CN116338193A - 一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用。所述的试剂盒中含有特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体包被的酶标板，其中所述的特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株ANSV‑VP7‑3G9分泌产生，所述的杂交瘤细胞株ANSV‑VP7‑3G9的保藏编号为CGMCC No.45157。本发明基于抗体捕获提出了一种非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，本发明的酶标板上首先包被一种可以识别抗原的单克隆抗体，利用单克隆抗体特异性地捕获抗原，再加入血清及酶标二抗。通过单克隆抗体捕获抗原，减少非目标抗原(如大肠杆菌)与ELISA酶标板的吸附作用，从而提高方法的特异性。该方法相比普通间接ELISA的2次级联放大作用变为三次级联放大，即保留了间接ELISA方法的敏感性，又提高了特异性。

Description

一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及一种间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用，特别涉及一种基于抗 体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用。本发明属于生物医药技 术领域。
背景技术
非洲马瘟(African horse sickness，AHS)是由非洲马瘟病毒(African horsesickness virus，AHSV)引起的马属动物发生的一种急性或亚急性虫媒传染病。该 病通过库蠓等吸血昆虫叮咬传播，主要症状为发热、皮下水肿和病毒血症，严重 时伴有组织和脏器出血，马属动物中马最易感，病死率可高达95％，骡驴次之。
尽管AHS的一些临诊症状和病理变化很典型，例如，患亚急性AHS的马匹 经常出现眶上水肿，结合相应病史足以做出初步诊断，但其他一些症状和病变的 特异性较低，可能与其他疾病相混淆，如马器质性脑病、马传染性贫血、亨德拉 病毒病、马病毒性动脉炎、马梨形虫病和紫癜性出血病，诊断时应加以排除。所 以实验室诊断对确诊性诊断至关重要。
目前非洲马瘟的实验室诊断方法的血清学检测方法主要包括酶联免疫吸附 试验(ELISA)、免疫印迹和微量补体结合实验进行抗体检测；病原学检测方法主 要包括用细胞接种、乳鼠接种等方法分离病毒，采用抗原ELISA、反转录聚合酶 链式反应(RT-PCR)和实时荧光RT-PCR进行病原学检测，采用病毒中和试验和 分型RT-PCR方法进行病毒定型。我国是非洲马瘟无疫区国家，该病的诊断主要 是核酸检测及抗体检测。目前国外有商品化的非洲马瘟血清学检测方法与病原学 检测方法诊断试剂，国内还缺乏相应的产品。
非洲马瘟病毒包含9个血清型，既非洲马瘟病毒1～9型(AHSV1～9)，由 10个双链RAN片段组成，编码7种结构蛋白(VP1–VP7)和4种非结构蛋白 (NS1,NS2,NS3和NS3a)。VP2蛋白基因序列在不同血清型间变化范围是 47.6％-71.4％，是最重要的血清型特异性抗原，而VP7是AHSV病毒最重要的 血清群特异性抗原，不同血清型之间同源性为94.3％-99.5％，在各血清型间高度 保守，因此VP7基因及蛋白也是AHSV病原学及血清学检测中重要的备选抗原。
在2020年，距离我国较近的泰国发生了非洲马瘟疫情，此外非洲马瘟最重 要的传播媒介拟蚁库蠓在我国华南地区已有相关报道，因此非洲马瘟具有传入我 国的潜在风险。而其中基于AHSV VP7抗原的ELISA方法可用于检测非洲马瘟 病毒群特异性抗体，并在2002年获得欧盟的认可，但目前我国仍没有相关商品 化产品，主要还是依靠进口。为有效及时应对非洲马瘟传入我国的风险，研发基 于非洲马瘟的ELISA抗体检测方法至关重要。
通常来说，间接ELISA相比C-ELISA敏感性高，但特异性不强，多假阳性， 前期我们利用纯化后的VP7蛋白作为包被抗原，建立了一种非洲马瘟ELISA抗 体检测方法，也证实了该方法存在大量假阳性结果(>30％)，因此无法作为非洲 马瘟诊断的有效血清学方法。为了减少假阳性结果，我们制定一种新的策略，研 发了一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测 试剂盒及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，所述的 试剂盒中含有特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体包被的酶标板，其中所 述的特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株 ANSV-VP7-3G9分泌产生，所述的杂交瘤细胞株命名为ANSV-VP7-3G9，分类命 名为分泌针对VP7蛋白的单克隆抗体细胞株，所述的单克隆抗体细胞株保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.45157，保藏时间是2022年5 月18日。
其中，优选的，所述的酶标板上还通过特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克 隆抗体捕获有纯化后的非洲马瘟病毒VP7蛋白。
其中，优选的，所述的纯化后的非洲马瘟病毒VP7蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
其中，优选的，所述的试剂盒中还含有HRP标记的抗马IgG二抗，封闭液、 稀释液、显色液以及终止液。
其中，优选的，所述的封闭液为5％w/w的脱脂乳，所述的稀释液为5％w/w 的脱脂乳或5％w/wBSA，所述的显色液为TMB显色液，所述的终止液为2M H2SO4。
其中，优选的，抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体浓度为2μg/mL、非洲 马瘟病毒VP7蛋白浓度为0.25μg/mL、血清稀释度为400倍稀释、HRP标记的 抗马IgG二抗浓度为20000倍稀释。
进一步的，本发明还提出了所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体 检测试剂盒在制备检测非洲马瘟病毒抗体试剂中的用途。
其中，优选的，所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒 在检测非洲马瘟病毒抗体时，按照以下步骤进行：
(1)将特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体按照2μg/mL浓度包被 酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；
(2)封闭液封闭后加入0.25μg/mL纯化后的非洲马瘟病毒VP7蛋白100μ L/孔，37℃作用30分钟；
(3)PBST洗涤2次后，加入1:400稀释的待检血清，37℃作用30分钟；
(4)PBST洗涤2次后，加入1:2000稀释的HRP标记的抗马IgG二抗，37℃ 作用30分钟；
(5)PBST洗涤2次后，加入显色液，100微升/孔，37℃显色10分钟；
(6)加入2M H2SO4进行终止，在OD450nm读值。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明基于抗体捕获提出了一种非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，本发 明的酶标板上首先包被一种可以识别抗原的单克隆抗体，利用单克隆抗体特异性 地捕获抗原，再加入血清及酶标二抗，具体步骤同间接ELISA原理。通过单克隆 抗体捕获抗原，减少非目标抗原(如大肠杆菌)与ELISA酶标板的吸附作用，从 而提高方法的特异性。该方法相比普通间接ELISA的2次级联放大作用变为三次 级联放大，即保留了间接ELISA方法的敏感性，又提高了特异性。
附图说明
图1为重组VP7蛋白的SDS-PAGE分析；
其中，M：蛋白Marker；1：重组菌破碎后上清；2：重组菌破碎后沉淀；
图2为重组VP7蛋白的SDS-PAGE分析；
其中，M：蛋白Marker；1：重组菌破碎后上清；2：重组菌破碎后沉淀；
图3为5株单克隆抗体效价测定结果；
图4为普通间接ELISA原理(左)及基于抗体捕获的间接ELISA原理(右)；
图5为不同单克隆抗体捕获抗原的能能力；
图6为对捕获抗体浓度、抗原浓度、血清稀释度及酶标抗原工作浓度的筛选；
图7为抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测方法特异性试验；
图8为商品化的非洲马瘟C-ELISA的敏感性；
图9为基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA的敏感性；
图10为加速不同天数下S/P值的统计结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分，而不是全部的实施例，基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1非洲马瘟病毒VP7蛋白的表达、纯化
1材料与方法
1.1质粒和菌株
Rosetta感受态细胞购自上海康为世纪有限公司；
1.2样品及试剂
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Gel Extraction Kit)、高纯度质粒小提试剂 盒(Pureplasmid Mini Kit)等均购自康为世纪有限公司；马传染性贫血病毒 (Equineinfections anemin virus，EIAV)、马流感病毒(Equine innuenza virus,EIV, (H7N7、H3N8))、马疱疹病毒(Equine herpes virus,EHV,I型、II型、III型、 IV型、VII型)、马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)、马链球菌 (Streptococcus equi,SE)等阳性血清保存于哈尔滨兽医研究所。
1.3目的蛋白的诱导表达、纯化
根据非洲马瘟诊断技术(GB/T 21675-2008)提供的VP7基因序列(GenBank:KT030566.1)，对VP7基因进行密码子优化，并将密码子优化后的VP7基因合 成到pET32a载体上。将合成的质粒转化入Rosetta，37℃培养12-14小时。将阳 性菌落，接种于5mL含有1μg/mL的氨苄青霉素抗性的新鲜LB液体培养基中， 在37℃下170r/min震荡培养16h，以1：100比例接种于Amp/LB液体培养基中， 37℃170r/min培养，等到菌液OD600nm为0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.6mmol/L 的IPTG，24℃进行诱导表达。诱导后，取4ml菌液，进行富集菌体并加入1.5ml PBS进行超声破碎；破碎后，4℃、12000r/min离心5min。沉淀同样用等量PBS 冲洗两遍，再用等量PBS重悬。分别取40μL上清样品和沉淀重悬样品，并各加 入10μL 5x SDS-PAGE LoadingBuffer混合均匀，95℃煮沸5min，取20μL处理 的样品进行SDS-PAGE，电泳结束后，用于考马斯亮蓝染色。以非洲马瘟的阳性 血清为一抗(1:200稀释)，HRP标记的抗马IgG为二抗(1:5000稀释)进行 Westernblot分析。
2.结果
2.1 VP7蛋白的表达与纯化
通过SDS-PAGE分析显示，重组pET32a-FljB菌，破碎后上清和沉淀中均出 现一条相对分子质量约52kDa的蛋白条带(图1)，证明重组蛋白获得表达，并 主要以包涵体形式存在。表达获得的VP7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 示。Westernblot分析表明重组蛋白与非洲马瘟阳性血清发生特异性反应(图2)， 与SDS-PAGE结果吻合，证实重组蛋白具有良好的反应原性。
实施例2单克隆抗体(捕获抗体)的制备
1材料
1.1免疫原纯化的非洲马瘟的VP7蛋白(实施例1制备，稀释含量1mg/ml)。
1.2细胞骨髓瘤细胞SP2/0，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。
1.3试验动物6～8周龄雌性Balb/c小鼠，由中国农业科学院哈尔滨兽医研 究所实验动物中心提供。
1.4细胞培养液含20％胎牛血清、青链霉素各100U(μg)/ml的1640培 养基，置2～8℃保存。1640培养基，购自Sigma公司；胎牛血清，购自Ausbian 公司。
1.5细胞冻存液取10ml二甲基亚砜(DMSO)，溶于90ml胎牛血清中，混 合均匀后，置2～8℃备用。
1.6试剂盒
1.6.1BCA试剂盒，购自Novagen公司。
1.6.2SBAClonotypingTMSystem/HRP，购自SouthernBiotech公司。
1.7其他试剂PEG4000、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和HRP标记的 羊抗鼠IgG，均购自Sigma公司；TMB显色液，购自Thermo公司；
2方法
2.1杂交瘤细胞的构建
2.1.1动物免疫
2.1.1.1一次免疫将纯化后的非洲马瘟VP7蛋白与等体积的弗氏完全佐剂 进行乳化作为免疫原，经背部皮下注射4-6周龄Balb/c小鼠，200μl(含VP7蛋 白100μg)/只。
2.1.1.2二次免疫首次免疫后3周，将纯化后的非洲马瘟VP7蛋白与等体 积的弗式不完全佐剂混合乳化作为免疫原，按照一次免疫的免疫方式和剂量采取 腹腔注射进行二次免疫。
2.1.1.3三次免疫二免后3周，将纯化后的非洲马瘟VP7蛋白与等体积的 弗式不完全佐剂混合乳化作为免疫原，按照二次免疫的免疫方式和剂量进行三次 免疫。
2.1.1.4第四次免疫细胞融合前3天，将纯化后的非洲马瘟VP7蛋白为免 疫原经腹腔注射接种小鼠，200μl(含VP7蛋白100μg)/只。
2.1.2骨髓瘤细胞的准备融合前1～2天，扩大培养骨髓瘤细胞，使其处于 对数生长期，且生长状态良好。融合当天，弃去培养液，并用无血清1640轻轻 冲洗两次，用15ml1640基础培养液将细胞从瓶壁上轻轻吹下。取少量骨瘤细胞 悬液，用细胞计数板计数，准备融合。
2.1.3免疫脾细胞的准备
2.1.3.1融合前，将加强免疫的小鼠眼球采血处死，制备阳性血清。浸泡于 75％酒精5分钟后放于超净工作台。
2.1.3.2将小鼠固定于鼠架上，无菌打开腹腔，分离结缔组织取出脾脏，将 脾脏放入盛有15ml 1640基础培养液的平皿中，用无菌注射器吸取培养液轻轻吹 出脾细胞，反复操作3～4次。
2.1.3.3将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加1640基础培养液约至30ml， 混匀。对细胞悬液用细胞计数板计数，备用。
2.1.4脾细胞与骨髓瘤细胞融合
2.1.4.1HAT培养液，1640培养液及1ml PEG4000水浴中预热，另备42℃ 预热的灭菌水500ml。
2.1.4.2上述准备的对数生长期SP2/0细胞与免疫小鼠脾细胞按1∶8入50ml 离心管中，轻轻颠倒混匀。800r/min离心10分钟，吸尽上清以免影响融合效率， 轻轻弹击离心管底部使细胞尽量均匀的铺满离心管底。
2.1.4.3融合过程在盛有42℃水的融合杯中进行，将1ml 37℃预热的 PEG4000溶液逐滴加入到50ml离心管中，边加边缓慢转动离心管，并于90秒内 加完，37℃静置1～2分钟。
2.1.4.4先慢后快地加入1640基础培养液终止反应，第1分钟滴加1ml 1640， 第2分钟滴加1ml 1640，第3分钟滴加3ml 1640，第4分钟滴加10ml 1640，第 5分钟滴加10ml1640。静置2分钟，轻轻颠倒2次，静置7分钟，以800r/min 离心10分钟，弃去上清。用110mlHAT培养液轻轻重悬细胞，200μl/孔接种于已 培养有饲养细胞的96孔培养板中，置37℃、5％的CO2培养箱中培养。
2.1.4.5 3天后半量换液，6天后半量换液，待细胞长至孔底面积1/4～1/3时 取上清进行筛选检测并更换为HT培养液。
2.1.5阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆应用间接ELISA方法检测杂交瘤 细胞培养上清，并通过2～3次连续的有限稀释克隆法筛选阳性克隆，对细胞株进 行扩大培养和冻存。间接ELISA方法如下：
2.1.5.1包被用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH值9.6)将非洲马瘟VP7蛋 白至1μg/ml，分别加入96孔酶联反应板，100μl/孔，置2～8℃过夜。
2.1.5.2洗涤弃去孔内液体，用PBST(0.01mol/L，pH值7.4)洗板3次， 250μl/孔，每次洗涤均将板倒扣于干燥滤纸上将液体拍干。
2.1.5.3封闭加入含5％脱脂乳的PBS(0.01mol/L，pH值7.4)，200μl/孔， 置37℃封闭2小时。
2.1.5.4洗涤方法同2.1.5.2项。
2.1.5.5加样加入待检样品，100μl/孔，37℃作用1小时。
2.1.5.6洗涤方法同2.1.5.2项
2.1.5.7加入二抗加入1：10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，100μl/ 孔，37℃作用30min。
2.1.5.8洗涤方法同2.1.5.2项
2.1.5.9显色加入TMB显色液，100μl/孔，置室温(15～25℃)显色(避 光孵育)5分钟。
2.1.5.10终止加入终止液50μl/孔，轻微振荡混匀后，在波长450nm下用 酶标仪读其OD450nm值(应在加入终止液后5分钟内完成读数)，并记录结果。
2.1.5.11判定
试验成立的条件当待检样品OD450nm值＞1.0且P/N值(P/N＝被测样品 OD450nm值/阴性对照OD450nm值)＞2.1，判定为阳性，其所对应的最大稀释 度为其效价。
2.1.6阳性杂交瘤细胞株的亚克隆用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的 亚克隆，克隆3次，至克隆孔内的抗体阳性率达到100％，将获得的阳性杂交瘤 细胞扩大培养后置液氮中冻存。
2.2单克隆抗体的制备和纯化
2.2.1腹水的制备取6～8周龄Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏 不完全佐剂，接种7～10天后，每只小鼠腹腔注射1～2.5×106个/0.5ml个生长良好 的杂交瘤细胞。待小鼠腹部明显膨大后抽取收集腹水。将收获腹水置4℃，以 10000r/min离心10分钟，取上清保存备用。
2.2.2单克隆抗体的纯化
2.2.2.1样品准备将制备的腹水室温溶解后，与4～5倍体积的结合/洗涤缓 冲液(20mmol/L磷酸纳，pH值7.0)混合后，经0.45μm滤器过滤。
2.2.2.2装柱平衡将HiTrap protein G填料(约2ml柱床体积)装入合适的 层析柱，用10倍柱体积的结合/洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸纳，pH值7.0)平衡， 流速为1ml/min。
2.2.2.3上样将样品加到平衡好的层析柱中，流速为0.2～1ml/min，收集流 出液，反复使样品流经柱子3～5次。
2.2.2.4洗涤用10～15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液(20mmol/L磷酸纳，pH 值7.0)清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白。
2.2.2.5洗脱用洗脱缓冲液(0.1mol/L甘氨酸，pH值2.7)进行洗脱5～6 次，每次洗脱体积1ml，收集流出液。洗脱后应立即用中和缓冲液(1mol/L Tris-HCl， pH值9.0)进行中和，每1ml洗脱流出液中加入约120μl中和缓冲液(1mol/L Tris-HCl，pH值9.0)。
2.3单克隆抗体的鉴定
2.3.1单克隆抗体亚类鉴定将筛选的单克隆细胞株株用SBA ClonotypingTMSystem/HRP试剂盒按照说明书对筛选出的单克隆抗体亚类进行 鉴定。
2.3.2蛋白浓度的测定按照BCA试剂盒说明书中检测方法，对纯化后单克 隆抗体蛋白浓度进行测定。
2.3.3效价测定取杂交瘤细胞株细胞纯化后的抗体用PBS(0.01mol/L，pH 值7.4)进行10倍梯度稀释，用间接ELISA的方法进行检测，将不同株抗体从 2.5μg/ml依次进行2倍梯度稀释。稀释后的抗体加入包被0.1μg VP7蛋白的ELISA 板中作用1h，然后加入1：10000倍稀释的HRP标记的抗鼠二抗作用30min，显 色10min。
3结果
3.1单克隆抗体细胞株的筛选
通过3轮纯化，共筛到5株能识别VP7融合蛋白的杂交瘤细胞株。
3.2单克隆抗体的鉴定
3.2.1单克隆抗体亚类鉴定按照SBA ClonotypingTMSystem/HRP试剂盒 说明书对筛选出的单克隆抗体亚类进行鉴定，结果表明(表1)3G9、6G4株单 克隆抗体亚类IgG1，3E9株单克隆抗体亚类IgG2a，5E2株单克隆抗体亚类IgG2b，5株单克隆抗体轻链均为κ型。
表1单克隆抗体1A10亚类鉴定结果
Figure BDA0003763575080000101
3.2.2效价测定用间接ELISA的方法测定5株杂交瘤细胞株纯化后抗体的 效价。结果表明3G9、3E9、6G4效价最高，8.2x105，其次是8B5，效价为4.1x105， 5E2效价最低，效价为2.0x105(图3)。
实施例3基于抗体捕获的非洲马瘟ELISA抗体检测方法的建立
1、抗体捕获间接ELISA反应原理设计
常规间接ELISA抗体检测方法原理(图4左)：当进行血清样品检测时，样 品中的受检物质(抗体)与固定ELISA板子上的抗原结合。通过洗板除去非结合 物，再加入酶标记的抗体，此时，能固定下来的酶量与样品中被检物质的量呈正 相关。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中待检抗 体含量，从而对结果进行定性或定量分析。一般包被抗原多来源于利用大肠杆菌 表达系统进行的原核表达，如果纯化的抗原纯度不够，大肠杆菌抗原则会非特异 性吸附到ELISA板子上，若待检血清中含有大肠杆菌的抗体，则会造成假阳性结 果，而马属动物血清中含有大肠杆菌抗体比较常见，因此也会存在较多假阳性结 果。因此，间接ELISA虽然相比竞争ELISA敏感，但特异性不好，也进一步限制了该方法的应用。为了达到既保留间接ELISA的敏感性，又能提高间接ELISA 的特异性，本发明人设计了基于抗体捕获的间接ELISA反应原理(图4右)：首 先包被一种可以识别抗原的单克隆抗体，利用单克隆抗体特异性地捕获抗原，再 加入血清及酶标二抗，具体步骤同间接ELISA原理。通过单克隆抗体捕获抗原， 减少非目标抗原(如大肠杆菌)与ELISA酶标板的吸附作用，从而提高方法的特 异性。该方法相比普通间接ELISA的2次级联放大作用变为三次级联放大，即保 留了间接ELISA方法的敏感性，又提高了特异性。
2、捕获抗体的筛选
将不同的单克隆抗体进行包被，对5株抗体的捕获抗原的能力进行筛选。具 体步骤如下：
(1)将5株纯化后单克隆抗体分别按照2μg/mL浓度包被(100μL/孔)，4℃ 包被过夜(>12h)；
(2)封闭液封闭后加入0.25μg/mL(100μL/孔)VP7抗原(实施例1制备)， 37℃作用30分钟；
(3)PBST洗涤2次后，加入1:400稀释的AHSV阳性血清，37℃作用30 分钟；
(4)PBST洗涤2次后，加入1:2000稀释的酶标二抗(HRP标记的抗马IgG 二抗)，37℃作用30分钟；
(5)PBST洗涤2次后，加入显色液(100微升/孔)37℃显色10分钟；
(6)加入2M H2SO4进行终止，在OD450nm读值。
其中，封闭液为5％w/w的脱脂乳，稀释液为5％w/w的脱脂乳或5％w/wBSA， 显色液为TMB显色液，所述的终止液为2M H2SO4。
结果表明，采用抗原捕获的原理，5株纯化后单克隆抗体仅3G9具备捕获 VP7抗原的能力。因此后续ELISA方法反应条件的优化以3G9抗体为捕获抗体 进行试验。
将分泌单克隆抗体3G9的杂交瘤细胞株命名为ANSV-VP7-3G9，分类命名为 分泌针对VP7蛋白的单克隆抗体细胞株，所述的单克隆抗体细胞株保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter,CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.45157，保藏时间是2022年5月18日。
3、最佳捕获抗体浓度、抗原浓度、血清稀释度及酶标抗原工作浓度的筛选
采用抗体捕获(图4右)的反应策略分别对包被抗体浓度、抗原浓度、血清 稀释度及酶标抗原工作浓度进行反应条件优化和筛选，确定反应策略的最佳反应 条件(如图6)。最终确定条件为：捕获抗体浓度为2μg/mL、抗原浓度为0.25μg/mL、 血清稀释度为400倍稀释、酶标二抗浓度为20000倍稀释。
4、基于抗体捕获的非洲马瘟ELISA抗体检测方法临界值的确定
应用优化的非洲马瘟ELISA抗体检测方法对1000份非洲马瘟阴性血清进行 检测，利用以下公式进行计算S/P值，根据1000份非洲马瘟阴性血清计算结果， 其S/P值最均低于0.22，为了保证结果的准确性，将临界值定为0.25。因此，当 待检血清样品的抑制率值大于或等于临界值(Cutoff)时判为阳性，低于临界值 时则判为阴性。
Figure BDA0003763575080000121
5、特异性试验
利用优化出的最佳反应条件，对非洲马瘟阳性血清(AHSV)、马传染性贫血 病病毒(EIAV)、马动脉炎病毒(EAV)、马疱疹病毒(EHV)、马流感病毒(EIV)、 马泰勒虫(T.equi)、马巴贝斯虫(B.caballi)、马腺疫链球菌(S.equi)、马流产沙 门氏菌(S.abortus equi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhi)、都柏林沙门氏菌(S.dublin)、 肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)等阳性血清进行检测，评估非洲马瘟ELISA抗体检 测方法的特异性，结果显示，只有非洲马瘟阳性血清呈阳性，而其他病原阳性血 清检测结果均为阴性(如图7)。因此证明该方法具有良好的特异性。
5、基于抗体捕获的非洲马瘟ELISA与商品化非洲马瘟ELISA抗体方法检测 马血清样品敏感性的对比
对1份非洲马瘟阳性血清，分别采用本发明建立的基于抗体捕获的非洲马瘟ELISA和商品化的非洲马瘟C-ELISA方法进行检测。结果表明商品化C-ELISA (图8)检测阳性样品的最大稀释度均为16倍稀释(16×)，而本发明检测阳性血 清最大稀释度也为16倍(图9)，所以，基于抗体捕获的非洲马瘟ELISA与商品 化的C-ELISA检测的敏感性相当。
6.抗体捕获的非洲马瘟ELISA抗体检测方法的重复性
由3个成员分别对7份血清进行检测，对检测结果进行计算，统计3个成员 结果的组内变异系数以及组间变异系数(如表2)(变异系数＝标准差/平均数)。 结果表明，对于7份血清，3个成员检测结果的组内变异系数范围为别为 3.19％-7.02％、0％-3.11％、0.27％-5.26％。3个成员检测结果为1.17-6.65％。无论 组内还是组间变异系数均＜8％，因此证明该试剂盒具有良好的稳定性。
表2组内、组间变异系数
Figure BDA0003763575080000131
7.抗体捕获的非洲马瘟ELISA抗体检测方法加速试验
将配制的3套非洲马瘟ELISA试剂盒放置37℃，每天对敏控血清进行效价 检测(0-8天)。由3人分别对敏控血清进行效价测定试验，每人做2个重复，共 6个重复37℃存放1天相当于4℃保存1月。试验成立的条件阳性对照血清 OD450nm值>0.8，阴性对照血清OD450nm值＜0.25，则判为试验成立。结果判定检 测样品S/P值≥0.25时，判为阳性；检测样品S/P值＜0.25时，判为阴性。计算 S/P值后，对3人的数据进行统计(图10)。结果表明加速第0-8天，不同血清稀 释度的S/P值均比较平缓，证明该试剂盒比较稳定。对非洲马瘟ELISA试剂盒保存期加速试验结果进行统计(如表3)，当加速第8天时，成员1、成员3所做阳 性血清OD450nm>0.8，敏控血清效价为3200x，成员2所做阳性血清 OD450nm＝0.798略低于0.8，试验不成立，但敏控血清效价仍满足3200。在加速 第7天时，3人的试验均成立，测定效价均为3200x，试剂盒合格，为保证试剂 盒的稳定性，暂定非洲马瘟ELISA试剂盒保存期为4℃保存6个月。
表3非洲马瘟ELISA试剂盒保存期加速试验统计结果
Figure BDA0003763575080000132
8、临床样品的检测
8.1基于抗体捕获的非洲马瘟ELISA检测标准血清
应用本发明建立的基于抗体捕获的非洲马瘟ELISA方法对商品化非洲马瘟 ELISA阳性(10)和阴性样品(400份)进行检测，结果如表4所示。基于抗体捕 获的非洲马瘟ELISA和商品化非洲马瘟ELISA的阳性和阴性符合率均为100％。
表4临床样品的检测结果
Figure BDA0003763575080000141
注：“+”代表阳性结果，“-”代表阴性结果
8.2基于抗体捕获的非洲马瘟ELISA检测临床样品
利用抗体捕获的非洲马瘟ELISA对我国18个省份或地区共947份临床血清进 行检测，结果表明非洲马瘟抗体阳性率为0％。因此我国目前还没有非洲马瘟传入， 本发明对我国非洲马瘟的监测以及防控具有重要的意义。

Claims (8)

1.一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体包被的酶标板，其中所述的特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株ANSV-VP7-3G9分泌产生，所述的杂交瘤细胞株ANSV-VP7-3G9保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.45157。
2.如权利要求1所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标板上还通过特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体捕获有纯化后的非洲马瘟病毒VP7蛋白。
3.如权利要求1所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的纯化后的非洲马瘟病毒VP7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有HRP标记的抗马IgG二抗，封闭液、稀释液、显色液以及终止液。
5.如权利要求4所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭液为5％w/w的脱脂乳，所述的稀释液为5％w/w的脱脂乳或5％w/wBSA，所述的显色液为TMB显色液，所述的终止液为2M H2SO4。
6.如权利要求4所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体浓度为2μg/mL、非洲马瘟病毒VP7蛋白浓度为0.25μg/mL、血清稀释度为400倍稀释、HRP标记的抗马IgG二抗浓度为20000倍稀释。
7.权利要求1-6任一项所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒在制备检测非洲马瘟病毒抗体试剂中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，所述的基于抗体捕获的非洲马瘟间接ELISA抗体检测试剂盒在检测非洲马瘟病毒抗体时，按照以下步骤进行：
(1)将特异性抗非洲马瘟病毒VP7蛋白单克隆抗体按照2μg/mL浓度包被酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；
(2)封闭液封闭后加入0.25μg/mL纯化后的非洲马瘟病毒VP7蛋白100μL/孔，37℃作用30分钟；
(3)PBST洗涤2次后，加入1:400稀释的待检血清，37℃作用30分钟；
(4)PBST洗涤2次后，加入1:2000稀释的HRP标记的抗马IgG二抗，37℃作用30分钟；
(5)PBST洗涤2次后，加入显色液，100微升/孔，37℃显色10分钟；
(6)加入2M H2SO4进行终止，在OD450nm读值。
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