CN113462655A

CN113462655A - 检测新型冠状病毒的试剂和方法

Info

Publication number: CN113462655A
Application number: CN202010243709.XA
Authority: CN
Inventors: 喻长杰; 于安路; 陈飞; 郭子平
Original assignee: Suzhou Research Institute Institute Of Biochemistry And Cell Biology Chinese Academy Of Sciences
Current assignee: Suzhou Research Institute Institute Of Biochemistry And Cell Biology Chinese Academy Of Sciences
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2021-10-01

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒(SARS‑Cov‑2)核酸检测方法的假病毒质控品及其应用，属于临床医学核酸分子检测技术领域。本发明将SARS‑Cov‑2特征性基因(ORF1ab、N和E)片段制成多种假病毒，形成阳性假病毒质控品体系。将其他高致病型的人类冠状病毒(SARS、MERS、HKU1、OC43、NL63、229E)各自特征性基因片段制备成一系列假病毒，形成阴性假病毒质控品体系。在临床医学对SARS‑Cov‑2进行核酸分子检测时，阳性假病毒质控品、阴性假病毒质控品与待测患者样本一同参与包括样本处理在内的整个实验操作流程，以有效地防止“假阴性”或“假阳性”的实验结果产生。本发明制备假病毒质控品体系的应用最大限度地降低了SARS‑Cov‑2核酸分子检测方法研究开发与验证过程中因高致病病原微生物所带来的生物安全性风险。

Description

检测新型冠状病毒的试剂和方法

技术领域

本发明属于临床医学核酸分子检测技术领域，具体涉及检测新型冠状病毒的试剂和方法。

背景技术

2019新型冠状病毒(SARS-Cov-2)是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约60-140nm，属于网巢病毒目冠状病毒科。此病毒每组基因组长度约三万个核苷酸左右，编码4个结构蛋白： S蛋白(spike protein)，M蛋白(membraneglycoprotein)，核衣壳蛋白N (nucleocapsid phosphoprotein)，和小包膜E(envelopeprotein)蛋白。其基因序列显示SARS-Cov-2属于乙型冠状病毒属谱系β(BetacoronavirusLineage β, Sarbecovirus)进化树中分支较长的一种病毒，例如MERS-CoV或SARS-CoV。

在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(第七版)中明确规定：“五、诊断标准，(二)确诊病例，疑似病例同时具备以下病原学或血清学证据之一者：1.实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；2.病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；3.血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上。”根据CDC和WHO的推荐，针对新型冠状病毒SARS-Cov-2的核酸诊断一般是针对ORF1ab基因、N基因和E基因。目前，在临床医学检测中，新型冠状病毒核酸检测已全面开展，已有多款新型冠状病毒核酸检测试剂盒获得了批准。然而，在新型冠状病毒肺炎疫情防控的关键时期，在各医疗机构开展的核酸分子检测过程中，报道了核酸检测结果“假阴性”现象，严重地影响了疫情的有效防控。与此同时，防止新型冠状病毒核酸检测结果“假阳性”对于疫情防控，节约珍贵社会医疗资源也显得相当重要。

在核酸检测试剂盒中设置阳性、阴性质控品，或者在核酸检测过程中添加阳性、阴性质控品，以监测包括样本处理过程在内的PCR实验过程全流程，是确保核酸检测结果有效性，防止“假阴性”或“假阳性”检测结果出现的最有效手段。

目前，一般是选择体外转录的RNA或者临床阳性病毒作为质控品，用于检测方法性能评价。但是两者都具有很明显的缺点：1.体外转录的RNA作为质控品时自身质量不稳定，易受环境中RNase破坏；对样本处理过程不能有效监控；2.临床阳性病毒作为质控品，对于高致病性病毒(例：新型冠状病毒、 SARS、MERS等)存在很高的生物安全风险。

本领域亟需新型冠状病毒的低风险高精度检测试剂和技术。

发明内容

本发明基于新型冠状病毒肺炎疫情防控需求，针对目前核酸检测常用质控品存在的缺陷，利用装甲RNA病毒技术制备的新型冠状病毒(SARS-Cov-2) 阳性假病毒质控品和阴性假病毒质控品，应用到新型冠状病毒(SARS-Cov-2) 临床核酸检测过程中，有效地监控整个核酸检测过程，确保检测结果的准确可靠，为中国乃至全球新型冠状病毒肺炎疫情防控发挥重要作用。

本发明提供一种核酸分子，包含选自(1)-(3)中一种、两种或三种的序列：

(1)新型冠状病毒的ORF1ab基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；

(2)新型冠状病毒的N基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少 95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；

(3)新型冠状病毒的E基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少 95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子包含选自(1)-(3)中一种、两种或三种的序列：

(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，

(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列或其对应 RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，

(3)如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列或其对应 RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:1第7-356 位所示的ORF1ab基因cDNA序列或其互补序列、如SEQ ID NO:1第357-675 位所示的N基因cDNA序列或其互补序列、和如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1第7-1025位所述序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所示序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子包含

(1)新型冠状病毒的ORF1ab基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；和

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子包含

(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，和

(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列或其对应 RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:1第7-356 位所示的ORF1ab基因cDNA序列或其互补序列和如SEQ ID NO:1第357-675 位所示的N基因cDNA序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1第7-675位所述序列或其互补序列。

本发明还提供含有第一方面所述核酸分子的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还含有病毒的成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因序列和包装位点序列或其对应的DNA序列。

在一个或多个实施方案中，所述病毒是能用于制备装甲RNA病毒颗粒的病毒。

在一个或多个实施方案中，所述病毒是噬菌体，优选MS2噬菌体或Qbeta 噬菌体。

在一个或多个实施方案中，所述病毒是TMV病毒。

本发明还提供一种工程细胞，其特征在于，所述工程细胞含有本文所述的核酸分子，或本文所述的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述工程细胞是大肠杆菌。

本发明还提供一种假病毒颗粒，其含有的核酸分子包含选自以下的一种、两种或多种序列：

(1)新型冠状病毒的ORF1ab基因的序列，或与其具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；

(2)新型冠状病毒的N基因的序列，或与其具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；

(3)新型冠状病毒的E基因的序列，或与其具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒的核酸分子包含选自(1)- (3)中一种、两种或三种的序列：

(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列的对应 RNA序列，或该RNA序列的互补序列，

(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列的对应RNA 序列，或该RNA序列的互补序列，

(3)如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列的对应RNA 序列，或该RNA序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒的核酸分子包含如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列的对应RNA序列或其互补序列、如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列的对应RNA序列或其互补序列、和如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列的对应RNA序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒的核酸分子包含SEQ ID NO:1 第7-1025位所述序列的对应RNA序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒的核酸分子包含SEQ ID NO:1 所示序列的对应RNA序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒的核酸分子包含：

(1)新型冠状病毒的ORF1ab基因的序列，或与其具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；和

(2)新型冠状病毒的N基因的序列，或与其具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒的核酸分子包含

(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列的对应 RNA序列，或该RNA序列的互补序列，和

(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列的对应RNA 序列，或该RNA序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒的核酸分子包含SEQ ID NO:1 第7-675位所述序列的对应RNA序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒是能用于制备装甲RNA病毒颗粒的病毒的假病毒颗粒。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒是噬菌体假病毒颗粒，优选 MS2噬菌体假病毒颗粒或Qbeta噬菌体假病毒颗粒。

在一个或多个实施方案中，所述假病毒颗粒是TMV病毒假病毒颗粒。

本发明还提供一种制备假病毒颗粒的方法，包括：

(1)将本文所述的核酸构建物引入工程细胞，

(2)在核酸构建物转录和/或翻译的条件下培养工程细胞，

任选的(3)由所述工程细胞收集假病毒颗粒。

在一个或多个实施方案中，所述工程细胞是大肠杆菌。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的核酸分子、核酸构建物和/或假病毒颗粒。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括阴性假病毒颗粒，所述阴性假病毒颗粒含有选自SARS、MERS、HKU1、OC43、NL63、229E中一种或多种病毒的新型冠状病毒的选自ORF1ab基因、N基因和E基因的一种或多种同源序列，或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述阴性假病毒颗粒含有选自SEQ ID NO:3-8 中的一种或多种序列的对应RNA序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含与本文所述的核酸分子匹配的引物。优选地，所述引物包含选自SEQ ID NO:13、14、16、17、19、20中的一种或多种的序列。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含与本文所述的核酸分子匹配的探针。优选地，所述引物包含选自SEQ ID NO:15、18、21中的一种或多种的序列。

本发明还提供本文所述核酸分子、核酸构建物、假病毒颗粒在制备检测新型冠状病毒的试剂盒中的用途，其中所述核酸分子、核酸构建物、假病毒颗粒用作阳性对照。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括阴性假病毒颗粒，所述阴性假病毒颗粒含有选自SARS、MERS、HKU1、OC43、NL63、229E中一种或多种病毒中新型冠状病毒的选自ORF1ab基因、N基因和E基因的一种或多种同源序列，或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述阴性假病毒颗粒含有选自SEQ ID NO:3-8 中的一种或多种或全部序列的对应RNA序列或其互补序列。

本发明还提供本文所述核酸分子、核酸构建物、假病毒颗粒在评估新型冠状病毒检测试剂盒中的用途。

本发明的优点：

使用假病毒颗粒赋予RNA或DNA对外部影响、特别是对核糖核酸酶的抗性，样品不会在生产、保存和使用中降解从而失去效果。

本发明的阳性或阴性假病毒颗粒作为对照可与临床样品经过完全相同的实验过程，包括样品处理和检测，所以使用本发明试剂盒的实验结果可以直观地体现样品处理和检测过程是否适当，避免因处理过程不当造成的假阳性或假阴性。例如，若阳性假病毒颗粒在经过与临床样品相同的处理和检测过程后结果为阴性，则该处理和检测过程可能存在不当操作，所以该临床样品的结果可能不可信。而现有技术中的RNA或DNA对照均不经过样品处理而直接进行检测，无法知晓样品处理过程对结果是否有影响。

附图说明

图1为三种新型冠状病毒假病毒核酸电泳图。

图2为新型冠状病毒假病毒RNA荧光RT-PCR检测。

图3为新型冠状病毒假病毒的电镜照片。

图4为假病毒中残留质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为假病毒通用荧光RT-PCR检测极限测定的结果。

图6为假病毒应用于实际样本检测结果。

具体实施方式

本发明利用MS2噬菌体装甲RNA技术，将新型冠状病毒(SARS-Cov-2) 特征性基因(ORF1ab、N和/或E)片段制成多种假病毒，形成阳性假病毒质控品。同时，将其他高致病型高风险的类似冠状病毒(SARS、MERS、HKU1、 OC43、NL63、229E)各自特征性基因片段制备成一系假病毒，形成阴性假病毒质控品。这些阴性假病毒质控品含有的基因片段与SARS-Cov-2特征性 ORF1ab基因、N基因和E基因序列同源程度较高。假病毒质控品体系具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，在临床医学对新型冠状病毒(SARS-Cov-2)进行核酸分子检测时，阳性假病毒质控品、阴性假病毒质控品与待测患者样本一同参与包括样本处理在内的整个实验操作流程，以有效地防止“假阴性”或“假阳性”的实验结果产生。可用于新型冠状病毒(SARS-Cov-2)及其他多种高危冠状病毒等核酸检测方法和检测试剂盒的质量控制。

本文中，“装甲核酸”、“假病毒”或“假病毒颗粒”可互换使用，指核酸分子RNA或DNA被包封在病毒外壳蛋白中。所述RNA或DNA可以化学产生或异源产生，例如通过细菌(例如大肠杆菌)异源产生后者赋予RNA或 DNA对外部影响、特别是对核糖核酸酶的抗性。RNA可使用MS2噬菌体或 Qbeta噬菌体或TMV病毒进行装甲。DNA可使用λ噬菌体GT11进行装甲。

本发明的假病毒的核酸分子包含新型冠状病毒(SARS-Cov-2)的特征性基因(ORF1ab、N和/或E)，从而可作为检测新冠病毒的阳性对照。具体地，所述核酸分子可以包含(1)新型冠状病毒的ORF1ab基因的序列或其cDNA 序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；或(2)新型冠状病毒的N基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；或(3)新型冠状病毒的E基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。所述核酸分子也可以包含(1)新型冠状病毒的ORF1ab基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；和(2)新型冠状病毒的N基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。所述核酸分子也可以包含(1)新型冠状病毒的ORF1ab 基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；和(3)新型冠状病毒的E基因的序列或其cDNA 序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。所述核酸分子也可以包含(2)新型冠状病毒的N基因的序列或其cDNA 序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列，和(3)新型冠状病毒的E基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。优选地，所述核酸分子包含(1)新型冠状病毒的ORF1ab基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；和(2) 新型冠状病毒的N基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；和(3)新型冠状病毒的E基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。

例如，本发明的核酸分子可包含(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的 ORF1ab基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，或(3)如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA 序列或RNA序列的互补序列。本发明的核酸分子还可包含(1)如SEQ ID NO:1 第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA 序列或RNA序列的互补序列，和(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N 基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列。本发明的核酸分子还可包含(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，和(3)如SEQ IDNO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列或其对应 RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列。本发明的核酸分子还可包含(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列或其对应RNA 序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，和(3)如SEQ ID NO:1第 676-1025位所示的E基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或 RNA序列的互补序列。本发明的核酸分子还可包含(1)如SEQ ID NO:1第7-356 位所示的ORF1ab基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA 序列的互补序列，和(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA 序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，和(3) 如SEQID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列。

本发明一个实施方案中的核酸分子包含如下的一种或多种：(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的序列，(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的序列，和(3)如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的序列。具体地，核酸分子如 SEQ ID NO:1第7-1025位所示。

本发明还提供作为检测新冠病毒的阴性对照的核酸分子，包含与新型冠状病毒类似的冠状病毒(SARS、MERS、HKU1、OC43、NL63、229E)的特征性基因片段。本发明中，类似冠状病毒的特征性基因片段与新型冠状病毒的 ORF1ab基因、N基因和/或E基因具有较高的同源性。因此，本文的作为阴性对照的核酸分子包含如下所示的序列或其互补序列：SARS的特征性基因序列 SEQ ID NO:3或与其对应的RNA；MERS的特征性基因序列SEQ ID NO:4或与其对应的RNA；HKU1的特征性基因序列SEQ ID NO:5或与其对应的RNA； OC43的特征性基因序列SEQ ID NO:6或与其对应的RNA；NL63的特征性基因序列SEQ ID NO:7或与其对应的RNA；229E的特征性基因序列SEQ ID NO:8 或与其对应的RNA。

本文中，如上所述的新型冠状病毒的基因序列或其cDNA序列可以是与参照序列(ORF1ab、N和/或E的基因序列或其cDNA序列)有至少95％序列、至少97％、至少98％、至少99％相同性的变体。这一同源性高于作为检测新冠病毒的阴性对照中所用的类似冠状病毒的片段与新型冠状病毒的参照序列的同源性。因此，上述的新型冠状病毒的基因序列与类似冠状病毒的相应片段可以分别作为检测新型冠状病毒的阳性和阴性对照。

本文所述的核酸分子的序列包括经密码子优化而发生变化的序列，只要所编码的氨基酸序列不变即可。经密码子优化的序列可对具体物种表现出更适合的表达性。本领域周知对编码序列进行密码子优化的方法。

本发明还包括含有本文所述核酸分子的核酸构建体。本文中，核酸构建体是可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。该核酸构建体除了含有本文所述的核酸分子的序列以外，还含有病毒的成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因序列和包装位点序列或其对应的DNA序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个适于病毒包装的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。

在某些实施方案中，所述核酸构建体是载体。具体而言，可将本文所述的编码序列克隆入许多类型的载体，这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、病毒和粘粒。载体可以是表达载体，或者是克隆载体。在具体实施例中，所述核酸构建体是原核表达载体pET32a。适用于装载本发明核酸分子的载体可以是DNA载体或RNA载体。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV 立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。所述启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，例如 IPTG诱导型启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，包括但不限于用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。可采用本领域技术人员熟知的方法构建含本文所述的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA 合成技术、体内重组技术等。

本文还包括包含、表达本文所述核酸分子或核酸构建体的宿主细胞或工程细胞。宿主细胞或工程细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或 Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子或核酸构建体在所述宿主细胞或工程细胞中组成型表达或诱导表达。诱导表达所需的启动子和试剂本领域周知。

可采用常规的方法将本文的载体导入宿主细胞中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等。

本文还包括上述假病毒的制备方法，包括将含有本文所述核酸分子的核酸构建物引入工程细胞，和在核酸构建物转录和/或翻译的条件下培养工程细胞，和任选的由所述工程细胞获得并纯化假病毒颗粒。本领域技术人员知晓常用工程细胞的培养方法，和从工程细胞获得并纯化病毒颗粒的方法，例如超声破碎、有机溶剂沉淀等。

例如，在新型冠状病毒阳性假病毒颗粒(阳性对照)的实施方案中，本发明的制备过程包括：(1)获得用于新型冠状病毒的ORF1ab基因、N基因和E 基因序列，如序列SEQ IDNO:1所示；所述ORF1ab基因、N基因和E基因通过合成获得，这些片段覆盖了目前多数SARS-Cov-2通用核酸检测方法和试剂盒检测的区域；(2)将包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的序列及通过步骤1获得的ORF1ab基因、N基因和E基因序列，以1种或几种组合的形式克隆于原核表达载体(pET32a)；以ORF1ab、N、E三基因片段为例：将MS2噬菌体基因组中5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的cDNA序列克隆于原核表达载体pET32a中，在其下游插入ORF1ab、N、E三基因片段的cDNA序列，获得表达载体pET32a-MS2-SARS-CoV-2-ORF1ab+N+E；(3)将所述质粒载体转化入BL21大肠杆菌感受态细胞中，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录、翻译；(4)收集步骤3获得的大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒质控品。含有本文其它核酸分子的阳性假病毒颗粒以及含有本文所述其他病毒的同源片段的阴性假病毒颗粒的制备方法与此类似。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的核酸分子、核酸构建物和/或假病毒颗粒。例如，所述试剂盒包含(1)如SEQ ID NO:1第7-356 位所示的序列，(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的序列，和(3)如 SEQ ID NO:1第676-1025位所示的序列，或含有这些序列的对应RNA序列的假病毒颗粒。为了进行核酸检测，所述试剂盒还包含与本文所述的核酸分子匹配的引物。优选地，所述引物选自SEQ ID NO:13、14、16、17、19、20中的一种或多种。所述试剂盒还可包括阴性假病毒颗粒，所述阴性假病毒颗粒含有前述作为检测新冠病毒的阴性对照的核酸分子。这些核酸分子包含选自SARS、 MERS、HKU1、OC43、NL63、229E中一种或多种病毒的新型冠状病毒的选自ORF1ab基因、N基因和E基因的一种或多种同源序列，或其互补序列。在一个或多个实施方案中，所述阴性假病毒颗粒含有选自SEQ ID NO:3-8中的一种或多种序列的对应RNA序列或其互补序列。在一个实施方案中，本发明试剂盒包含(1)含有SEQ ID NO:1所示序列的对应RNA序列的MS2噬菌体颗粒，任选的(2)含有SEQ ID NO:3-8中所示序列的对应RNA序列的MS2噬菌体颗粒，和任选的(3)序列如SEQ ID NO:13-21所示的多核苷酸。

进一步地，本文还包括本文涉及的各种产品的应用，这包括本文所述核酸分子、核酸构建物、假病毒颗粒在制备检测样品中新型冠状病毒的试剂盒中的用途，其中所述核酸分子、核酸构建物、假病毒颗粒用作阳性对照。所述应用还可以是本文所述核酸分子、核酸构建物、假病毒颗粒在评估新型冠状病毒检测方法或试剂盒中的用途。所述评估可以是检测方法或试剂盒的重复性或最低检测限等性能指标。所述样品包括但不限于呼吸道样品(包括上呼吸道样品和下呼吸道样品，如支气管样品或肺泡灌洗液等)、眼结膜拭子样品、尿道样品例如尿液、肠道样品例如粪便、血液、血清等。本文还包括检测样品中新型冠状病毒的方法，包括使用本文所述核酸分子、核酸构建物、假病毒颗粒作为阳性对照对样品中的核酸进行PCR或RT-PCR检测。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID NO:1：新型冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点

AAGCTTTGGTGCATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCC AAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAA CTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCT GCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATG CTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAG CCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCT TTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTGCCAAAAGGCTTC TACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACG TGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTC TCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCT TGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAA CAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCG GCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACCGGAGTTGTTAATCC AGTAATGGAACCAATTTATGATGAACCGACGACGACTACTAGCGTGCCTTTGT AAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACA GGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC TAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATA TTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAA TCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAACGAACTAAATATTATA TTAGTTTTTCTGCTAGC

SEQ ID NO:2：MS2噬菌体基因组5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点序列

GGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGCTAATGCC ATTTTTAATGTCTTTAGCGAGACGCTACCATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGGA ATTCCATTCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTACCCTTGATAGGGA GAACGAGACCTTCGTCCCCTCCGTTCGCGTTTACGCGGACGGTGAGACTGAAG ATAACTCATTCTCTTTAAAATATCGTTCGAACTGGACTCCCGGTCGTTTTAACT CGACTGGGGCCAAAACGAAACAGTGGCACTACCCCTCTCCGTATTCACGGGGG GCGTTAAGTGTCACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGCGAAGTGGGTCATC GTGGGGTCGCCCGTACGAGGAGAAAGCCGGTTTCGGCTTCTCCCTCGACGCAC GCTCCTGCTACAGCCTCTTCCCTGTAAGCCAAAACTTGACTTACATCGAAGTGC CGCAGAACGTTGCGAACCGGGCGTCGACCGAAGTCCTGCAAAAGGTCACCCA GGGTAATTTTAACCTTGGTGTTGCTTTAGCAGAGGCCAGGTCGACAGCCTCAC AACTCGCGACGCAAACCATTGCGCTCGTGAAGGCGTACACTGCCGCTCGTCGC GGTAATTGGCGCCAGGCGCTCCGCTACCTTGCCCTAAACGAAGATCGAAAGTT TCGATCAAAACACGTGGCCGGCAGGTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTAC CACTAATGAGTGATATCCAGGGTGCATATGAGATGCTTACGAAGGTTCACCTT CAAGAGTTTCTTCCTATGAGAGCCGTACGTCAGGTCGGTACTAACATCAAGTT AGATGGCCGTCTGTCGTATCCAGCTGCAAACTTCCAGACAACGTGCAACATAT CGCGACGTATCGTGATATGGTTTTACATAAACGATGCACGTTTGGCATGGTTGT CGTCTCTAGGTATCTTGAACCCACTAGGTATAGTGTGGGAAAAGGTGCCTTTCT CATTCGTTGTCGACTGGCTCCTACCTGTAGGTAACATGCTCGAGGGCCTTACGG CCCCCGTGGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATAACGGGT GAGTCCATCATAAGCGTTGACGCTCCCTACGGGTGGACTGTGGAGAGACAGGG CACTGCTAAGGCCCAAATCTCAGCCATGCATCGAGGGGTACAATCCGTATGGC CAACAACTGGCGCGTACGTAAAGTCTCCTTTCTCGATGGTCCATACCTTAGATG CGTTAGCATTAATCAGGCAACGGCTCTCTAGATAGAGCCCTCAACCGGAGTTT GAAGCATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTG GCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATC AGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAG CTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAA CCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAA ATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTG TTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATC GCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATT ACCCATGTCGAAGACAACAAAGAAGTTCAACTCT

SEQ ID NO:3：人类SARS冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点

AAGCTTTGGTGCTTCATGTTGTCTGTATTGTAGATGCCACATTGACCATCC AAATCCTAAAGGATTCTGTGACTTGAAAGGTAAGTACGTCCAAATACCTACCA CTTGTGCTAATGACCCAGTGGGTTTTACACTTAGAAACACAGTCTGTACCGTCT GCGGAATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACCAACTCCGCGAACCCTTG ATGCAGTCTGCGGATGCATCAACGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCA GCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTCTACAGGGC TTTTGATATTTACAACGAAAAAGTTGCTGGTTTTGCAAAATTGCCAAAAGGCTT CTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCAC GTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCT CCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCT AGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAA CAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCG CCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAGGAGTTGCTAATCC AGCAATGGATCCAATTTATGATGAGCCGACGACGACTACTAGCGTGCCTTTGT AAGCACAAGAAAGTGAGTACGAACTTATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAAACA GGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC TAGTCACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATA TTGTTAACGTGAGTTTAGTAAAACCAACGGTTTACGTCTACTCGCGTGTTAAAA ATCTGAACTCTTCTGAAGGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAACGAACTAACTAT TATTATTATTCTGTTAAGCTT

SEQ ID NO:4：人类MERS冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点

AAGCTTTGGAGCTTCAGTGTGTCTCTATTGCCGTGCGCATATAGAACATC CTGATGTCTCTGGTGTTTGTAAATATAAGGGTAAGTTTGTCCAAATCCCTGCTC AGTGTGTCCGTGACCCTGTGGGATTTTGTTTGTCAAATACCCCCTGTAATGTCT GTCAATATTGGATTGGATATGGGTGCAATTGTGACTCGCTTAGGCAAGCAGCA CTGCCCCAATCTAAAGATTCCAATTTTTTAAACGAGTCCGGGGTTCTATTGTAA ATGCCCGAATAGAACCCTGTTCAAGTGGTTTGTCCACTGATGTCGTCTTTAGGG CATTTGACATCTGCAACTATAAGGCTAAGGTTGCTGGTATGCTTCCTAAAAACT TCCACATTGAGGGGACTGGAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCCTCTAGC TTAAGCAGAAACTCTTCCAGATCTAGTTCACAAGGTTCAAGATCAGGAAACTC TACCCGCGGCACTTCTCCAGGTCCATCTGGAATCGGAGCAGTAGGAGGTGATC TACTTTACCTTGATCTTCTGAACAGACTACAAGCCCTTGAGTCTGGCAAAGTAA AGCAATCGCAGCCAAAAGTAATCACTAAGAAAGATGCTGCTGCTGCTAAAAAT AAGATGCGCCACAAGCGCACTTCCACCAAAAGTTTCAACATGGTGCTGGAATA CAGAATTTTAAGGAAACGCTGTATTATCAGAACAATGTCTTTATGTCTGAAGCT AAATGCTGGGTGGAAACCGATCTGAAGAAAGGGCCACATGAATTCTGTTCACA GCATACGCTTTATATTAAGGATGGCGACGATGGTTACTTCCTTCCTTATCCAGA CCCTTCAAGAATTTTGTCTGCCGGTTGCTTTGTAGATGATATCGTTAAGACTGA CGGTACACTCATGGTAGAGCGGTTTGTGTCTTTGGCTATAGATGCTTACCCTCT CACAAAGCATGAAGATATAGAATACCAGAATGTATTCTGGGTCTACTTACAGTATATAGAAAAACTGTATAAAGAAGCTT

SEQ ID NO:5：人类HKU1冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点

GCTAGCTGGTGCCTCAGTTTGTATTTATTGCCGTGCACGTGTAGAGCATC CAGATGTAGATGGTATATGTAAATTACGTGGTAAATTTGTACAAGTCCCTTTGG GTATAAAAGATCCTATTCTTTATGTGTTAACACATGATGTTTGTCAAGTCTGTG GTTTTTGGAGAGATGGCAGTTGTTCCTGTGTAGGTTCAAGTGTCGCTGTTCAAT CTAAAGATTTAAATTTTTTAAACGGGTTCGGGGTACTAGTGTGAATGCCCGGCT AGTACCCTGTGCTAGTGGTTTATCTACTGATGTTCAATTAAGGGCATTTGACAT TTGTAATACCAATAGAGCTGGTATAGGTTTAAGAAGCTATCCCTACTAGGTTTC CGCCTGGTACGATTTTGCCTCAAGGCTATTATGTTGAAGGCTCAGGAAGGTCTG CTTCTAATAGTCGACCAGGTTCACGTTCTCAATCACGTGGACCCAATAATCGTT CATTAAGTAGAAGTAATTCTAATTTTAGACATTCAGATTCTATAGTAAAACCTG ATATGGCTGATGAGATCGCTAATCTTGTTTTAGCCAAGCTTGGTAAAGATTCTAAACCTCAGCAAGTCACTAAGCAAAATGCCAAGGAAATCAGGCATAAAATTTTA ACAAAACCTCGCCAAAAGCGAACTCCTAATAAATGGTAATACTGTTTCTGAGG CTGTGTCTAGATTAGTTGAATCAGCTTCTGAATTTATTGTTTGGCGTGCAGAGG CACTTAATAAGTATGGTTGATTTATTTTTCAATGATACTGCTTGGTACATAGGA CAGATTTTAGTTTTAGTTTTATTTTGTCTTATTTCTTTAATCTTTGTTGTTGCTTT TTTAGCAACTATTAAGCTTTGTATGCAACTTTGTGGTTTTTGTAATTTCTTTATT ATTTCACCTTCGGCTTACGTTTATAAAAGAGGTATGCAGTTGTATAAGTCTTAT AGTGAACAAGTTATACCACCCACTTCAGATTATTTAATCTAAATCTAAACATTA TGAATAAATGCTAGC

SEQ ID NO:6：人类OC43冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点

AAGCTTTGGTGCGTCTGTTTGTATATATTGCCGCGCACGAGTTGAACACC CAGATGTTGATGGGTTGTGCAAATTACGCGGCAAGTTTGTACAAGTGCCTGTA GGTATAAAAGATCCTGTGTCTTATGTTTTGACACATGATGTTTGTCGAGTTTGT GGATTTTGGCGGGATGGAAGTTGTTCATGTGTTAGCACTGACACTACTGTTCAA TCAAAAGATACTAATTTTTTAAACGGGTTCGGGGTACGAGTGTAGATGCCCGT CTCGTACCCTGCGCCAGTGGTTTATCTACTGATGTACAATTAAGGGCATTTGAT ATTTACAATGCTAGTGTTGCTGGCATTGGTTTGGGACTAGTTGTTTTAAGAAAT GTGGTGGTTGTTGTGATGATTATACTGGATACCAGGAGTTAGTAATCAAAACTT CACATGACGACTAAGTTCGTCTTTGATTCATTGCACTGATCTCTTGTTAGATCTT TTTGCAATCTAGCATTTGTTAAAGTTCTTAAGGCCACGCCCTATTAATGGACAT TTGGAGACCTGAGAAGAAATATCTCCGTTATATTAACGGTTTTAATGTCTCAGAATTAGAAGATGCTTGTTTTAAATTTAACTATCAATTTCCTAAAGTAGGATATTG TAGAGTTCCTAGTCATGCTTGGTGCCGTAATCAAGGTAGATTTTGTGCTACATA AGCTT

SEQ ID NO:7：人类NL63冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点

AAGCTTGTTCTCTATTGCTTTGCCTCCAGAGCTCTCTGTTGTTGAGTTTGA GGATCGCTCTAATAACTCATCTCGTGCTAGCAGTCGTTCTTCAACTCGTAACAA CTCACGAGACTCTTCTCGTAGCACTTCAAGACAACAGTCTCGCACTCGTTCTGA TTCTAACCAGTCTTCTTCAGATCTTGTTGCTGCTGTTACTTTGGCTTTAAAGAAC TTAGGTTTTGATAACCAGTCGAAGTCACCTAGTTCTTCTGGTACTTCCACTCCT AAGAAACCTAATAAGCCTCTTTCTCAACCCAGGGCTGATAAGCCTTCTCAGTTG AAGATCGTTTTAAAAATGCTGATCTTAAGGATGGTTATTTTGTTATAAAGAGGT GTACTAAGTCGGTTATGGAACACGAGCAATCCATGTATAACCTACTTAACTTTT CTGGTGCTTTGGCTGAGCATGATTTCTTTACTTGGAAAGATGGCAGAGTCATTT ATGGTAATGTTAGTAGACATAATCTTACTAAATATACTATGATGGACTTGGTCT ATGCTATGCGTAACTTTGATGAACAAAATTGTGATGTTCTAAAAGAAGTATTAGTTTTAACTGGTTGTTGTGAAGCTT

SEQ ID NO:8：人类229E冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点

GCTAGCTGGCGCGTCTGTTTGTATTTATTGCAGAGCACATGTTGCACATC CAACCATGGACGGTTTTTGTCAGTACAAAGGCAAGTGGGTACAAGTGCCTATA GGTACAAATGACCCTATAAGATTTTGTCTTGAAAATACTGTTTGTAAAGTTTGT GGTTGTTGGCTTAATCATGGCTGTACATGTGACCGGACTGCTATCCAAAGTTTT GATAACAGTTATTTAAACGAGTCCGGGGCTCTAGTGCCGCTCGACTAGAGCCC TGTAATGGTACAGACATAGATTACTGTGTCCGTGCATTTGACGTTTACAATAAA GATGCGTCTTTTATCGGAAAAAATCTGAAGTCCAATTGCCTGACTCCCGTGCTC CTTCCCGGTCTCAGTCGAGGTCGCAGAGTCGCGGTCGTGGTGAATCCAAACCT CAATCTCGGAATCCTTCAAGTGACAGAAACCATAACAGTCAGGATGACATCAT GAAGGCAGTTGCTGCGGCTCTTAAATCTTTAGGTTTTGACAAGCCTCAGGAAA AAGATAAAAAGTCAGCGAAAACGGGTACTCCTAAGCCTTCTCGTAATCAGAGT CCTGCTTCTTCTCAAACTTCTGCCAAGAGTCTTGCTCGTTCTCAGAGTTCTGAA ACAAAAGAACAAAAGCATGAAATGCAAAAGCCACGGTCCCAGCTGTTGGAAT AGTCAACACAGATTTCAAATTAGAAATCCACTAAGATGTTCCTTAAGCTAGTG GATGATCATGCTTTGGTTGTTAATGTACTACTCTGGTGTGTGGTGCTTATAGTG ATACTACTAGTGTGTATTACAATAATTAAACTAATTAAGCTTTGTTTCACTTGC CATATGTTTTGTAATAGAACAGTTTATGGCCCCATTAAAAATGTGTACCACATT TACCAATCATATATGCACATAGACCCTTTCCCTAAACGAGTTATTGATTTCTAA ACTAAACGACAATGTCAAATGACAATTGTACGGGTGACATTGTCACCCATTTG AAGAATTGGGCTAGC

SEQ ID NO:9

ORF1ab-F：5’-GTACTGCCGTTGCCACATAGAT-3’

SEQ ID NO:10

ORF1ab-R：5’-ATCATTGTAGATGTCAAAAGCCC-3’

SEQ ID NO:11

N-R：5’-CTTTAGTGGCAGTACGTTTTTG-3’

SEQ ID NO:12

E-R：5’-TCGTTTAGACCAGAAGATCAGGAA-3’

SEQ ID NO:13

靶标一(ORF1ab)正向引物(F)：5'-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3'

SEQ ID NO:14

靶标一(ORF1ab)反向引物(R)：5'-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3'

SEQ ID NO:15

靶标一(ORF1ab)荧光探针(P)：

5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

SEQ ID NO:16

靶标二(N)正向引物(F)：5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'

SEQ ID NO:17

靶标二(N)反向引物(R)：5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'

SEQ ID NO:18

靶标二(N)荧光探针(P)：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'

SEQ ID NO:19

靶标三(E)正向引物(F)：5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3'

SEQ ID NO:20

靶标三(E)反向引物(R)：5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3'

SEQ ID NO:21

靶标三(E)荧光探针(P)：5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG -BHQ1-3'

SEQ ID NO:22

pET32a-F:5’-GGTGCGGACATCTCGGTAGTG-3’

SEQ ID NO:23

pET32a-R:5’-GCGGTTTGCGTATTGGGC-3’

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明。实施例中所用到的材料和方法，除非另有说明，否则为本领域常规的材料和方法。

实施例

实施例1、假病毒质控品表达载体的构建

1.三基因(ORF1ab+N+E)的假病毒表达载体 pET32a-MS2-SARS-COV2-ORF1ab+N+E的构建：

参考NCBI数据库中的MS2噬菌体基因组序列(Reference Sequence: NC_001417.2)以及SARS-Cov-2的ORF1ab基因、N基因和E基因(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所公布的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列覆盖区域)，通过人工合成的方式制备包含MS2噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、新型冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点在内的DNA片段，辅助性多克隆位点位于ORF1ab、N和 E基因片段中间。MS2噬菌体序列如序列表SEQ ID NO:2所示，新型冠状病毒核酸片段对应的cDNA序列及辅助性酶切位点序列如表中的SEQ ID No:1 所示。

2.双基因(ORF1ab+N)假病毒表达载体 pET32a-MS2-SARS-COV2-ORF1ab+N和单基因(ORF1ab)假病毒表达载体 pET32a-MS2-SARS-COV2-ORF1ab的构建：

通过辅助性多克隆位点用相应的限制性内切酶分别将E基因片段和N+E 基因片段酶切，凝胶电泳胶回收并纯化后得到的线性化载体，通过连接酶将粘性末端连接后分别得到环状的含ORF1ab+N双片段和ORF1ab单片段的表达载体。

3.阴性假病毒质控品表达载体的构建：

参考NCBI数据库人类SARS冠状病毒(NC_004718.3)、MERS冠状病毒(NC_019843.3)、HKU1冠状病毒(NC_006577.2)、OC43冠状病毒 (AY391777.1)、NL63冠状病毒(NC_005831.2)、229E冠状病毒(NC_002645.1) 基因组序列，通过DNAMAN序列比对软件及其他辅助软件找到与SARS-Cov-2 的ORF1ab基因、N基因和E基因同源性较高的序列，按照pET32a-MS2-SARS-COV2表达载体的构建方法分别构建含人类SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、HKU1冠状病毒、OC43冠状病毒、NL63冠状病毒、229E 冠状病毒核酸片段的质粒载体pET32a-MS2-SARS-COV、pET32a-MS2-MERS、 pET32a-MS2-HKU1、pET32a-MS2-OC43、pET32a-MS2-NL63、 pET32a-MS2-229E。pET32a-MS2-SARS-Cov对应的cDNA序列及辅助性酶切位点序列如SEQ ID NO:3所示；pET32a-MS2-MERS对应的cDNA序列及辅助性酶切位点序列如SEQID NO:4所示；pET32a-MS2-HKU1对应的cDNA序列及辅助性酶切位点序列如SEQ ID NO:5所示；pET32a-MS2-OC43对应的cDNA 序列及辅助性酶切位点序列如SEQ ID NO:6所示；pET32a-MS2-NL63对应的 cDNA序列及辅助性酶切位点序列如表中的SEQ ID No:7所示；pET32a- MS2-229E对应的cDNA序列及辅助性酶切位点序列如表中的SEQ ID No:8所示。

实施例2、假病毒质控品的制备

(1)将实施例1制备得到的质粒表达载体转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(终浓度为50μg/ml)的营养琼脂平板上，37℃培养18h(营养琼脂平板的具体制备方法如下：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，琼脂粉1.5g，溶于90mL ddH₂O中，调节pH值至7.0-7.2，然后补加ddH₂O并定容至100mL，高压灭菌后备用。然后挑取阳性单克隆菌接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养。

(2)将2ml过夜培养的菌液接种到200ml氨苄青霉素抗性的LB液体培养基(氨苄青霉素终浓度为100μg/ml)中，200rpm振荡培养至OD值大约在 0.6-0.8(液体LB培养基的具体制备方法为：胰蛋白胨1g，NaCl 0.5g，酵母浸出物0.5g，溶于90mL ddH2O中，调pH值至7.0-7.2，补加ddH2O并定容至100mL，高压灭菌后备用)。

(3)加入终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在 28℃条件下，按1:100的比例将上述培养的菌液接种于含氨苄青霉素(终浓度为 50μg/ml))的液体LB培养基中，200rpm诱导表达16h。

(4)将菌液4000g离心10min，收集菌体沉淀，用PBS洗涤两次。重新悬于5ml超声破碎缓冲液中，在冰上超声：超声时间20s，间隔时间15s，超声次数30次，重复处理两次。将破碎完全的表达产物4000rpm离心10min，沉淀细胞碎片，收集上清转移到另一干净的离心管中，得到含病毒样质控品的表达产物。

(5)先后用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤上述消化后的液体。

(6)加固体NaCl至浓度为1mol/L，冰浴1h。4℃12000r/min离心10min，以除去细菌碎片，将上清液转移到另一干净的离心管中。

(7)加固体聚乙二醇PEG8000至终浓度为10％(W/V)，室温搅拌使其完全溶解，冰浴1h以使病毒样质控品形成沉淀。4℃12000r/min离心10min，回收沉淀的病毒样质控品，弃去上清并用纸吸去残存的液体。

(8)加适量的水到沉淀中，用枪头不停吸打使其充分混匀。然后加入等体积的氯仿振荡30s，以除去病毒样质控品悬液里的聚乙二醇和细菌碎片。4℃ 5000r/min离心15min，分离有机相和水相，回收含病毒样质控品的水相，即为纯化的病毒样质控品，最后分装到无RNase和DNase的EP管中，放置于-80℃ 保存备用。

(9)按照同样的方法获得阳性病毒质控品SARS-Cov-2-ORF1ab+N+E、SARS-Cov-2-ORF1ab+N、SARS-Cov-2-ORF1ab和阴性病毒质控品SARS、 MERS、HKU1、OC43、NL63、229E。

实施例3、假病毒质控品RNA的验证

1.实施例2制备的3种阳性假病毒质控品中RNA的提取(按照

ViralRNA Mini Kit试剂盒的核酸提取方法提取RNA)

(1)吸取560μl准备好的buffer AVL(含有carrier RNA)到1.5ml离心管中。

(2)将140μl假病毒质控品原液加入到装有buffer AVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15s，混匀。室温放置10min。

(3)瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。样品中加入560μl无水乙醇，斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。

(4)吸取630μl上步中的溶液小心的加入column(已装入到2ml离心管中)中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6,000×g(8,000rpm)离心 1min。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。小心的打开column 的盖子，重复此步骤。

(5)小心的打开column的盖子，加入500μl buffer AW1。盖上盖子。 8,000rpm离心1min。将column放入新的2ml收集管中，弃去旧的收集管。

(6)小心的打开column的盖子，加入500μL buffer AW2。盖上盖子。全速离心(14,000rpm 3min)。

(7)将column放入新的1.5mL离心管中，弃去旧的收集管，小心打开 column的盖子加入60μl室温的buffer AVE。盖上盖子，室温放置1min后8,000 rpm离心1min。保存待用。

2.RNA反转录成cDNA(按照BIO-RAD iScript cDNA Synthesis Kit试剂盒的反转录步骤)，反应体系如下：

反转录条件如下：

25℃引物结合5min；反转录过程46℃反应20min，95℃反转录酶失活1 min。

3.用PCR扩增法检测反转录得到的cDNA是否含有正确的插入目的基因片段，设计分别扩增不同片段长度的上游引物ORF1ab-F(SEQ ID NO:9)和下游引物ORF1ab-R(SEQ IDNO:10)、N-R(SEQ ID NO:11)、E-R(SEQ ID NO:12) 序列如表SEQ ID No.10所示。以质粒载体 pET32a-MS2-SARS-Cov-2-ORF1ab+N+E为模板设置阳性对照，以ddH₂O为模板设置阴性对照。反应体系如下：

反应体系的组成	用量
		模板(假病毒质控品原液)	1.0μL
ORF1ab-F(10μm/L)	0.5μL
		ORF1ab-R、N-R、E-R(10μm/L)	0.5μL
Mix(10×)	5.0μL
		ddH2O	43μL

扩增条件如下：

95℃预变性5min；循环反应33次，条件为95℃1min，50℃40sec，72℃ 40sec；72℃延伸5min。

通过1.0％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。结果如图1所示，以 pET32a-MS2-SARS-Cov-2-ORF1ab+N+E为模板的阳性对照和阳性假病毒质控品SARS-Cov-2-ORF1ab+N+E出现三条目的条带，分别为977bp、636bp、312 bp；阳性假病毒质控品SARS-Cov-2-ORF1ab+N出现两条目的条带，分别为636 bp、312bp；阳性假病毒质控品SARS-Cov-2-ORF1ab出现一条312bp目的条带。

4.新型冠状病毒假病毒质控品RNA荧光RT-PCR检测

(1)引物和探针

依据中国疾病预防控制中心《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》合成相应的引物和探针，核酸检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab(ORF1ab)、核壳蛋白(N)包膜蛋白基因(E)。引物和探针序列如 SEQ ID NO:13-21所示。

(2)样品：内含新型冠状病毒基因序列的假病毒质控品，PBS溶液。

荧光RT-PCR反应液配制与加样：参照美国疾病预防控制中心《实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测2019新型冠状病毒》方法配制，每个反应需要荧光RT-PCR反应液20μL，每个反应中加入5μl提取好的样品。组成如下：

(3)上机反应：将PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。按如下循环条件设置反应如下：

步骤	阶段	循环数	温度(℃)	时间
					UNG酶孵育	1	1	25	2min
逆转录	2	1	50	15min
					酶灭活	3	1	95	2min
扩增	4	40	95	3s
								60	30s

(4)结果：实施例2制备的新型冠状病毒假病毒质控品质检测后出现典型的扩增曲线且Ct值均小于30，检测结果见图2。PBS阴性样品无Ct值并且无扩增曲线。

实施例4、阳性假病毒质控品电镜检测

将上述假病毒质控品原液20倍稀释后，取用稀释液用2％磷钨酸进行负染，然后在透射电镜下观察假病毒质控品。可以观察到大小形态一致的病毒样质控品，如图3所示。

实施例5、假病毒质控品残留质粒DNA的检测

用PCR扩增法检测实施例2制备的假病毒质控品中是否含有残留的含基因片段的载体质粒，设计扩增pET32a载体的上游引物pET32a-F和下游引物 pET32a-R，序列如SEQ IDNO:22-23所示。以质粒载体 pET32a-MS2-SARS-Cov-2-ORF1ab+N+E为模板设置阳性对照，以ddH₂O为模板设置阴性对照。反应体系如下：

反应体系的组成	用量
		模板(假病毒质控品原液)	1.0μL
pET32a-F(10μm/L)	0.5μL
		pET32a-R(10μm/L)	0.5μL
Mix(10×)	5.0μL
		ddH2O	43μL

扩增条件如下：

通过1.0％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。结果如图4所示，以 pET32a-MS2-SARS-Cov-2-ORF1ab+N+E为模板的阳性对照孔出现大小为218 bp的目的条带，以纯化的假病毒质控品为模板的实验孔的相应位置未见该大小的条带，说明制备的假病毒质控品原液中无质粒DNA残留，可用于实时荧光 RT-PCR分析。

实施例6：假病毒质控品荧光RT-PCR检测极限测定

将实施例2制备的新型冠状病毒假病毒RNA质控品，按照实施例3中的核酸提取方法提取RNA，然后经10倍系列稀释制成一系列标准品(10⁷-100copies/10μL)，按实施例4中荧光RT-PCR检测方法对系列标准品进行检测，测定其检测极限。结果表明该检测方法的检测限达到约10copies/ 反应。10copies/反应下检测结果见图5。

实施例7：假病毒质控品在实际样本检测中的应用

1.应用方法：

中国疾病预防控制中心《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》

美国疾病预防控制中心《实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测2019新型冠状病毒》

2.商品化试剂盒：新型冠状病毒核酸检测试剂盒(国械注准20203400064) (圣湘生物科技股份有限公司)

3.新型冠状病毒荧光RT-PCR检测：

样品：内含新型冠状病毒基因序列的假病毒质控品(阳性对照)，内含其他六种冠状病毒基因序列的假病毒质控品(阴性对照)PBS溶液，临床样品。

核酸提取和引物与实施例4中的相同，荧光RT-PCR反应液配制、加样、上机反应按照试剂盒说明书操作。

4.结果判定：

根据中国疾病预防控制中心《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》结果判定的阈值规定：阴性：无Ct值或Ct为40。

阳性：Ct值<37，可报告为阳性。

灰区：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

5.质控品检测结果及质控性能评价：

实施例2中制备的假病毒质控品(阳性对照)和实际临床样本检测后出现典型的扩增曲线且Ct值均小于35，检测结果见图6，假病毒质控品(阴性对照)和PBS等阴性样品无Ct值并且无扩增曲线，与预期结果相符。表明该装甲RNA质控品可实现对样品核酸提取和检测过程的全程质量控制，可作为阳性质控样品应用到新型冠状病毒通用荧光RT-PCR检测方法中。

序列表

<110> 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院

<120> 检测新型冠状病毒的试剂和方法

<130> 202173

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1031

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aagctttggt gcatcgtgtt gtctgtactg ccgttgccac atagatcatc caaatcctaa 60

aggattttgt gacttaaaag gtaagtatgt acaaatacct acaacttgtg ctaatgaccc 120

tgtgggtttt acacttaaaa acacagtctg taccgtctgc ggtatgtgga aaggttatgg 180

ctgtagttgt gatcaactcc gcgaacccat gcttcagtca gctgatgcac aatcgttttt 240

aaacgggttt gcggtgtaag tgcagcccgt cttacaccgt gcggcacagg cactagtact 300

gatgtcgtat acagggcttt tgacatctac aatgataaag tagctggttt tgctaaattg 360

ccaaaaggct tctacgcaga agggagcaga ggcggcagtc aagcctcttc tcgttcctca 420

tcacgtgtag tcgcaacagt tcaagaaatt caactccagg cagcagtagg ggaacttctc 480

ctgctagaat ggctggcaat ggcggtgatg ctgctcttgc tttgctgctg cttgacagat 540

tgaaccagct tgagagcaaa atgtctggta aaggccaaca acaacaaggc caaactgtca 600

ctaagaaatc tgctgctgag gcttctaaga agcctcggca aaaacgtact gccactaaag 660

catacaatgt aacaccggag ttgttaatcc agtaatggaa ccaatttatg atgaaccgac 720

gacgactact agcgtgcctt tgtaagcaca agctgatgag tacgaactta tgtactcatt 780

cgtttcggaa gagacaggta cgttaatagt taatagcgta cttctttttc ttgctttcgt 840

ggtattcttg ctagttacac tagccatcct tactgcgctt cgattgtgtg cgtactgctg 900

caatattgtt aacgtgagtc ttgtaaaacc ttctttttac gtttactctc gtgttaaaaa 960

tctgaattct tctagagttc ctgatcttct ggtctaaacg aactaaatat tatattagtt 1020

tttctgctag c 1031

<210> 2

<211> 1790

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gggtgggacc cctttcgggg tcctgctcaa cttcctgtcg agctaatgcc atttttaatg 60

tctttagcga gacgctacca tggctatcgc tgtaggtagc cggaattcca ttcctaggag 120

gtttgacctg tgcgagcttt tagtaccctt gatagggaga acgagacctt cgtcccctcc 180

gttcgcgttt acgcggacgg tgagactgaa gataactcat tctctttaaa atatcgttcg 240

aactggactc ccggtcgttt taactcgact ggggccaaaa cgaaacagtg gcactacccc 300

tctccgtatt cacggggggc gttaagtgtc acatcgatag atcaaggtgc ctacaagcga 360

agtgggtcat cgtggggtcg cccgtacgag gagaaagccg gtttcggctt ctccctcgac 420

gcacgctcct gctacagcct cttccctgta agccaaaact tgacttacat cgaagtgccg 480

cagaacgttg cgaaccgggc gtcgaccgaa gtcctgcaaa aggtcaccca gggtaatttt 540

aaccttggtg ttgctttagc agaggccagg tcgacagcct cacaactcgc gacgcaaacc 600

attgcgctcg tgaaggcgta cactgccgct cgtcgcggta attggcgcca ggcgctccgc 660

taccttgccc taaacgaaga tcgaaagttt cgatcaaaac acgtggccgg caggtggttg 720

gagttgcagt tcggttggtt accactaatg agtgatatcc agggtgcata tgagatgctt 780

acgaaggttc accttcaaga gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac 840

atcaagttag atggccgtct gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata 900

tcgcgacgta tcgtgatatg gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct 960

ctaggtatct tgaacccact aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc 1020

gactggctcc tacctgtagg taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc 1080

tacatgtcag gaacagttac tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct 1140

ccctacgggt ggactgtgga gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat 1200

cgaggggtac aatccgtatg gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg 1260

gtccatacct tagatgcgtt agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa 1320

ccggagtttg aagcatggct tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa 1380

ctggcgacgt gactgtcgcc ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct 1440

ctaactcgcg ttcacaggct tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga 1500

atcgcaaata caccatcaaa gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg 1560

tagagcttcc tgtagccgca tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt 1620

tcgctacgaa ttccgactgc gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg 1680

gaaacccgat tccctcagca atcgcagcaa actccggcat ctactaatag acgccggcca 1740

ttcaaacatg aggattaccc atgtcgaaga caacaaagaa gttcaactct 1790

<210> 3

<211> 1032

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aagctttggt gcttcatgtt gtctgtattg tagatgccac attgaccatc caaatcctaa 60

aggattctgt gacttgaaag gtaagtacgt ccaaatacct accacttgtg ctaatgaccc 120

agtgggtttt acacttagaa acacagtctg taccgtctgc ggaatgtgga aaggttatgg 180

ctgtagttgt gaccaactcc gcgaaccctt gatgcagtct gcggatgcat caacgttttt 240

aaacgggttt gcggtgtaag tgcagcccgt cttacaccgt gcggcacagg cactagtact 300

gatgtcgtct acagggcttt tgatatttac aacgaaaaag ttgctggttt tgcaaaattg 360

ccaaaaggct tctacgcaga gggaagcaga ggcggcagtc aagcctcttc tcgctcctca 420

tcacgtagtc gcggtaattc aagaaattca actcctggca gcagtagggg aaattctcct 480

gctcgaatgg ctagcggagg tggtgaaact gccctcgcgc tattgctgct agacagattg 540

aaccagcttg agagcaaagt ttctggtaaa ggccaacaac aacaaggcca aactgtcact 600

aagaaatctg ctgctgaggc atctaaaaag cctcgccaaa aacgtactgc cacaaaacag 660

tacaacgtca ctcaggagtt gctaatccag caatggatcc aatttatgat gagccgacga 720

cgactactag cgtgcctttg taagcacaag aaagtgagta cgaacttatg tactcattcg 780

tttcggaaga aacaggtacg ttaatagtta atagcgtact tctttttctt gctttcgtgg 840

tattcttgct agtcacacta gccatcctta ctgcgcttcg attgtgtgcg tactgctgca 900

atattgttaa cgtgagttta gtaaaaccaa cggtttacgt ctactcgcgt gttaaaaatc 960

tgaactcttc tgaaggagtt cctgatcttc tggtctaaac gaactaacta ttattattat 1020

tctgttaagc tt 1032

<210> 4

<211> 1041

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aagctttgga gcttcagtgt gtctctattg ccgtgcgcat atagaacatc ctgatgtctc 60

tggtgtttgt aaatataagg gtaagtttgt ccaaatccct gctcagtgtg tccgtgaccc 120

tgtgggattt tgtttgtcaa ataccccctg taatgtctgt caatattgga ttggatatgg 180

gtgcaattgt gactcgctta ggcaagcagc actgccccaa tctaaagatt ccaatttttt 240

aaacgagtcc ggggttctat tgtaaatgcc cgaatagaac cctgttcaag tggtttgtcc 300

actgatgtcg tctttagggc atttgacatc tgcaactata aggctaaggt tgctggtatg 360

cttcctaaaa acttccacat tgaggggact ggaggcaata gtcaatcatc ttcaagagcc 420

tctagcttaa gcagaaactc ttccagatct agttcacaag gttcaagatc aggaaactct 480

acccgcggca cttctccagg tccatctgga atcggagcag taggaggtga tctactttac 540

cttgatcttc tgaacagact acaagccctt gagtctggca aagtaaagca atcgcagcca 600

aaagtaatca ctaagaaaga tgctgctgct gctaaaaata agatgcgcca caagcgcact 660

tccaccaaaa gtttcaacat ggtgctggaa tacagaattt taaggaaacg ctgtattatc 720

agaacaatgt ctttatgtct gaagctaaat gctgggtgga aaccgatctg aagaaagggc 780

cacatgaatt ctgttcacag catacgcttt atattaagga tggcgacgat ggttacttcc 840

ttccttatcc agacccttca agaattttgt ctgccggttg ctttgtagat gatatcgtta 900

agactgacgg tacactcatg gtagagcggt ttgtgtcttt ggctatagat gcttaccctc 960

tcacaaagca tgaagatata gaataccaga atgtattctg ggtctactta cagtatatag 1020

aaaaactgta taaagaagct t 1041

<210> 5

<211> 1038

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gctagctggt gcctcagttt gtatttattg ccgtgcacgt gtagagcatc cagatgtaga 60

tggtatatgt aaattacgtg gtaaatttgt acaagtccct ttgggtataa aagatcctat 120

tctttatgtg ttaacacatg atgtttgtca agtctgtggt ttttggagag atggcagttg 180

ttcctgtgta ggttcaagtg tcgctgttca atctaaagat ttaaattttt taaacgggtt 240

cggggtacta gtgtgaatgc ccggctagta ccctgtgcta gtggtttatc tactgatgtt 300

caattaaggg catttgacat ttgtaatacc aatagagctg gtataggttt aagaagctat 360

ccctactagg tttccgcctg gtacgatttt gcctcaaggc tattatgttg aaggctcagg 420

aaggtctgct tctaatagtc gaccaggttc acgttctcaa tcacgtggac ccaataatcg 480

ttcattaagt agaagtaatt ctaattttag acattcagat tctatagtaa aacctgatat 540

ggctgatgag atcgctaatc ttgttttagc caagcttggt aaagattcta aacctcagca 600

agtcactaag caaaatgcca aggaaatcag gcataaaatt ttaacaaaac ctcgccaaaa 660

gcgaactcct aataaatggt aatactgttt ctgaggctgt gtctagatta gttgaatcag 720

cttctgaatt tattgtttgg cgtgcagagg cacttaataa gtatggttga tttatttttc 780

aatgatactg cttggtacat aggacagatt ttagttttag ttttattttg tcttatttct 840

ttaatctttg ttgttgcttt tttagcaact attaagcttt gtatgcaact ttgtggtttt 900

tgtaatttct ttattatttc accttcggct tacgtttata aaagaggtat gcagttgtat 960

aagtcttata gtgaacaagt tataccaccc acttcagatt atttaatcta aatctaaaca 1020

ttatgaataa atgctagc 1038

<210> 6

<211> 702

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aagctttggt gcgtctgttt gtatatattg ccgcgcacga gttgaacacc cagatgttga 60

tgggttgtgc aaattacgcg gcaagtttgt acaagtgcct gtaggtataa aagatcctgt 120

gtcttatgtt ttgacacatg atgtttgtcg agtttgtgga ttttggcggg atggaagttg 180

ttcatgtgtt agcactgaca ctactgttca atcaaaagat actaattttt taaacgggtt 240

cggggtacga gtgtagatgc ccgtctcgta ccctgcgcca gtggtttatc tactgatgta 300

caattaaggg catttgatat ttacaatgct agtgttgctg gcattggttt gggactagtt 360

gttttaagaa atgtggtggt tgttgtgatg attatactgg ataccaggag ttagtaatca 420

aaacttcaca tgacgactaa gttcgtcttt gattcattgc actgatctct tgttagatct 480

ttttgcaatc tagcatttgt taaagttctt aaggccacgc cctattaatg gacatttgga 540

gacctgagaa gaaatatctc cgttatatta acggttttaa tgtctcagaa ttagaagatg 600

cttgttttaa atttaactat caatttccta aagtaggata ttgtagagtt cctagtcatg 660

cttggtgccg taatcaaggt agattttgtg ctacataagc tt 702

<210> 7

<211> 616

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

aagcttgttc tctattgctt tgcctccaga gctctctgtt gttgagtttg aggatcgctc 60

taataactca tctcgtgcta gcagtcgttc ttcaactcgt aacaactcac gagactcttc 120

tcgtagcact tcaagacaac agtctcgcac tcgttctgat tctaaccagt cttcttcaga 180

tcttgttgct gctgttactt tggctttaaa gaacttaggt tttgataacc agtcgaagtc 240

acctagttct tctggtactt ccactcctaa gaaacctaat aagcctcttt ctcaacccag 300

ggctgataag ccttctcagt tgaagatcgt tttaaaaatg ctgatcttaa ggatggttat 360

tttgttataa agaggtgtac taagtcggtt atggaacacg agcaatccat gtataaccta 420

cttaactttt ctggtgcttt ggctgagcat gatttcttta cttggaaaga tggcagagtc 480

atttatggta atgttagtag acataatctt actaaatata ctatgatgga cttggtctat 540

gctatgcgta actttgatga acaaaattgt gatgttctaa aagaagtatt agttttaact 600

ggttgttgtg aagctt 616

<210> 8

<211> 1027

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gctagctggc gcgtctgttt gtatttattg cagagcacat gttgcacatc caaccatgga 60

cggtttttgt cagtacaaag gcaagtgggt acaagtgcct ataggtacaa atgaccctat 120

aagattttgt cttgaaaata ctgtttgtaa agtttgtggt tgttggctta atcatggctg 180

tacatgtgac cggactgcta tccaaagttt tgataacagt tatttaaacg agtccggggc 240

tctagtgccg ctcgactaga gccctgtaat ggtacagaca tagattactg tgtccgtgca 300

tttgacgttt acaataaaga tgcgtctttt atcggaaaaa atctgaagtc caattgcctg 360

actcccgtgc tccttcccgg tctcagtcga ggtcgcagag tcgcggtcgt ggtgaatcca 420

aacctcaatc tcggaatcct tcaagtgaca gaaaccataa cagtcaggat gacatcatga 480

aggcagttgc tgcggctctt aaatctttag gttttgacaa gcctcaggaa aaagataaaa 540

agtcagcgaa aacgggtact cctaagcctt ctcgtaatca gagtcctgct tcttctcaaa 600

cttctgccaa gagtcttgct cgttctcaga gttctgaaac aaaagaacaa aagcatgaaa 660

tgcaaaagcc acggtcccag ctgttggaat agtcaacaca gatttcaaat tagaaatcca 720

ctaagatgtt ccttaagcta gtggatgatc atgctttggt tgttaatgta ctactctggt 780

gtgtggtgct tatagtgata ctactagtgt gtattacaat aattaaacta attaagcttt 840

gtttcacttg ccatatgttt tgtaatagaa cagtttatgg ccccattaaa aatgtgtacc 900

acatttacca atcatatatg cacatagacc ctttccctaa acgagttatt gatttctaaa 960

ctaaacgaca atgtcaaatg acaattgtac gggtgacatt gtcacccatt tgaagaattg 1020

ggctagc 1027

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gtactgccgt tgccacatag at 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atcattgtag atgtcaaaag ccc 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ctttagtggc agtacgtttt tg 22

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tcgtttagac cagaagatca ggaa 24

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

ttgctgctgc ttgacagatt 20

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

atattgcagc agtacgcaca ca 22

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

acactagcca tccttactgc gcttcg 26

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

ggtgcggaca tctcggtagt g 21

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gcggtttgcg tattgggc 18

Claims

1.一种假病毒颗粒，其含有的核酸分子包含选自以下的一种、两种或多种序列：

2.如权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒的核酸分子包含选自(1)-(3)中一种、两种或三种的序列：

(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列的对应RNA序列，或该RNA序列的互补序列，

(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列的对应RNA序列，或该RNA序列的互补序列，

(3)如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列的对应RNA序列，或该RNA序列的互补序列。

3.如权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒的核酸分子包含如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列的对应RNA序列或其互补序列、如SEQID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列的对应RNA序列或其互补序列、和如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列的对应RNA序列或其互补序列。

4.如权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒的核酸分子包含：

(1)如SEQ ID NO:1第7-356位所示的ORF1ab基因cDNA序列的对应RNA序列，或该RNA序列的互补序列，和

(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列的对应RNA序列，或该RNA序列的互补序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒是能用于制备装甲RNA病毒颗粒的病毒的假病毒颗粒，优选噬菌体假病毒颗粒。

6.一种制备假病毒颗粒的方法，包括：

(1)将核酸构建物引入工程细胞，

(2)在核酸构建物转录和/或翻译的条件下培养所述工程细胞，

任选的(3)由所述工程细胞收集假病毒颗粒，

所述核酸构建物包含具有选自以下(1)-(3)中一种、两种或三种的序列的核酸分子：

(2)新型冠状病毒的N基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列；

(3)新型冠状病毒的E基因的序列或其cDNA序列，或与它们具有至少95％序列相同性的变体，或所述序列或变体的互补序列。

7.如权利要求6所述的方法，所述核酸构建物包含具有选自以下(1)-(3)中一种、两种或三种的序列的核酸分子：

(2)如SEQ ID NO:1第357-675位所示的N基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列，

(3)如SEQ ID NO:1第676-1025位所示的E基因cDNA序列或其对应RNA序列，或该cDNA序列或RNA序列的互补序列。

8.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-5所述的假病毒颗粒，

优选地，所述试剂盒还包括阴性假病毒颗粒，所述阴性假病毒颗粒含有选自SARS、MERS、HKU1、OC43、NL63、229E中一种或多种病毒的新型冠状病毒的选自ORF1ab基因、N基因和E基因的一种或多种同源序列，或其互补序列；优选地，所述阴性假病毒颗粒含有选自SEQID NO:3-8中的一种或多种序列的对应RNA序列或其互补序列，

优选地，所述试剂盒还包含与所述假病毒颗粒所含的核酸分子相匹配的引物，更优选地，所述引物包含选自SEQ ID NO:13、14、16、17、19、20中的一种或多种的序列，

优选地，所述试剂盒还包含与所述假病毒颗粒所含的核酸分子相匹配的探针，更优选地，所述探针包含选自SEQ ID NO:15、18、21中的一种或多种的序列。

9.权利要求1-5中任一项所述的假病毒颗粒在制备检测新型冠状病毒的试剂盒中的用途，其中所述假病毒颗粒用作阳性对照。

10.权利要求1-5中任一项所述的假病毒颗粒在评估新型冠状病毒检测方法或检测试剂盒中的用途。