CN102841209A - 一种以猪瘟病毒重组蛋白ns2建立的elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，包括猪瘟病毒重组蛋白NS2包被的酶标板、10倍浓缩洗涤剂、血清稀释液、标准血清、抗猪IgG酶标抗体、酶标抗体稀释液、封闭剂、显色剂A、显色剂B和终止液。采用本发明可以对猪瘟病毒抗体检测的ELISA方法试剂盒，所建立的方法具有特异性、灵敏度及可操作性。在敏感度试验方面，与免疫荧光技术方法符合率为82%，且比免疫荧光技术方法更敏感，在其他病原的检出率为零，该方法较HI更具有快速、成本低廉，结果易于判定的优点，检测猪瘟兔化弱毒疫苗免疫后的监测工作服务。

Description

一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种高度接触性、致死性传染病，临床上主要以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征。CSF具有高度传染性，主要通过呼吸道和消化道传染，不分季节，传播速度快，发病率和死亡率高，流行广泛，给养猪业造成了巨大的经济损失，是严重危害我国养猪业的最重要的疫病之一。我国将其列为一类传染病，因此，加强CSFV诊断技术的研究对预防和控制本病具有重要的意义。

猪瘟的主要检测技术有正向间接血凝试验(IHA)。用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验。抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。血凝抑制试验方法简便、快速、经济、敏感性强、特异性高，可应用于猪瘟的检验以及流行病学的调查等。酶联免疫吸附试验(ELISA)是当前应用最广、发展最快的一项新技术。

NS2是一个具有自我裁剪功能的蛋白酶，可将前体蛋白NS2-3切割成NS2和NS3，其中His1447和Cys1512是保持NS2蛋白酶活性所必需的氨基酸残基。NS2对病毒RNA复制是非必需的，但它可以调节病毒RNA复制，防止病毒RNA或蛋白在细胞内聚集过多而导致宿主细胞死亡。所以，利用NS2非结构蛋白包被抗原来检测猪瘟兔化弱毒疫苗的是目前检测的研究方向。近年来，国内外对猪瘟的研究多数集中在以猪瘟的结构蛋白E1和E2为基础的诊断方法的研发方面，而对猪瘟病毒非结构蛋白NS2为基础的诊断方法研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，包括猪瘟病毒重组蛋白NS2包被的酶标板、10倍浓缩洗涤剂、血清稀释液、标准血清、抗猪IgG酶标抗体、酶标抗体稀释液、封闭剂、显色剂A、显色剂B和终止液。

所述的浓缩洗涤剂为PBST，其含0.05%Tween-20的PBS溶液。

所述的血清稀释液为1%BSA的PBS溶液。

所述的标准血清为标准阴阳性血清，其中，标准阳性血清为用猪瘟兔化弱毒疫苗C株免疫后得到完全保护的猪血清，标准阴性血清为从未用过疫苗且抗体水平接近阴性血清平均值的猪血清。

所述的酶标抗体稀释液为PBS缓冲液。

所述的封闭剂为5%BSA的PBS溶液。

所述的显色剂A为含有1mg/ml OPD，pH5.5的柠檬酸缓冲液。

所述的显色剂B为H₂O₂。

所述的终止液为2M的H₂SO₄。

试剂盒将检测血清样品进行预处理后，与包被好的抗原相结合，利用酶标记的抗体与待检血清样品中的抗原或抗体特异性结合后，在底物溶液参与下显色进行检测。

本发明的以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒的制备方法包括以下步骤：

（1）包被抗原的制备：参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列，设计并合成一组引物为：

引物15’TGCCTCGTAGTTATGTAAACAGGCAGCCA3’

引物25’TTTGGATTCCCTCCATCCTTAGTGGAGTTGCC3’；

通过用逆转录扩增出NS2长1371bp的片段，将扩增的NS2基因序列克隆至表达载PEGFP-C1中，构建成重组真核表达载体PEGFPNS2，经酶切鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，于37℃，0.5mmol/L IPTG条件下诱导表达，经亲和层析纯化获得纯化的重组蛋白NS2；

（2）以纯化后的猪瘟病毒重组蛋白NS2作抗原建立ELISA试剂盒；

a、设计抗原最佳稀释度的测定为将不同稀释倍数的抗原包被酶标板，将标准阴、阳性血清各一份梯度稀释后进行ELISA实验，测得不同条件下的P／N值；结果表明，当抗原做30倍稀释，血清作1倍、5倍、10倍稀释时P／N值均较大(P／N值分别为4.9、5.12、5.33)，因此选择30倍稀释做为抗原的最佳稀释度；

b、设计的血清与酶标二抗稀释倍数的选择为将标准阴阳性血清分别作1倍、5倍、10倍及20倍梯度稀释，将酶标二抗从2000倍开始做倍比稀释进行方阵实验，当酶标二抗稀释倍数为l：2000～1：4000时；阳性血清的OD值为1.0左右，阴性血清的OD值在0.2左右，因此选择酶标二抗的工作浓度定为l：2000，血清做10倍稀释；

c、设计的封闭剂的选择为用不同浓度的明胶、BSA及脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液的检测结果表明：BSA溶液的封闭效果好于不同浓度的脱脂奶粉溶液和明胶溶液；随着所试BSA溶液浓度的提高，阴阳性血清的OD值均下降，但P／N值不断升高；当以5％BSA溶液封闭时P／N最高(P／N为7.76)；明胶溶液作为封闭剂时阴阳性血清OD值均较高，存在非特异性反应，故确定5％BSA的PBS溶液作为封闭剂；

d、设计显色液A和显色液B，显色液A位含有1mg/ml OPD，pH5.5的柠檬酸缓冲液，显色液B为H₂O₂；

e、设计的阴阳性血清临界值的确定为用间接ELISA对150份阴性血清进行检测，用SPSS软件统计分析，阴性血清的OD₄₅₀值呈正态分布，平均值(X)为0.136，标准差(SD)为0.035，最小值为0.049，最大值为0.21；

（3）结果判定标准：根据OD₄₅₀值计算P/N值；当P/N值≥4时实验成立（P为阳性对照血清及待检血清的OD值，N为阴性对照血清的OD值）；然后，根据S/N值对待检血清进行判定（S为待检血清的OD₄₅₀值）；

结果：阴性：S/N≤0.27；可疑：0.27＜S/N≤0.85；阳性：S/N＞0.85。

本发明建立了可以对猪瘟病毒抗体检测的ELISA方法试剂盒，所建立的方法具有特异性、灵敏度及可操作性。在敏感度试验方面，与免疫荧光技术方法符合率为82%，且比免疫荧光技术方法更敏感，在其他病原的检出率为零，该方法较HI更具有快速、成本低廉，结果易于判定的优点，检测猪瘟兔化弱毒疫苗免疫后的监测工作服务。

具体实施方式

本发明的试剂盒具体组成如下：

1、材料

1.1参考血清标准阳性血清为用猪瘟兔化弱毒疫苗C株免疫仔猪20～25日，2周后采血分离血清，用HI实验测定HI效价为1:1024～1:2048，分装后-80℃保存。阴性血清为从未用过疫苗且抗体水平接近阴性血清平均值的猪血清。

1.2ELISA反应板为丹麦Nunc公司产品，抗猪IgG酶标抗体购置Sigma公司产品。

1.3表达载体PEGFP-C1购自TAKARA公司。

1.4实验动物仔猪均为河南仔猪场公司产品。

2、抗原的制备

包被抗原的制备参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列，设计并合成一组引物，

引物15’TGCCTCGTAGTTATGTAAACAGGCAGCCA3’

引物25’TTTGGATTCCCTCCATCCTTAGTGGAGTTGCC3’。

通过用逆转录扩增出NS2长1371bp的基因序列。将扩增的NS2基因序列克隆至表达载体PEGFP-C1中，构建重组真核表达载体PEGFP-NS2。经酶切鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，于37℃，0.5mmol/L IPTG条件下诱导表达重组蛋白NS2，表达率为30%。经亲和层析法纯化获得重组蛋白NS2，为包被抗原。

3、ELISA工作条件的确定

3.1抗原最佳稀释度的测定将不同稀释倍数的抗原包被酶标板，将标准阴、阳性血清各一份梯度稀释后进行ELISA实验，测得不同条件下的P／N值。结果表明，当抗原做30倍稀释，血清作1倍、5倍、10倍稀释时P／N值均较大(P／N值分别为4.9、5.12、5.33)，因此选择30倍稀释做为抗原的最佳稀释度。

3.2血清与酶标二抗稀释倍数的选择将标准阴阳性血清分别作1倍、5倍、10倍及20倍梯度稀释，将酶标二抗从2000倍开始做倍比稀释进行方阵实验。当酶标二抗稀释倍数为l：2000～1：4000时，阳性血清的OD值为1.0左右，阴性血清的OD值在0.2左右，因此选择酶标二抗的工作浓度定为l：2000，血清做10倍稀释。

3.3封闭剂的选择用不同浓度的明胶、BSA及脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液的检测，结果表明：BSA溶液的封闭效果好于不同浓度的脱脂奶粉溶液和明胶溶液。随着所试BSA溶液浓度的提高，阴阳性血清的OD值均下降，但P／N值不断升高。当以5％BSA溶液封闭时P／N最高(P／N为7.76)；明胶溶液作为封闭剂时阴阳性血清OD值均较高，存在非特异性反应，故确定5％BSA的PBS溶液作为封闭剂。

3.4设计显色液A和显色液B显色液A位含有1mg/ml OPD，pH5.5的柠檬酸缓冲液，显色液B为H₂O₂。

3.5阴阳性血清临界值的确定用间接ELISA对150份阴性血清进行检测，用SPSS软件统计分析，阴性血清的OD₄₅₀值呈正态分布，平均值(X)为0.136，标准差(SD)为0.035，最小值为0.049，最大值为0.21。

X+3×SD=0.237即为阴阳性血清的临界值，为了降低假阳性或假阴性结果，在此基础上再加上和减去一个标准差作为可疑值区间，得到ELISA的可疑值范围为0.21～0.264。

3.6抗原包被板的保存期确定将抗原包被板分别在4℃保存0、1、2、3、4、5个月，取不同保存时间的抗原板，对16份不同OD值的血清样品进行ELISA检测，比较判定结果的变化来确定保存时间对试剂盒稳定性的影响。结果显示，阴阳性血清的OD值虽略有变化，但样本血清的阴阳性判定结果变化不明显。

4、试剂盒的组成的制备

4.110倍浓缩洗涤液：PBST（含0.05%Tween-20的PBS溶液）

4.2血清稀释液：1％BSA的PBS溶液

4.3标准血清：自制的标准阴阳性血清

4.4抗猪IgG酶标抗体：购置Sigma公司产品

4.5酶标抗体稀释液：PBS缓冲液

4.6显色剂A：含有1mg/ml OPD，pH5.5的柠檬酸缓冲液

4.7显色剂B：H₂O₂

4.8终止液：2M的H₂SO₄

4.9封闭液：5%BSA的PBS溶液

5、操作步骤

从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

加标准品和待测样本：分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准阴阳性血清各50μL；待测样本孔中先加入待测血清10μL，再加血清稀释液40μL（即稀释5倍）；空白对照孔不加。

温育：37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

洗板：将孔中的液体用力甩净，在吸水纸上拍干，每孔加洗涤液200μl，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。

加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。

温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

洗板：同上洗板步骤。

显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，平板混匀器混匀30s（或用手轻轻震荡混匀30s），37℃避光显色15min。

终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。

测定：以空白孔调零，在终止后15min内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。

6结果判定

根据OD₄₅₀值计算P/N值。当P/N值≥4时实验成立（P为阳性对照血清及待检血清的OD值，N为阴性对照血清的OD值）。然后，根据S/N值对待检血清进行判定（S为待检血清的OD₄₅₀值）。

结果：阴性：S/N≤0.27；可疑：0.27＜S/N≤0.85；阳性：S/N＞0.85。

Claims (10)

1.一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，包括猪瘟病毒重组蛋白NS2包被的酶标板、10倍浓缩洗涤剂、血清稀释液、标准血清、抗猪IgG酶标抗体、酶标抗体稀释液、封闭剂、显色剂A、显色剂B和终止液。

2.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤剂为PBST，其含0.05%Tween-20的PBS溶液。

3.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的血清稀释液为1%BSA的PBS溶液。

4.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的标准血清为标准阴阳性血清，其中，标准阳性血清为用猪瘟兔化弱毒疫苗C株免疫后得到完全保护的猪血清，标准阴性血清为从未用过疫苗且抗体水平接近阴性血清平均值的猪血清。

5.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的酶标抗体稀释液为PBS缓冲液。

6.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的封闭剂为5%BSA的PBS溶液。

7.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的显色剂A为含有1mg/ml OPD，pH5.5的柠檬酸缓冲液。

8.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的显色剂B为H₂O₂。

9.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2M的H₂SO₄。

10.根据权利要求1所述的一种以猪瘟病毒重组蛋白NS2建立的ELISA试剂盒，其特征在于，试剂盒将检测血清样品进行预处理后，与包被好的抗原相结合，利用酶标记的抗体与待检血清样品中的抗原或抗体特异性结合后，在底物溶液参与下显色进行检测。