CN101672849A - 鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒及其制备方法和用途，该试剂盒包括EHDV抗原包被ELISA板、单克隆抗体IgG－HRP酶结合物、阳性血清、阴性血清、20倍浓缩洗涤液、10倍浓缩稀释液、底物I、底物II、底物III、终止液。制备方法包括：a、制备鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原，并检定鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性；b、制备抗鹿流行性出血病病毒的单克隆抗体，并对抗体辣根过氧化酶(HRP)酶结合物进行制备与鉴定；c、制备阳性血清和阴性血清；d、制备鹿流行性出血病病毒抗原包被的ELISA板；e、制备20倍浓缩洗涤液和10倍浓缩稀释液，并制备底物I、底物II、底物III及终止液；f、组装试剂盒。本发明的试剂盒用于鹿流行性出血病的诊断、检疫、检测和流行病学调查，具有特异性强，敏感性高等特点。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种鹿流行性出血病病毒抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒及其制备方法和用途。
【背景技术】
鹿流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease of deer，EHD)是一种季节性、非接触性的病毒性传染病。鹿流行性出血病病毒(EHDV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的成员，是通过节肢动物(主要是库蠓)传播的双股RNA病毒，在形态结构上与蓝舌病病毒(BTV)极为相似，血清学上与蓝舌病有明显交叉。在自然条件下，鹿流行性出血病病毒可引起牛、绵羊等家畜及白尾鹿(Odocoileusvirginianus)、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物感染。美国已从白尾鹿、黑尾鹿、绵羊、山羊、牛、野牛及库蠓体内分离到了病毒。以白尾鹿最为严重，临床特征为体温短暂升高，呈休克症状，粘膜和浆膜出血，于昏迷状态下死亡。病变呈广泛性充血、出血、严重水肿和血管坏死，有时出现腹膜水肿。绵羊EHD与蓝舌病(bluetongue virus，BTV)相似，死亡率2～30％，牛感染后可以检测到抗体，但不表现症状，美国牛群中EHD病毒的血清阳性相当普遍。该病在日本、中国台湾、朝鲜都有报道，临床以发热、精神沉郁、吞咽困难、消瘦等为特征，有时还导致怀孕牛流产、死产。
目前EHD共发现8个血清型，美国大多为EHDV-2、EHDV-1，澳大利亚有EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等6个血清型。尼日利亚]分离到EHDV-3、EHDV-4。另外，印度尼西亚、中国台湾省、马来西亚、菲律宾、圭亚等地都分离到EHDV。本病目前尚无有效疫苗和治疗措施，控制和消灭EHD必须花费大量的人力物力，给EHDV流行的国家带来很大的经济损失。建立基于单克隆抗体的鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)方法，是动物检疫中急需解决的关键技术问题。
【发明内容】
本发明旨在解决上述问题，而提供一种特异性强，敏感性高，适用于鹿流行性出血病的快速诊断、检测、检疫和流行病学调查的鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒。
本发明的目的还在于提供该鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒的制备方法。
本发明的另一目的在于提供该鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒的用途。
为实现上述目的，本发明提供一种鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒，该试剂盒包括：
EHDV抗原包被ELISA板
单克隆抗体IgG-HRP酶结合物
阳性血清
阴性血清
20倍浓缩洗涤液
10倍浓缩稀释液
底物I
底物II
底物III
终止液
其中，所述单克隆抗体IgG-HRP酶结合物为辣根过氧化酶(HRP)标记的鼠抗鹿流行性出血病病毒的特异性单克隆抗体(McAb)(IgG)；20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％Tween-20的0.01mol/L pH7.4的PBST(磷酸缓冲液)，10倍浓缩稀释液为10倍浓缩的含1％明胶的PBST；底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液；底物II为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；底物III为双氧水(H2O2)溶液；终止液为1mol/L H2SO4硫酸溶液。
该试剂盒的优选方案包括：
EHDV抗原包被ELISA板 2板96孔酶标板
单克隆抗体IgG-HRP酶结合物 0.5ml
阳性血清 1ml
阴性血清 1ml
20倍浓缩洗涤液 50ml
10倍浓缩稀释液 30ml
底物I 20ml
底物II 2ml
底物III 1ml
终止液 20ml
其中，所述单克隆抗体IgG-HRP酶结合物为辣根过氧化酶(HRP)标记的鼠抗鹿流行性出血病病毒的特异性单克隆抗体(McAb)(IgG)；20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％Tween-20的0.01mol/L pH7.4的PBST(磷酸盐缓冲液)；10倍浓缩稀释液为10倍浓缩的含1％明胶的PBST；底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液；底物II为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；底物III为双氧水(H2O2)溶液；终止液为1mol/L H2SO4硫酸溶液。
本发明还提供了所述鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒的制备方法，该方法包括：
a、制备鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原，并检定鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性；
b、制备抗鹿流行性出血病病毒的单克隆抗体，并对抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体辣根过氧化酶(HRP)酶结合物进行制备与鉴定；
c、制备阳性血清和阴性血清；
d、制备鹿流行性出血病病毒抗原包被的ELISA板；
e、制备20倍浓缩洗涤液和10倍浓缩稀释液，并制备底物I、底物II、底物III及终止液；
f、将上述制备好的ELISA抗原包被板、酶结合物、10倍浓缩稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液I、底物液II、底物液III、终止液、阳性血清、阴性血清定量分装，分别贴上标签与说明，并装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。
步骤a中，鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的制备方法为：将BHK-21细胞长成单层后接种EHDV，无血清的基础培养基培养，细胞病变达75％以上时，收获病毒，反复冻融3次，以8000转/分离心30分钟，取上清液，加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒；采用20％、60％(w/v)不连续蔗糖密度梯度20000r/分钟4℃超速离心3小时，收获提纯的病毒条带作为抗原；鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性检定方法为：将纯化的病毒抗原用维持液作适当稀释接种到已长成单层的BHK21细胞上，同时作正常细胞对照，传二代，无CPE出现，表明作为包被抗原用的病毒已灭活彻底，纯化的抗原是安全的。
步骤b中，抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备方法为：用提纯的鹿流行性出血病抗原分别加等体积弗氏完全佐剂乳化和弗氏不完全佐剂乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW4000)融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV的阳性孔，获得能稳定传代并分泌抗EHDV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，利用BALB/c小鼠制备抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体腹水；抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体辣根过氧化酶(HRP)酶结合物的制备与鉴定方法为：将抗鹿流行性出血病病毒BALB/c小鼠腹水McAb，分别经1次50％和2次33％饱和硫酸铵沉淀提纯，透析除盐；用改良过的过碘酸氧化法将辣根过氧化物酶(HRP)标记于单克隆抗体，1mL/管分装，-80℃温度保存。
步骤c中，阳性血清的制备方法为：挑选体格健壮的18个月以上的山羊2～3只，将纯化后EHDV与等体积弗氏完全佐剂乳化，充分混匀后经背部皮下注射，2mL/只，首免后第2周和第4周分别用EHDV相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂(FIA)进行二免和三免后，无菌采血分离血清，1mL/管分装，-80℃温度保存；阴性血清的制备方法为：选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血用血清中和试验或酶联免疫吸附试验检测血清中是否有鹿流行性出血病的抗体，证实无鹿流行性出血病抗体的山羊，无菌采血分离血清，1mL/管分装，-80℃温度保存。
步骤d中，鹿流行性出血病病毒抗原包被ELISA板的制备方法：将纯化后的鹿流行性出血病病毒用优化好的上述包被缓冲液稀释成4.0μg/mL，以50μL/孔加入ELISA板，置4℃温度的冰箱中过夜包被，拍干ELISA板；以200μL/孔加入优化好的封闭液，置4℃温度的冰箱中封闭过夜；彻底拍干ELISA板。将已包被好的ELISA板置于铝簿或簿锡纸中，内置2g硅胶干燥剂，封口，置4℃温度保存。
步骤e中，20倍浓缩洗涤液制备方法为：NaCL160g，KH2PO44g，Na2HPO4.12H2O 58g，KCL4g，Tween-2010mL，蒸馏水1000mL，充分溶解，另加0.01％的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌后分装；10倍浓缩稀释液制备方法为：NaCL80g，KH2PO42g，Na2HPO4.12H2O 29g，KCL 2g，Tween-205mL，明胶100g，蒸馏水1000mL，充分溶解，另加0.01％的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌后分装；所述底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液，底物II为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，底物III为双氧水(H2O2)溶液，终止液为1mol/L H2SO4硫酸溶液。
本发明的试剂盒的检测操作流程为：用稀释液以1∶10稀释阳性、阴性对照血清和所有被检血清，加入ELISA板，每份被检血清样品做两孔，每孔加50μL；37℃湿盒感作45分钟，每孔加50μLHRP标记的McAb酶结合物，酶标板置37℃温度湿盒感作40分钟；洗板四次，每孔加100μL底物液，酶标板置湿盒暗盒15分钟；加入50μL/孔终止液；用酶标仪在波长450nm下测定光密度值(OD值)，计算抑制百分率(PI)。
本发明还进一步提供了该鹿流行性出血病病毒抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒的用途，该试剂盒用于鹿流行性出血病的诊断、检疫、检测和流行病学调查。
本发明的贡献在于，它解决了鹿流行性出血病病毒的快速检测及诊断问题。本发明的鹿流行性出血病病毒抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒具有特异性强，敏感性高等特点，可适用于鹿流行性出血病的快速诊断、检测、检疫和流行病学调查。
【具体实施方式】
本发明的鹿流行性出血病病毒抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒的制备方法包括但不限于下述实施例。该方法的具体步骤为：
1、鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的制备：BHK-21细胞长成单层后接种鹿流行性出血病病毒EHDV，于37℃温度反应1小时。加入无血清的基础培养基继续培养，3～4d后细胞病变(CPE)达75％以上时，收获病毒。将收获的病毒液反复冻融3次，以8000转/分离心30分钟，取上清液，加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒。以28000转/分及4℃温度超速离心3小时。沉淀用1/100原体积的PBS(磷酸缓冲液)溶解，然后采用20％、60％(w/v)不连续蔗糖密度梯度20000转/分及4℃温度超速离心3小时，收获提纯的病毒条带作为抗原，用DU800核酸蛋白分析仪测定蛋白含量，-20℃温度保存备用。
2、鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原安全性检定：将纯化的病毒抗原用维持液作适当稀释(1∶10～1∶100)接种到已长成单层的BHK21细胞上，同时作正常细胞对照。在37℃温度培养6d，接种细胞与正常细胞相同，无CPE出现；取培养液上清(包括正常细胞培养液上清)包被酶标板，用阳性血清进行检测，病毒培养液和正常细胞培养液显色情况一致，均为无色，表明作为包被抗原用的病毒已灭活彻底，不具感染性，ELISA包被抗原是安全的。
3、抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备：首先进行鹿流行性出血病病毒的培养和纯化，用EHDV病毒接种BHK-21细胞长成单层，收获的细胞培养病毒液反复冻融3次，以8000转/分离心30分钟，取上清液，超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心，收获提纯的病毒条带，用核酸蛋白分析仪测定蛋白含量为2.85g/L，于-20℃温度保存备用；用提纯的鹿流行性出血病病毒抗原分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW4000)融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗EHDV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；将获得的分泌抗EHDV的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔制备单抗腹水；采集单克隆抗体腹水，测定抗体效价、蛋白含量和亲和力，腹水ELISA效价高达为1∶512000，用核酸蛋白分析仪测定纯化腹水IgG的含量为1.56g/L。亲和力分常数高达6.12×107mol/L。用间接ELISA方法鉴定制备的单克隆抗体仅与鹿流行性出血病病毒有特异性免疫反应，而与其它相关病毒(如BTV、VSV、AKV、PPRV、BVDV等)没有任何免疫反应。
4、抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体辣根过氧化酶(HRP)酶结合物的制备与鉴定：将抗鹿流行性出血病病毒BALB/c小鼠腹水McAb，分别经1次50％和2次33％饱和硫酸铵沉淀提纯，透析除盐；用改良过的过碘酸氧化法将辣根过氧化物酶(HRP)标记于单克隆抗体。标记程序如下：将5mg HRP溶于0.5mL 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5mL 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。加0.75mL 0.1mol/L Na2CO3混匀。加入0.75mL纯化单抗(15mg/mL)，混匀。称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5mL注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套，盖紧，于4℃温度过夜。用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积的新鲜配制的5mg/mL NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20体积的NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或于4℃温度过夜)。将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。测定克分子比值和标记率，鉴定酶结合物质量，用ELISA法测定酶活性和抗体活性。HRP抗体酶结合物的保存时，加入等量甘油(或1％BSA和50％甘油)后，小量分装于-20℃温度存放。
5、阳性血清的制备：挑选体格健壮的18个月以上的山羊2～3只，将纯化后的鹿流行性出血病病毒EHDV与等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化，充分混匀后经背部皮下注射，2mL/只；首免后第2周和第4周分别用EHDV相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂(FIA)进行二免和三免；待山羊血清中抗鹿流行性出血病病毒IgG抗体酶联免疫吸附试验效价达1∶500以上，无菌采血分离血清，离心或过滤除去沉淀，进行56℃温度加热30分钟灭活，用血清保存液配方I按1∶2稀释(能用正常的山羊血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本)，抽滤除菌，1mL/管分装，贴上标签，于-80℃温度保存。不可反复冻融，解冻后只能在4℃温度保存一周。
6、阴性血清的制备：选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血用行业标准SNT1167-2002《鹿流行性出血病琼脂免疫扩散试验操作规程》检测方法确认的血清中是否有鹿流行性出血病的抗体，证实无鹿流行性出血病抗体的山羊，无菌采血分离血清。用血清保存液配方I按1∶2稀释，1mL/管分装，贴上标签，于-80℃温度保存。
7、包被缓冲液的优化：包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，用碳酸盐缓冲液0.05mol/L pH9.6、磷酸盐缓冲液0.05mol/L pH7.6和Tris盐酸缓冲液0.05mol/L pH7.6三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5μg/ml和2.5μg/ml，酶标抗体工作浓度为1∶1000及1∶500，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统。同时为了保证缓冲液能够长期保存，在包被液中添加了0.01％的硫柳汞作为防腐剂。结果获得以下最佳包被液的配方：0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液(NaHCO31.465g、Na2CO30.795g或Na2CO3.10H2O 1.2g、水500mL)中含0.01％的硫柳汞、1μg/ml两性霉素B、谷氨酸钠1％、1％BSA、30μg/mL蛋白酶抑制剂(胰凝乳蛋白酶)等，溶解后过滤除菌，置于4℃温度冰箱，一周内使用。
8、最适抗原包被浓度的优化：抗原纯化后要准确测定蛋白质浓度，用优化好的上述包被缓冲液，将包被抗原稀释成0.1μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，6.0μg/mL，8.0μg/mL，10.0μg/mL等6个浓度，包被ELISA板，每孔100μL，进行ELISA测定。经孵育、显色、终止后，用自动酶标仪分析。显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，选择浓度最低而OD值最大的包被抗原量作为最适抗原包被浓度，测得蛋白质的最适包被浓度为2.0μg/mL～4μg/mL。
9、酶标抗体稀释度的优化：抗原包被浓度为4μg/mL，将酶标抗体做系列稀释：1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800，经孵育、洗涤及显色终止后，用自动酶标仪分析，选择OD值为1～1.5左右的酶标抗体稀释度为最适工作浓度。结果表明，将酶标抗体做1∶1000稀释时，OD值为1～1.5左右。
10、抗原抗体反应时间和McAb竞争反应时间的优化：以反应时间短、效果最好、背景值最低为原则，反应时间采用20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、60分钟等8个点进行比较，结果表明，当抗原抗体反应时间为45分钟、McAb竞争反应时间为40分钟时效果最好，背景值低。
11、底物作用时间的优化：在其它条件相同的情况下，采用5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟等7个时间点进行比较，获得15分钟为最佳的底物作用时间。
12、20倍浓缩洗涤液、10倍浓缩稀释液、底物液、终止液的优选：本发明通过试验，选定如下最佳的洗涤液、稀释液、底物液配方：
(1)20倍浓缩洗涤液配方：NaCL160g，KH2PO44g，Na2HPO4.12H2O 58g，KCL4g，Tween-2010mL，蒸馏水1000mL，充分溶解，另加0.01％的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌后分装。用时作20倍稀释。
(2)10倍浓缩稀释液配方：NaCL80g，KH2PO42g，Na2HPO4.12H2O 29g，KCL 2g，Tween-205mL，明胶100g，蒸馏水1000mL，充分溶解，另加0.01％的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌后分装。用时作10倍稀释。
(3)底物液的优选：底物液I配方：乙酸-柠檬酸缓冲液(pH6.0)：乙酸钠(A液)——乙酸钠1.64g、水200mL，溶解后置于4℃温度冰箱备用；柠檬酸(B液)——柠檬酸2.1g、水100mL，溶解后置于4℃温度冰箱备用。配制：取B液约2mL至A液中调pH值至6.0，置于4℃温度冰箱备用。另加0.01％的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌分装。底物液II配方：TMB溶液：TMB350mg、甲醇100mL，加温溶解后保存于不透光的棕色瓶中，保存于室温或在2℃～7℃温度保存。底物液III配方：每个ELISA试剂盒配一管0.5mL的30％H2O2，临用时再按每10ml底物液10μL。工作底物液配制：临用前配制。取底物液I(37℃)9.7mL、底物液II 300μL、底物液III 10μL混合。
(4)终止液的优选：采用1mol/L H2SO4、1.5％NaF、0.1％叠氮钠和1％十二烷基硫酸钠(SDS)作为终止液，进行优选，结果以1mol/L H2SO4的终止液效果最好。
13、封闭液和封闭方法的优选：经试验，选定0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)中含1％牛血清白蛋白(BSA)、2％明胶、0.01％硫柳汞、两性霉素B(1μg/ml)、庆大霉素(20μg/ml)，过滤除菌。进行4℃温度冰箱中封闭过夜与37℃温度2小时封闭效果比对试验，封闭和不封闭比对试验，及封闭后洗板和封闭后不洗板比对试验。结果显示，4℃温度冰箱中封闭过夜、封闭后不洗板的方法获得了最佳的试验结果。
14、血清、抗体、单克隆抗体保存液的优选：配方I：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中含0.01％的硫柳汞、两性霉素B(1μg/ml)、20μg/ml庆大霉素、谷氨酸钠1％、1％BSA、1％乳糖(或山梨醇甘油)、含蛋白酶抑制剂(如胰凝乳蛋白酶30μg/mL)，过滤除菌。配方II：将对乙酰氨基酚1.5g，聚乙二醇(MW20000)10g，小牛血清2g，吐温(Tween)-201mL，硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的盐酸缓冲盐水1000mL配制而成，过滤除菌。结果以配方I作为保存液的保存效果最好。
15、包被ELISA板制备、保存以及保存期限的测定：选择进口优质的可拆96孔ELISA板，将纯化后的EHDV，用优化好的上述包被缓冲液稀释成4.0μg/mL，以50μL/孔加入ELISA板，置于4℃温度冰箱中过夜包被，拍干ELISA板；以200μL/孔加入优化好的封闭液，置于4℃温度冰箱中封闭过夜；彻底拍干ELISA板。将已包被好的ELISA板置于铝簿或簿锡纸中，内置2g硅胶干燥剂，封口，于4℃温度保存，定期用ELISA测定效果，以测定保存期。结果表明，包被ELISA板于4℃温度下保存至8个月，与新包被的ELISA板检测效果完全一致。
16、试剂盒检测操作程序
(1)将试剂盒中的EHDV抗原包被ELISA板、20倍浓缩洗涤液、10倍浓缩稀释液、底物液、终止液取出，置于室温下至少30分钟。
(2)用双蒸水配制稀释液、洗涤液。如工作稀释液：10mL 10倍稀稀液+90mL双蒸水，工作洗涤液：25mL20倍洗涤液+475mL双蒸水。
(3)配制1∶10的阳性、阴性对照血清和所有被检血清，如方法：10μL血清+90μL稀释液，混匀。
(4)HRP标记的McAb酶结合物的稀释(均按1∶1000稀释)，如McAb稀释：20μL McAb+20mL稀释液，混匀。
(5)加样
——在酶标板上设立稀释液空白对照、阴性血清对照、阳性血清对照(每孔做两孔)。
——每份被检血清样品做两孔。
——取100μL稀释液入空白对照孔，取50μL阴性、阳性血清入相应的对照孔，取50μL被检血清样品入相邻横行孔内，于37℃温度湿盒感作45分钟。
——每孔加50μLHRP标记的McAb酶结合物(空白对照孔不加)，轻轻混匀。
(6)酶标板于37℃温度湿盒感作40分钟。
(7)配制底物液：取出9.7mL底物液I于棕色瓶中，分别加入底物液II 300μL和底物液III 7μL，充分混匀。
(8)先用洗涤液洗酶标板孔4次，每次2分钟。
(9)加底物液：所有板孔加100μL底物液，酶标板置湿盒暗盒15分钟。
(10)加终止液：加入50μL/孔终止液。
(11)用酶标仪在波长450nm下测定光密度值(OD值)，按下式计算抑制百分率(PI)：
(12)试剂盒阳性判定值的确定：按照上述试剂盒的检测程序，采用行业标准SNT1167-2002《鹿流行性出血病琼脂免疫扩散试验操作规程》检测方法确认的50份阴性血清和50份阳性血清，进行c-ELISA试验后，结果所有阴性血清的百分抑制率≥50％，所有阳性血清的百分抑制率＜50％。因此，获得c-ELISA阳性判定值(cut-off value)为：PI≥50％被检血清EHDV抗体阳性；PI＜50％被检血清EHDV抗体阴性。
17、试剂盒的组装：将按上述方法制备好的ELISA抗原包被板(封闭于铝簿/簿锡纸中，内置2g硅胶干燥剂，封口)、酶结合物、单克隆抗体、10倍浓缩稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液I、底物液II、底物液III、终止液、阳性血清、阴性血清定量分装，分别贴上标签与说明，装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签，并附上一份详细的试剂盒使用操作说明书。
18、试剂盒中各种试液的配制与分装见表1：
表1
| 试液名称 | 体积(ml)和检测样品数(T) | 标识 |
| EHDV抗原包被ELISA板 | 2板96孔酶标板(96T) | 铝簿密封 |
| HRP标记的单克隆抗体酶结合物 | 0.5ml | 1ml黑盖冻存管 |
| 阳性血清 | 1ml | 2ml蓝盖冻存管 |
| 阴性血清 | 1ml | 2ml黄盖冻存管 |
| 20倍浓缩洗涤液 | 50ml | 白色平底瓶 |
| 10倍浓缩稀释液 | 30ml | 白色平底瓶 |
| 底物I(pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液) | 20ml | 黑色平底瓶 |
| 底物II(TMB) | 2ml | 2ml棕色冻存管 |
| 底物III(H2O2) | 1ml | 2ml白色冻存管 |
| 终止液 | 20ml | 红盖滴瓶 |
| 使用说明书 | 1份 | -- |
19、试剂盒的临床样品检测与应用以及试剂盒敏感性、特异性的评价：按照上述试剂盒的检测程序，采用行业标准SNT1167-2002《鹿流行性出血病琼脂免疫扩散试验操作规程》检测方法确认的50份阴性血清和50份阳性血清，进行c-ELISA试验。统计获得试剂盒的特异性为96％(阴性结果数/阴性样品总数＝48/50)，敏感性为92％(阳性结果数/阳性样品总数＝46/50)，本试剂盒的特异性、敏感性为良好。
Claims (10)
1、一种鹿流行性出血病病毒抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
EHDV抗原包被ELISA板
单克隆抗体IgG-HRP酶结合物
阳性血清
阴性血清
20倍浓缩洗涤液
10倍浓缩稀释液
底物I
底物II
底物III
终止液
其中，所述单克隆抗体IgG-HRP酶结合物为辣根过氧化酶(HRP)标记的鼠抗鹿流行性出血病病毒的特异性单克隆抗体(McAb)(IgG)；20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％Tween-20的0.01mol/L pH7.4的PBST；10倍浓缩稀释液为10倍浓缩的含1％明胶的PBST；底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液；底物II为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；底物III为双氧水(H2O2)溶液；终止液为1mol/L H2SO4硫酸溶液。
2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
EHDV抗原包被ELISA板 2板96孔酶标板
单克隆抗体IgG-HRP酶结合物 0.5ml
阳性血清 1ml
阴性血清 1ml
20倍浓缩洗涤液 50ml
10倍浓缩稀释液 30ml
底物I 20ml
底物II 2ml
底物III 1ml
终止液 20ml
其中，所述单克隆抗体IgG-HRP酶结合物为辣根过氧化酶(HRP)标记的鼠抗鹿流行性出血病病毒的特异性单克隆抗体(McAb)(IgG)；20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％Tween-20的0.01mol/L pH7.4的PBST；10倍浓缩稀释液为10倍浓缩的含1％明胶的PBST；底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液；底物II为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；底物III为双氧水(H2O2)溶液；终止液为1mol/L H2SO4硫酸溶液。
3、一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括：
a、制备鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原，并检定鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性；
b、制备抗鹿流行性出血病病毒的单克隆抗体，并对抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体辣根过氧化酶(HRP)酶结合物进行制备与鉴定；
c、制备阳性血清和阴性血清；
d、制备鹿流行性出血病病毒抗原包被的ELISA板；
e、制备20倍浓缩洗涤液和10倍浓缩稀释液，并制备底物I、底物II、底物III及终止液；
f、将上述制备好的ELISA抗原包被板、酶结合物、10倍浓缩稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液I、底物液II、底物液III、终止液、阳性血清、阴性血清定量分装，分别贴上标签与说明，并装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。
4、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的制备方法为：将BHK-21细胞长成单层后接种EHDV，无血清的基础培养基培养，细胞病变达75％以上时，收获病毒，反复冻融3次，以8000转/分离心30分钟，取上清液，加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒；采用20％、60％(w/v)不连续蔗糖密度梯度20000转/分4℃温度超速离心3小时，收获提纯的病毒条带作为抗原；鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性检定方法为：将纯化的病毒抗原用维持液作适当稀释接种到已长成单层的BHK21细胞上，同时作正常细胞对照，传二代，无CPE出现，表明作为包被抗原用的病毒已灭活彻底，纯化的抗原是安全的。
5、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备方法为：用提纯的鹿流行性出血病抗原分别加等体积弗氏完全佐剂乳化和弗氏不完全佐剂乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW4000)融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV的阳性孔，获得能稳定传代并分泌抗EHDV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，利用BALB/c小鼠制备抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体腹水；抗鹿流行性出血病病毒单克隆抗体辣根过氧化酶(HRP)酶结合物的制备与鉴定方法为：将抗鹿流行性出血病病毒BALB/c小鼠腹水McAb，分别经1次50％和2次33％饱和硫酸铵沉淀提纯，透析除盐；用改良过的过碘酸氧化法将辣根过氧化物酶(HRP)标记于单克隆抗体，1mL/管分装，-80℃温度保存。
6、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，阳性血清的制备方法为：挑选体格健壮的18个月以上的山羊2～3只，将纯化后EHDV与等体积弗氏完全佐剂乳化，充分混匀后经背部皮下注射，2mL/只，首免后第2周和第4周分别用EHDV相同剂量加等体积弗氏不完全佐剂(FIA)进行二免和三免后，无菌采血分离血清，1mL/管分装，-80℃温度保存；阴性血清的制备方法为：选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血用血清中和试验或酶联免疫吸附试验检测血清中是否有鹿流行性出血病的抗体，证实无鹿流行性出血病抗体的山羊，无菌采血分离血清，1mL/管分装，-80℃温度保存。
7、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中，鹿流行性出血病病毒抗原包被ELISA板的制备方法：将纯化后的鹿流行性出血病病毒用优化好的上述包被缓冲液稀释成4.0μg/mL，以50μL/孔加入ELISA板，置4℃温度的冰箱中过夜包被，拍干ELISA板；以200μL/孔加入优化好的封闭液，置4℃温度的冰箱中封闭过夜；彻底拍干ELISA板。将已包被好的ELISA板置于铝簿或簿锡纸中，内置2g硅胶干燥剂，封口，置4℃温度保存。
8、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(e)中，20倍浓缩洗涤液制备方法为：NaCL160g，KH2PO44g，Na2HPO4.12H2O 58g，KCL4g，Tween-20 10mL，蒸馏水1000mL，充分溶解，另加0.01％的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌后分装；10倍浓缩稀释液制备方法为：NaCL80g，KH2PO4 2g，Na2HPO4.12H2O 29g，KCL 2g，Tween-20 5mL，明胶100g，蒸馏水1000mL，充分溶解，另加0.01％的硫柳汞作防腐剂，过滤除菌后分装；所述底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液，底物II为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，底物III为双氧水(H2O2)溶液，终止液为1mol/L H2SO4硫酸溶液。
9、如权利要求1所述试剂盒的检测操作流程为：用稀释液以1∶10稀释阳性、阴性对照血清和所有被检血清，加入ELISA板，每份被检血清样品做两孔，每孔加50μL；37℃湿盒感作45分钟，每孔加50μLHRP标记的McAb酶结合物，酶标板置37℃温度湿盒感作40分钟；洗板四次，每孔加100μL底物液，酶标板置湿盒暗盒15分钟；加入50μL/孔终止液；用酶标仪在波长450nm下测定光密度值(OD值)，计算抑制百分率(PI)。
10、权利要求1所述鹿流行性出血病病毒抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒用于鹿流行性出血病的诊断、检疫、检测和流行病学调查。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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