CN113322302A - 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法,以羧基磁珠为介质,将特异性抗体与羧基磁珠偶联,进行病毒颗粒捕获分离,再进行QPCR检测。实验显示,本发明方法可以成功将样本中的病毒颗粒捕获分离,并且因磁珠偶联抗体的不同,可以将样本中不同组分的病毒颗粒区分。通过本发明方法,意外发现细胞上清、血清中病毒粒子成分有所不同,细胞上清中HBV DNA主要来源于衣壳病毒,完整病毒颗粒含量较少;而血清标本中衣壳病毒含量低于完整病毒颗粒。随着血清中HBV DNA拷贝数的增加,其血清中完整病毒颗粒的含量明显增加,提示完整病毒颗粒的检测可能作为新的血清标志物。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及HBV完整病毒颗粒,具体涉及一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种具有双链DNA基因组的假逆转录病毒。其重要的特征是HBV感染肝细胞后可以分泌多种形式的病毒颗粒,大致可以分为包含基因组及无基因组的病毒粒子。根据基因组的种类又可以分为HBV RNA类病毒粒子、HBVDNA病毒粒子与无基因组病毒粒子。以有无乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)为标准,又可以将不同基因组的病毒粒子划分为核衣壳病毒、包膜化病毒与亚病毒粒子。其中最具代表性的有亚病毒颗粒、NCs(nucleocapsid)颗粒、HBV RNA病毒粒子与完整病毒颗粒(HBV Dane颗粒)。NCs主要为包裹基因组的核衣壳病毒,根据包裹的基因组种类的不同分为成熟与不成熟两种,成熟的NCs包裹双链脱氧核糖核酸(double-stranded DNA,dsDNA),而未成熟的NCs含有的基因组则为HBV复制中间体。研究显示只有成熟的NCs才能被包膜化形成完整病毒颗粒(Ning X,Nguyen D,Mentzer L,et al.Secretion of genome-free hepatitis Bvirus-single strand blocking model for virion morphogenesisof para-retrovirus[J].Plos Pathogens,2011,7(9):e1002255)。HBV血清中含有较多的亚病毒颗粒,其主要成分为丰富的HBsAg蛋白(Heermann KH,Goldmann U,Schwartz W,etal.Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pre-s sequence[J].Journal of Virology,1984,52(2):396),它可以与宿主细胞分泌的表面抗体(hepatitis B surface antibody,HBsAb)反应,减少血清中HBsAb的含量,从而阻断这些抗体对HBV Dane颗粒的清除(Rydell GE,Prakash K,Norder H,et al.Hepatitis B surfaceantigen on subviral particles reduces the neutralizing effect of anti-HBsantibodies on hepatitis B viral particles in vitro[J].Virology,2017,509:67-70)。HBV Dane是一种球形颗粒,直径约为42nm,外含包膜蛋白(大、中、小表面蛋白),内由乙肝核心抗原(hepatitis B virus core antigen,HBcAg)包裹部分双链DNA(partiallydouble-stranded DNA,rcDNA)形成的核衣壳组成。与HBsAg病毒颗粒相比,前者包含丰富的大表面蛋白(Large protein,Lp),Lp蛋白是成熟NCs包膜化和完整病毒颗粒分泌不可缺少的成分(Bruss V,Ganem D.The role of envelope proteins in hepatitis B virusassembly[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(3):1059-63)。迄今为止,HBV Dane颗粒被认为是HBV分泌的多种病毒粒子中唯一具有传染性的病毒颗粒。其传染性大致有两个原因,一是包膜蛋白上含有可与肝细胞受体结合的结构域,从而介导HBV的感染;二为HBVDane颗粒可以将其内部携带的完整基因组运送到新的肝细胞,从而造成持续性感染。HBV不同形式的病毒粒子在病毒生命周期中各司其职,都有自己独特的作用,其中HBV Dane颗粒是HBV存在传染性最重要的成分,而NCs颗粒是保证其正确形成的关键性粒子。
技术方面,目前区分这些病毒颗粒的方法大多为密度梯度离心法,该方法缺乏相应的特异性,也尚未有直接的证据核实这些病毒颗粒的存在。临床方面,HBV的难以消除是由于共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的存在,因此对HBV的检测除了金标准肝组织活检外,主要为cccDNA的检测,而cccDNA的检测分直接检测与替代指标检测,如下图1所示,虽然上述的血清标志物对疾病检测有一定的指导作用,但也各自具有一定的局限性。基于HBV感染性主要源于完整病毒颗粒的原则,因此,HBV完整病毒颗粒的检测可能更能反应cccDNA的真实活性状态。而目前与HBV完整病毒颗粒相关的检测指标主要有LP与HBV DNA,因为这些方法只是对HBV Dane颗粒的部分结构进行检测,因此也存在不足。如HBV大蛋白的检测易出现假阳性,并且只能近似反映但不能代表HBV Dane的含量;现有的DNA检测方法只能检测血清中HBV DNA的总拷贝数,无法区分这些DNA来源于哪部分病毒颗粒,而存在感染性的HBV DNA主要包含在HBV Dane颗粒中。因此,HBV DNA的水平并不能代表真实的感染状态。综上可知,HBV Dane颗粒的检测至关重要。但是到目前为止,关于HBV完整病毒颗粒检测的研究甚少。基于此现状,很有必要建立一种HBV完整病毒颗粒直接检测的方法。
发明内容
为了解决现有技术中的问题,本发明提供一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法,包括抗体-磁珠偶联、HBV病毒粒子捕获和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,QPCR)检测步骤,其特征在于:所述抗体-磁珠偶联为在缓冲液中将羧基磁珠、NHS与等量EDC混合反应以活化磁珠,在偶联缓冲液中将活化的磁珠与抗体混合反应,得到抗体-磁珠偶联反应物;所述抗体选自PreS1抗体或/和HBc抗体。
进一步,抗体-磁珠偶联步骤中磁珠活化的温度为25℃。待偶联的抗体用MES溶液稀释,抗体终浓度为0.6g/L。
更进一步,所述抗体-磁珠偶联步骤为:取磁珠至EP管中,磁力分离,用MES缓冲液洗涤3次;施加磁场,去上清,将NHS与等量EDC溶液迅速加入EP管中,剧烈震荡,25℃持续活化磁珠30min;借助磁力架,用MES溶液洗涤磁珠3次;将待偶联的抗体用MES溶液稀释至抗体终浓度为0.6g/L;活化好的磁珠用MES溶液重悬,剧烈摇晃,保证磁珠全部分散;取活化磁珠悬液,分5次加入稀释好的抗体悬液中,每次加入磁珠后,立即温和混匀,4℃,温和旋转混匀4h;配制5%的BSA溶液(10mL MES溶液+0.5g BSA);施加磁场,将上清移去,迅速向管中加入BSA封闭液,25℃温和旋转30min;借助磁力架,用PBS将磁珠清洗三次;向管中转移保存液,将磁珠悬起,4℃保存。
根据本发明的一个实施方案,上述HBV病毒粒子捕获为样本中加入抗体磁珠偶联物,混匀,在25℃条件下结合40min进行病毒粒子捕获。
进一步,所述HBV病毒粒子捕获为取已偶联好的抗体磁珠保存液,磁力分离弃上清,PBS洗涤两次;取细胞上清或乙肝患者血清至EP管中,PBS稀释;向稀释的样本中加入抗体磁珠偶联物,混匀,25℃旋转结合40min进行病毒粒子捕获(复合物)。
根据本发明的一个实施方案,上述实时荧光定量PCR的程序为50℃UNG酶反应2min,1个循环;94℃Taq酶活化5min,1个循环;94℃变性15s,45个循环;57℃退火、延伸、荧光采集30s,45个循环;25℃仪器冷却10s,1个循环。
上述实时荧光定量PCR为:捕获的复合物用50μL PBS重悬后,转移到PCR 8联管中,借助PCR板磁力架,去上清;将所需试剂提前避光放置室温,设置标准品A-D、阴、阳性对照,8联管每孔加5μL样本释放剂,瞬时离心,敲打混匀,避光静置10min;制备PCR混合液,每人份:38μL反应液+2μL酶混合液+0.2μL内标;按照以下程序进行QPCR循环扩增检测:50℃UNG酶反应2min,1个循环;94℃Taq酶活化5min,1个循环;94℃变性15s,45个循环;57℃退火、延伸、荧光采集30s,45个循环;25℃仪器冷却10s,1个循环。
有益效果:
灵敏快捷的病毒检出方法对疾病的诊断是至关重要的。目前为止,实验室常用的对HBV病毒颗粒富集、分离的方法主要包括:超速离心法与PEG8000沉淀法。虽然超速离心法已被认为是一种较成熟的病毒分离、浓缩的方法,但仍存在耗时长,与PCR的兼容性差(假阳性数量增多)、降低病毒感染性等问题(Kobayashi S,Natori K,Takeda N,etal.Immunomagnetic capture rt-PCR for detection of norovirus from foodsimplicated in a foodborne outbreak[J].Microbiol Immunol,2004,48(3):201–204)。与之相比,沉淀法更加简单易行,但也会干扰随后的PCR扩增(J,SvobodováJ,LA,et al.A method for the preparation of purified antigens ofcoxsackievirus B3 from a large volume of cell culture supernatant[J].ActaVirol,1992,36(5):483–487)。故开发出新的操作更简单、兼容性更好的病毒富集、分离的检测方法是必要的。
本发明提供一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法,以羧基磁珠为介质,将特异性抗体与羧基磁珠偶联,进行病毒颗粒捕获分离,再进行QPCR检测。实验显示,本发明方法可以成功将样本中的病毒颗粒捕获分离,并且因磁珠偶联抗体的不同,可以将样本中不同组分的病毒颗粒区分。除此之外,随着加入的样本量与抗体-磁珠复合物的增加,可以达到病毒富集的效果。令人惊喜的是,通过本发明捕获方法,意外发现细胞上清、血清中病毒粒子成分有所不同,在细胞中NCs颗粒占较大比例,而血清中主要为HBV Dane颗粒,尤其是在高滴度血清载量时该现象尤为明显。细胞上清中NCs颗粒的高占比可能解释了细胞上清收集到的病毒感染性较低的原因。血清中NCs颗粒含量低的原因可能是因为大多数HBV感染患者的血液循环中具有强效和持久的抗核心抗体,因此,高免疫原性裸衣壳非常迅速地被清除。而且随着血清中HBV DNA拷贝数的增加,其血清中完整病毒颗粒的含量呈明显上升趋势,提示完整病毒颗粒的检测可能作为新的血清标志物。本发明具有重要的实用价值,值得临床大力推广。
附图说明
图1是现有技术的HBV检测方法分析图;
图2是偶联所需抗体梯度优化结果图;
图3是捕获病毒验证结果图;
图4是病毒捕获方法验证结果图;
图5是BC组病毒捕获体系优化结果图;
图6是BS组病毒捕获体系优化结果图;
图7是HepG2.2.15细胞中病毒粒子含量结果图;
图8是HepAD38细胞上清中病毒粒子含量结果图;
图9是血清样本中病毒粒子含量结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细地说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。本发明所用原料及试剂均为市售产品。除特殊说明外,本发明所采用的百分数均为重量百分数。
主要试剂
主要仪器设备
主要耗材
主要试剂配制
实施例1
抗体-磁珠偶联
(1)剧烈震荡羧基磁珠,使其分散均匀。取3.3mg磁珠至2mL EP管中,磁力分离,用预冷MES缓冲液洗涤3次;
(2)施加磁场,去上清,将100μL NHS与等量EDC溶液迅速加入EP管中,剧烈震荡,25℃持续活化磁珠30min;
(3)借助磁力架,用预冷的MES溶液洗涤磁珠3次,并尽快用于抗体偶联;
(4)将待偶联的抗体用预冷MES溶液稀释至抗体终浓度约为0.6g/L,100μL;
(5)活化好的磁珠用100μL MES溶液重悬,剧烈摇晃,保证磁珠全部分散;
(6)每次取20μL活化磁珠悬液,分5次将活化磁珠悬液缓慢加入稀释好的抗体悬液中,每次加入磁珠后,立即温和混匀,4℃,温和旋转混匀4h;
(7)配制5%的BSA溶液(10mL MES溶液+0.5g BSA);
(8)施加磁场,将上清移去,迅速向管中加入200μL BSA封闭液,25℃温和旋转30min;
(9)借助磁力架,用PBS将磁珠清洗三次;
(10)向管中转移120μL保存液,将磁珠悬起,4℃保存。
HBV病毒粒子的捕获
(1)取5μL上述已偶联好的抗体磁珠保存液,磁力分离弃上清,PBS洗涤两次;
(2)取细胞上清或乙肝患者血清5μL至2mL EP管中,PBS稀释至体系为500μL;
(3)向(2)中制好的样本中加入抗体磁珠偶联物,混匀,25℃旋转结合40min;
(4)施加磁场后,弃上清。将洗涤后的捕获物用PBS重悬,之后根据目的不同采用westernblot、QPCR等进行分析。
实时荧光定量PCR
(1)按上述方法捕获病毒,磁力分离,PBS 200μL洗涤2次;
(2)捕获的复合物用50μL PBS重悬后,转移到PCR 8联管中,借助PCR板磁力架,去上清;
(3)将所需试剂提前避光放置室温,方便后续使用;
(4)设置标准品A-D、阴、阳性对照,8联管每孔加5μL样本释放剂,瞬时离心,敲打混匀,避光静置10min;
(5)制备PCR混合液,每人份:38μL反应液+2μL酶混合液+0.2μL内标;
(6)QPCR循环参数设置
(7)运行。
核酸电泳
(1)配制1%的核酸凝胶;
(2)将上述QPCR产物作为样本,全部上样;
(3)恒压120V,20min;
(4)凝胶成像仪紫外拍照分析。
结果
病毒捕获原则
为了较特异的将HBV感染者体内不同的病毒颗粒分离出来,本发明开发了一种基于抗原抗体相互作用的免疫方法来捕获、分离不同的病毒粒子。据文献报道,PreS1被认为是HBV Dane特有的结构,NC颗粒因其基因组直接被HBc蛋白包裹形成核衣壳而未被包膜化,故可用HBc单克隆抗体对其进行识别。基于这一原理,发明人用分别偶联有PreS1、HBc鼠单克隆抗体的羧基磁珠与HBV患者血清孵育。在适当比例下,单克隆抗体与包膜蛋白或衣壳蛋白上相应的抗原形成复合物,磁力分离,弃上清,此时病毒被成功捕获到磁珠上,相应buffer重悬磁珠,用于后续相关实验研究。
磁珠偶联抗体浓度优化
不同的抗体由于其种类及氨基数量不同,与磁珠结合达到饱和时的浓度也不同。为了避免因磁珠偶联抗体量不同而造成的抗原捕获量的差异,首先对羧基磁珠偶联抗体所需浓度进行了优化。该实验所用的磁珠、PreS1抗体、HBc抗体浓度分别为2mg/mL、1mg/mL、2.7mg/mL。根据商品化羧基磁珠说明书推荐,18μg抗体可饱和1mg羧基磁珠。以此为标准,分别采用18μg、36μg、54μg、72μg、90μg、108μg的HBc抗体与1mg羧基磁珠偶联,将HBc抗体-磁珠偶联物及抗体偶联后的上清进行取样,考马斯亮蓝染色后对结果进行分析。如图2a)所示,当抗体的添加量增加时,其复合物中检测到的HBc抗体条带也逐渐加深。图2b)中,当HBc抗体量为54μg时(lane 3),上清开始出现抗体条带,且条带的深浅趋势与加入的抗体总量、复合物中的Ab量一致,暗示着54μg HBc抗体可以饱和1mg羧基磁珠。本着节约试剂的原则,后续选用54μg HBc抗体与羧基磁珠偶联。基于同样的优化方法,图2c)显示,1mg羧基磁珠达到饱和所需的PreS1抗体约为18μg。
HBV病毒捕获方法验证
为了验证该磁珠(偶联有抗体)是否可以有效捕获HBV血清中核酸型的病毒粒子,对捕获产物进行QPCR定量后,以QPCR产物为样本进行核酸电泳。如图3,核酸结果显示,BP组(lane 2用偶联有无关抗体的磁珠捕获病毒)无目的条带,而BS组(lane 3用偶联有PreS1抗体的磁珠捕获病毒)、BC组(lane 4用偶联有HBc抗体的磁珠捕获病毒)与阳性对照组(lane5)均在100bp左右出现目的条带。综上,该课题建立的捕获体系是可行的。为了进一步验证该方法的特异性,以重组GST-PreS1蛋白、HBc蛋白的特异性抗体为探针,利用免疫印迹法对捕获物中的HBV病毒成分进行检测。HBV DNA型的NCs颗粒主要由HBc蛋白与HBV DNA组成,与之相比,HBV Dane颗粒还包含最外层的表面蛋白(S、M、L蛋白)。如图4,与阴性对照BP组相比,BS组在42kD处检测出PreS1蛋白(图a lane 4)(因为GST-PreS1不稳定,易降解,因此抗体纯度相比之下稍低),约20kD处检测到HBc蛋白(图blane 4),说明BS组捕获的病毒颗粒包含LHBs与HBc蛋白,结合核酸电泳结果,提示这部分病毒颗粒为HBV Dane颗粒。而BC组仅在约20kD处检测到目的条带(图b lane 5),提示BC组可捕获NCs颗粒。总的来说,本发明开发的新捕获体系不仅可行,且具有较高的特异性。
HBV病毒捕获体系优化
基于抗原抗体反应的比例性原则,在对血清中HBV病毒颗粒的含量进行分析前,首先优化了抗原抗体反应所需最佳比例,以确保血清标本中不同成分病毒粒子被完全捕获。以一系列梯度体积(5μL、10μL、20μL、50μL、100μL)的107HBV DNA患者血清为样本,加入5μL抗体-磁珠复合物,病毒捕获40min,施加磁场,待磁珠用PBS清洗后,借助圣湘HBV核酸定量试剂盒对捕获物进行QPCR分析。图5、图6可以看出,BC组与BS组捕获产物的HBV拷贝数均随加入的血清体积的增加而呈上升趋势,表明5μL抗体-磁珠可以将血清中相应的病毒粒子完全捕获。本着微量的原则,后续实验将采用统一的捕获体系:5μL HBV标本(用500μL PBS稀释),5μL抗体-磁珠悬液。
不同HBV病毒粒子在细胞上清中的含量
为了研究不同组分HBV DNA的动态变化,在HepG2.2.15与HepAD38两种稳定表达HBV的细胞系中,分别予以不同浓度梯度ETV(0.1μM、1μM、10μM及PBS对照组)预处理,24h后弃上清,代之以新鲜DMEM及不同浓度梯度的ETV。72h后将上清转移至EP管,分别用PreS1抗体-磁珠、HBc抗体-磁珠捕获上清中的病毒粒子后,对捕获产物进行QPCR检测。检测结果显示,当用ETV处理HepG2.2.15细胞后,上清液中HBV DNA的拷贝数以剂量依赖的方式减少(图7),且BC组与BS组来源的HBV DNA拷贝数不同,BC组来源的DNA整体高于BS组,BC组DNA拷贝数的下降趋势与HBV DNA一致。以上研究成果意味着该捕获方法可以分离、捕获细胞上清中的病毒粒子。惊喜的是,该实验意外发现细胞上清中的HBV DNA可能主要来源于NCs颗粒,而HBV Dane颗粒的含量相对较少。在HepAD38细胞实验也得到相同结论(图8)。
外周血中不同HBV病毒粒子的含量
为了进一步探讨HBV不同病毒粒子在外周血中的含量,随机选取56例不同滴度的病人血清进行检测,如图9,QPCR结果显示,除个别病人外,与BC组相比,血清中BS组DNA含量较高,尤其是在高滴度血清载量时该现象尤为明显,而且随着血清中HBV DNA拷贝数的增加其血清中完整病毒颗粒的含量明显增加。
Claims (9)
1.一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法,包括抗体-磁珠偶联、HBV病毒粒子捕获和实时荧光定量PCR步骤,其特征在于:所述抗体-磁珠偶联为在缓冲液中将羧基磁珠、NHS与等量EDC混合反应以活化磁珠,在偶联缓冲液中将活化的磁珠与抗体混合反应,得到抗体-磁珠偶联反应物;所述抗体选自PreS1抗体或/和HBc抗体。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:抗体-磁珠偶联步骤中磁珠活化的温度为25℃。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:待偶联的抗体用MES溶液稀释,抗体终浓度为0.6g/L。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述抗体-磁珠偶联步骤为:取磁珠至EP管中,磁力分离,用MES缓冲液洗涤3次;施加磁场,去上清,将NHS与等量EDC溶液迅速加入EP管中,剧烈震荡,25℃持续活化磁珠30min;借助磁力架,用MES溶液洗涤磁珠3次;将待偶联的抗体用MES溶液稀释至抗体终浓度为0.6g/L;活化好的磁珠用MES溶液重悬,剧烈摇晃,保证磁珠全部分散;取活化磁珠悬液,分5次加入稀释好的抗体悬液中,每次加入磁珠后,立即混匀,4℃,旋转混匀4h;配制5%的BSA溶液;施加磁场,将上清移去,迅速向管中加入BSA封闭液,25℃旋转30min;借助磁力架,用PBS将磁珠清洗三次;向管中转移保存液,将磁珠悬起,4℃保存。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于:所述HBV病毒粒子捕获为样本中加入抗体磁珠偶联物,混匀,在25℃条件下结合40min进行病毒粒子捕获。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于:所述HBV病毒粒子捕获为取已偶联好的抗体磁珠保存液,磁力分离弃上清,PBS洗涤两次;取细胞上清或乙肝患者血清至EP管中,PBS稀释;向稀释的样本中加入抗体磁珠偶联物,混匀,25℃旋转结合40min进行病毒粒子捕获。
7.如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于:所述实时荧光定量PCR的程序为50℃UNG酶反应2min,1个循环;94℃Taq酶活化5min,1个循环;94℃变性15s,45个循环;57℃退火、延伸、荧光采集30s,45个循环;25℃仪器冷却10s,1个循环。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述实时荧光定量PCR为:捕获的复合物用50μL PBS重悬后,转移到PCR 8联管中,借助PCR板磁力架,去上清;将所需试剂提前避光放置室温,设置标准品A-D、阴、阳性对照,8联管每孔加5μL样本释放剂,瞬时离心,敲打混匀,避光静置10min;制备PCR混合液,每人份:38μL反应液+2μL酶混合液+0.2μL内标;按照以下程序进行QPCR循环扩增检测:50℃UNG酶反应2min,1个循环;94℃Taq酶活化5min,1个循环;94℃变性15s,45个循环;57℃退火、延伸、荧光采集30s,45个循环;25℃仪器冷却10s,1个循环。
9.一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法,采用如下步骤:
(1)抗体-磁珠偶联:取磁珠至EP管中,磁力分离,用MES缓冲液洗涤3次;施加磁场,去上清,将NHS与等量EDC溶液迅速加入EP管中,剧烈震荡,25℃持续活化磁珠30min;借助磁力架,用MES溶液洗涤磁珠3次;将待偶联的抗体用MES溶液稀释至抗体终浓度为0.6g/L;活化好的磁珠用MES溶液重悬,剧烈摇晃,保证磁珠全部分散;取活化磁珠悬液,分5次加入稀释好的抗体悬液中,每次加入磁珠后,立即混匀,4℃,旋转混匀4h;配制5%的BSA溶液;施加磁场,将上清移去,迅速向管中加入BSA封闭液,25℃旋转30min;借助磁力架,用PBS将磁珠清洗三次;向管中转移保存液,将磁珠悬起,4℃保存;
(2)HBV病毒粒子捕获:取已偶联好的抗体磁珠保存液,磁力分离弃上清,PBS洗涤两次;取细胞上清或乙肝患者血清至EP管中,PBS稀释;向稀释的样本中加入抗体磁珠偶联物,混匀,25℃旋转结合40min进行病毒粒子捕获;
(3)实时荧光定量PCR:捕获的复合物用50μL PBS重悬后,转移到PCR 8联管中,借助PCR板磁力架,去上清;将所需试剂提前避光放置室温,设置标准品A-D、阴、阳性对照,8联管每孔加5μL样本释放剂,瞬时离心,敲打混匀,避光静置10min;制备PCR混合液,每人份:38μL反应液+2μL酶混合液+0.2μL内标;按照以下程序进行QPCR循环扩增检测:50℃UNG酶反应2min,1个循环;94℃Taq酶活化5min,1个循环;94℃变性15s,45个循环;57℃退火、延伸、荧光采集30s,45个循环;25℃仪器冷却10s,1个循环。
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