KR101857417B1

KR101857417B1 - 효소면역기법을 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법

Info

Publication number: KR101857417B1
Application number: KR1020160024487A
Authority: KR
Inventors: 양동군; 조현례; 김하현; 조인수; 장상호; 전은성; 이상오
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-02-29
Filing date: 2016-02-29
Publication date: 2018-05-15
Also published as: KR20170101655A

Abstract

본 발명은 2차 정제 단계를 포함하는 효소면역기법용 항원의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 항원 및 상기 항원을 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 효소면역기법용 항원 및 이를 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법에 따르면 일본뇌염바이러스를 2차 정제하여 다량의 돼지 혈청에 대한 전처리 과정 없이 신속하게 일본뇌염바이러스에 대한 항체가를 확인할 수 있으므로 동물에서 일본뇌염바이러스 감염증의 위험성을 크게 줄일 수 있다는 장점이 있다.

Description

효소면역기법을 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법{A diagnostic method to measure antibody against Japanese encephalitis virus using an enzyme linked immunosorvent assay (ELISA)}

본 발명은 2차 정제 단계를 포함하는 효소면역기법용 항원의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 항원 및 상기 항원을 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법에 관한 것이다.

일본뇌염(Japanese encephalitis)은 플라비비리대(Flaviviridae)에 속하는 일본뇌염바이러스가 원인체이며, 파충류, 왜가리와 같은 양생 조류뿐만 아니라 돼지, 말 닭에 감염증을 유발할 수 있다. 특히, 돼지는 일본뇌염바이러스를 증폭하는 숙주로 알려져 있기 때문에 매년 모기발생 이전에 예방접종을 실시하고 있다. 비록 일본뇌염바이러스로 감염된 성돈과 비육돈은 임상증상이 뚜렷하게 나타나지 않지만, 감염된 임신 모돈은 조산, 사산 등의 번식장애 질병을 일으킨다.

일본뇌염바이러스는 국내에서 1935년 최초로 미국 군인에서 확인되었으며, 1969년 허약자돈으로부터 분리되었다. 바이러스 분리는 주로 모기에서 확인되었으며, envelop (E) 유전자의 변이를 바탕으로 5개의 유전자형으로 분류하고 있다. 국내에서는 1990년도 이전에는 주로 유전자 3형이 발생하였고 그 이후에는 1형이 분리되고 있으며, 최근 2010년에는 유전자 5형이 발견되기도 하였다. 일본뇌염은 주로 아시아 지역에서 발생하는 것으로 알려져 있으나, 2011년 이탈리아의 모기에서 일본뇌염을 확인하였으며, 프랑스인의 1.3%가 일본뇌염의 항체를 보유하는 것으로 나타나 이제는 아시아지역 뿐만 아니라 유럽에서도 발생하고 있는 것을 알 수 있다.

또한, 일본뇌염바이러스는 크기가 40 ~ 50 ㎚로 외막을 가지는 구형 바이러스이다. 게놈 분석에 따르면 일본뇌염바이러스는 단일가닥의 양성-극성 RNA 바이러스로서 지질 외막이 바이러스의 캡시드 코어를 둘러싸고 있다. 게놈 분석에 따르면 일본뇌염바이러스는 약 11 kb 크기의 RNA 게놈을 가지며 하나의 긴 ORF(Open reading frame)를 암호화하고 있으며, 게놈의 양쪽 끝에 바이러스의 복제, 전사 및 해독에 관여하는 95개의 뉴클레오티드로 구성되는 5'-NTR(non-translated region)과 574개의 뉴클레오티드로 구성되는 3'-NTR 2개의 시스-작용 인자(cis-acting factor)가 위치하고 있다. 특히 일본뇌염바이러스의 RNA 게놈 중 5' 말단에 I 캡 구조를 가지고 있는 반면, 3' 말단에는 폴리 A 꼬리(poly (A) tail)가 없는 것이 특징이다.

일본뇌염바이러스의 ORF는 하나의 긴 다-단백질(poly-protein)로 발현되며 번역과 동시에 또는 번역 후 프로세싱에 의해 최소한 3개의 구조 단백질(structural protein)과 7개의 비구조단백질(nonstructural protein, NS)이 합성된다. 구조 단백질은 5' 말단에서부터 보면 캡시드(capsid, C), 전-멤브레인(premembrane, pM) 및 외피(envelope, E) 순으로 암호화되어 있는데, 특히 외피 단백질은 바이러스 표면의 당단백질로서, 바이러스의 어셈블리(assembly) 과정에서 당화(glycosylation) 및 이합체화(dimerization)가 일어나서, 숙주 세포 수용체로의 바이러스의 부착, 특이적 막-융합, 적혈구 응고 억제, 항-융합(anti-fusion) 항체의 유도 및 바이러스에 대한 중화 항체의 생성 등에 관여한다.

또한, 바이러스의 자기복제에 필수적인 자기복제 효소 (replicase)로 구성된 7개의 비구조적 단백질들은 NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5순으로 암호화되어 있는데, 그 중에서 NS3는 헬리카아제(helicase)/세린 프로테아제(serine protease)/NTPase 등 다양한 기능을 가지고 있으며, NS5는 RNA 중합효소의 기능을 갖는 것으로 알려져 있다.

공지된 일본뇌염의 항체를 검사하는 방법에는 바이러스 중화시험 (virus neutralization: VN), 플라크 감소중화시험 (Plaque reduction neutralization test: PRNT), 혈구응집억제시험 (hemagglutination inhibition test: HI), 보체결합반응(complement fixation test) 등이 있다. 바이러스 중화시험은 정확하지만, 실험실 내에서 사용하는 방법으로 세포배양과 관련된 장비 및 숙련된 사람이 필요하며, 플라크 감소중화시험은 표준혈청검사법으로 알려져 있으나, 바이러스 중화시험과 비슷하고 추가적으로 아가로오스(agarose) 및 염색해야 하는 과정이 추가되므로 복잡한 실험방법이라는 단점이 있다. 혈구응집억제시험법은 혈구응집용 일본뇌염바이러스 항원과 거위 적혈구가 필요하며 비특이 반응을 제거하기 위하여 25%의 카올린과 거위혈구 처리가 필요하므로 번거롭다. 또한, 보체결합반응을 이용한 항체검사는 비특이 반응이 많으며, 효소면역반응법에 의한 일본뇌염 바이러스에 대한 항체법은 상용화 되어 있지 않다.

일본뇌염바이러스에 대한 항체검출을 위해서는 일본뇌염바이러스의 비구조단백질 (non-structural protein 1; NS1)에 대한 항체를 검출하는 것이 이상적이지만, 국내에서는 일본뇌염 생백신을 접종하기 때문에 야외 모기에 의해 감염된 항체와 백신접종에 의한 항체를 감별할 수 없다. 따라서 실험실내에서 일본뇌염바이러스를 사용하지 않고 신속하고 편리하며 특이도와 민감도가 높은 항체검출기법이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 정제한 일본뇌염바이러스를 항원으로 하여 효소면역기법을 개발한 결과 돼지에서 일본뇌염바이러스에 대한 혈중 항체를 검사할 수 있는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 배양 세포에 일본뇌염바이러스를 접종하여 증식시킨 후 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 일본뇌염바이러스를 필터를 이용하여 1차 정제하는 단계; 및 (c) 상기 1차 정제된 일본뇌염바이러스를 수크로오스를 이용하여 2차 정제하는 단계;를 포함하는 효소면역기법용 항원의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 효소면역기법용 항원의 제조 방법에 의해 제조된 효소면역기법용 항원 및 이를 포함하는 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 (a) 생물학적 시료를 일본뇌염바이러스 항원과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시료 중 상기 일본뇌염바이러스의 항원과 결합된 항체의 존재를 효소면역기법에 의하여 검출하는 단계를 포함하는 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 배양 세포에 일본뇌염바이러스를 접종하여 증식시킨 후 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 일본뇌염바이러스를 필터를 이용하여 1차 정제하는 단계; 및 (c) 상기 1차 정제된 일본뇌염바이러스를 수크로오스를 이용하여 2차 정제하는 단계;를 포함하는 효소면역기법용 항원의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 효소면역기법용 항원의 제조 방법에 의해 제조된 효소면역기법용 항원을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항원을 포함하는 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료를 일본뇌염바이러스 항원과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시료 중 상기 일본뇌염바이러스의 항원과 결합된 항체의 존재를 효소면역기법에 의하여 검출하는 단계를 포함하는 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 효소면역기법용 항원 및 이를 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법에 따르면 일본뇌염바이러스를 2차 정제하여 다량의 돼지 혈청에 대한 전처리 과정 없이 신속하게 일본뇌염바이러스에 대한 항체가를 확인할 수 있으므로 동물에서 일본뇌염바이러스 감염증의 위험성을 크게 줄일 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 효소면역기법용 항원의 제조 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 2차 정제한 일본뇌염바이러스에 대해 웨스턴 블롯팅으로 단백질을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 효소면역기법에서 일본뇌염바이러스 항원의 최적 농도를 결정하기 위한 실험의 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 효소면역기법에서 시료인 혈청의 최적 희석배수를 결정하기 위한 실험의 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 효소면역기법에서 최적 콘주게이트의 배수를 결정하기 위한 실험의 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 바이러스 중화시험, 혈구응집억제시험 및 플라크 감소중화시험의 결과와 본 발명에 따른 효소면역기법의 결과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 배양 세포에 일본뇌염바이러스를 접종하여 증식시킨 후 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 일본뇌염바이러스를 필터를 이용하여 1차 정제하는 단계; 및 (c) 상기 1차 정제된 일본뇌염바이러스를 수크로오스를 이용하여 2차 정제하는 단계;를 포함하는 효소면역기법용 항원의 제조 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명의 효소면역기법용 항원의 제조 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이며 이하, 본 발명의 방법 중 각 단계에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명의 (a) 단계는 배양 세포에 일본뇌염바이러스를 접종하여 증식시킨 후 배양하는 단계이다.

본 발명에서 “일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus)”는 플라비비리대에 속하며 돼지에 감염되어 일본뇌염을 발생시킬 수 있는 바이러스를 제한없이 포함하나, 바람직하게는 KV1899-120P(기탁번호 KCTC18347P)주를 포함한다. KV1899-120P주는 1999년에 돼지 혈액으로부터 분리된 일본뇌염 바이러스를 여러 가지 배양 세포에서 120대 계대 및 증식하여 얻은 바이러스주로, 120대 계대 및 증식을 통해 최초 분리주와 비교하여 아미노산 및 핵산 서열에 변화가 발생하였으며 이로 인해 환경에 적응하고 증식이 빠르다는 장점이 있다.

상기 KV1899-120P 바이러스의 prME, NS1 부위의 유전체 염기서열 분석결과는 서열번호 1과 같다. 일본뇌염바이러스의 유전체는 RNA이므로 서열번호 1의 DNA서열은 RNA서열로부터 DNA로 전환된 것이며, KV1899-120P의 전체 유전체 서열이다.

본 발명에서 배양 세포는 당업계에 일본뇌염바이러스의 감염 또는 증식에 사용되는 것으로 알려진 세포일 수 있다. Vero 세포(African green monkey kidney cell), BHK-21(baby hamster kidney cell) 및 PK15 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 Vero 세포이다. Vero 세포는 일본뇌염바이러스의 증식 효율이 높으며 취급이 어렵지 않다는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 배양기 내에서 90% 증식시킨 Vero 세포에 KV1899-120P 주를 접종하고 세포변성효과를 확인하고 이를 증식시킨 후 바이러스를 배양하였으며, 이에 대해 1차 정제 단계를 수행하였다.

배양 후 1차 정제 단계 수행 전에는 원심분리하여 죽은 세포 또는 죽어가는 세포의 잔여물을 제거할 수 있다.

본 발명의 (b) 단계는 상기 배양된 일본뇌염바이러스를 필터를 이용하여 1차 정제하는 단계이다.

상기 필터는 100 kDa 내지 300 kDa의 크기를 여과할 수 있다. 본 발명의 일 실시 예에서는 100 kDa의 여과 필터가 장착된 펌프를 이용하여 일본뇌염바이러스를 1차로 농축하였다.

본 발명의 (c) 단계는 상기 1차 정제된 일본뇌염바이러스를 수크로오스를 이용하여 2차 정제하는 단계이다.

상기 수크로오스는 상기 (b) 단계에 따라 1차 정제된 일본뇌염바이러스 여과액에 남아있는 잔여 세포 성분을 제거하기 위하여 10% 내지 60%의 수크로오스를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 10% 농도의 수크로오스 용액 및 50% 농도의 수크로오스 용액을 사용하였으나, 10% 내지 60%로 농도를 구배하여 사용할 수 있다.

적절한 농도의 수크로오스 용액에 1차 정제된 일본뇌염바이러스를 넣고 원심분리하면 일본뇌염바이러스 항원이 모이게 되고, 이를 회수하여 정제 농축된 효소면역기법의 항원으로 사용할 수 있다. 더욱 정제된 항원을 얻기 위해서는 상기 (c) 단계 수행 후, (c) 단계를 반복하여 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 효소면역기법용 항원은 2차 정제단계를 거쳐 고도로 정제 및 농축된 것을 특징으로 하므로, 효소면역기법 수행 시 높은 상관관계(r)의 값을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항원을 포함하는 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출용 효소면역기법 키트를 제공한다.

본 발명에서 용어 효소면역기법(enzyme linked immunosorvent assay (ELISA))은 비색법, 화학발광법 및 형광분석법에 기초하는 것을 포함한다. 효소면역기법은 혈장 및 뇨를 포함하는 시료 중 소량의 약물 및 기타 항원 성분 측정시에 성공적으로 적용되어 왔으며, 수행이 간편하다는 장점이 있다.

상기 “생물학적 시료”는 임의의 동물, 예컨대 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원용, 스포츠용 또는 애완용 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물, 바람직하게는 돼지로부터 분리된 신체 시료를 지칭한다. 일 실시예에서, 상기 생물학적 시료는 일본뇌염바이러스에 감염된 동물로부터의 시료이다.

상기 시료는 생물학적 체액, 예컨대, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 소포액, 정액, 양수액, 젖, 전혈, 뇨, 뇌-척수액, 타액, 객담, 눈물, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지 뿐만 아니라, 균질화된 조직, 종양 조직, 및 세포 추출물과 같은 조직 추출물을 포함한다. 바람직하게, 시료는 동물로부터 분리된 혈청이다. 본 발명에서 상기 혈청은, 동물로부터 얻어진 혈액으로부터 혈괴를 제거하고 얻어진 상층액을 사용하되 용혈된 혈청은 제외하는 것이 바람직하다.

일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출을 위해서, 생물학적 시료를 본 발명의 효소면역기법용 항원과 접촉시킨다. 상기 항원은 지지체에 코팅(고정화)된 형태일 수 있다.

상기 항원은 2 μg/mL로 지지체에 코팅되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 코팅(고정화)은 통상적으로, 분석 절차에 앞서 수-불용성 매트릭스 또는 표면으로의 흡착에 의해 또는 비-공유 또는 공유 커플링에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 질산 및 환원제로 지지체를 미리 활성화시키거나 활성화시키지 않은 채로, 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드 가교를 사용하여 포획 시약들을 불용화시키거나, 또는 분석 절차 후에 예로서, 면역침전법에 의해 포획 시약들을 불용화시킴으로써 달성된다.

고정화를 위해 사용되는 고체상은, 예를 들어, 표면, 입자, 다공성 매트릭스 등의 형태의 지지체를 비롯한, 필수적으로 수-불용성이고 면역분석 측정법에서 유용한 임의의 불활성 지지체 또는 담체일 수도 있다. 통상적으로 사용되는 지지체의 예는 작은 쉬트, 세파덱스, 폴리비닐 클로라이드, 플라스틱 비드, 및 96-웰 플레이트를 포함하여 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로부터 제조된 분석 플레이트 또는 시험관 뿐만 아니라, 예로서, 여과지, 아가로스, 가교된 덱스트란 및 기타 다당류와 같은 입상 물질을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 96-웰 플레이트를 고체상으로 하여 항원을 4℃에서 12시간 동안 코팅하였고, 코팅액으로는 NaCO₃(1.59 g), NaHCO₃(2.93 g)의 시약을 1,000 mL 녹여 pH가 9.6이 되도록 하여 사용하였다.

효소면역기법의 플레이트에 항원을 코팅하고 나머지 부분을 정지하기 위하여 0.05% PBST (Na₂HPO₄(1.15 g), NaCl(8 g), KCl (0.2 g), KH₂PO₄(0.2 g), pH 7.2)를 만들고, 이 PBS에 0.05% Tween 20, 1% 카세인(casein)과 ProClin300을 15 ppm의 농도로 추가하여, 정지 시약(정지 완충액)을 제조하여 사용하였으나 5% 스킴 밀크 또는 5% 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 사용할 수 있다.

효소면역기법의 플레이트를 세척하기 위하여는 바람직하게 Na₂HPO₄(1.15 g), NaCl(8 g), KCl (0.2 g), KH₂PO₄(0.2 g), Tween 20 (0.5 mL) 넣고 1,000 mL이 되도록 만들어 세척액으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 효소면역기법에서 1차 항체로 돼지의 혈청을 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시 예에서는 효소면역기법에 사용되는 혈청의 최적 희석 배수를 20배 내지 200배, 바람직하게는 100배인 것으로 확인하였다.

본 발명의 효소면역기법에서 2차 항체(콘주게이트)로 peroxidase conjugated anti-swine IgG를 사용할 수 있고, 이를 사용하는 경우 최적 사용량은 10 ng 내지 20 ng, 바람직하게는 10 ng임을 본 발명의 구체적인 실시예를 통해 확인하였다.

이후, 당업계에 공지된 효소면역기법에 따라 OD(Optical Density) 값을 측정하여 이를 분석하면, 간편하고 신속하게 동물에서 분리한 시료 중 일본뇌염바이러스의 항원과 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있는 효과가 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 일본뇌염바이러스의 증식 및 염기서열 분석

1-1 일본뇌염바이러스의 증식

일본뇌염바이러스를 증식시키기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다. KV1899-120P 바이러스주(수탁번호 KCTC18347P)는 1999년도에 경기도 돼지 농장에서 분리하여 여러 가지 세포를 이용하여 120대까지 계대한 것이다. KV1899-120P 바이러스주를 Vero 세포(African green monkey kidney cell)에 접종하였다.

바이러스를 접종하고 4일 후부터 특이적인 세포변성효과(Cytopathic effect: CPE)가 나타남을 확인하였고, 상기 세포에 대해 동결융해과정을 3회 실시한 후 바이러스 함량을 확인한 결과 10^7.0 TCID₅₀/mL 였고, 이를 이용해 다음 실험을 실시하였다.

1-2 일본뇌염바이러스의 염기서열 분석

Vero 세포에서 KV1899-120P 일본뇌염바이러스주의 N, M, E, NS1-5 유전자의 서열분석을 위해서, 하기의 표 1과 같이 12종의 프라이머 세트를 작성하였다. 제작된 프라이머 세트는 상업적으로 제작의뢰를 통해 올리고뉴클레오티드로 제작하였다(바이오니아, 대한민국).

Vero 세포에서 5대 계대한 KV1899-120P 일본뇌염바이러스주의 N, M, E 및 NS1-5 유전자를 상기 12종의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 후 클로닝하여 염기서열을 확인하였다.

유전자의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었으며, 확인 결과 유전자 염기서열의 ORF(open reading frame)는 10,963개의 뉴클레오티드로 구성되어 있음을 확인하였다.

이를 바탕으로 1999년도 분리하여 보고한 KV1899 1P 주와의 염기서열 및 아미노산의 상동성을 확인한 결과, 양 바이러스 서열 상 221개의 뉴클레오타이드가 차이가 있으며, 또한 연역된 아미노산을 비교한 결과 67개의 아미노산이 차이를 나타냄을 확인하였다.

120대 계대한 일본뇌염바이러스의 E 단백질은 500개의 아미노산으로 구성되어 있는데, 최초 분리주(KV1899 1P)와 비교하여 E73, E132, E138, E160, E179, E394 부분에서 6개의 아미노산이 변화되었으며, NS1-51, NS1-52, NS1-146, NS1-175, NS1-183, NS1-193, NS1-198, NS1-206, NS1-212, NS1-218, NS1-298, NS1-315, NS1-339 부분에서 13개의 아미노산이 변화된 것을 확인하였다.

즉, 120대 계대한 일본뇌염바이러스 KV1899-120P 주는 최초 분리주와 비교하였을 때 염기서열 및 아미노산의 변화가 생겼으며, 따라서 120대 계대 결과 증식 속도가 빠르고 증식 환경에 적응할 수 있다는 장점이 있다.

실시예 2: 일본뇌염바이러스 항체검사용 효소면역기법에 사용하기 위한 항원의 제조

2-1 일본뇌염바이러스의 증식

효소면역기법의 항원을 얻기 위해서는 많은 양의 일본뇌염바이러스가 필요하기 때문에 Vero 세포를 roller 배양기에 세포가 90% 증식할때까지 배양하였다. 일본뇌염바이러스(KV1899-120P주)를 상기 배양한 Vero 세포에 접종하고, 4-5일이 지난 이후에 바이러스를 수확하여 확인한 결과 10^7.0 TCID₅₀/mL를 나타냄을 확인하고, 500 mL의 일본뇌염바이러스를 확보하였다.

바이러스 배양액내에 남아있는 죽은 세포 또는 죽어가는 세포의 찌꺼기를 제거하기 위하여, 3,500 - 4,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다.

2-2. 일본뇌염바이러스의 정제

효소면역기법의 효율에 있어서 사용되는 항원의 정제가 매우 중요한 변수로 작용한다. 항원으로 사용하기 위한 일본뇌염바이러스를 농축 정제하기 위해서, 도 1에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 구체적으로, 1000 mL의 멸균된 플라스틱 용기에 상기 증식시킨 일본뇌염바이러스 500 mL를 넣은 후 얼음 위에 올려놓고, 100 kDa의 여과용 필터를 장착하고 펌프를 이용하여 100배 농축이 될 때까지 여과시킨 후 이를 수집하였다. 이와 같은 1차 정제 항원을 10,000 g에서 5분 동안 원심분리하여 침전물은 버리고 상층액을 2차 정제 단계에 사용하였다.

1차 정제 단계에서 얻어진 바이러스 농축액은 세포성분을 많이 포함하여 효소면역기법의 항원으로 사용하기에 적합하지 않기 때문에 추가적으로 수크로오스를 이용한 2차 정제를 수행하였다.

구체적으로, 분자량 10 kDa 이하의 물질을 제거하기 위하여 10 kDa이 투석되는 투석망(thermo scientific, slide-A lyser)에 상기 바이러스 농축액을 넣고 PBS로 하룻밤 투석하였다. 새로운 PBS로 3-4회 채워 투석을 실시한 후에 0.45 μm의 여과기를 통하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. GTNE 완충액(200 mM 글리신, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)을 이용하여 50%, 10%의 수크로오스 용액을 만들었다. 투명한 초원심 튜브에 50% 및 10%의 수크로오스를 각각 12 mL씩 넣어 준비한 후 일본뇌염바이러스 농축액 5 mL를 10%의 수크로오스 위에 올려놓은 후 초원심분리기를 이용하여 100,000 g에서 3시간 원심분리하여 바이러스를 정제하였다. 원심분리한 후 50%와 10% 사이에서 보이는 일본뇌염바이러스를 피펫을 이용하여 회수하였다. 회수한 이후에 상기와 같은 투석방법으로 한번 더 투석하였다.

투석하여 얻어진 일본뇌염바이러스를 Amicon ultra centrifugal filter를 이용하여 여과한 후 단백질 농도를 측정한 결과 전체 12 - 15 mg임을 확인하고 이를 수확하여 항원으로 사용하였다.

2-3. 일본뇌염바이러스 항원 확인

상기와 같이 2차에 걸쳐 농축 정제한 일본뇌염바이러스의 항원을 확인하기 위하여, 일본뇌염의 특이항체(마우스 특이항체: 4B42)를 이용하여 공지의 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 약 54 kDa 크기의 일본뇌염바이러스의 E 단백질을 확인할 수 있었다. 이후 이를 항원 평가를 위해 사용하였다.

2-4. 일본뇌염바이러스 항원의 최적 사용 농도 결정

상기 2-3에서 확인한 항원을 평가하기 위해서, 국내에서 사육하고 있는 돼지 175두에서 혈청을 준비하였다. 상기 혈청을 효소면역기법에서 표준혈청으로 사용하기 위해 혈청검사를 수행하였다. 혈구응집억제시험 결과를 통해서 20배 이상을 양성으로 확인하였다.

상기와 같이 확인한 10배 이상의 혈청을 이용하여 효소면역기법에 사용할 최적의 일본뇌염바이러스 항원농도를 설정하기 위하여, 항원을 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg/mL로 하여 96 well plate에 100 μl씩 분주하고, 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 코팅한 96 well plate를 200 μl의 PBST(Na₂HPO₄(1.15 g), NaCl(8 g), KCl (0.2 g), KH₂PO₄(0.2 g), Tween 20(0.5 mL)을 넣고 1,000 mL이 되도록 제조)로 2회 세척하였고, 1% 카세인(casein)이 함유되어 있는 정지 완충액(blocking buffer)[0.05% PBST 용액에 0.05% Tween 20, 1% 카세인과 ProClin300을 15 ppm의 농도로 추가하여 제조]을 이용하여 항원이 코팅되지 않은 부위를 정지하고, 실온에서 2시간 배양하였다. 돼지 혈청으로 3개의 양성혈청(혈구응집억제항체가 80배(HIU80), 혈구응집억제항체가 40배(HIU40))과 3개의 음성혈청(10배 이하 혈구응집억제항체 3개(HIU<10))를 100배 희석하여 100 μl를 적용하였다. 1시간 후에 PBST로 2회 세척하고, 2차 항체(콘주게이트)인 peroxidase conjugated goat anti-swine IgG를 10 ng으로 희석하여 100 μl를 적용하였다. 37℃에서 1시간 반응시키고, 100 μl의 발색제 (N-N tetra methylbenzidine)를 넣고 10분 후에 0.5 M 황산으로 발색을 정지하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 일본뇌염바이러스에 음성을 보인 혈청은 0.25 미만의 흡광도 값을 나타내었으며, 이를 통해 돼지 혈청에서 일본뇌염바이러스에 대한 효소면역기법에 사용할 최적 농도를 2 μg/mL로 설정하였다.

2-5. 일본뇌염바이러스 항체 검사를 위한 혈청의 최적 희석농도의 결정

읾본뇌염바이러스 항체 검사를 위한 혈청 희석배수를 결정하기 위하여, 상기 2-4에서 얻어진 결과를 바탕으로 96 well plate에 일본뇌염바이러스 항원을 2 μg/mL가 되도록 코팅하고, 일본뇌염바이러스에 혈구응집억제항체가 80배, 320배의 양성혈청과, 음성혈청 2개(혈구응집억제항체가 10배 이하)를 2배부터 2진 희석하여 100 μl 씩 적용하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 1시간 반응 이후에 PBST로 2회 세척하고, peroxidase conjugated goat anti-swine IgG, 발색제 및 발색정지 용액을 상기 2-4의 실험방법과 동일하게 실시하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 일본뇌염바이러스 음성혈청은 0.25 미만의 흡광도 값을 나타낸 반면, 일본뇌염바이러스 양성혈청은 80배의 혈청희석배수에서 1.3 이상의 흡광도를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 돼지 혈청에서 일본뇌염바이러스 항체를 검사하기 위한 최적의 혈청희석농도는 100배로 설정하였다.

2-6. 돼지 혈청의 콘주게이트 농도의 결정

상기에서 얻어진 결과를 바탕으로 96 well plate에 일본뇌염바이러스 항원을 2.0 μg/mL가 되도록 코팅하고, 일본뇌염바이러스에 혈구응집억제항체가 160배 2개, 혈구응집억제항체가 80배, 혈구응집억제항체가 40배, 혈구응집억제항체가 20배의 양성혈청과, 음성혈청 7개를 100 μl 씩 적용하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후에 PBST로 2회 세척하고, 콘주게이트 농도를 10, 20, 30, 40, 50 ng으로 하고, 발색제 및 발색정지 용액은 상기의 실험방법과 동일하게 실시하여 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 일본뇌염바이러스 음성혈청이 0.25이하의 흡광도 값을 나타내는 콘주게이트의 농도가 10 ng으로 나타남을 확인하였다. 따라서, 10ng의 농도를 최적의 콘주게이트 농도로 설정하였다.

실시예 3: 일본뇌염바이러스 혈청검사를 위한 효소면역기법의 민감도, 특이도, 정확도 확인

상기에서 얻어진 최적의 조건 하에서 수행한 효소면역기법으로 돼지 혈청에서 일본뇌염바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있는지 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 정제한 일본뇌염바이러스의 항원 2 μg/mL를 96 well plate에 100 μl씩 분주하고, 4℃에서 12시간 동안 코팅하고, 세척 후 175개의 돼지 혈청을 100배 희석한 후 100 μl 씩 적용하였다. 그 이후는 상기의 방법과 동일하게 실시하였다. 효소면역기법을 이용하여 얻어진 결과와 바이러스 중화시험, 혈구응집억제시험 및 플라크 감소중화시험에서 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2의 결과를 바탕으로 민감도, 특이도, 정확도를 다음과 같이 계산하였다.

상기와 계산한 바와 같이, 바이러스 중화시험, 혈구응집억제, 플라크 감소중화시험에서 특이도는 각각 94.7%, 92.2%, 94.7%를 나타내었으며, 민감도는 각각 95.0%, 91.8%, 94.7%를 나타내었고, 정확도는 각각 94.8%, 92.0%. 94.8%를 나타내었다.

또한 바이러스 중화시험, 혈구응집억제 및 플라크 감소중화시험법에서 얻어진 결과와 효소면역기법의 흡광도 결과를 바탕으로 상관관계를 확인한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, R²값은 바이러스 중화시험, 혈구응집억제 및 플라크 감소중화시험법에서 각각 0.908, 0.864, 0.846으로 나타났으며, 이를 다시 상관관계(r) 값으로 변환하였을 때 0.95, 0.93, 0.92로 확인되어 높은 상관관계를 나타내는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따라 정제된 일본뇌염바이러스를 항원으로 이용하여 효소면역기법을 수행한 결과, 대량의 돼지 혈청에서 혈청의 희석만으로 간단하게 일본뇌염바이러스에 대한 항체가를 확인할 수 있으므로, 동물의 일본뇌염바이러스의 감염증 위험성을 크게 감소시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

한국생명공학연구원

KCTC18347P

20150116

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> A diagnostic method to measure antibody against Japanese encephalitis virus using an enzyme linked immunosorvent assay (ELISA) <130> 1_70P <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10963 <212> DNA <213> japanese encephalitis virus KV1899-120P <400> 1 agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt 60 gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga aaaccatgac taaaaaacca ggagggcccg 120 ggaaaaaccg ggccatcaat atgctgaaac gcggattacc ccgcgtattc ccactagtgg 180 gagtgaagag ggtagtgatg agcttgttgg acggcagagg gccagtacga tttgtgctgg 240 ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttgggccgct 300 ggagagcagt ggaaaaaagt gtggcaatga aacatcttac cagtttcaaa cgagaacttg 360 gaacactcat cgacgccgtg aacaagcggg gcaaaaaaca aaccaaaaga ggagggaatg 420 aaagctcgat tatgtggctt gccagcttgg caatcgtaac agcctgtgcc ggagccatga 480 agctatcaaa ctttcaagga aagcttctga tgaccatcaa caacacggac attgcggacg 540 tcatcgtgat ccccacctca aaaggtgaaa acagatgttg ggtccgagca atcgacgttg 600 gttacatgtg tgaagacacc atcacgtacg aatgtccgaa gcttgccgtg ggcaacgatc 660 cggaagacgt ggactgctgg tgcgacaatc aagaagtcta cgtgcagtat ggtcgctgca 720 cacggaccag gcattccaaa cgaagcagaa gatccgtttc ggtccaaacg catggggaaa 780 gctcactagt gaacaaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaggccacg cgatacctca 840 tgaaaacgga gaactggatt ataaggaacc ctggttatgc tttcctggcg gcggcacttg 900 gatggatgct tggcagcaac agtggccaac gtgtggtgtt tactattctc ttgctgttgg 960 tcgctccggc ttacagtttc aactgtctgg gaatgggaaa tcgggatttc atagaaggag 1020 ccagtggagc cacttgggtg gatctggtgt tagaaggaga tagctgtttg acaatcatgg 1080 caaacgacaa accaacacta gatgtccgca tgatcaacat tgaagctagc caacttgctg 1140 aagtcaggag ttactgctac cacgcttcag tcacggacat ttcaacggtg gctcaatgcc 1200 ccacgactgg agaagcccac aacgaaaaac gtgctgacag cagctacgtg tgcaaacaag 1260 gctttactga ccgcggatgg ggaaatggat gtggactttt cgggaaagga agcattgaca 1320 catgcgcaaa attttcttgt accagtaagg ccattggaag aatgatccaa ccagagaaca 1380 tcaagtacaa ggttggcata ttcgtgcacg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt 1440 actcagcgca agtagaagcg tctcaagcag caaagtttac tgtgactcca aatgctccct 1500 caataaccct cacgcttggt gattatggag aagtcacact ggattgtgaa ccaaggagtg 1560 gactgaacac tgaagcgttc tatgtcatga ccgtgggttc gaagtcattc ttagtccata 1620 gggaatggtt ccatgacctt tctcttccct ggacgtcccc ctcaagcacg gcatggagaa 1680 acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cacatgccac aaaacaatct gtcgtagctc 1740 ttgggtcaca ggagggaggc ctccatcaag cgttggcagg agccatcgtg gtggagtact 1800 cgagctcagt gaagttgaca tcaggtcacc tgaaatgcag gctaaaaatg gacaaactgg 1860 ctctgaaggg cacgacttat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccag 1920 cggacacagg ccatggaaca gttgtcattg agctcacata ctctggaagt gatggtccct 1980 gtaaaattcc gattgtctca gtcgcgagtt taaacgacat gacccctgtg gggaggctgg 2040 taacagtaaa ccccttcgtc gcgacatcta gctccaactc aaaggtgctg gttgagatgg 2100 aacctccctt cggagactct tatatcgtgg ttggaagagg ggacaagcag attaaccaac 2160 actggcacaa agctggaagc acgctgggta aagccttctc aacaactttg aaaggggctc 2220 agagactagc agcgctaggt gacacagcct gggacttcgg ctccattgga ggggtattca 2280 actccatagg gaaagctgtt caccaagtat ttggcggtgc attcagaacg ctctttgggg 2340 gaatgtcttg gatcacacaa ggactaatgg gggccttact tctttggatg ggtgtcaacg 2400 cacgagatcg gtcaattgcc ctggcttttc tggccacggg agctgtgctc gtgtttttag 2460 cgaccaatgt gcatgccgac actggctgtg ccattgacat cacaagaaaa gagatgaggt 2520 gtggaagcgg catcttcgtg cacaacgacg tagaggcttg ggtagataga tacaaatatc 2580 tgccagagac gcccagatcc ttagcgaaga tcgtccacaa agcacatcaa gaaggagtgt 2640 gcggggtcag atccgtcact agactggaac accagatgtg ggaatctgtg cgggacgaac 2700 tgaatgtctt gctcaaagag aacgcggtgg atctcagtgt ggtggtgaac aagcccgtgg 2760 ggagatatcg ctcagccccc aaacgcctat ccatgactca agaaaagttt gagatgggct 2820 ggaaagcatg gggaaaaagc attcttttcg cccccgaatt ggccaactcc acgttcgtcg 2880 tggatggacc cgagacaaag gaatgccctg atgagcgcag agcctggaac agcatgcaga 2940 tcgaagactt cggcttcggc atcacatcaa cccgagtgtg gctgaaaatt agagaggaga 3000 acactgatga gtgtgatgga gcagtcatag ggacagctgt taaagggcat gtggcagttc 3060 acagtgactt gtcgtactgg attgagagcc gtctcaatga cacctggaaa cttgagaggg 3120 ctgtcttcgg agaggtgaaa tcttgcactt ggcccgagac acacactctt tggggtgacg 3180 gtgttgagga gagcgagctt atcatcccac ataccatagc tggaccgaga agcaagcaca 3240 accggagaga agggtataaa acacaaaacc agggaccctg ggatgagaac ggcatcgtcc 3300 ttgactttga ctattgtcca ggaacaaaag tcaccatcac agaggactgt ggcaagaggg 3360 gtccctcaat cagaaccact actgacagtg gaaagctgat caccgattgg tgttgccgca 3420 gctgttctct accgccttta cggttccgga cagaaaatgg ttgctggtat gggatggaaa 3480 tcagacctgt taagcatgat gaaacaacac tcgttagatc acaggttgac gctttcaacg 3540 gcgaaatgat tgatcctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg 3600 tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga cgattcctgc ggttttgggg gctctacttg 3660 tgctgatgct tgggggcatc acttacactg acctggcaag atatgtggtg ctagttgctg 3720 cggctttcgc ggaggccaac agtgggggag atgttctgca cctcgctttg atagccgtct 3780 tcaagatcca accagctttt ctggtcatga acatgcttag cgcgagatgg acgaaccaag 3840 agaacgtggt tctggtcctg ggggcggctt ttttccaact agcttcagtg gagttacaga 3900 tcggagtcca cggaatcctg aacgccgcag ccatagcatg gatgatcgtc cgagcgatca 3960 catttccctc aacttctacc gttgccatgc cagtcttagc gctcctaact ccgggaatga 4020 gggccttgta tctggacacc tacagaatca ttcttcttgt cataggaatt tgttccctgc 4080 tgcaagagag gagaaagacc atggcgaaga agaaaggagc cgtgctcttg ggcttagcgc 4140 tcacatctac cggatggttt tcgcccacca ctatcgcagc cggactaatg gtctgcaacc 4200 caaacaagaa gagagggtgg ccagctaccg agttcctttc agcggttggg ttgatgtttg 4260 ccattgtggg aggtctagcc gagttggaca tcgaatctat gtcaataccc ttcatgctgg 4320 cagggctcat ggcagtgtcc tacgtggtgt caggaaaggc aaccgacatg tggctggacc 4380 gggctgccga tatcagctgg gagatggaag ctgcaatcac cggaagtagc cggaggctgg 4440 atgttaaatt ggatgacgac ggcgactttc acttgattga tgatcccggt gttccatgga 4500 aagtctggct cttgcgtatg tcttgtatcg gtttagccgc tctgacaccc tgggctatcg 4560 ttcctgccgc ttttggctat tggctcactc tgaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgttct 4620 gggacacgcc atctccaaag ccttgcctaa agggggacac caccacagga gtttaccgaa 4680 ttatggctag ggggattctc ggcacttacc aggccggcgt tggagtcatg tacgagaatg 4740 ttttccacac attgtggcac acaactagag gagcagccat catgagtgga gaaggaaagc 4800 taacgccata ctggggtagt gtgaaggaag accgcataag ctacggaggc ccgtggaggt 4860 tcgaccggaa gtggaatgga acagatgatg tgcaagtgat cgtggtggaa ccagggaaac 4920 ctgcagtgaa catccagaca aaaccgggag tgtttcgcac ccctttcggg gaggtcggag 4980 cagtcagctt ggactaccca cggggaacat ccggctcacc catcctagat tccaatggag 5040 atatcatagg cttgtatggc aatggagttg aactcggcga tggatcgtac gtcagcgcca 5100 ttgtgcaggg cgaccgtcaa gaggaatcag ttccagatgc ctacactcca agcatgctga 5160 aaaagagaca gatgactgtg ctggacctgc acccaggttc gggaaaaacc aggaagatcc 5220 taccccagat aatcaaggat gccatccagc agcgcttgag aacagccgtg ttggcaccca 5280 cacgagtggt agcagcagaa atggcggaag ctttgagagg actcccagta cgatatcaaa 5340 cctcagcagt gcagagggag catcagggaa acgaaatagt agacgtaatg tgccatgcca 5400 ctctgaccca tagactaatg tcaccaaaca gggtgcccaa ctacaactta ttcgtgatgg 5460 acgaggctca cttcactgac ccagctagca tcgccgctcg gggttatatc gcaaccaagg 5520 tggaactggg ggaggcagca gccattttta tgacggcgac cccgcccggg accactgatc 5580 cctttcccga ctcaaatgcc ccagttcatg acctgcagga tgagatccca gacagggcat 5640 ggagcagtgg atacgaatgg atcacggact atgtggggaa aactgtgtgg ttcgtggcaa 5700 gtgtgaaaat ggggaatgag atcgcaatgt gccttcaaag agcggggaaa aaggtcatcc 5760 agctcaatcg taagtcttat gacacagaat acccaaaatg caaaaatgga gattgggact 5820 ttgttatcac cactgacatc tctgagatgg gggccaattt tggtgcgagc agggtcattg 5880 actgcagaaa gagtgtgaaa cccaccatcc tagaggaggg agaaggtaga gtcattcttg 5940 gaaacccatc ccccataacc agtgcaaatg cagcccaacg gagaggtaga gtgggcagga 6000 atcccaacca agttggagat gaataccatt acgggggggc caccagtgaa gatgacagca 6060 acttagccca ctggacagag gcaaaaatta tgctagacaa catacacatg cctaatggat 6120 tagtggctca gctgtacggg ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggagagtacc 6180 gtctcagagg tgaggagaag aagaacttct tggagctgct tagaacggct gacctcccag 6240 tatggctagc ctacaaggtg gcgtccaatg gcattcagta cactgacaga aaatggtgct 6300 ttgatggacc acgcacaaat gccatactag aagataacac tgaggtggag atagtcaccc 6360 gaatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggctcga cgcgagggtt tatgcagacc 6420 accaggccct caagtggttt aaggattttg cagcgggcaa gagatcagcc gtcagtttca 6480 tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacacgggaa gccttagaca 6540 caatgtatct ggtggctaca gctgagaaag gtggaaaggc acaccgcatg gctcttgagg 6600 aactgcccga cgcattggag accattacac tcatcgttgc catcactgtg atgacaggag 6660 gattcttcct gctcatgatg cagagaaagg gtataggaaa aatgggtcta ggggctctag 6720 tgctcacgct ggccaccttt ttcctatggg cggcggaggt tcctggaacc aaaatagcgg 6780 gtaccttact agtcgccctg ttgctgatgg tggtcctcat tccggaacca gaaaaacaga 6840 ggtcacagac agacaatcag ttggcagtgt ttctcatctg cgtcctgacc gtggtcggag 6900 tggtggcagc aaatgagtac ggaatgctgg aaaaaaccaa agcagacctt aagagcatgt 6960 ttggcggaag gacgcaagca tcaggactga ccggattgcc aagcatggca ctggacttgc 7020 gcccagccac agcttgggcg ctgtatgggg ggagcacagt tgtgttaacc cctctcctga 7080 agcacctaat cacctcagaa tacgtcacca catcgttagc ttcaatcagt tcacaagcgg 7140 gttcgctgtt tgtcttgccg cgaggcgtgc ctttcactga cttggatcta accgttggcc 7200 ttgtctttct tggctgttgg ggccaaatca ccctcaccac gttcttaaca gctatggtgc 7260 tagtgacact ccactatgga tacatgctcc ctgggtggca agcagaggca ctcagagctg 7320 ctcagagaag aacagcggct ggcataatga agaatgccgt cgtggacgga atggtcgcca 7380 ctgatgtgcc cgaactggaa agaaccactc ctttgatgca aaagaaagtc ggccaagtgc 7440 tcctcatagg ggttagcgtg gcggcgtttc tcgtcaaccc caatgttacc accgtgagag 7500 aggcaggtgt gttggtgacg gcagccacac tcaccttgtg ggacaatgga gccagtgcag 7560 tctggaattc caccaccgct acggggctct gccatgtcat gcgaggcagc tacctagctg 7620 gcggctccat tgcctggact ctcatcaaga acgctgacaa gccctcctta aaaaggggga 7680 ggcctggagg caggacgtta ggggagcagt ggaaggaaaa gttgaatgct atgagtaggg 7740 atgagttctt caaatacaga agagaggcca taattgaggt ggaccgcact gaagcacgca 7800 gggctaggcg cgagaacaac atagtgggag gacatccagt ctcgcgaggg tcagcaaagc 7860 tccgctggct tgtggaaaaa ggatttgtct caccaatagg aaaagtcata gatctgggat 7920 gcgggcgcgg aggctggagc tactacgcag caactctgaa aaaagttcag gaagtcaaag 7980 ggtacacgaa aggtggggcg ggacacgaag aaccgatgct catgcagagt tacggttgga 8040 acctggtctc gctaaaaagt ggggtggacg tattctacaa accctcggag cctagtgaca 8100 ccctgttctg tgacataggt gaatcttccc caagtccgga ggtggaggaa caacgcactc 8160 tgcgcgtctt agaaatgaca tctgactggt tacatcgggg acctagagag ttctgcataa 8220 aagtgctctg cccttacatg cctaaagtta tagaaaagat ggaagtcctg caacgccgtt 8280 tcggtggcgg gctggtgcgc cttcccctgt ctcgaaactc caaccatgag atgtactggg 8340 tgagtggagc tgctggcaat gtggtgcatg cggtcaacat gaccagccaa gtgctgctag 8400 ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga agaggatgtc aacctgggca 8460 gcgggacgag agctgtgggg aagggagagg tccatagcaa ccaggaaaaa attaggaaga 8520 gaattcagaa actcagagag gaattcgcta caacctggca caaagacccc gagcatccat 8580 accgaacttg gacctatcac ggaagttacg aagtgaaggc cactggctca gcaagctctc 8640 tcgtcaatgg ggtagtaaag cttatgagca aaccctggga cgccatcgcc aatgtcacca 8700 caatggccat gactgacacc accccctttg gccagcagag ggtctttaaa gagaaggttg 8760 acacgaaggc tccagagcca ccagcaggag tcaaggaagt gctcaacgag actaccaact 8820 ggctgtgggc ccacttgtca cgggagaaac gacctcgctt gtgcactaag gaagaattca 8880 taaagaaagt caacagcaac gcagctctcg gagcagtgtt cgctgaacag aatcaatgga 8940 gcacggcgcg ggaagccgtg ggtgaccctc tgttctggga gatggtcaat gaagaaaggg 9000 aaaaccattt gcgaggggag tgccacacgt gcatttacaa catgatggga aaaagagaga 9060 aaaaacccgg agagttcgga aaggctaaag ggagtagggc tatctggttc atgtggctcg 9120 gagctcggta cctagagttc gaagccctag gatttctaaa tgaagatcat tggctgagcc 9180 gagagaattc aggaggtggg gtggaaggtt caggcgtcca aaagctggga tacattctcc 9240 gtgacatagc aggtaagcaa ggaggtaaaa tgtatgccga tgacactgcc gggtgggaca 9300 ccagaatcac cagaaccgac ttggaaaatg aagccaaagt gctggagctt ttggatggtg 9360 aacaccgcat gctcgcccga gccataattg aactaacgta taggcacaaa gtggttaagg 9420 ttatgagacc tgcagcagga ggaaagacag tgatggacgt gatatcacga gaagaccaaa 9480 gggggagcgg gcaggtggtg acctacgctc tcaacacatt cacgaacatt gccgtccagc 9540 ttgtccgctt gatggaggct gagggggtca ttggaccaca acacttggaa cagctgccca 9600 ggaaaaacaa aatagctgtt aggacctggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca 9660 ggatggcgat cagtggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggatgacaga ttcgccacgg 9720 ctctccattt cctcaacgca atgtcgaagg tcagaaaaga tatccaagaa tggaagcctt 9780 cgcatggttg gcaggactgg cagcaggttc ctttttgctc caatcatttt caggagattg 9840 tgatgaaaga tggaaggagc atagtcgtcc cgtgcagagg gcaggatgag ctgattggca 9900 gggcgcgcat ctccccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggctaaag 9960 cgtatgcaca gatgtggctg cttctatact tccatcggag ggacctacgc ctcatggcaa 10020 atgcaatctg ctcagcagtt ccagtggact gggtacccac aggcagaaca tcctggtcac 10080 tacactcaaa aggagagtgg atgaccactg aagacatgct gcaagtctgg aacagggtat 10140 ggattgaaga aaatgaatgg atgatggaca agaccccaat cacaagctgg acagacgttc 10200 cgtacgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagtct catcggaacg cgatccaggg 10260 caacatgggc tgagaacatc tacgcggcaa taaaccaagt gagggccatc attggaaaag 10320 aaaattatgt tgattacatg acttccctca gaagatatga ggatgtattg attcaggagg 10380 acagggtcat ttagacagga ttaagtcatg tgtgtaatgt gagataagaa aatgtgcatg 10440 tggagtcagg ccagcaaaag ctgccaccga atactgagta gacggtgctg cctgcgtctc 10500 agttccagga ggactgggtt aacaaatctg acaacggaag gtgggaaagc cctcagaacc 10560 gtctcggaag caggtccctg ctcaccggaa gttgaaagac caacgtcagg ccacaatttt 10620 gtgccactcc gctggggagt gcggcctgcg cagccccagg aggactgggt taacaaagcc 10680 gttgaggccc cacggcccaa gcctcgtcta agatgcaata gactaggtgt aaggactaga 10740 ggttagagga gaccccgtgg aaacaacatc atgcggccca agccccctcg aagctgtaga 10800 ggaggtggaa ggactagagg ttagaggaga ccccgcattt gcatcaaaac agcatattga 10860 cacctgggaa tagactggga gatcttctgc tctatctcaa catcagctac ttggcacaga 10920 gcgccgaagt atgtagctgg tggtgaggaa gaacacagga tct 10963

Claims

(a) 베로세포(Vero cell), BHK-21 세포(baby hamster kidney cell) 및 PK15 세포로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 배양 세포에 일본뇌염바이러스 KV1899-120P(수탁번호 KCTC18347P)를 접종하여 증식시킨 후 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 일본뇌염바이러스를 필터를 이용하여 1차 정제하는 단계; 및
(c) 상기 1차 정제된 일본뇌염바이러스를 수크로오스를 이용하여 2차 정제하는 단계;를 포함하는 효소면역기법용 항원의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 (a-1) 배양 세포에 일본뇌염바이러스를 접종하여 증식시킨 후 배양하는 단계; 및 (a-2) 배양물을 원심분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소면역기법용 항원의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b-1) 상기 배양된 일본뇌염바이러스를 필터를 이용하여 1차 정제하는 단계; 및 (b-2) 정제물을 투석망을 이용하여 투석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소면역기법용 항원의 제조 방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 필터는 100kDa 내지 300kDa의 여과 필터인, 효소면역기법용 항원의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 수크로오스는 10%(w/w) 내지 60%(w/w)의 농도인, 효소면역기법용 항원의 제조 방법.
제1항 내지 제3항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 효소면역기법용 항원.
제8항에 따른 항원을 포함하는 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출용 효소면역기법 키트.
(a) 생물학적 시료를 제8항에 따른 효소면역기법용 항원과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시료 중 상기 효소면역기법용 항원과 결합된 항체의 존재를 효소면역기법에 의하여 검출하는 단계;를 포함하는 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법.
삭제
제10항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈장, 전혈, 혈청, 뇨 및 타액으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법.