CN114015725A - 一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法 - Google Patents
一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114015725A CN114015725A CN202111212401.XA CN202111212401A CN114015725A CN 114015725 A CN114015725 A CN 114015725A CN 202111212401 A CN202111212401 A CN 202111212401A CN 114015725 A CN114015725 A CN 114015725A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cov
- sars
- pseudovirus
- antibody
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 74
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 25
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 claims abstract description 135
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 76
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 44
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 32
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract description 26
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 19
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000004448 titration Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 15
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 10
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 6
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 claims description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000001808 coupling effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 claims description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 4
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 230000005653 Brownian motion process Effects 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 101710114810 Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000005537 brownian motion Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011551 log transformation method Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108010016297 plasmin drug combination deoxyribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001485 positron annihilation lifetime spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000001521 two-tailed test Methods 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2770/20052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种新冠病毒(SARS‑CoV‑2)完整病毒颗粒的检测方法，包括假病毒的产生与滴定、体外假病毒感染、羧基磁珠与抗体的偶联、SARS‑CoV‑2定量RT‑qPCR检测步骤。本发明对血清和HBV的抗干扰能力比直接qPCR检测更显著，检测内分析的变异系数分别为0.83%和5.19%，提示本发明方法对检测完整的SARS‑CoV‑2颗粒具有良好的特异性和稳定性。综上所述，本发明建立了一种基于伪病毒的检测SARS‑CoV‑2完整病毒颗粒的新方法，它将在许多特殊情况下对快速和准确的病毒感染风险评估发挥巨大作用。
Description
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，具体涉及一种新冠病毒(SARS-CoV-2)完整病毒颗粒的检测方法。
背景技术
由新型冠状病毒SARS-CoV-2引发的严重急性呼吸系统综合征(COVID-19)已经发展成为全球严重的公共卫生事件。尽管全球已经在COVID-19的诊断、治疗和预防上投入了巨额资金，但由于SARS-CoV-2的高传染性、致病性和突变率，疫情仍然十分严峻。病原体SARS-CoV-2是一种具有3万碱基的单股正链RNA基因组，直径约80-120nm的新型β-冠状病毒。病毒的基因组包含5个主要的开放阅读框，依次为5′非翻译区-复制酶复合物(ORF1ab)-刺突蛋白(S)-包膜蛋白(E)-膜蛋白(M)-核衣壳(N)-3′非翻译区。在细胞感染过程中，S蛋白首先与位于II型肺细胞表面的人受体血管紧张素转换酶2(ACE2)相互作用，并与宿主细胞膜融合。正义RNA被释放入胞质后移动到细胞核，首先产生非结构蛋白和病毒RNA聚合酶。RNA合成之后，由亚基因组mRNA合成病毒结构蛋白，并进一步包装成新的完整病毒粒子。子代病毒将被包裹在细胞质内的囊泡中，通过胞吐作用释放到细胞外，进行下一个病毒感染周期。然而，核衣壳蛋白可以与病毒基因组RNA形成冷凝物，并作为“亚病毒颗粒”分泌到细胞外，这是病毒生命周期中常见的现象。如，乙型肝炎病毒核心蛋白和病毒DNA可以组装成衣壳粒子并分泌，人类免疫缺陷病毒(HIV)衣壳蛋白(CA)和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(CA)可以包裹病毒RNA并以亚病毒颗粒的形式释放。从以上SARS-CoV-2生命周期中可以看出，完整的病毒颗粒是唯一能造成持续感染的元素。
截至目前，各个领域已经开发了多种及时高效检测SARS-CoV-2感染的方法，包括基于病理的胸部计算机断层扫描、基于蛋白质的病毒抗原和抗体检测，基于病毒RNA的定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、RT-LAMP/Cas12 DETECTR检测、RPA/SHERLOCK检测和miRNA生物传感器检测。这些方法对于检测新型冠状病毒感染情况和治疗预后具有重要价值，但有些病毒成分中仅含有病毒RNA片段和/或抗原，如亚病毒颗粒，检测信号仍呈阳性，以致于不能真正反映病毒复制和感染的能力。特别是需要确定这些感染者是否能分泌完整的病毒并感染接触人群。此外，在许多特殊情况下，如COVID-19患者康复、患者所在医院周边区域、冷链物流、密闭客舱等，需要对完整病毒进行检测，以科学评估其感染人的能力。因此，迫切需要一种新的方法来检测完整的新冠病毒(SARS-CoV-2)颗粒。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明提供一种新冠病毒(SARS-CoV-2)假病毒系统。
假病毒由目标病毒的一些功能成分组成，并通过在宿主细胞内的少量繁殖来确定安全性。因此，它常被用作SARS-CoV-2病毒感染、治疗和诊断的致病模型。目前所构建的SARS-CoV-2假病毒可在病毒包膜上表达Spike(或RDB结构域)，可用于研究SARS-CoV-2的受体和感染途径，评估和量化中和抗体，构建重组疫苗。但这些缺乏病毒基因序列的假病毒不适合用于检测完整的SARS-CoV-2病毒颗粒。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明提供一种假病毒系统，其特征在于：将SARS-CoV-2的部分病毒基因组整合到慢病毒表达质粒中，在其包膜上表达刺突(S)糖蛋白以模拟SARS-CoV-2的功能结构；所述SARS-CoV-2的部分病毒基因组为含有SARS-CoV-2ORF1ab(15415-15540)，N基因(28750-29150)和E(26360-26381)的序列；所述慢病毒表达质粒为pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒。
根据本发明的一个实施方案，本发明所述假病毒系统是利用Lipofectamine 8000将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后收集细胞上清并混合；在4℃3000g离心15分钟去除细胞碎片后，将细胞上清置于20％蔗糖溶液上，使用Beckman SW28转子4℃125,000rpm(112,000g)离心15h得到SARS-CoV-2假病毒沉淀。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种新冠病毒(SARS-CoV-2)完整病毒颗粒的检测方法。
一种新冠病毒(SARS-CoV-2)完整病毒颗粒的检测方法，包括假病毒产生、假病毒鉴定、亲和抗体的筛选、羧基磁珠与抗体偶联、SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测；所述假病毒产生为利用Lipofectamine 8000将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后收集病毒上清并混合；然后离心清除细胞碎片，将细胞上清置于20％蔗糖溶液上，使用Beckman SW28转子离心获得病毒沉淀。
根据本发明的一个实施方案，本发明所述假病毒产生是利用Lipofectamine 8000将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后48h和72h收集病毒上清并混合；4℃3000g离心10分钟清除细胞碎片后将细胞上清置于20％蔗糖溶液上，使用Beckman SW28转子4℃25,000rpm(112,000g)离心15h获得病毒沉淀。
根据本发明的一个实施方案，本发明所述假病毒鉴定是利用SARS-CoV-2假病毒和编码GFP的对照假病毒感染过表达hACE2或空载慢病毒质粒转染HEK-293FT细胞，感染48小时和72小时荧光显微镜下观察假病毒感染情况，同时在72小时收集上清液，并行荧光定量PCR检测是否有病毒颗粒分泌；采用鼠抗SARS-CoV-2S(S2)单克隆抗体进行westernblot检测确定S蛋白融入假病毒的效率；利用2019-nCoV核酸检测试剂盒(Sansure Bio,China)采用RT-qPCR检测假病毒中的SARS-CoV-2ORF1ab基因确保SARS-CoV-2病毒基因组成功融入慢病毒。
根据本发明的一个实施方案，本发明所述亲和抗体筛选是利用SARS-CoV-2假病毒裂解液和病毒颗粒分别进行SDS-PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳进行解析后，鼠/人抗SARS-CoV-2S/M单克隆抗体作为一抗，HRP-羊抗鼠单克隆抗体作为二抗进行最佳特异性和亲和力抗体的筛选。
根据本发明的一个实施方案，本发明所述羧基磁珠与抗体偶联为用NHS和EDC溶液在25℃下连续激活羧基磁珠30分钟后；将已激活的MSP-COOH-F1加入稀释后的CQ25抗体中，混合后在4℃旋转4小时，分离上清后，用1％BSA溶液在25℃下温和封闭复合物30分钟；最后用偶联后磁珠和分离的上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色评价偶联效果。
根据本发明的一个实施方案，本发明所述SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测是将磁珠抗体复合物与假病毒在PBS缓冲液中常温旋转混合45分钟。捕获后的复合物采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒，在Bio-rad CFX96系统中检测SARS-CoV-2RNA水平。
一种新冠病毒(SARS-CoV-2)完整病毒颗粒的检测方法，包括假病毒产生、假病毒鉴定、亲和抗体的筛选、羧基磁珠与抗体偶联、SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测；所述假病毒产生是利用Lipofectamine 8000将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后48h和72h收集病毒上清并混合；4℃3000g离心10分钟清除细胞碎片后将细胞上清置于20％蔗糖溶液上，使用Beckman SW28转子4℃25,000rpm(112,000g)离心15h；所述假病毒鉴定为利用SARS-CoV-2假病毒和编码GFP的对照假病毒感染过表达hACE2或空载慢病毒质粒转染HEK-293FT细胞，感染48小时和72小时荧光显微镜下观察假病毒感染情况，同时在72小时收集上清液，并行荧光定量PCR检测是否有病毒颗粒分泌；采用鼠抗SARS-CoV-2S(S2)单克隆抗体进行western blot检测确定S蛋白融入假病毒的效率；利用2019-nCoV核酸检测试剂盒(Sansure Bio,China)采用RT-qPCR检测假病毒中的SARS-CoV-2ORF1ab基因确保SARS-CoV-2病毒基因组成功融入慢病毒；所述羧基磁珠与抗体偶联为用NHS和EDC溶液在25℃下连续激活羧基磁珠30分钟后；将已激活的MSP-COOH-F1加入稀释后的CQ25抗体中，混合后在4℃旋转4小时，分离上清后，用1％BSA溶液在25℃下温和封闭复合物30分钟；最后用偶联后磁珠和分离的上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色评价偶联效果；所述亲和抗体筛选为利用SARS-CoV-2假病毒裂解液和病毒颗粒分别进行SDS-PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳进行解析后，鼠/人抗SARS-CoV-2S/M单克隆抗体作为一抗，HRP-羊抗鼠单克隆抗体作为二抗进行最佳特异性和亲和力抗体的筛选；所述SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测是将磁珠抗体复合物与假病毒在PBS缓冲液中常温旋转混合45分钟，捕获后的复合物采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒，在Bio-rad CFX96系统中检测SARS-CoV-2RNA水平。
有益效果：
本发明提供一种能够完全模拟完整SARS-CoV-2的新型假病毒系统，并在此基础上提供一种新型的SARS-CoV-2完整病毒颗粒的免疫分子检测方法。通过对捕获病毒颗粒抗体的筛选、抗体-磁珠耦合参数和检测条件的优化，本发明免疫分子检测方法能够检测完整的SARS-CoV-2病毒颗粒，具有较高的敏感性和特异性。令人惊讶的是，本发明这种免疫分子检测对血清和HBV的抗干扰能力比直接qPCR检测更显著，检测内分析的变异系数分别为0.83％和5.19％，提示新型免疫分子检测方法对检测完整的SARS-CoV-2颗粒具有良好的特异性和稳定性。
假病毒的使用使高致病性病毒的研究摆脱了高水平的生物安全设施，为新冠病毒研究做出了巨大贡献。然而，目前报道的假病毒要么模拟SARS-CoV-2的抗原，要么模拟SARS-CoV-2的RNA序列，不能模拟完整的SARS-CoV-2颗粒。发明人设计的伪SARS-CoV-2病毒包含三个关键元素，一是它能在假病毒的衣壳上表达SARS-CoV-2的活性刺突(S)糖蛋白，引发与磁珠-抗体的特异性免疫反应从而捕获完整的病毒颗粒。二是病毒RNA序列的三个片段序列，ORF1ab(15415-15540)，N基因(28750-29150)和E(26360-26381)被包裹进假病毒的基因组，这意味着这个全新的假病毒可用于由世卫组织推荐和销售的所有的核酸检测试剂，而不用重新设计qPCR的引物。此外，还将GFP基因整合到假病毒基因组中，可以方便地评估假病毒包装效率和假病毒感染细胞的能力。令人惊喜的是，发明人发现新型假病毒与正常假病毒一样，感染细胞后不会继续增殖并分泌到上清中形成二次感染，这意味着SARS-CoV-2假病毒在模拟病毒感染、中和抗体评价等后续实验中是非常安全的。
与现有的核酸检测相比，仅增加磁珠捕获病毒颗粒的步骤，后续的定量PCR检测仍可利用大部分市面上销售的检测试剂，这意味着免疫分子检测可以在短时间内以极低的成本大规模应用于临床。该方法可用于多种情况下，如检测恢复期患者的完整病毒颗粒清除即感染性消失，评估出院后复阳的病人是否仍能感染周围人群，检测病毒检测采样室、国际航班客舱、国际冷链物流基地等高危环境中是否存在完整的病毒颗粒从而评估感染风险采取相应的防护措施等。在接下来的研究和应用中，可以通过筛选更具有亲和的抗体和质量更高的的羧基磁珠来提高检测的灵敏度，并可以将等温核酸扩增方法与此方法相结合，进一步简化实验过程，降低对实验设备的依赖，从而促进该检测方法在临床实践中的应用。
综上所述，新型的假病毒充分模拟了SARS-CoV-2，使相关研究更加安全方便。基于免疫分子的方法首次对完整的病毒颗粒进行检测，更准确地评估患者的感染状况和环境感染风险，实现了个性化精准治疗和环境资源的有效利用。
附图说明
图1是SARS-CoV-2慢病毒的包装和鉴定示意图；其中A.SARS-CoV-2和SARS-CoV-2伪病毒的结构；B.慢病毒包装原理；C.SARS-CoV-2假病毒的感染性：以转染空载质粒的HEK-293FT细胞和编码GFP的VSV-G假病毒作为对照；D.western blot检测慢病毒中SARS-CoV-2S蛋白；对照:编码野生型SARS-CoV-2S糖蛋白的质粒转染293T细胞过表达的SARS-CoV-2S蛋白；E.2019-nCoV核酸检测试剂盒qPCR检测SARS-CoV-2慢病毒合成克隆的cDNA(SansureBio，中国，湖南)；用同样的程序制备VSV-G伪病毒的作为阴性样本。
图2是鉴定与SARS-CoV-2假病毒完整病毒颗粒结合的潜在抗体图；其中A.将SARS-CoV-2假病毒在100℃加热10min后，用western blot方法鉴定与完整病毒颗粒结合的潜在抗体；对照:用编码野生型SARS-CoV-2S糖蛋白的载体转染293T细胞表达的SARS-CoV-2S蛋白；B.通过颗粒凝胶鉴定与完整病毒颗粒结合的潜在抗体；用同样的方法制备VSV伪病毒并作为阴性对照。
图3是基于免疫捕获的新型SARS-CoV-2假病毒检测平台的建立结果图；其中A.基于免疫捕获的SARS-CoV-2假病毒检测平台流程图；B.用BCA法测定偶联后羧基磁珠-抗体复合物的蛋白浓度；C偶联参数优；D.羧基磁珠(MB)和偶联CQ25抗体的磁珠(MB-CQ25)的粒径分析，P<0.0001；****；E.抗hiv1 P24抗体鉴定捕获后的SARS-CoV-2假病毒；F.CQ25抗体-羧基磁珠复合物捕获病毒的特异性鉴定。
图4是SARS-CoV-2假病毒检测平台验证结果图；其中A.分析的线性回归，当SARS-CoV-2假病毒滴度在102～107TU/ml范围内时，免疫分子检测的定量Cq值与滴度(log变换)呈线性关系，y＝-2.57x+40.203,R2＝0.99；直接qPCR检测结果在10～107TU/mL范围内，y＝-2.070x+33.23,R2＝0.98；B.检测的特异性，用24个羧基磁珠-cq25抗体复合物(CQ25-MB)和24个捕获的假病毒来确定本实验的特异性，P<0.0001；****。C.VSV-G伪病毒干扰；将不同体积的VSV-G假病毒加入检测平台，检测干扰；D.血清中HBV不同拷贝的干扰；SARS-CoV-2假病毒滴度为105TU/ml。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用原料及试剂均为市售产品。除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
实施例
(一)材料与方法
1、假病毒的产生和滴定
设计并构建了含有SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因的部分序列和GFP报告基因的质粒，命名为PLV-SARS-CoV-2-N-GFP。具体地说，利用Lipofectamine 8000(BeyotimeBio.C0533)将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后48h和72h收集病毒上清并混合。4℃3000g离心10分钟清除细胞碎片后，将细胞上清置于20％蔗糖溶液上，使用Beckman SW28转子4℃25,000rpm(112,000g)离心15h获得病毒沉淀(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)。采用HIV-1Gag p24DuoSet ELISA试剂盒(义翘生物技术股份有限公司，北京，中国。11695)对假病毒滴度进行定量。
2、假病毒鉴定
利用SARS-CoV-2假病毒和编码GFP的对照假病毒感染过表达hACE2或空载慢病毒质粒转染HEK-293FT细胞，感染48小时和72小时荧光显微镜下观察假病毒感染情况，同时在72小时收集上清液，并行荧光定量PCR检测是否有病毒颗粒分泌；采用鼠抗SARS-CoV-2S(S2)单克隆抗体进行westernblot检测确定S蛋白融入假病毒的效率；利用2019-nCoV核酸检测试剂盒(Sansure Bio,China)采用RT-qPCR检测假病毒中的SARS-CoV-2ORF1ab基因确保SARS-CoV-2病毒基因组成功融入慢病毒；
3、羧基磁珠与抗体的偶联
用100ul的NHS和100ul的EDC溶液在25℃下连续激活3mg羧基磁珠(FlyW&Y Bio,Chongqing,China)30分钟后。将已激活的MSP-COOH-F118030106)加入稀释后的CQ25抗体(0.6g/L)中，混合后在4℃轻轻旋转4小时。分离上清后，用1％BSA溶液在25℃下温和封闭复合物30分钟。最后用偶联后磁珠和分离的上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色评价偶联效果。
4、SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测
将磁珠抗体复合物与假病毒在PBS缓冲液中常温旋转混合45分钟，捕获后的复合物采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒，在Bio-rad CFX96系统中检测SARS-CoV-2RNA水平。采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光定量实时PCR)(Sansure Bio,China.001)，在Bio-rad CFX96系统(美国大力神Bio-rad,CA)中检测SARS-CoV-2RNA水平。每次反应包含样品5ul、样品释放剂5ul、含有反应材料、引物和探针的2019-nCoV-PCR反应液26ul、含有逆转录酶和Taq酶的酶混合物4ul。对每个样品进行3个重复的分析，并包括两个无模板控制(NTC)孔，以确认没有污染。
5、亲和抗体筛选
利用SARS-CoV-2假病毒裂解液和病毒颗粒分别进行SDS-PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳进行解析后，利用市场购买的11种鼠/人抗SARS-CoV-2S/M单克隆抗体作为一抗，HRP-羊抗鼠单克隆抗体作为二抗进行最佳特异性和亲和力抗体的筛选。
免疫印迹
将制备的假病毒或293T细胞转染野生型SARS-CoV-2S糖蛋白载体后过表达的SARS-CoV-2S蛋白30ul与6μl 6×SDS样品缓冲液混合，在95℃煮沸10min。然后对样品进行SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹。用稀释1:1000的小鼠抗S蛋白抗体(CQ2、CQ20、CQ25、CQ8、CQ12、CQ001、CQ100、CQ040、CQ042、CQ023和M1E1)作为一抗，1:4000稀释的山羊抗小鼠IgG(proteintech.No.SA00003-1)作为二抗。
病毒颗粒凝胶
在1×TAE缓冲液中，变性样品在1％琼脂糖凝胶上70V电泳2小时。根据虹吸原理，凝胶中的病毒颗粒在1×TBE缓冲液中转移到尼龙膜上。转移后，用5％BSA封闭膜30min,在抗hiv-1P24抗体液或抗S抗体液中4℃孵育12h,最后用1×TBST缓冲液洗涤，曝光。
6、粒度分析
用NanoBrook 90PLUS PALS粒径分析仪(Brookhaven Instruments Corporation,Holtsville,NY,USA)对羧基磁珠(MB)和磁珠-cq25抗体复合物(MB-cq25)的有效粒径进行了表征。取2.5ul样品(25g/L)加入3ml纯水(1‰triton-100)混合，使样品均匀分散在介质中呈布朗运动。如有必要，超声15分钟。根据仪器说明书设置参数后测量粒径。每次设置三个复杂的孔，重复两次。使用GraphPad Prism 8(GraphPad Software,Inc.，San Diego,CA,USA)对数据进行分析和绘制。
7、统计分析
采用SPSS 21.0forWindows(SPSS,Chicago,IL,USA)统计软件包进行线性回归、描述性统计、重复测量方差分析和两组未配对t检验。所有显著性检验均为双尾检验，p<0.05为有统计学意义。
(二)结果
1、SARS-CoV-2假病毒的构建与鉴定
为了避免高致病性和传染性的风险，SARS-CoV-2活病毒必须在生物安全3级条件下处理，这导致许多研究小组被限制进行与SARS-CoV-2相关的研究，尽管这些研究可能是必要的，非常重要和紧迫的。目前所报道的假病毒仅具有S蛋白或病毒核酸无法模拟病毒的完整结构。因此，发明人构建了一种新型假病毒，该假病毒不仅在病毒表面衣壳上表达刺突(S)糖蛋白，还融合了SARS-CoV-2病毒基因组的部分基因，包括ORF1ab基因、N基因、E基因和GFP编码序列(图1A)。
为了构建SARS-CoV-2假病毒，发明人首先成功构建了慢病毒转移质粒pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和包膜质粒pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)。通过将转移质粒、包装质粒和包膜质粒三质粒系统(pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒)共转染HEK-293FT cell包装生产SARS-CoV-2假病毒(图1B)后，首先检测其传染性和安全性。用SARS-CoV-2假病毒和对照VSVG假病毒感染过表达ACE2或空载的慢病毒质粒转导的HEK-293FT细胞，分别在48h和72h荧光显微镜下观察带有绿色荧光的被感染的细胞。在SARS-CoV-2假病毒感染的72h时，可在HEK-293FT-ACE2细胞中观察到丰富的GFP荧光，表明假病毒成功构建和转导(图1C)。同时在感染72小时收集细胞上清进行荧光定量PCR检测，以确定细胞上清中是否有分泌的病毒颗粒。RT-qPCR结果均未产生阳性信号，说明病毒颗粒不能在感染的HEK-293FT-hACE2细胞中复制和分泌，提示假病毒再感染细胞能力较差，具有较好的生物安全性。
S蛋白融入假病毒的效率采用鼠抗SARS-CoV-2S(S2)单克隆抗体进行westernblot检测。用编码野生型SARS-CoV-2S糖蛋白的载体转染293T细胞，使其表达S蛋白并作为阳性对照。与对照泳道一致，在SARS-CoV-2假病毒泳道中也可发现特异性条带，而作为阴性对照的VSV-G假病毒在相应位置未发现特异性条带。其中190kDa和80kDa两条主要的条带分别对应于单体S蛋白(S1+S2)和S2结构域(图1D,3lane)，SARS-CoV-2蛋白S1和S2之间存在额外的furin位点。而在250kDa以上位置的条带可能是二聚体或三聚体S蛋白的产物。
为了确保SARS-CoV-2病毒基因组成功融入慢病毒，发明人利用2019-nCoV核酸检测试剂盒(Sansure Bio,China)采用RT-qPCR检测假病毒中的SARS-CoV-2ORF1ab基因。如图1(E)所示，与阴性样本VSV-G假病毒相比，只有SARS-CoV-2假病毒能产生阳性检测信号。以上结果进一步证实SARS-CoV-2假病毒构建成功。
2、筛选用于捕获SARS-CoV-2假病毒颗粒的抗体。
基于SARS-CoV-2的包膜蛋白和刺突糖蛋白，发明人使用了11株单克隆抗体，分别为CQ2、CQ20、CQ25、CQ8、CQ12、CQ001、CQ100、CQ040、CQ042、CQ023和M1E1(购自重庆博奥赛斯生物科技有限公司和厦门万泰生物科技有限公司公司)，通过westernblot和病毒颗粒凝胶试验，筛选能与SARS-CoV-2假病毒颗粒结合的抗体。虽然在western blot实验中，假病毒的裂解产物可以与四株抗体发生免疫反应，包括CQ20、CQ2、CQ8和CQ25(图2a)，但由于空间位阻限制，完整的SARS-CoV-2假病毒颗粒只能与CQ2、CQ25和M1E1抗体发生免疫反应(图2b)。可以看出，在11种抗体中，CQ25抗体是与SARS-CoV-2假病毒颗粒结合的亲和力和特异性最高。
3、新型SARS-CoV-2完整病毒颗粒免疫分子检测方法的建立
基于SARS-CoV-2假病毒和筛选的特异性抗体，如图3A所示，基于免疫分子原理发明人设计了一个全新的SARS-CoV-2病毒颗粒检测平台。羧基磁珠的羧基与抗体的氨基共价结合形成肽键，从而使抗体与羧基磁珠偶联；在与SARS-CoV-2假病毒共孵育后，羧基磁珠-cq25抗体复合物可特异性捕获SARS-CoV-2假病毒颗粒；磁力架分离上清后，SARS-CoV-2假病毒颗粒被富集并与其他可能的亚病毒颗粒如游离RNA片段、核衣壳蛋白与病毒基因组RNA形成的冷凝物以及病毒包装过程中产生的空病毒粒子等分离；最后利用荧光定量PCR对复合物进行定量定性检测。免疫和分子的原理结合，进一步确保检测平台只针对完整的病毒颗粒。
为建立SARS-CoV-2完整病毒颗粒的免疫分子检测平台，发明人首先成功偶联羧基磁珠和cq25抗体。利用BCA法测定偶联后复合物的蛋白浓度来评价偶联的效果(图3B)，与未处理的羧基磁珠相比，复合物在562nm处具有更高的吸光度，说明抗体已成功与磁珠偶联。在SDS-PAGE电泳结果中，偶联后的磁珠在抗体的相应位置均有特异性的条带，而未处理的羧基磁珠则无特异性的条带，进一步证明磁珠与抗体成功偶联。随着添加的抗体量不断增加，偶联完成后分离的上清中抗体持续增加(图3C)，表明3.3mg羧基磁珠至少可被60ug的抗体完全偶联。同时粒度分析的结果表明，复杂的耦合后的平均有效直径约为600nm和羧基磁珠约300nm，粒度的显著增加进一步证实了抗体和羧基磁珠之间的耦合是有效的(图3D)。
接下来，发明人测试了SARS-CoV-2假病毒是否可以被偶联了特异性抗体的羧基磁珠捕获。因为HIV1 P24是慢病毒衣壳中含量最多的标志蛋白，发明人利用单克隆小鼠抗HIV1p24抗体进行病毒颗粒凝胶实验，成功鉴定了捕获后的完整病毒颗粒的病毒衣壳蛋白(图3E)。接着利用SARS-CoV-2S假病毒、VSV-G假病毒、HBV病毒等非特异性样本进一步验证病毒捕获的特异性。对捕获后的磁珠-抗体-病毒复合物进行RT-qPCR检测，与阴性样本相比，只有发明人构建的SARS-CoV-2假病毒可检测到阳性信号，这表明该便携式平台可以捕获完整的SARS-CoV-2假病毒颗粒，具有良好的特异性(图3F)。
4、基于免疫分子的SARS-CoV-2完整病毒颗粒检测平台的验证。
SARS-CoV-2活病毒具有危险的致病性和传染性，必须在生物安全3级条件下处理，因此不得不使用构建的SARS-CoV-2假病毒来验证完整病毒颗粒检测平台。线性范围是指信号与物质浓度在一定范围内存在直接相关关系。用P24 ELASE试剂盒检测SARS-CoV-2假病毒滴度约为6.07×107TU/ml。由于缺乏标准品，发明人对原始SARS-CoV-2假病毒进行了10倍梯度稀释，同时进行荧光定量PCR以确定线性范围。当假病毒滴度在102～107TU/ml范围内时，免疫分子检测方法的定量Cq值与其滴度(对数变换)呈线性关系y＝-2.57x+40.203(R2＝0.99，图4A)，而直接qPCR的线性范围为10～107TU/ml范围内，y＝-2.070x+33.23(R2＝0.98)。这两种不同的检测方法对同一滴病毒产生了不同的信号，这很可能是方法上的差异和不完全病毒粒子干扰的组合结果，但病毒包装过程中产生的完整病毒颗粒与非完整病毒颗粒的比例还有待进一步研究。
如图4B所示，24个阴性样本即羧基磁珠-抗体(CQ25-MB与24个捕获假病毒后的阳性样本之间存在显著差异，P<0.0001；****。当阴性样本的平均滴度+1.96标准差(SD)用作检测极限(LOD)时,LOD为103TU/Ml。尽管当假病毒的滴度低于103TU/Ml时，定量Cq值可以测得数值，但荧光定量PCR的结果仍被认为是阴性的。
发明人使用VSV-G假病毒和不同乙肝病毒拷贝数的血清来验证该方法的抗干扰能力。如图4C所示，添加不同体积的VSV-G假病毒对完整SARS-CoV-2假病毒颗粒的定量定性检测影响不大，分析间变异系数分别为1.85％和1.69％。正常人血清中含有大量的白蛋白和各种抗体，这些因素是否会影响检测的特异性和稳定性？因此，发明人比较了正常人血清和不同乙肝病毒拷贝数的患者血清分别对直接qPCR和免疫分子检测的干扰能力(图4D)。令人惊讶的是，本发明这种免疫分子检测对血清和HBV的抗干扰能力比直接qPCR检测更显著，检测内分析的变异系数分别为0.83％和5.19％。提示本发明新型免疫分子检测方法对检测完整的SARS-CoV-2颗粒具有良好的特异性和稳定性。
Claims (9)
1.一种假病毒系统，其特征在于：将SARS-CoV-2的部分病毒基因组整合到慢病毒表达质粒中，在其包膜上表达刺突(S)糖蛋白，以模拟SARS-CoV-2的功能结构；所述SARS-CoV-2的部分病毒基因组为含有SARS-CoV-2ORF1ab(15415-15540)，N基因(28750-29150)和E(26360-26381)的序列；所述慢病毒表达质粒为pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒。
2.如权利要求1所述的假病毒系统，其特征在于：所述假病毒系统是利用Lipofectamine8000将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后收集病毒上清并混合；然后离心清除细胞碎片，将细胞上清置于蔗糖溶液上，使用Beckman SW28转子离心得到病毒沉淀。
3.一种新冠病毒(SARS-CoV-2)完整病毒颗粒的检测方法，包括假病毒的产生与滴定、假病毒鉴定、亲和抗体的筛选、羧基磁珠与抗体的偶联、SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测、免疫印迹、病毒颗粒凝胶和粒度分析步骤；所述假病毒的产生与滴定为利用Lipofectamine8000将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后收集病毒上清并混合；然后离心清除细胞碎片，将细胞上清置于蔗糖溶液上，使用Beckman SW50.1转子离心；采用HIV-1Gag p24 DuoSet ELISA试剂盒对假病毒滴度进行定量。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述假病毒的产生是利用Lipofectamine8000将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后48h和72h收集病毒上清并混合；4℃3000g离心10分钟清除细胞碎片后，将细胞上清置于20％蔗糖溶液上，使用Beckman SW50.1转子4℃112,000g离心15h得到病毒沉淀。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述体外假病毒感染为将，用SARS-CoV-2假病毒和编码GFP的对照假病毒在48孔板中感染过表达hACE2或空载慢病毒质粒转染的HEK-293FT细胞48小时和72小时后荧光显微镜下观察假病毒感染情况；同时72小时收集上清液，并行荧光定量PCR检测是否有病毒颗粒分泌。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述亲和抗体筛选为利用SARS-CoV-2假病毒裂解液和病毒颗粒分别进行SDS-PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳进行解析和转膜后，鼠/人抗SARS-CoV-2S/M单克隆抗体作为一抗，HRP-羊抗鼠单克隆抗体作为二抗进行最佳特异性和亲和力抗体的筛选。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述羧基磁珠与抗体的偶联为用NHS和EDC溶液在25℃下连续激活羧基磁珠30分钟后；将已激活的MSP-COOH-F1加入稀释后的CQ25抗体中，混合后在4℃旋转4小时，分离上清后，用1％BSA溶液在25℃下温和封闭复合物30分钟；最后用偶联后磁珠和分离的上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色评价偶联效果。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测是将磁珠抗体复合物与假病毒在PBS缓冲液中常温旋转混合45分钟，捕获后的复合物采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒，在Bio-rad CFX96系统中检测SARS-CoV-2RNA水平。
9.一种新冠病毒(SARS-CoV-2)完整病毒颗粒的检测方法，包括假病毒产生、假病毒鉴定、亲和抗体的筛选、羧基磁珠与抗体偶联、SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测；所述假病毒产生是利用Lipofectamine 8000将pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)、pLV-SARS-CoV-2-N-GFP和pMD2质粒三种共转染HEK-293FTcells，转染后48h和72h收集病毒上清并混合；4℃3000g离心10分钟清除细胞碎片后将细胞上清置于20％蔗糖溶液上，使用Beckman SW50.1转子4℃25,000rpm(112,000g)离心15h获得假病毒沉淀；所述假病毒鉴定是利用SARS-CoV-2假病毒和编码GFP的对照假病毒感染过表达hACE2或空载慢病毒质粒转染HEK-293FT细胞，感染48小时和72小时荧光显微镜下观察假病毒感染情况，同时在72小时收集上清液，并行荧光定量PCR检测是否有病毒颗粒分泌；采用鼠抗SARS-CoV-2S(S2)单克隆抗体进行westernblot检测确定S蛋白融入假病毒的效率；利用2019-nCoV核酸检测试剂盒(Sansure Bio,China)采用RT-qPCR检测假病毒中的SARS-CoV-2ORF1ab基因确保SARS-CoV-2病毒基因组成功融入慢病毒；所述亲和抗体筛选为利用SARS-CoV-2假病毒裂解液和病毒颗粒分别进行SDS-PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳进行解析和转膜后，鼠/人抗SARS-CoV-2S/M单克隆抗体作为一抗，HRP-羊抗鼠单克隆抗体作为二抗进行最佳特异性和亲和力抗体的筛选；所述羧基磁珠与抗体偶联为用NHS和EDC溶液在25℃下连续激活羧基磁珠30分钟后；将已激活的MSP-COOH-F1加入稀释后的CQ25抗体中，混合后在4℃旋转4小时，分离上清后，用1％BSA溶液在25℃下温和封闭复合物30分钟；最后用偶联后磁珠和分离的上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色评价偶联效果；所述SARS-CoV-2定量RT-qPCR检测为将磁珠抗体复合物与假病毒在PBS缓冲液中常温旋转混合45分钟，捕获后的复合物采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒，在Bio-rad CFX96系统中检测SARS-CoV-2RNA水平。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111212401.XA CN114015725B (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法 |
| PCT/CN2022/080846 WO2022252745A1 (zh) | 2021-06-02 | 2022-03-15 | 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒 |
| US18/475,264 US20240018611A1 (en) | 2021-06-02 | 2023-09-27 | Immune molecule virus particle detection kit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111212401.XA CN114015725B (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114015725A true CN114015725A (zh) | 2022-02-08 |
| CN114015725B CN114015725B (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=80056670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111212401.XA Active CN114015725B (zh) | 2021-06-02 | 2021-10-18 | 一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114015725B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115287265A (zh) * | 2022-07-12 | 2022-11-04 | 四川大学华西医院 | 多能活性制剂诱发恒河猴抵抗新冠突变体的免疫防治模型 |
| CN115786326A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-14 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111471717A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-31 | 复百澳（苏州）生物科技有限公司 | 一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法 |
| CN111662884A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-15 | 中吉当康(北京)基因技术有限公司 | 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统 |
| CN112553172A (zh) * | 2021-02-19 | 2021-03-26 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种covid-19假病毒及其制备方法和用途 |
| CA3101131A1 (en) * | 2020-01-31 | 2021-07-31 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for preventing and treating coronavirus infection - sarscov-2 vaccines |
| CN113248578A (zh) * | 2020-02-12 | 2021-08-13 | 重庆医科大学 | 新型冠状病毒(2019-nCoV)重组抗原及多克隆抗体 |
| CN113322302A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-08-31 | 重庆医科大学 | 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 |
| CN113325177A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-31 | 博奥赛斯(重庆)生物科技有限公司 | 一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用 |
| WO2021175298A1 (zh) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 浙江东方基因生物制品股份有限公司 | 新冠病毒检测的试剂以及检测方法 |
| CN113462655A (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院 | 检测新型冠状病毒的试剂和方法 |
| WO2021219029A1 (en) * | 2020-04-28 | 2021-11-04 | Versitech Limited | Sars-cov-2 viral proteins and use thereof |
| WO2021254341A1 (zh) * | 2020-06-16 | 2021-12-23 | 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 | 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用 |
| CN114075553A (zh) * | 2021-10-30 | 2022-02-22 | 西北工业大学 | 一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法 |
| CN115125271A (zh) * | 2021-03-25 | 2022-09-30 | 广州中医药大学顺德医院(佛山市顺德区中医院) | 一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品 |
| WO2022252745A1 (zh) * | 2021-06-02 | 2022-12-08 | 重庆医科大学 | 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒 |
-
2021
- 2021-10-18 CN CN202111212401.XA patent/CN114015725B/zh active Active
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3101131A1 (en) * | 2020-01-31 | 2021-07-31 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for preventing and treating coronavirus infection - sarscov-2 vaccines |
| CN113248578A (zh) * | 2020-02-12 | 2021-08-13 | 重庆医科大学 | 新型冠状病毒(2019-nCoV)重组抗原及多克隆抗体 |
| WO2021175298A1 (zh) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 浙江东方基因生物制品股份有限公司 | 新冠病毒检测的试剂以及检测方法 |
| CN113462655A (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院 | 检测新型冠状病毒的试剂和方法 |
| CN111471717A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-31 | 复百澳（苏州）生物科技有限公司 | 一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法 |
| WO2021219029A1 (en) * | 2020-04-28 | 2021-11-04 | Versitech Limited | Sars-cov-2 viral proteins and use thereof |
| WO2021254341A1 (zh) * | 2020-06-16 | 2021-12-23 | 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 | 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用 |
| CN111662884A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-15 | 中吉当康(北京)基因技术有限公司 | 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统 |
| CN112553172A (zh) * | 2021-02-19 | 2021-03-26 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种covid-19假病毒及其制备方法和用途 |
| CN115125271A (zh) * | 2021-03-25 | 2022-09-30 | 广州中医药大学顺德医院(佛山市顺德区中医院) | 一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品 |
| CN113322302A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-08-31 | 重庆医科大学 | 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 |
| WO2022252745A1 (zh) * | 2021-06-02 | 2022-12-08 | 重庆医科大学 | 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒 |
| CN113325177A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-31 | 博奥赛斯(重庆)生物科技有限公司 | 一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用 |
| CN114075553A (zh) * | 2021-10-30 | 2022-02-22 | 西北工业大学 | 一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| LIZHOU ZHANG等: "SARS-CoV-2 spike-protein D416 mutation increases virion spike density and infectivity", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 11, no. 1, XP093138516, DOI: 10.1038/s41467-020-19808-4 * |
| RUODAN XU等: "Construction of SARS-CoV-2 Virus-like Particles by Mammalian Expression System", FRONTIERS IN BIOENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, vol. 8 * |
| WU X等: "Immunomolecular assay based on selective virion capture by spike antibody and viral nucleic acid amplification for detecting intact SARS-CoV-2 particles", NANOBIOTECHNOLOGY, vol. 20, no. 1, 5 September 2022 (2022-09-05) * |
| 伍晓莉: "基于免疫分子法检测SARS-CoV-2完整病毒颗粒", 中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑, no. 2 * |
| 殷建国等: "一种新型冠状病毒假病毒的制备及初步应用", 免疫学杂志, vol. 37, no. 4 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115287265A (zh) * | 2022-07-12 | 2022-11-04 | 四川大学华西医院 | 多能活性制剂诱发恒河猴抵抗新冠突变体的免疫防治模型 |
| CN115786326A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-14 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
| CN115786326B (zh) * | 2022-11-04 | 2023-10-03 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114015725B (zh) | 2024-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hsu et al. | Persistent infection with and serologic crossreactivity of three novel murine noroviruses | |
| CN111978378B (zh) | SARS-CoV-2抗原多肽及其应用 | |
| US7575753B2 (en) | SRSV detection kit | |
| CN114015725B (zh) | 一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法 | |
| Monto et al. | Ether treatment of type B influenza virus antigen for the hemagglutination inhibition test | |
| Jiang et al. | Sapporo-like human caliciviruses are genetically and antigenically diverse | |
| US20240018611A1 (en) | Immune molecule virus particle detection kit | |
| Forgacs et al. | SARS-CoV-2 mRNA vaccines elicit different responses in immunologically naïve and pre-immune humans | |
| Sapkal et al. | Detection and isolation of Japanese encephalitis virus from blood clots collected during the acute phase of infection | |
| Irwin et al. | Presence of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 subtype A infection in a New York community with high HIV prevalence: a sentinel site for monitoring HIV genetic diversity in North America | |
| Ricks et al. | Development of a bead-based immunoassay using virus-like particles for detection of alphaviral humoral response | |
| Tsugawa et al. | Virological, serological, and clinical features of an outbreak of acute gastroenteritis due to recombinant genogroup II norovirus in an infant home | |
| Hale et al. | Homotypic and heterotypic IgG and IgM antibody responses in adults infected with small round structured viruses | |
| CN113817753A (zh) | 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用 | |
| Dimitrov et al. | Prevalence of antibodies to human caliciviruses (HuCVs) in Kuwait established by ELISA using baculovirus‐expressed capsid antigens representing two genogroups of HuCVs | |
| Bouche et al. | Immunosorbent assay based on recombinant hemagglutinin protein produced in a high-efficiency mammalian expression system for surveillance of measles immunity | |
| Christenson et al. | Methods for screening the naturally acquired and vaccine-induced immunity to the measles virus | |
| Patil et al. | Variable neutralizing antibody responses to 10 SARS-CoV-2 variants in natural infection with wild-type (B. 1) virus, Kappa (B. 1.617. 1), and Delta (B. 1.617. 2) variants and COVISHIELD vaccine immunization in India: utility of the MSD platform | |
| LaBrecque et al. | Recombinant hepatitis A virus antigen: improved production and utility in diagnostic immunoassays | |
| Qi et al. | Synthesis and application of hepatitis E virus peptides to diagnosis | |
| CN107064488A (zh) | 一种猪瘟病毒血清总抗体固相阻断elisa试剂盒所用抗原的制备方法 | |
| AU649473B2 (en) | Enterovirus peptides | |
| KR101857417B1 (ko) | 효소면역기법을 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법 | |
| CN105906694B (zh) | 基孔肯亚病毒特异性检测抗原及其应用 | |
| Forgacs et al. | Functional characterization of SARS-CoV-2 vaccine elicited antibodies in immunologically naïve and pre-immune humans |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |