CN117169499A

CN117169499A - 一种盖他病毒的双抗体夹心elisa检测试剂盒以及应用

Info

Publication number: CN117169499A
Application number: CN202311402055.0A
Authority: CN
Inventors: 粟硕; 王宇; 翟晓凤; 秦岩; 李小玲; 姜智文; 王宁宁; 张晓光; 陈杰; 王宇彤
Original assignee: Sanya Research Institute Of Nanjing Agricultural University; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Sanya Research Institute Of Nanjing Agricultural University; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2023-10-27
Filing date: 2023-10-27
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2043-10-27
Also published as: CN117169499B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种盖他病毒的双抗体夹心ELISA检测试剂盒以及应用。本发明利用GETV作为免疫原，筛选得到能靶向暴露在GETV表面结构域的抗体，利用该抗体首次建立了一种针对盖他病毒的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，具有更贴近临床样品真实性的特性。所述试剂盒包括：包被有抗GETV多克隆抗体的酶标板、封闭液、酶标抗GETV单克隆抗体、洗涤液、底物显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照。本发明有利于临床上动物感染早期的鉴别诊断，通过抗原学检测手段避免出现对于急性期动物表现病毒血症但检测不到血清学阳性的现象，能够提早发现并进行治疗，从而最大程度的降低GETV在临床上带来的损失。

Description

一种盖他病毒的双抗体夹心ELISA检测试剂盒以及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种盖他病毒的双抗体夹心ELISA检测试剂盒以及应用。

背景技术

盖他病毒（Getah Virus，GETV）是一种单股正链的RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属成员。可通过蚊虫媒介传播感染多种哺乳动物，在包括中国在内的许多东亚国家的猪、马、牛等动物中暴发，影响了养殖行业的健康发展。临床上母猪感染可导致生殖系统障碍，马匹感染可导致淋巴结肿大、发烧和后躯肿大等症状。

目前，利用RT-PCR方法、血清学检测和抗原检测方法是检测GETV最常用的手段。RT-PCR方法存在对于实验仪器要求较高、且容易出现交叉污染的情况；血清学方法如间接ELISA，并不适用于早期的鉴别诊断，因疾病感染早期会出现抗体空白导致结果不准确的情况；且样本选择范围较小，只能通过采集血清进行检测，临床上效率低且可能会影响动物的临床生产；目前缺乏一种能够在早期检测GETV的抗原检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种盖他病毒的双抗体夹心ELISA检测试剂盒以及应用；本发明采用天然病毒作为免疫原，而非人为表达的GETV-E蛋白，从而最大程度筛选出能够特异性识别天然病毒构象的抗体，能够提高临床上对盖病毒检测的准确性；本发明的试剂盒能够识别天然病毒构象且具备早期鉴别诊断的优势，在临床检测上具有真实性和及时性，从而大幅度减少因盖他病毒引起的经济损失。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

第一方面，本发明首先提供了一种盖他病毒抗原捕获抗体，所述盖他病毒抗原捕获抗体主要采用纯化后的盖他病毒作为免疫原，免疫成年健康家兔后制备的多克隆抗体（又称兔源抗GETV多克隆抗体）。

在具体的实施方案中，所述的成年健康家兔为新西兰大白兔。

第二方面，本发明提供了一种盖他病毒酶标抗体，所述盖他病毒酶标抗体包括采用纯化后的盖他病毒作为免疫原，免疫BALB/c小鼠制备的单克隆抗体。

所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中：

所述重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸突变（如置换、插入或缺失等）的氨基酸序列；

所述轻链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、或95%以上同一性的序列，或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸突变（如置换、插入或缺失等）的氨基酸序列。

编码前述单克隆抗体的基因也在本发明的保护范围内。

在具体的实施方案中，所述的GETV酶标抗体标记了辣根过氧化物酶（又称酶标抗GETV单克隆抗体）。

在具体的实施方案中，本发明所述的免疫原选择为在BHK-21细胞中增殖的GETV-HN毒株，通过Reed-Muench法测定其TCID₅₀达到10^-8.0/mL，通过蔗糖密度梯度离心法纯化GETV-HN病毒粒子，通过BCA测定其浓度为2.0 mg/mL。以纯化后的病毒粒子作为免疫原。

其中，所述免疫原为具有天然构象的病毒粒子。

第三方面，本发明保护一种检测GETV病原的双抗体夹心ELISA试剂盒，主要包括前文所述的盖他病毒抗原捕获抗体和前文所述的盖他病毒酶标抗体。

在具体的实施方案中，所述试剂盒主要包括以下成分：包被有前文所述的盖他病毒抗原捕获抗体的酶标板、封闭液、前文所述的单克隆抗体（酶标抗体）、洗涤液、底物显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照以及样品稀释液。

本发明提供的检测GETV病原的双抗体夹心ELISA试剂盒，它采用蔗糖密度梯度离心纯化的GETV蛋白作为免疫原，免疫成年健康家兔后制备的多克隆抗体作为捕获抗体，免疫BALB/C小鼠后制备的单克隆抗体为检测抗体并标记了辣根过氧化物酶（HRP）。本发明的双抗体夹心ELISA试剂盒安全性、与RT-PCR检测结果具有100%符合率。

第四方面，本发明提供了一种前文所述的双抗体夹心ELISA试剂盒的构建方法，包括以下步骤：

（1）制备盖他病毒抗原捕获抗体和检测抗体（酶标抗体）：

（2）确定盖他病毒抗原捕获抗体和酶标抗体最佳稀释度；

（3）确定包被稀释液；

（4）确定包被温度和时间；

（5）确定封闭液；

（6）确定酶标抗体反应时间；

（7）确定抗原孵育时间；

（8）确定显色温度和时间。

在具体的实施方案中，所述步骤（2）中，捕获抗体的最适工作浓度为10 μg/mL，HRP-2B5最适的稀释倍数是1：800。

在具体的实施方案中，所述步骤（3）中，包被稀释液为碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃1.59g, NaHCO₃2.93 g, PH=9.6）。

在具体的实施方案中，所述步骤（4）中，包被温度4℃，包被过夜。

在具体的实施方案中，所述步骤（5）中，封闭液可选择1%BSA、5%BSA或5%脱脂乳等，更优选为5%脱脂乳。

在具体的实施方案中，所述步骤（6）中，酶标抗体反应时间为37 ℃ 60 min。

在具体的实施方案中，所述步骤（7）中，抗原孵育时间为37 ℃ 60 min。

在具体的实施方案中，所述步骤（8）中显色温度为37℃，显色时间为10min。

第五方面，本发明还保护前述盖他病毒抗原捕获抗体、盖他病毒抗原酶标抗体、前文所述的试剂盒，前文所述的构建方法在制备检测GETV病原的检测产品中的应用。

有益效果

1. 本发明选择的免疫原为蔗糖梯度离心的GETV，相比人为表达的GETV-E蛋白，其为天然构象，以填补原核表达构象与临床样品存在差异的弊端，经过SDS-PAGE分析可见病毒粒子的目的条带，无杂带，与预期相符，最终获得高纯度的盖他病毒。

2. 本发明制备的多克隆抗体和单克隆抗体均具有识别天然GETV构象的特性，对于临床检测可以增加双抗体夹心ELISA结果的可靠性和真实性。

3. 本发明有利于临床上动物感染早期的鉴别诊断，填补了目前GETV临床的早期检测方法的空白，能够提早发现并进行治疗，从而最大程度的降低GETV在临床上带来的损失。

4. 本发明特异性强，与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒不会发生交叉反应，试剂盒检测盖他病毒阳性和阴性样品与RT-PCR检测结果具有100%符合率。

5. 本发明稳定性高，批内及批间差异系数均小于10%。

6. 本发明操作快速，3h即可报告结果，一般技术人员按说明书即可操作，场地不受限制。

7. 待检样品选择范围较广，可以为血清也可以为粪便，采集方便、效率高且不妨碍动物正常生产。

具体实施方式

以下的实施例中的试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本发明的优点和特点将会随着实施例的阐释更加清楚，但实施例仅是范例性的，对本发明不构成任何限制。本领域技术人员对本发明的技术和形式的改变，都将落入本发明保护范围。

一种检测GETV病原的双抗体夹心ELISA试剂盒，主要包括盖他病毒抗原捕获抗体和盖他病毒酶标抗体，所述试剂盒主要包括以下成分：包被有抗GETV多克隆抗体的酶标板、封闭液、前文所述的单克隆抗体、洗涤液、底物显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照以及样品稀释液。

更具体的，所述的酶标板是由碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃1.59 g, NaHCO₃2.93 g, pH=9.6）作为包被液稀释前述盖他病毒抗原捕获抗体至终浓度为10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；第二日洗涤后用封闭液37 ℃封闭1-2 h，洗净后甩干塑封。

更具体的，所述封闭液可选择1%BSA、5%BSA或5%脱脂乳等，更优选为5%脱脂乳。

更具体的，所述的样品稀释液：NaCl 8.0 g；KH₂PO₄0.24 g；Na₂HPO₄·12H₂O 1.44g；KCl 0.2 g溶于1000 mL双蒸水中。

所述的洗涤液：NaCl 160.0 g；KH₂PO₄4.8 g；Na₂HPO₄12H₂O 28.8 g；KCl 4 g溶于1000 mL双蒸水，加入1.5 mL Tween-20。

所述的单克隆抗体为1：800~1600稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠源单克隆抗体。

所述底物显色液由A液和B液组成，其中：

所述的底物显色液A液：CH₃COONa 13.6 g，枸橼酸1.6 g，30%H₂O₂0.3 mL，ddH₂O定容至500 mL。

所述的底物显色液B液：EDTA-2Na 0.2 g，枸橼酸0.95 g，TMB 0.15 g，甘油50 mL，ddH₂O定容至500 mL。

所述的终止液：浓H₂SO₄10 mL，ddH₂O定容至100 mL。

实施例1 免疫原的制备

取生长状态良好的BHK-21单层细胞，弃掉培养液，加入10⁷PFU的GETV-HN毒株，置于37 ℃，CO₂浓度为5%的恒温培养箱内培养1 h后，弃掉培养液，加入DMEM不完全培养基，放入培养箱中培养，待细胞病变达到70-80%左右，将细胞培养物反复冻融2次后收取病毒液，-80 ℃保存。

将反复冻融2次后的病毒在4 ℃下以8000 r/min离心30 min，将GETV用不含血清的DMEM以10倍比稀释从1：10¹到1：10⁸，每个稀释比设置6个重复，将其接种到96孔板的BHK-21细胞中，并设置阳性对照和阴性对照。待病变后，用Reed-Muench法计算出GETV组织培养半数感染量（TCID₅₀）并记录下来。

病毒通过蔗糖密度梯度离心法进行纯化。首先取100 mL GETV细胞培养上清，加终浓度为7% PEG 6000（v / v）和2.3% NaCl（v / v）在4°C孵育过夜，以4000g离心30分钟并获得沉淀混合物，并用PBS重悬，即得粗提病毒。在冰上静置两小时后，将病毒粗制剂进行蔗糖20-60%（w /v）密度梯度离心，并以160,000g离心样品1.5 h。用针头收集GETV全病毒对应的光散射带，取纯化后病毒以PBS和Tris-HCL-EDTA（TE）透析48 h，即得病毒纯化制剂，作为免疫用的抗原。

实施例2 鼠源抗GETV单克隆抗体的制备

用纯化的GETV作为免疫原，对试验动物进行免疫。免疫方法如下：第一次免疫时，首次免疫（免疫原：弗氏完全佐剂=1：1，v / v），通过背部皮下多点注射方式进行BALB/C小鼠的免疫（200 μg/只）；14d后进行第二次免疫，再隔10 d进行三免（按照免疫原：弗式不完全佐剂=1：1，v / v）。在进行细胞融合的前3天，腹腔注射50 μg无佐剂的纯化后GETV以加强免疫。融合前收集阳性血清作为后续ELISA阳性对照。

融合后的杂交瘤细胞经ELISA筛选及有限稀释法进行3次亚克隆，得到稳定分泌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及单克隆抗体，得到2B5和1E12两株单克隆抗体，经过Westernblotting及IFA试验证明筛选获得的两株单克隆抗体可特异性识别GETV抗原。

其中，2B5的重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；轻链可变区具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列。

实施例3 兔源抗GETV多克隆抗体的制备

用纯化的GETV作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫。第一次免疫时，将600 µgGETV与等体积的弗氏完全佐剂涡旋混匀后，在冰浴中乳化，完全乳化后将其皮下注射；第一次免疫两周后，用弗氏不完全佐剂乳化等量的病毒，并使用相同的方法进行皮下注射；随后的第三次和第四次免疫接种使用与第二次免疫接种相同的方法进行。第四次免疫后一周采集兔血，分离血清，并通过间接ELISA法鉴定血清效价。将分离的血清作连续的倍比稀释，用纯化的GETV作为包被抗原，用分离血清作为一抗检测效价，当效价到达后续研究的要求时，心脏采集血液，静置过夜后3000 r/min分离血清，为后续抗体纯化做准备。

使用蛋白A亲和层析法来纯化腹水抗体。具体步骤如下：首先柱平衡，样品过柱前用5个柱床体积的平衡液冲洗亲和柱，进行柱平衡；将平衡好的Protein A Agrose Resin缓慢加入腹水5 mL，放于4 ℃摇床上结合过夜；次日，使用20 mL的PBS分三次过柱，以除去吸附的杂蛋白，并收集洗涤后的液体；再用15 mL的0.2 mol/L，pH=3.0洗脱液洗脱抗体，收集洗脱液后立即加入1 mol/L，pH=8.0中和液中和pH至7.0，-80 ℃保存备用。

以纯化后的单克隆抗体2B5和1E12为样品，使用辣根过氧化物酶标记试剂盒对其进行标记。首先将待标记的单克隆抗体置于透析袋中，放置于1 L 1×PBS溶液中4 ℃旋转透析过夜，恢复其pH值并将其溶剂置换为PBS缓冲液，然后取500 μL使用ddH₂O溶解的HRP溶液于5 mL离心管中，加入200 μL HRP活化缓冲液，于旋转混匀仪上避光室温缓慢反应30min，然后加入200 μL HRP偶联缓冲液，室温静置30 min，溶液缓慢变为棕黄色，再加入1 mg待偶联的单克隆抗体（体积控制在1 mL左右），轻轻混匀后将液体转移至已处理好的透析袋中，将透析袋置于2 L配制好的偶联透析液中，4℃旋转透析过夜。次日，将透析袋中液体转移至5 mL离心管中，加入100 μL还原剂，室温静置2 h，每间隔半小时轻轻混匀3-5次。将制备后的HRP-2B5和HRP-1E12放置-80℃备用。

1双抗体夹心ELISA捕获抗体和酶标抗体组合的确定

1.1实验方法

将先前制备的盖他病毒捕获抗体用pH=9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10 µg/mL，每孔100 µL每孔包被酶标板，4 ℃包被过夜；次日用0.05%吐温-20的PBS洗板五次，每次2 min，加入5%脱脂乳，200 µL每孔37 ℃下封闭1 h，然后洗五次，每次2 min；阳性孔中加入GETV，对应的阴性孔中加入细胞上清液，在37 ℃下孵育1 h，洗板五次，每次2 min；然后将先前测定的ELISA反应较高的2种酶标抗体分别1：800稀释，在37 ℃孵育1 h，洗五次，每次2 min；再加入底物显色液，37 ℃下避光孵育20 min，然后加50 µL的2M浓H₂SO₄以终止显色反应，通过酶标仪测得OD_450nm。

结果判定：P/N＝(待检样品孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)，当阳性对照孔的OD值(P)≥1.0、阴性对照孔的OD值(N)<0.2时，试验成立，待测样品孔P/N≥2.1时为阳性。P/N值越大，说明对应的捕获抗体与酶标抗体的组合越好。

1.2实验结果：

将纯化后的GETV兔源多克隆抗体作为盖他病毒抗原捕获抗体，HRP酶标单克隆抗体作为检测抗体，检测GETV，结果如表1所示，HRP-2B5的反应性显著强于HRP-1E12，因此选择HRP-2B5作为检测抗体。

表1捕获抗体和检测抗体最优组合的确定

2双抗体夹心ELISA捕获抗体和酶标抗体最佳稀释度的确定

2.1实验方法

采用棋盘滴定法进行最适浓度的筛选。用pH=9.6的碳酸盐缓冲液将捕获抗体分别稀释至2 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL和20 µg/mL的浓度进行包被，每孔100µL，4℃包被过夜；次日PBST洗板五次，每次2 min；加入5%脱脂乳，每孔200 µL，37 ℃封闭1 h，洗板五次，每次2 min；阳性孔中加入GETV，对应的阴性孔中加入细胞上清液，在37 ℃下孵育1 h，洗板五次，每次2 min；加入用PBS分别以1:800、1:1600、1:3200、1:6400和1:12800稀释度的酶标抗体进行37 ℃孵育30 min，洗五次，每次2 min；再加入底物显色液，37 ℃下避光孵育20min，然后加50 µL的2M浓H₂SO₄以终止显色反应，通过酶标仪测得OD_450nm。

2.2实验结果

计算P/N值，P/N最大值所对应的浓度就是盖他病毒抗原捕获抗体与酶标抗体的最佳工作浓度。结果如表2所示，选择P/N值最大时对应的浓度为最优工作浓度，最终确定GETV兔源多克隆抗体的最适工作浓度为10 μg/mL，HRP-2B5最适的稀释倍数是1：800。

表2捕获抗体和检测抗体浓度的优化

3最佳包被稀释液的确定

3.1实验方法

分别用pH=9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）、pH=7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）、pH=6.6的Tris-HCl缓冲液和pH=8.8的Tris-HCl缓冲液作为包被抗体稀释液，包被10 µg/mL的抗体，每孔100µL，4℃包被过夜；次日PBST洗板五次，每次2 min；加入5%脱脂乳，每孔200 µL，37℃封闭1 h，洗板五次，每次2 min；阳性孔中加入GETV，对应的阴性孔中加入细胞上清液，在37 ℃下孵育1 h，洗板五次，每次2 min；加入用PBS分别以1:800稀释度的酶标抗体进行37℃孵育30 min，洗五次，每次2 min；再加入底物显色液，37 ℃下避光孵育20 min，然后加50µL的2M浓H₂SO₄以终止显色反应，通过酶标仪测得OD_450nm。

3.2实验结果

计算4种包被稀释液OD_450nm值的P/N值，CBS（pH=9.6）作为包被液的包被效果最好，P/N值最大，因此以下试验均选择CBS（pH=9.6）作为包被液。

表3兔抗GETV多抗最佳包被条件确定

4最佳包被温度和时间的确定

4.1实验方法

用pH=9.6的碳酸盐缓冲液将盖他病毒抗原捕获抗体稀释至10 µg/mL的浓度进行包被，每孔100µL，包被时间和条件设定为37 ℃ 2小时，37 ℃ 2小时后4 ℃包被，4 ℃包被过夜；次日PBST洗板五次，每次2 min；加入5%脱脂乳，每孔200 µL，37 ℃封闭1 h，洗板五次，每次2 min；阳性孔中加入GETV，对应的阴性孔中加入细胞上清液，在37 ℃下孵育1 h，洗板五次，每次2 min；加入用PBS以1:800稀释的酶标抗体进行37 ℃孵育30 min，洗五次，每次2 min；再加入底物显色液，37 ℃下避光孵育20 min，然后加50 µL的2M浓H₂SO₄以终止显色反应，通过酶标仪测得OD_450nm。

4.2实验结果

以4 ℃过夜为条件包被时，P/N值显著优于另外两组，因此采用4 ℃过夜包被为最佳包被条件。

表4 最佳包被温度及时间的确定

5最佳封闭液优化

5.1实验方法

用pH=9.6的碳酸盐缓冲液将盖他病毒抗原捕获抗体稀释至10 µg/mL的浓度进行包被，每孔100µL，4 ℃包被过夜；次日PBST洗板五次，每次2 min；以1%BSA、5%BSA和5%脱脂奶粉为封闭液，对相同含量的GETV样品在37 ℃下封闭1 h和封闭2 h进行对比试验，每孔200 µL，37 ℃封闭1 h，洗板五次，每次2 min；阳性孔中加入GETV，对应的阴性孔中加入细胞上清液，在37 ℃下孵育1 h，洗板五次，每次2 min；加入用PBS以1:800稀释的酶标抗体进行37 ℃孵育30 min，洗五次，每次2 min；再加入底物显色液，37 ℃下避光孵育20 min，然后加50 µL的2M浓H₂SO₄以终止显色反应，通过酶标仪测得OD_450nm。

5.2实验结果

从表中数据可知，在不同种类封闭液但相同含量的GETV条件下，阳性检测值封闭2h约为封闭1 h的1.2~1.6倍；而阴性检测数值封闭2 h约为封闭1 h的0.8~1.1倍，相比而言采用37℃ 2 h封闭的条件最佳，并且用5%脱脂奶粉作为封闭液时P/N显著优于另外两组，为15.46，因此5%脱脂奶粉为最佳封闭液。

表5-1最佳封闭条件的确定

表5-2最佳封闭条件的确定

6酶标抗体最佳反应时间优化

6.1实验方法

用pH=9.6的碳酸盐缓冲液将盖他病毒抗原捕获抗体稀释至10 µg/mL的浓度进行包被，每孔100µL，4 ℃包被过夜；次日PBST洗板五次，每次2 min；以5%脱脂奶粉为封闭液，在37 ℃下封闭2 h，每孔200 µL，37 ℃封闭1 h，洗板五次，每次2 min；阳性孔中加入GETV，对应的阴性孔中加入细胞上清液，在37 ℃下孵育1 h，洗板五次，每次2 min；用PBS以1:800稀释的酶标抗体，最佳反应时间分为三组：37 ℃ 30 min，37 ℃ 60 min，37 ℃ 120 min，洗五次，每次2 min；再加入底物显色液，37 ℃下避光孵育20 min，然后加50 µL的2M浓H₂SO₄以终止显色反应，通过酶标仪测得OD_450nm。

6.2实验结果

结果如表6所示，酶标抗体于37 ℃孵育 1 h时，P/N值显著优于37 ℃ 30 min以及37 ℃ 2 h两组，选取此条件作为酶标检测抗体最佳反应时间。

表6酶标抗体最佳反应条件的确定

7抗原孵育时间的优化

7.1实验方法

用pH=9.6的碳酸盐缓冲液将盖他病毒抗原捕获抗体稀释至10 µg/mL的浓度进行包被，每孔100µL，4 ℃包被过夜；次日PBST洗板五次，每次2 min；以5%脱脂奶粉为封闭液，在37 ℃下封闭2 h，每孔200 µL，37 ℃封闭1 h，洗板五次，每次2 min；阳性孔加入GETV抗原，对应的阴性孔中加入细胞上清液，在37 ℃下孵育30 min、60 min、90 min和120 min，洗板五次，每次2 min；用PBS以1:800稀释的酶标抗体，在37 ℃下孵育60 min，洗五次，每次2min；再加入底物显色液，37 ℃下避光孵育20 min，然后加50 µL的2M浓H₂SO₄以终止显色反应，通过酶标仪测得OD_450nm。

7.2实验结果

结果如表7所示，抗原孵育时间在60 min时，P/N值最高，因此选取此条件作为抗原孵育的最佳反应时间。

表7 抗原孵育时间的优化

8显色条件的优化

8.1实验方法

用pH=9.6的碳酸盐缓冲液将盖他病毒抗原捕获抗体稀释至10 µg/mL的浓度进行包被，每孔100 µL，4 ℃包被过夜；次日PBST洗板五次，每次2 min；以5%脱脂奶粉为封闭液，在37 ℃下封闭2 h，每孔200 µL，37 ℃封闭1 h，洗板五次，每次2 min；阳性孔加入GETV抗原，对应的阴性孔中加入细胞上清液，在37 ℃下孵育60 min，洗板五次，每次2 min；用PBS以1:800稀释的酶标抗体，在37 ℃下孵育60 min，洗五次，每次2 min；再加入底物显色液，37 ℃下避光孵育，最佳显色时间分为三组，分别是10、20和30 min，然后加50 µL的2M浓H₂SO₄以终止显色反应，通过酶标仪测得OD_450nm。

8.2实验结果

加TMB显色液后避光于37 ℃孵育时，孵育时间越长，阴性孔背景颜色越深，37 ℃20 min的条件下P/N值最大，说明此条件是TMB显色最佳反应时间。

表8 TMB显色最佳反应条件的确定

实施例7 本发明试剂盒的特异性、灵敏性以及标准曲线的建立实验

1双抗体夹心ELISA方法阴阳临界值的确定

测定20份阴性临床样本OD_450nm的平均值（`x）为0.134，标准方差（S）=0.033。阴性，阳性样本临界值=OD_450nm≥`xOD_450nm+3S，得出临界值为0.233，说明当检测样品OD_450nm≥0.233，且P/N≥2时，判定为阳性。20份阴性样品检测结果见表9。

表9 GETV双抗体夹心ELISA检测方法判断标准的确定

2特异性实验

选取GETV抗原作为阳性对照，BHK-21细胞上清液作为阴性对照，将PDCoV、PEDV和TGEV病毒液作为待检抗原，判定检测方法的特异性，结果如表10所示，本发明所建立的夹心ELISA检测方法能够特异性识别GETV，具有良好的特异性。

表10 特异性检测结果

3敏感性实验

根据上述已确定的夹心ELISA的最佳工作条件，将10⁸TCID₅₀/mL的GETV液使用1×PBS梯度10倍稀释成不同TCID₅₀，将其作为待检抗原进行双抗体夹心ELISA检测。结果如表11所示，本发明建立的夹心ELISA方法对GETV的最低检出量为10³TCID₅₀/mL，敏感性良好。

表11 GETV敏感性检测结果

4重复性实验

根据上述已确定的夹心ELISA的最佳工作条件，进行批次内与批次间的重复性测定，结果如表12所示，本试验建立的检测GETV双抗体夹心ELISA方法的批间及批内变异系数小于10%，表明此方法检测时具有良好的重复性。

表12 重复性实验

5符合率实验

用建立好的双抗体夹心ELISA检测方法，对本实验室已保存的20份阳性抗原进行检测，同时选择本实验室保存的10个阴性样品进行检测，符合率达到100%，说明建立好的夹心ELISA检测方法可用于临床GETV抗原的检测，具有一定的实用价值。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims

1.检测盖他病毒病原的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，主要包括盖他病毒抗原捕获抗体和盖他病毒酶标抗体；所述盖他病毒抗原捕获抗体为采用纯化后的盖他病毒作为免疫原，免疫成年健康家兔后制备的多克隆抗体，所述盖他病毒酶标抗体为采用纯化后的盖他病毒作为免疫原，免疫BALB/c小鼠制备的单克隆抗体；

所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

所述轻链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的盖他病毒免疫原是具有天然构象的病毒粒子。

3.根据权利要求1-2任一所述的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体标记辣根过氧化物酶。

4.根据权利要求3所述的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主要包括以下成分：包被有兔源抗GETV多克隆抗体的酶标板、封闭液、酶标抗GETV单克隆抗体、洗涤液、底物显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照以及样品稀释液。

5.一种权利要求4所述的双抗体夹心ELISA试剂盒的构建方法，包括以下步骤：

（1）制备盖他病毒抗原捕获抗体和盖他病毒酶标抗体：

（2）确定盖他病毒抗原捕获抗体和酶标抗体最佳稀释度；

（3）确定包被稀释液；

（4）确定包被温度和时间；

（5）确定封闭液；

（6）确定酶标抗体反应时间；

（7）确定抗原孵育时间；

（8）确定显色温度和时间。

6. 根据权利要求5所述的双抗体夹心ELISA试剂盒的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）中，包被温度4℃，包被过夜；所述步骤（6）中，酶标抗体反应时间为37℃ 60 min。

7. 根据权利要求5所述的双抗体夹心ELISA试剂盒的构建方法，其特征在于，所述步骤（7）中，抗原孵育时间为37℃ 60 min；所述步骤（8）中显色温度为37℃，显色时间为10min。

8.权利要求1所述的盖他病毒酶标抗体，其特征在于，所述盖他病毒酶标抗体为采用纯化后的盖他病毒作为免疫原，免疫BALB/c小鼠制备的单克隆抗体；所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

所述轻链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

9.权利要求8所述的盖他病毒酶标抗体、权利要求1所述的试剂盒、权利要求5-7任一所述的双抗体夹心ELISA试剂盒的构建方法在制备非疾病诊断目的的检测GETV病原的检测产品中的应用。