CN109613249A - 一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒特别适用于国内森林脑炎病毒的早期辅助诊断，其具有特异性强、敏感性高、检测快速、操作方便、成本低廉等优点，适合临床推广。

Description

一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种医用检测用试剂盒，更具体地涉及一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

森林脑炎病毒又称蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)属于黄病毒属，森林脑炎病毒为球形颗粒，基因组为单股正链RNA，长约11kb，共编码3个结构蛋白即衣壳蛋白(C)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，在3个结构蛋白中，E蛋白是病毒最重要的结构蛋白，其含有多种T细胞表位和B细胞表位，决定着病毒的组织嗜性，介导病毒与细胞膜受体的结合，诱导保护性的免疫反应。森林脑炎病毒至少有3个亚型，即西欧亚型、西伯利亚亚型和远东亚型。该病毒以侵袭中枢神经系统为主的方式引起急性传染病，该病病死率高，预后不好，约25-37％的患者会留下麻痹型后遗症。

目前常用的实验室病原性检测技术主要包括：病毒分离、血清学试验(如补体结合试验、血凝抑制试验等)、分子生物学(如RT-PCR技术等)、ELISA等方法诊断森林脑炎。其中，病毒分离培养需要取脑脊液作病毒分离，且在发病早期阳性率较低，还存在对实验培养条件等要求高、耗时长等缺陷；血清学试验需要检测双份血清效价增加4倍以上有诊断意义，该类方法操作繁琐费时，难于高通量检测，且检测过程中会经常出现假阳性反应；另外，病毒中和试验需要活病毒，所以操作比较困难；而分子生物学方法如RT-PCR也容易出现交叉污染、假阳性，并且还需要昂贵的检测仪器，不利于森林脑炎病毒的临床检测推广。

目前，ELISA法检测森林脑炎病毒IgM类抗体，是早期辅助诊断的主要方法，特异性检测人血清/血浆中IgM类抗体，适用于森林脑炎的早期辅助诊断，其操作简单，容易掌握，不需要昂贵的精密仪器设备，容易得到临床推广。现在，欧洲有多家公司生产该类产品，但分别使用了6种西欧亚型病毒株，测定结果均为定性检测，并且采用了7种不同的判定单位。我国尚没有森林脑炎病毒IgM抗体检测试剂盒上市。

现有产品的制备方法均采用间接ELISA法进行IgM类抗体定性检测。以德国IBL公司森脑病毒IgM抗体检测试剂盒为例，先用灭活全病毒或重组病毒抗原包被酶标板，然后加入待检血清，孵育并洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgM抗体(抗-μ链)，孵育并洗涤后，加入四甲基联苯胺(TMB)底物显色，显色强度与样品中病毒特异性IgM抗体量成正比。

并且，现有的森林脑炎病毒IgM抗体检测试剂盒制备过程中采用的病毒株均为西欧亚型，而我国流行的病毒株为远东亚型，理论上采用现有国外产品用于国内森林脑炎病毒的临床测定会降低测定的特异性；另外，现有的森林脑炎病毒IgM抗体检测试剂盒在制备过程中，为了减少样品中IgG类抗体对测定结果的影响，均在样品稀释液中加入类风湿类因子或抗人IgG抗体，虽然理论上减少了样品中IgG对检测结果的影响，但并不能完全消除其对检测结果的影响，且类风湿类因子或抗人IgG抗体的加入也会导致生产成本的增加、操作步骤的繁复。

因此，为了克服上述缺陷，有必要开发适用于国内森林脑炎病毒早期辅助诊断的森林脑炎病毒IgM抗体检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种可克服现有技术的缺陷，能够适用于国内森林脑炎病毒临床检测的森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，其具有特异性强、敏感性高、检测快速、操作方便、成本低廉等优点，其能够用于临床森林脑炎病例的早期辅助诊断。

本发明提供一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒基于捕获法进行森林脑炎病毒IgM抗体检测。

进一步地，所述试剂盒包括小鼠抗人IgM抗体(抗μ链)、酶标抗体；

更进一步地，所述试剂盒还包括酶标板(ELISA板)、森林脑炎灭活病毒、样品稀释液、洗液、包被液、封闭液、酶显色底物和终止液；

更进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；

更进一步地，所述酶标抗体为过氧化物酶标记的森林脑炎病毒特异性单克隆抗体；

更进一步地，所述过氧化物酶标记的森林脑炎病毒特异性的单克隆抗体为靶向森林脑炎病毒E蛋白的单克隆抗体，优选地，所述单克隆抗体的效价≥1×10⁵，更优选地，所述单克隆抗体的效价≥1×10⁶。

更进一步地，所述酶为过氧化物酶；

更进一步地，所述包被液采用0.05mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液；封闭液采用含5％牛血清白蛋白的PBS(0.02mol/L，pH 7.0-7.4)；洗液采用含0.05％吐温-20的PBS溶液；终止液采用2mol/L的硫酸溶液；酶显色底物为双组份四甲基联苯胺溶液(TMB)，分为A液、B液；

更进一步地，阳性对照为稀释的抗森林脑炎病毒IgM人阳性血清；

更进一步地，阴性对照为稀释的抗森林脑炎病毒IgM人阴性血清。

本发明还提供一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，所述方法包括将单独包装的小鼠抗人IgM抗体(抗μ链)、酶标抗体置于同一试剂盒中。

进一步地，所述方法还包括将单独包装的样品稀释液、森林脑炎灭活病毒、洗液、包被液、封闭液、酶显色底物和终止液以及酶标板置于同一试剂盒中。

进一步地，所述森林脑炎灭活病毒优选为森林脑炎“森张”株灭活病毒。

本发明还提供一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，所述方法包括：

(1)抗-μ抗体包被酶标板的制备：用包被液将鼠抗人IgM抗体稀释成0.5-1μg/ml，优选1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜，弃上清，用洗液洗3遍，加入封闭液，200μl/孔，4℃过夜；弃去上清，用洗液洗3遍，晾干，4℃保存；

(2)分别加入阳性对照、阴性对照、待检血清，100μl/孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗3遍；

(3)分别加入森林脑炎“森张”株灭活病毒，100μl/孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗3遍；

(4)分别加入辣根过氧化物酶标记的抗森林脑炎病毒“森张”株E蛋白单克隆抗体，100μl/孔，37℃孵育30分钟，洗涤液洗5遍；

(5)分别加入TMB底物A、B液，各50μl/孔，37℃孵育15分钟显色；

(6)分别加入2mol/L硫酸，各50μl/孔，终止显色，并利用酶标仪测定样品的OD450值以判断待检血清中是否为森林脑炎病毒IgM抗体阳性。

有益效果

与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下优点和效果：

本发明的试剂盒基于森林脑炎病毒“森张”株制备而成，“森张”株为我国独有的远东亚型，制备的单克隆抗体特异性好，同其它黄病毒属病毒无交叉反应，因此本发明的试剂盒特别适用于国内对森林脑炎的诊断，有优异的临床推广价值。

本发明的试剂盒采用捕获法检测IgM抗体，其不同于现有技术常用的采用间接法检测IgM抗体的试剂盒，相对于间接法ELISA，本发明试剂盒无需在产品制备过程中额外加入类风湿因子或抗人IgG抗体，消除了额外加入上述组分对检测结果影响的风险，以及降低了成本。

本发明的试剂盒的特异性大于98％(95％置信区间：95％-99.7％)，灵敏度可达100％(95％置信区间：70-100％)，且具有良好的抗干扰能力，适合用于早期对森林脑炎感染的辅助诊断。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

实施例1：森林脑炎病毒抗原的制备

取已经长成致密单层的Vero细胞，弃去细胞生长液，加入Versene溶液清洗，弃去，加入pH值为7.4终浓度为0.1％的细胞消化液进行消化，待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变后，弃去细胞消化液，配制细胞生长液(在199溶液中加入终浓度为10％的新生牛血清，采用7.5％NaHCO₃溶液调整pH值至6.8～7.6即可)，并用细胞生长液并分散细胞，细胞的接种浓度为1.0×10⁴/ml，在细胞培养瓶进行细胞培养，培养温度为36～38℃，培养48小时后，可长成致密单层细胞。弃去细胞培养瓶内的细胞生长液，用Earle’s液或0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞后弃去，加入含有森林脑炎病毒“森张”株的悬浮液(由长春生物制品研究所有限责任公司制备和保存)，病毒感染复数为0.5；维持液配方为：在199溶液中加入终浓度为2％的新生牛血清，采用7.5％NaHCO₃溶液调整pH值至7.6～8.6；培养温度为32～34℃，经24小时培养后开始进行流加收获。

病毒收获液经0.45μm滤柱进行澄清，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化。病毒收获液经澄清处理后，选择100KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择20倍。

浓缩后的病毒液选择1/2000的β-丙内酯进行灭活，灭活时间为24小时，灭活温度为2～8℃；在灭活过程中注意摇晃，使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后，在35～37℃水浴2～4小时，以使残留的β-丙内酯降解。

浓缩病毒液经灭活后，选择Sepharose 4FF介质，用pH 7.4～7.8的0.01M PBS缓冲液平衡后，进行柱层析纯化，用紫外监测仪(A＝280nm)检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原。

实施例2：抗森林脑炎病毒抗体的制备

将实施例1制备的森林脑炎病毒“森张”株的灭活抗原作为免疫原，以1:1的体积加入弗氏完全佐剂并进行乳化，免疫9周龄雌性健康BALB/C小鼠，经腹腔、肌肉及皮下多点注射，免疫程序为在第0天、第7天及第14天进行三次免疫，融合前3天进行静脉加强免疫，3天后取脾脏淋巴细胞于小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合，用森林脑炎病毒“森张”株感染BHK-21细胞后用于间接免疫荧光法来筛选获得稳定表达抗森林脑炎病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株共计5株，分别收集其分泌的单克隆抗体，编号为单抗1、单抗2、单抗3、单抗4及单抗5。

分别测定上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的效价，所述测试方案如下：用间接ELISA法测定单抗效价，具体方法是(1)TBEV包被板的制备：将灭活的“森张”株纯化病毒用0.05mol/L，pH 9.6的包被液稀释成5μg/ml，包被酶标板，100μl/孔，4℃，20h；甩干后，每孔加入10％0.02mol/L，pH 7.2PBS稀释的牛血清白蛋白封闭，200μl/孔，4℃，16h；甩干，-20℃保存，备用；(2)单抗ELISA效价测定：将杂交瘤细胞培养上清10倍倍比系列稀释，含5％牛血清白蛋白的PBS为稀释液；NS-1骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照，将稀释的单抗加到步骤(1)制备的TBEV包被板中，100μl/孔，37℃孵育1小时，甩干，PBST洗3遍；加入HRP标记的羊抗小鼠IgG酶结合物，1：8000稀释，100μl/孔，37℃孵育30分钟，甩干，PBST洗5遍；(3)加底物显色，加TMB A、B液显色，37℃孵育15分钟，OD_450nm读数，cut-off＝2.1×阴性对照OD值作为判定标准。最终测得单抗效价除单抗2为1×10⁵外，其余单抗均为1×10⁶。

进一步测定了上述单克隆抗体的中和效价，方案如下：NS-1骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照。采用微量细胞病变法测定单抗中和效价：(1)病毒滴定：用地鼠肾原代细胞作为细胞基质，用于测定病毒滴度。将100CCID₅₀/ml的病毒作为病毒标准，用于测定单抗中和效价；(2)效价测定：将单抗上清2倍倍比稀释，分别与100CCID₅₀/ml的病毒等体积混合后，37℃共孵育1小时，之后加入到地鼠肾原代细胞预先铺好的96孔板中,100μl/孔,37℃培养7天，判定计算结果。最终测定中和效价的结果单抗1、单抗2、单抗4、单抗5的中和效价为1:32倍，而单抗3的中和效价为1:16倍。

由上述单抗的ELISA效价和中和效价结果可知，单抗1-5，尤其是单抗1、单抗4和单抗5均与森林脑炎病毒抗原具有良好的结合特性，均可用于制备森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，仅以单抗4为例进行下述实验。

通过小鼠体内法制备单克隆抗体腹水，即先给小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5ml/只，7天后腹腔注射浓度为1×10⁵-10⁶/ml的单抗4的杂交瘤细胞的细胞悬液，0.5ml/只，在接种杂交瘤细胞约7-10天后，小鼠有腹水积聚表现，腹部明显膨胀，无菌操作采集腹水，经离心除去脂质、细胞等杂质，56℃、30分钟灭活等处理后获得单克隆抗体腹水，腹水经1次50％饱和硫酸铵盐析，2次33％饱和硫酸铵盐析后，经rProtein-A Sepharose Fast Flow亲和层析进行纯化，纯化获得的单克隆抗体采用改良过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(Sigma，P8415)，制备获得辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体。

实施例3：森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的组成及制备

本发明试剂盒依据捕获法酶联免疫吸附试验原理，即在微孔条上预包被抗人IgM抗体(抗μ链)，其可与样品中的IgM抗体特异性结合，洗涤去除未结合的样品及IgM抗体，再加入抗原试剂与酶标单克隆抗体进行二次温育，当样品中存在IgM抗体时则形成“抗IgM抗体-IgM抗体-抗原-酶标单克隆抗体”复合物，复合物上连接的辣根过氧化物酶催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后变为黄色，通过是否显示颜色和或测定OD值来判断样品中是否存在IgM抗体。

试剂盒中小鼠抗人IgM抗体包被ELISA板由下述方法制备：

将购买的小鼠抗人IgM抗体(购自武汉科源安博公司)用包被液稀释成0.5-1μg/ml，优选1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜(＞16小时)；弃上清，用洗液洗3遍，加入封闭液，200μ/孔，4℃过夜，弃上清，用洗液洗3遍，晾干，4℃保存。

所述试剂盒含有：小鼠抗人IgM抗体(抗μ链)、ELISA板，样品稀释液、洗液、包被液、封闭液、阳性对照和阴性对照、过氧化物酶标记的抗森林脑炎病毒E蛋白单克隆抗体、酶显色底物和终止液。

其中包被液采用0.05mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液；

封闭液采用含5％牛血清白蛋白的PBS(0.02mol/L，pH 7.0-7.4)；

洗液采用含0.05％吐温-20的PBS溶液；

终止液采用2mol/L的硫酸溶液；

酶显色底物为双组份四甲基联苯胺溶液(TMB)，分为A液、B液；

阳性对照为稀释的抗森林脑炎病毒IgM人阳性血清；

阴性对照为稀释的抗森林脑炎病毒IgM人阴性血清。

实施例4：森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法

本发明的试剂盒可依据下述方法用于样品中森林脑炎病毒IgM抗体的检测：

(1)抗-μ抗体包被酶标板的制备：用包被液将鼠抗人IgM抗体稀释成0.5-1μg/ml，优选1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜，弃上清，用洗液洗3遍，加入封闭液，200μl/孔，4℃过夜；弃去上清，用洗液洗3遍，晾干，4℃保存；

(2)分别加入阳性对照、阴性对照、待检血清，100μl/孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗3遍；

(3)分别加入森林脑炎“森张”株灭活病毒，100μl/孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗3遍；

(4)分别加入辣根过氧化物酶标记的抗森林脑炎病毒“森张”株E蛋白单克隆抗体，100μl/孔，37℃孵育30分钟，洗涤液洗5遍；

(5)分别加入TMB底物A、B液，各50μl/孔，37℃孵育15分钟显色；

(6)分别加入2mol/L硫酸，各50μl/孔，终止显色

将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值，检测中阳性对照血清的OD值与阴性对照血清的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效；Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值OD_450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值OD_450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。

实施例5：森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的特异性、灵敏度及抗干扰能力测试

为了鉴定本发明试剂盒的性能，对其特异性、灵敏度及抗干扰能力进行了测定，具体如下：

特异性：选取150份已确定的阴性血清样本(免疫荧光作为金标准)，利用上述试剂盒检测，进行多次重复检测，优选重复次数为3-5次，统计计算多次重复后测定的总的阴性结果，结果显示总的阴性结果>98％(95％置信区间：95％-99.7％)，结果表明试剂盒具有非常高的特异性。

敏感性：利用上述试剂盒测定100份阳性临床样本(免疫荧光作为金标准)，多次重复，测出阳性结果达到100％(95％置信区间70％-100％)，结果表明试剂盒的敏感度非常高。

抗干扰实验：将商购的血红蛋白、胆红素、甘油三酯标准品，用多份混合阴性临床血清做稀释液进行系列稀释；当血红蛋白、胆红素、甘油三酯浓度分别≤10mg/ml、1mg/ml、5mg/ml时，利用上述试剂盒检测，检出结果均为阴性，该结果表明本发明试剂盒对临床血清的溶血、黄疸、浑浊度等情形具有良好的抗干扰作用，能够应用于临床推广。

实施例6:森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒对黄病毒属病毒交叉反应测试

为了测试本发明试剂盒的抗交叉反应能力，利用本发明试剂盒测定了其与除森林脑炎病毒外的其它黄病毒属病毒是否有交叉反应，具体如下：

利用包被好的酶标板同时检测森林脑炎病毒、乙型脑炎病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒和Hanzalova病毒阳性血清，分析结果以确定是否与其它黄病毒属病毒有交叉反应。

由下表表1可见，本发明试剂盒与乙型脑炎病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒和Hanzalova病毒均无交叉反应，只与森林脑炎病毒阳性血清有反应。

实施例7:森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒与商品化森脑病毒IgM抗体检测试剂盒检测效果比较

为了检测本发明试剂盒的临床应用效果，将本发明试剂盒与德国IBL公司森脑病毒IgM抗体检测试剂盒用于对血清样品进行检测分析。

本发明试剂盒按照实施例4的方法对待检血清进行检测。

依据德国IBL公司森脑病毒IgM抗体检测试剂盒的使用说明将其用于对待检血清进行检测。

检测结果如表2所示：

由上述检测结果可知，本发明的试剂盒相较于现有商品化试剂盒具有更好的敏感性和特异性，适用于临床推广使用。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (9)

1.一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒基于捕获法进行森林脑炎病毒IgM抗体检测，所述试剂盒包括小鼠抗人IgM抗体(抗μ链)、酶标抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为过氧化物酶标记的森林脑炎病毒特异性的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述过氧化物酶标记的森林脑炎病毒特异性的单克隆抗体为靶向森林脑炎病毒E蛋白的单克隆抗体，优选地，所述单克隆抗体的效价为1×10⁵，优选为1×10⁶。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标板(ELISA板)、森林脑炎灭活病毒、样品稀释液、洗液、包被液、封闭液、酶显色底物和终止液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为稀释的抗森林脑炎病毒IgM人阳性血清，阴性对照为稀释的抗森林脑炎病毒IgM人阴性血清。

7.权利要求1-6所述森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：将单独包装的小鼠抗人IgM抗体(抗μ链)、酶标抗体置于同一试剂盒中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将单独包装的样品稀释液、森林脑炎灭活病毒、洗液、包被液、封闭液、酶显色底物和终止液以及酶标板置于同一试剂盒中。

9.一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

(1)抗-μ抗体包被酶标板的制备；

(2)分别加入阳性对照、阴性对照、待检血清进行孵育，孵育完成后冲洗三次；

(3)分别加入森林脑炎“森张”株灭活病毒孵育，孵育完成后冲洗三次；

(4)分别加入辣根过氧化物酶标记的抗森林脑炎病毒“森张”株E蛋白单克隆抗体孵育，孵育完成后冲洗五次；

(5)分别加入TMB底物A、B液孵育显色；

(6)分别终止液终止显色，并利用酶标仪测定样品的OD₄₅₀值以判断待检血清中是否为森林脑炎病毒IgM抗体阳性。