KR20170079550A

KR20170079550A - 말 게타바이러스 혈청 진단방법

Info

Publication number: KR20170079550A
Application number: KR1020150190252A
Authority: KR
Inventors: 양동군; 김하현; 조현례; 최성숙; 이승헌
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2017-07-10

Abstract

본 발명은 말 게타바이러스 혈청 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 게타바이러스(Getah virus) KCTC18436P 항원을 사용하여 말의 시료에 존재하는 게타바이러스 항체를 효율적으로 검출할 수 있는 말 게타바이러스 혈청 진단방법 및 이를 위한 말 게타바이러스 혈청 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 말에서 게타바이러스에 대한 항체를 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 이러한 방법을 동시에 많은 시료에 적용할 수 있다. 또한 고가의 전문적인 분석장치가 없더라도 손쉽게 적용이 가능하며 기존 방법에 비해 경제적이라는 장점도 있다. 본 발명의 진단방법 또는 키트를 통해 보다 많은 수의 시료를 신속하고 정확하게 검사할 수 있게 됨에 따라 말 개체군 내에서 게타바이러스의 분포 및 이동을 모니터링하거나 예방백신을 개발하는데 크게 기여할 수 있을 것이라 기대된다.

Description

말 게타바이러스 혈청 진단방법{The diagnostic method for the detection of antibody against Getah virus in horse}

본 발명은 말 게타바이러스 혈청 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 게타바이러스(Getah virus) KCTC18436P 항원을 사용하여 말의 시료에 존재하는 게타바이러스 항체를 효율적으로 검출할 수 있는 말 게타바이러스 혈청 진단방법 및 이를 위한 말 게타바이러스 혈청 진단용 키트에 관한 것이다.

국내에서 사육되고 있는 말은 약 3만두 정도이며, 19,000 ~ 14,000두는 Thoroughbred 종을 약 16,000두는 기타 종을 사육하고 있다. 그리고 매년 700여 두의 말이 미국, 뉴질랜드 및 오스트리아에서 수입되고 있다. 최근 말 산업육성법은 승마와 경주마의 산업기반을 설립하기 위해 시행되고 있다.

게타바이러스(Getah virus)는 Bebaru, Chikungunya, Mayaro, O'nyong nyong, Ross River, Semliki Forest 및 Una virus와 Semliki forest군에 속하는 모기 매개성 바이러스이다. 이 게타바이러스는 여러 개의 속으로 나누어지는데 Sagiyama, Ross River 및 Bebaru 바이러스도 있다. 게타바이러스는 RNA를 소유하고 있으며, Togaviridae에 Alphavirus에 속한다. 4개의 비구조 단백질(nsP1 - nsP4)을 소유하고 있으며, 5개의 구조단백질(C, E3, E2, 6K, and E1)로 구성되어 있다. 구조단백질 중에서 E1은 성숙한 후에 E2 단백질에 융합하며, 이 E1은 세포질 내로 바이러스 핵산의 방출을 촉진하는 역할을 한다. 게타바이러스는 1955년 말레이시아 모기에서 최초로 분리 보고되었다. 그리고 이 바이러스는 일본, 중국, 오스트리아 및 한국의 Culex, Aedes and Armigeres 종 모기에서 분리되었다.

말에서의 게타바이러스 감염증은 일본과 인도에서 보고되었으며, 혈청학적 조사에 의하면 아시아 지역에 널리 퍼져 있음을 알 수 있다. 게타바이러스는 사람을 포함한 척추동물에서 감염증을 나타내며, 돼지와 말은 증폭숙주로 알려져 있다. 게타바이러스를 비강을 통해 실험적으로 감염된 말은 많은 양의 바이러스를 배출하는 것으로 확인되었으며, 이는 말에서 다른 말로 감염이 일어날 수 있음을 의미한다. 경주마에서 게타바이러스 감염증의 감염율이 약 40% 정도 되지만 임상증상은 크게 심하지 않다. 감염된 말은 약 1주일 정도 식욕결핍, 우울증을 보인다. 다른 증상으로는 다리에 부종과, 악하 임파절의 종대, 목부분의 피부에 홍반점과 뻣뻣한 걸음걸이 등의 임상증상을 나타낸다.

게타바이러스 진단을 위하여 바이러스분리법, 마우스 뇌내접종법을 사용하고 있으나 이것은 실험실을 구비하고 있는 곳에서 사용가능하며, 아직까지는 상용화되어있는 키트가 개발되어 있지 않다. 게타바이러스에 대한 항체검사법으로 중화항체법(SN)과 혈구응집억제법(HI), ELISA법이 주로 사용되고 있다. 혈구응집법은 실험술식이 복잡하고 혈청에서 비특이 성분을 제거하기 위하여 Kaolin과 혈구처리가 필요하며, 특이 거위혈구를 사용하기 때문에 거위를 사육해야하는 불편함이 있다. 가장 특이적인 항체검사법은 중화항체법이지만 이는 세포를 이용하기 때문에 숙련된 기술자가 필요하다.

최근 말 산업을 통한 레저산업이 상대적으로 중요시되고 있음에도 불구하고, 기후 변화와 온난화로 인하여 모기의 활동이 활발해질 개연성이 높다. 게타바이러스에 대한 항체가는 지역에 따라 약간 다르지만 일본과 중국에서 각각 47.8%, 25.0%를 나타내고 있다. 따라서 국내에서 사육하고 있는 말에서 게타바이러스의 항체의 측정은 말과 모기에서의 모기매개질병의 전파를 예상할 수 있으며, 이를 토대로 예방백신을 개발하는데 기여할 수 있다. 이에 말에서 게타바이러스에 대한 신속한 진단이 가능하고 많은 수의 혈청 시료를 검사할 수 있는 기술이 요구되고 있다.

Nemoto M, Bannai H, Tsujimura K, Kobayashi M, Kikuchi T, Yamanaka T, Kondo T. Getah Virus Infection among Racehorses, Japan, 2014. Emerg Infect Dis. 2015 May;21(5):883-5.

따라서 본 발명의 주된 목적은 말에서 게타바이러스에 대한 항체를 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 많은 시료에 적용할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 방법을 보다 용이하게 수행할 수 있는 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 말의 혈청 시료를 게타바이러스(Getah virus) KCTC18436P 항원과 접촉시키는 단계; 및 상기 혈청 시료 중 상기 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는 말 게타바이러스 혈청 진단 방법을 제공한다.

상기 게타바이러스 KCTC18436P은 1993년 8월에 돼지 혈액으로부터 분리된 바이러스로, 베로(vero) 세포(African green monkey kidney cell)에서 계대 및 증식하여 얻었다. 상기 게타바이러스의 유전체 염기서열 분석결과는 서열번호 1과 같다. 게타바이러스의 유전체는 RNA이므로 서열번호 1의 DNA서열은 게타바이러스 유전체 RNA서열로부터 DNA로 전환된 것이다.

본 발명의 진단방법에 있어서, 상기 말의 혈청 시료를 20 내지 200배 희석하여 상기 항원과 접촉시키는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 말의 혈청 시료를 희석한 희석액 50㎕ 당 0.05 내지 0.25㎍의 항원을 접촉시키는 것이 바람직하다. 이러한 희석배수범위 및 항원의 양은 게타바이러스 및 말의 혈청을 대상으로 한 연구결과를 바탕으로 도출된 것으로, 이에 따르면 보다 정확한 혈청 진단이 가능하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 게타바이러스(Getah virus) KCTC18436P 항원을 포함하는 말(horse) 게타바이러스 혈청 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 항원이 코팅된 용기를 포함하여 이루어지며, 상기 용기는 50㎕의 용액이 담기는 용기의 내부 면적당 0.05 내지 0.25㎍으로 상기 항원이 코팅된 용기인 것이 바람직하다. 이와 같이 항원이 코팅된 용기는 효소면역기법을 용이하게 수행할 수 있도록 하기 위해 제공되는 것으로, 용기에 말의 혈청 시료를 투입하여 혈청에 존재하는 게타바이러스 항체와 용기내부에 코팅된 항원이 항원-항체 결합반응을 일으키도록 할 수 있다. 결합반응을 유도한 이후 용기에서 나머지 혈청시료를 제거하고, 말의 IgG에 대한 항체 등을 사용하여 항원과 결합한 항체를 검출할 수 있다. 용기에 코팅되는 항원의 양은 게타바이러스 및 말의 혈청을 대상으로 한 연구결과를 바탕으로 도출된 것으로, 이에 따르면 보다 정확한 혈청 진단이 가능하다.

본 발명의 키트에는 상기와 같은 항원 또는 이 항원이 코팅된 용기 이외에도 효소면역기법을 수행하는데 필요한 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 추가로 포함될 수 있다. 이러한 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 게타바이러스(Getah virus) KCTC18436P를 숙주세포에 접종하고 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 상기 배양액에 분자량이 7000 내지 9000인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 5 내지 20%(w/v)가 되도록 첨가하고, 염화나트륨(NaCl)을 0.4 내지 0.6M의 농도가 되도록 첨가한 다음 원심분리하여 게타바이러스를 농축하는 단계; 및 5 내지 60%(w/v) 범위 내의 수크로오스(sucrose) 농도구배 원심분리를 수행하여 20 내지 30%(w/v)의 수크로오스 농도구배 분획을 수득하는 단계;를 포함하는 게타바이러스 KCTC18436P 항원 제조방법을 제공한다. 이에 따르면 본 발명에 사용되는 게타바이러스 KCTC18436P 항원을 매우 효과적으로 제조할 수 있다.

본 발명의 항원 제조방법에 있어서, 상기 숙주세포는 베로(vero)세포이고, 게타바이러스를 베로세포에 접종하여 24 내지 72시간 배양하고, 배양액을 수득하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면 말에서 게타바이러스에 대한 항체를 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 이러한 방법을 동시에 많은 시료에 적용할 수 있다. 또한 고가의 전문적인 분석장치가 없더라도 손쉽게 적용이 가능하며 기존 방법에 비해 경제적이라는 장점도 있다. 본 발명의 진단방법 또는 키트를 통해 보다 많은 수의 시료를 신속하고 정확하게 검사할 수 있게 됨에 따라 말 개체군 내에서 게타바이러스의 분포 및 이동을 모니터링하거나 예방백신을 개발하는데 크게 기여할 수 있을 것이라 기대된다.

도 1은 베로 세포에서 게타바이러스의 시간에 따른 증식능 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 베로 세포에서 게타바이러스를 증식하고, 농축한 후, 초원심 분리기를 이용하여 sucrose 위에서 정제하여 얻어진 바이러스를 전자현미경으로 확인한 결과이다.
도 3은 정제한 게타 바이러스의 최적 농도를 측정하기 위하여, 정제한 게타바이러스를 2진희석하고, 말 혈청을 100배 희석하여 얻어진 흡광도를 나타낸 것이다. 이를 바탕으로 2.5㎍/㎖을 코팅항원으로 설정하였다.
도 4는 말 혈청 배수를 결정하기 위하여, 정제한 게타바이러스를 2.5㎍/㎖를 코팅하고, 말 혈청을 20배부터 10진희석하여 얻어진 흡광도를 나타낸 것이다. 이를 바탕으로 40배의 말 혈청배수를 설정하였다.
도 5는 말 혈청 252개 대한 게타 바이러스 중화항체시험 결과와 효소면역법에의한 흡광도의 상관관계를 나타내는 그림으로 상관계수(r)는 0.812를 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 게타바이러스의 증식

게타바이러스를 증식시키기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 이때 사용된 게타바이러스(KCTC18436P)는 1993년도에 경상남도 도축장에서 채취한 돼지 혈액으로부터 분리한 것이다.

게타바이러스는 Vero(African green monkey kidney cell), BHK-21(baby hamster kidney cell) 및 RK-13 세포에서 증식이 가능하다. 따라서 세포를 취급하는데 어렵지 않는 Vero 세포를 선정하고, 이 Vero 세포에 게타바이러스를 접종하였다. 접종 후 24시간 이후부터 특이적인 세포변성효과를 나타내었고 이것을 동결융해과정을 3회 실시한 후 바이러스 함량을 확인한 결과 10^7.5 TCID₅₀/㎖임을 확인하였고 다음 실험을 실시하였다.

실시예 2. 게타바이러스의 염기서열 분석

2-1. 게타바이러스 C, P62, 6K 및 E1 유전자 분석을 위한 프라이머 작성

Vero 세포에서 증식한 게타바이러스의 유전자 염기서열을 확인하기 위하여 표 1과 같이 5종의 프라이머를 작성하였다. 디자인된 프라이머는 제작의뢰를 통해 oligonucleotide로 제작하였다(바이오니아, 대한민국).

프라이머	5'-3'올리고뉴클레오타이드	증폭크기(bp)	유전자
GE1F	GAT GTC CAC GCT GTC TAA GAG	990	C
GE1R	CGC GGG CTC TGA GCA TGG GA	990	C
GE2F	TGG CCA TTG TCC TGG GAG GG	1030	P62
GE2R	GGG ACA AAC GAG GAG GTG TAC	1030	P62
GE3F	CGT GGG CAC CAC CAG TAG CG	990	p62
GE3R	GGT GAT GGC ACG ACT GTC TTG	990	p62
GE4F	CTC CCC GAT GAC CCT ACA GC	880	6K
GE4R	TCG CGA TCC CGC CGA AGT CC	880	6K
GE5F	GGA CAT CCC GGA CAC CGC GT	490	E1
GE5R	CAA GCC TCC CGG AAT GCG GC	490	E1

2-2. 게타바이러스 C, P62, 6K 및 E1 유전자 분석

Vero 세포에서 5대 계대한 게타바이러스를 5종의 프라이머를 이용하여 증폭하고 클로닝하여 C, P62, 6K, 및 E1 유전자의 염기서열을 확인한 결과 유전자 염기서열 open reading frame의 크기는 3768bp이며, 1256개의 아미노산이었다(서열번호 1 참조). 이를 바탕으로 염기서열 및 아미노산의 상동성을 확인한 결과 2004년도에 분리한 AY702913주와는 3개의 뉴클레오타이드가 차이가 있으며, 또한 연역된 아미노산의 비교를 확인한 결과 3개의 아미노산이 차이를 나타냈었다. 또한 2008년도 중국에서 분리 보고한 YN0540 strain과 25개의 뉴클레오타이드의 차이를 나타냈다.

실시예 3. 말 혈청에서 게타바이러스 항체검사를 위한 면역효소기법

3-1. 게타바이러스의 증식

Vero 세포에서 게타바이러스의 증식능을 확인하기 위하여 25cm² flask에 게타바이러스를 접종하고 12시간부터 96시간까지 플라스크를 꺼내 얼린 후 시간에 따른 게타바이러스 함량을 확인하였다. 도 1과 같이 Vero 세포에 게타바이러스를 접종하고 36시간부터 48시간사이에 바이러스 함량이 10^7.5 TCID₅₀/㎖를 나타내고 그 이후 96시간까지 지속 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 Vero 세포를 roller 배양기에 증식하고 세포가 90% 증식하였을 때 게타바이러스를 접종하였으며, 48시간이 지났을 때 바이러스를 수확하여 확인한 결과 10^7.5 TCID₅₀/㎖를 나타내었고, 300㎖의 게타바이러스 배양액을 확보하고 다음 실험을 실시하였다. 이렇게 바이러스를 증식하였음에도 배양액 내에는 죽은 세포 혹은 죽어가는 세포의 찌꺼기가 많이 남아 있다. 이러한 세포 찌꺼기들은 3,500 ~ 4,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 제거하였다.

3-2. 게타바이러스의 PEG-8000에 의한 농축 및 sucrose를 이용한 정제

500㎖ 삼각플라스크에 증식한 게타바이러스 배양액 100㎖를 넣은 후 얼음 위에 올려 놓고, 0.5M의 NaCl(8.76g/100㎖)과 10%의 고형의 PEG-8000(10g/100㎖)을 추가하여 두 개의 시약이 완전히 녹도록 30분 동안 혼합하였다. 그리고 바이러스가 PEG-8000에 응집될 수 있도록 4℃에 12시간 동안 정치하였다. 그 이후에 3,600rpm에서 30분 동안 원심분리하여 침전된 항원을 수집하였다. 이때 가능한 상층액은 피펫을 통해 모두 제거하였다. 상층액은 제거하고 GTNE buffer(200mM glcine, 50mM Tris, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH7.5)를 이용하여 최초 바이러스 용량의 1/100에 해당하는 용액 즉 1㎖로 부유시켰다. 부유한 용액을 10,000g에서 5분 원심분리하여 침전물은 버리고 상층액을 다음 실험에 사용하였다. 이때 얻어진 바이러스 농축액은 세포성분이 많기 때문에 효소면역기법의 항원으로 사용하기에 적합하지 않다. 따라서 sucrose를 이용한 정제가 필요하다. 따라서 분자량 10kDa 이하의 물질을 제거하기 위하여 10kDa이 투석되는 투석망(thermo scientific, slide-A lyser)에 넣고 PBS로 하룻밤 투석하였다. 새로운 PBS로 3 ~ 4회 채워 투석을 실시하고 난 이후에 0.45㎛의 여과기를 통하여 세포 찌거기를 제거하였다. GTNE buffer를 이용하여 50%, 40%, 30%, 20%, 10%의 sucrose 용액을 만들었다. 투명한 초원심 튜브에 50%, 40%, 30%, 20%, 10%의 sucrose를 각각 2㎖씩 넣어 준비한 후 게타바이러스 농축액 1㎖를 가장 상층액에 올려 놓은 후 초원심분리기를 이용하여 100,000g에서 3시간 원심분리하여 바이러스를 분리하였다. 원심분리한 후 20%와 30% 사이에서 보이는 게타바이러스 항원을 피펫을 이용하여 회수하였다. 회수한 이후에 상기에 사용한 투석방법으로 다시 한번 더 투석하였다. 투석하여 얻어진 게타바이러스 항원을 Amicon ultra centrifugal filter를 이용하여 여과한 후 단백질 농도를 측정한 결과 1.09mg/㎖를 나타내었다. 이 게타바이러스 항원을 전자현미경으로 확인한 결과 도 2와 같이 40 ~ 60 nm 크기의 게타바이러스 입자를 확인할 수 있었다. 정제된 바이러스입자를 확인한 이후 다음 실험을 실시하였다.

3-3. 게타바이러스 항원 평가

국내에서 사육하고 있는 말 252두에서 혈청을 준비하고, 효소면역기법에서 표준혈청으로 사용하기 위해 혈청검사를 수행하였다(표 2 참조).

	구분	효소면역법
	구분	양성	음성	계
중화시험	양성	99	13	112
	음성	26	114	140
	계	125	127	252

중화항체검사 결과 2배 이상을 양성으로 확인하였고 4배 이상의 혈청을 이용하여 효소면역기법에 사용할 최적의 게타바이러스 항원농도를 설정하기 위하여 항원을 5㎍/㎖부터 2진 희석하여 96 well plate에 50㎕씩 분주하고, 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 96 well plate는 200㎕의 PBST로 2회 세척하였고, 5% skim milk를 이용하여 항원이 코팅되지 않은 부위를 blocking 하였다. 말 혈청은 게타바이러스에 4, 16, 64, 256배 양성혈청과, 음성혈청 2개를 100배 희석하여 적용하였고, 1시간 이후에 PBST로 2회 세척하고, peroxidase conjugated goat anti-horse IgG를 4000배 희석하여 50㎕를 적용하였다. 37℃에서 1시간 반응시키고, 발색제(3-ethy1- benzthiazoline sulfonate) 50㎕를 넣은 후 15분 후에 1% sodium dodecy1 sulfate(SDS)로 발색을 정지하였다. 이의 결과는 도 3에 나타내었다. 게타바이러스에 음성을 보인 혈청은 흡광도 값이 0.2이하를 나타내었으며, 이 실험을 통해 말 혈청에서 게타바이러스에 대한 효소면역기법에 사용할 최적 농도로 2.5㎍/㎖을 설정하였고, 혈청 희석배수를 결정하기 위하여 다음 시험을 진행하였다.

3-4. 말 혈청 희석배수의 결정

상기의 실험에서 얻어진 결과를 바탕으로 96 well plate에 게타바이러스 항원을 2.5㎍/㎖가 되도록 코팅하고, 게타바이러스에 4, 16, 32, 64, 128, 256배의 양성혈청과, 음성혈청 2개를 20배부터 2진희석하여 50㎕씩 적용하고 37℃에서 1시간 반응하였다. 1시간 반응 이후에 PBST로 2회 세척하고, peroxidase conjugated goat anti-horse IgG, 발색제 및 발색정지 용액은 상기의 실험방법과 동일하게 실시하여 도 4와 같은 결과를 얻었다. 도 4에서도 게타바이러스 음성혈청은 0.2이하의 흡광도 값을 나타낸 반면, 게타바이러스 양성혈청은 40배의 혈청희석배수에서 0.3부터 0.7까지의 흡광도를 나타내어 말 혈청에서 게타바이러스 항체를 검사하기위한 최적 혈청희석농도는 40배로 설정하였다. 이렇게 최적 혈청희석배수를 설정한 이후 다음 시험을 진행하였다.

3-5. 게타바이러스 혈청검사를 위한 효소면역기법의 적용

상기에서 얻어진 정제한 게타바이러스의 항원을 2.5㎍/㎖로 하여 96 well plate에 50㎕를 분주하고 4℃에서 12시간 동안 코팅한 다음, 세척한 후 252개의 말 혈청을 40배 희석하여 50㎕씩 적용하였다. 그 이후의 술식은 상기의 방법과 동일하게 실시하였다. 이의 결과를 바탕으로 중화항체에서 얻어진 혈청배수와 효소면역기법을 이용하여 얻어진 값의 상관관계를 확인한 결과 도 5와 같이 0.8128을 나타내어 높은 상관관계가 있음을 확인하였다. 이를 바탕으로 흡광도 값이 0.21 이상을 양성으로, 0.2 이하이면 음성으로 처리하여 민감도와 특이도를 확인한 결과 민감도는 79.2%, 특이도 89.7%를 나타내었다.

한국생명공학연구원

KCTC18436P

20151223

<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> The diagnostic method for the detection of antibody against Getah virus in horse <130> PA-D15214 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3762 <212> DNA <213> Getah virus <400> 1 atgaattaca ttccaactca aaccttttac ggacgccgtt ggcgaccacg cccggcgtac 60 cgtccatggc gggtgccgat gcagccggcc ccacccatgg tgattcctga gctgcaaact 120 ccgatcgtcc aggcccaaca gatgcagcag ctaatcagtg cagtttctgc cctgacgacc 180 aagcaaaatg gcaaagcacc gaagaagccg aagaaaaagc cgcaaaaagc gaaggctaag 240 aaaaacggac agcaaaagaa gaacgagaac aagaaaccac cgcctaagca gaagaatccg 300 gctaagaaga agaaaccagg aaaaagggaa cgcatgtgca tgaagataga gaatgattgc 360 atcttcgagg tcaagcttga cggtaaggtc acgggatacg cctgcctagt cggggataaa 420 gtgatgaagc cggcacacgt caaaggtgtg atcgacaacc ccgacctagc gaagcttacc 480 tacaagaaat cgagcaagta tgacctggag tgcgcccaga taccagtgca catgaagtca 540 gatacttcaa agtacaccca tgaaaaacca gaagggcact acaattggca tcacggtgca 600 gtgcagtaca gcggtggcag gttcacaatc ccgacaggcg caggtaaacc aggagacagc 660 ggccggccga tcttcgacaa caaaggacgc gtggtggcca ttgtcctggg aggggccaac 720 gaaggagcca ggactgccct atccgtcgtg acctggacca aagacatggt cacacggtac 780 accccagaag gaacagaaga atggtccgcc gccttgatga tgtgcgtctt agccaacgtt 840 acattcccat gctcagagcc cgcgtgtgca ccctgttgct atgaaaaaca accagaacag 900 acactgagga tgttagagga caacgtggac cgcccgggct actacgacct gctcgaggcc 960 acgatgacgt gtaacaatag tgcacgccac cgtcgcagtg tgacggaaca cttcaacgtc 1020 tacaaggcca cgaaaccgta tctagcgtat tgcgcggact gcggagacgg gcagttctgt 1080 tacagcccgg tggctataga aaaaattagg gatgaggctt ccgatggcat gataaaaatc 1140 caggtcgcag cgcaaattgg catcaacaaa ggaggaacac acgaacacaa caaaatcagg 1200 tacatcgccg ggcatgacat gaaagaggca aaccgggact ctttacaagt gcatacttcc 1260 ggtgtgtgcg ctattcgagg cacgatgggc cacttcatcg tggcctactg ccctccaggg 1320 gacgaactaa aggtccagtt ccaagatgca gaatcgcaca cccaggcctg caaagtgcag 1380 tacaaacacg caccggcccc agtaggcaga gaaaaattca ccgtcaggcc ccacttcggt 1440 atcgaagtgc catgcacaac gtaccagctg actaccgcac cgacggagga agagatcgac 1500 atgcataccc caccggatat cccagacata acgttgctgt cgcagcagtc aggtaatgta 1560 aagatcacag caggaggaaa aaccatcaga tacaactgca cgtgtggtag tggcaacgtg 1620 ggcaccacca gtagcgacaa gactatcaat tcgtgcaaaa tagcacagtg ccacgctgcg 1680 gtgactaacc acgataagtg gcagtacacc tcctcgtttg tccctagagc cgaccagttg 1740 tctcgcaaag gtaaagtgca cgtacctttc cctctgacca actccacatg cagggtgcct 1800 gttgcacgtg caccaggtgt cacatacgga aagagagaac tgacagtgaa actgcaccca 1860 gatcatccca cgctgttgac gtaccggagt ctaggagcag atccgcgccc gtatgaggag 1920 tggatagacc gatacgtcga acggaccata ccggtgaccg aagatgggat cgagtacaga 1980 tggggaaaca acccacccgt gcgcttgtgg gcccagctga caactgaagg caaaccccat 2040 gggtggccgc acgagatcat actctattac tatgggctat acccagcagc caccatcgcc 2100 gccgtctcag ccgcgggtct cgcagtcgta ctatcgctgc tggcgtcatg ttacatgttc 2160 gccactgcac gccgcaagtg cctgacccca tacgccctga cccccggagc tgtcgtcccg 2220 gtaacactag gagtactatg ctgcgcacca cgagcgcatg ccgcgtcatt tgcggaatct 2280 atggcgtatc tatgggatga gaatcaaacc ctgttttggc tggagcttgc aacgccgctc 2340 gctgccataa tcatacttgt atgctgcctg aagaacctgc tttgctgctg caaaccgctt 2400 tcttttttag tgctggtgag cctgggaact cccgtcgtaa aatcttacga acacaccgca 2460 acgatcccga atgtggtggg attcccgtat aaggctcaca ttgagaggaa cggcttctcc 2520 ccgatgaccc tacagcttga agtacttgga accagcttgg aacccacgct aaacttagag 2580 tacataacct gtgaatacaa gacagtcgtg ccatcacctt atatcaagtg ctgcgggaca 2640 tcagaatgca gatccatgga gcgccccgac tatcaatgcc aggtctacac aggagtgtac 2700 ccatttatgt ggggcggcgc atactgcttc tgcgacactg agaacaccca gctgagtgaa 2760 gcatacgttg atagatcgga cgtatgcaag cacgaccatg ccgccgccta caaggcgcat 2820 actgcggcaa tgaaagccac catccgaata agctacggga acctcaatca gacaacaacg 2880 gcgttcgtca acggggagca cacagtgacc gtcggaggca gcaggtttac ttttggtcca 2940 atctccactg cctggacgcc tttcgacaac aagatcgtcg tctacaagaa cgacgtctac 3000 aaccaggact tcccacccta cgggtcagga caaccaggga ggtttggaga catccagagc 3060 aggacggtag agagcaagga cctgtatgcc aacaccgccc tcaagttgtc aagaccttcg 3120 tccggtactg ttcacgtgcc ttacacacag accccttctg gctttaagta ctggataaaa 3180 gagagaggca cgtcgctgaa tgacaaggct ccctttggat gcgtaatcaa gaccaaccca 3240 gtcagagcag aaaattgcgc cgttggcaac atcccagtct ccatggacat cccggacacc 3300 gcgtttacgc gcgtgattga tgcacctgcc gtcacaaacc tggagtgcca agtggcggtc 3360 tgcacgcact catcggactt cggcgggatc gcgactctga ctttcaaaac tgacaaaccc 3420 ggaaaatgtg ctgtccattc tcattcgaac gtagccacca tacaggaggc agctgtggac 3480 atcaaaacag atggcaagat aaccctgcat ttctctacag catcagcatc cccggcattc 3540 aaggtatctg tgtgcagtgc caaaacgaca tgcatggcag cgtgtgagcc gccgaaggac 3600 cacatcgtcc cttatggggc gagccataac aaccaagttt ttcctgacat gtctggcacg 3660 gcaatgacat gggtgcagcg ggtagccggc ggactcggcg ggctaacact cgccgcagtg 3720 gcagtactta tactggtgac gtgtgtgact atgcgccgct aa 3762

Claims

말의 혈청 시료를 게타바이러스(Getah virus) KCTC18436P 항원과 접촉시키는 단계; 및
상기 혈청 시료 중 상기 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는 말 게타바이러스 혈청 진단 방법.
제 1항에 있어서,
상기 말의 혈청 시료를 20 내지 200배 희석하여 상기 항원과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 말 게타바이러스 혈청 진단 방법.
제 2항에 있어서,
상기 말의 혈청 시료를 희석한 희석액 50㎕ 당 0.05 내지 0.25㎍의 항원을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 말 게타바이러스 혈청 진단 방법.
게타바이러스(Getah virus) KCTC18436P 항원을 포함하는 말(horse) 게타바이러스 혈청 진단용 키트.
제 4항에 있어서,
상기 키트는
상기 항원이 코팅된 용기를 포함하여 이루어지며,
상기 용기는 50㎕의 용액이 담기는 용기의 내부 면적당 0.05 내지 0.25㎍으로 상기 항원이 코팅된 용기인 것을 특징으로 하는 말 게타바이러스 혈청 진단용 키트.
게타바이러스(Getah virus) KCTC18436P를 숙주세포에 접종하고 배양하여 배양액을 수득하는 단계;
상기 배양액에 분자량이 7000 내지 9000인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 5 내지 20%(w/v)가 되도록 첨가하고, 염화나트륨(NaCl)을 0.4 내지 0.6M의 농도가 되도록 첨가한 다음 원심분리하여 게타바이러스를 농축하는 단계; 및
5 내지 60%(w/v) 범위 내의 수크로오스(sucrose) 농도구배 원심분리를 수행하여 20 내지 30%(w/v)의 수크로오스 농도구배 분획을 수득하는 단계;를 포함하는 게타바이러스 KCTC18436P 항원 제조방법.
제 6항에 있어서,
상기 숙주세포는 베로(vero)세포이고,
게타바이러스를 베로세포에 접종하여 24 내지 72시간 배양하고, 배양액을 수득하는 것을 특징으로 하는 게타바이러스 KCTC18436P 항원 제조방법.