tgaaaaaacg ctggaagaag gccgtcgtcg tggctacgtg 2160

gaaactctct ttggccgccg ccgttatgta ccggacctgg aagctcgcgt taaaagcgtt 2220

cgtgaagcag cagaacgtat ggcattcaat atgccggttc agggtacagc agcggatctg 2280

atgaaactgg ctatggtcaa gctgttcccg cgtctggaag aaatgggtgc acgtatgctg 2340

cttcaggttc acgatgaact ggtactggaa gctccgaaag aacgtgcgga agcggtggcg 2400

cgtttggcaa aggaagttat ggaaggtgtc tacccacttg cggtaccgct ggaggtggaa 2460

gttggtattg gtgaagattg gctgtctgct aaagag 2496

<210> 4

<211> 2496

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcgtggta tgctgccgct tttcgaaccg aaaggtcgtg ttctgctggt ggacggccac 60

cacctggctt atcgcacctt ccacgcgttg aaaggcctga ctaccagccg cggcgagccg 120

gttcaagcag tatatggttt tgctaaaagc ctgctgaaag ctctgaaaga agatggtgac 180

gccgttatcg tagtatttga cgcaaaagcc ccgtctttcc gtcacgaagc ctacggcggt 240

tacaaagcag gtcgcgctcc gactccggaa gacttcccgc gtcaacttgc cctgatcaaa 300

gagctggtag atctgctggg ccttgcccgt ctggaagttc cgggttacga agctgatgat 360

gttctggcaa gcctcgcgaa gaaagccgaa aaagaaggct acgaagtccg tatcctgacc 420

gctgacaagg atctgtatca gctgctgtcc gatcgcatcc acgcgctgca cccggaaggt 480

tatctgatca ctcctgcttg gctgtgggaa aagtacggcc tgcgtccgga tcagtgggca 540

gattaccgtg ccctgaccgg cgatgaatct gacaacctgc ctggtgttaa aggcatcggt 600

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cgtcgtgaac cggaccgtga acgtctgcgt gcattcctgg aacgcctgga attcggtagc 840

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ccggctattg gtaaaaccga aaaaaccggc aaacgttcca cctcagctgc tgtgctggaa 1560

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ctgaaaagta cctacatcga ccctctcccg gacctgatcc acccacgtac tggtcgcctg 1680

cacacccgtt ttaaccagac cgcaaccgcg actggtcgcc tgagcagctc tgacccgaac 1740

ctgcagaaca tcccggtccg tactccgctg ggccagcgta tccgccgtgc atttatcgcc 1800

gaagaaggtt ggctgctcgt ggcgctggac tattcgcaga tcgaacttcg cgtgcttgca 1860

cacctgtctg gtgacgagaa ccttattcgt gtttttcagg aaggtcgtga catccatacc 1920

gaaaccgcta gttggatgtt cggcgtaccg cgtgaagcag tagatccact gatgcgtcgt 1980

gcggcaaaaa ccatcaactt cggtgttctg tacggcatgt ctgcacatcg tctgagccag 2040

gaactggcga ttccgtacga agaagcccag gcgttcattg aacgttactt ccagagcttt 2100

ccgaaggtgc gtgcttggat tgaaaaaacg ctggaagaag gccgtcgtcg tggctacgtg 2160

gaaactctct ttggccgccg ccgttatgta ccggacctgg aagctcgcgt taaaagcgtt 2220

cgtgaagcag cagaacgtat ggcattcaat atgccggttc agggtacagc agcggatctg 2280

atgaaactgg ctatggtcaa gctgttcccg cgtctggaag aaatgggtgc acgtatgctg 2340

cttcaggttc acgatgaact ggtactggaa gctccgaaag aacgtgcgga agcggtggcg 2400

cgtttggcaa aggaagttat ggaaggtgtc tacccacttg cggtaccgct ggaggtggaa 2460

gttggtattg gtgaagattg gctgtctgct aaagag 2496

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggtcgcg gatccatgcg tggtatgctg ccgc 34

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtggtggtgc tcgagttact ctttagcaga cagccaatc 39

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atctggaagt tctgttccag gggcccggat ccatg 35

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcttgttag cagccggatc tcagtggtgg tgg 33

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctggcaccc agcacaat 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggccggact cgtcatac 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agccgccgat ccacacggag t 21

Claims

1.一种耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述TaqDNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。

3.编码权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.包含权利要求2或3所述的核苷酸序列的重组载体。

5.包含权利要求2或3所述核苷酸序列或权利要求4所述重组载体的重组微生物。

6.权利要求1所述的突变型Taq DNA聚合酶、权利要求2或3所述的核苷酸序列、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组微生物在PCR领域中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是在包含血液或血液制品的样品体系的PCR领域中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述样品体系中血液的体积浓度为10％～40％。