CN105651998A - 猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物生物制品领域，具体而言，涉及一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法。该方法使用细胞ELISA方法的原理进行猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的测定，间接测定繁殖后代的病毒粒子，避免了因各种外界因素致死的病毒粒子的干扰，操作简单、耗时短、精度高，可大幅提高生产效率，是一种值得推广的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量测定方法。

Description

猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法

技术领域

本发明涉及动物生物制品领域，具体而言，涉及一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法。

背景技术

猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)引起的一类高发病率的高度接触性传染病。该病被OIE列为A类传染病之一，是国际畜牧兽医产品贸易重要检疫对象。家猪和野猪是CSFV的唯一自然宿主。针对该病尚无有效的治疗药物，通常应用疫苗免疫进行预防，目前，国内广泛使用猪瘟兔化弱毒疫苗来预防猪瘟的发生。

CSF临床记载发现于19世纪初期，1903年被证实为病毒感染所致。CSFV感染后导致的病理变化及病程与感染猪的年龄、健康状况、饲养环境和免疫状态息息相关，但更大程度却决于CSFV毒株的毒力强弱。由于猪瘟兔化弱毒疫苗是经家兔传代致弱而来，该病毒注射到家兔体内可以使家兔呈现暂时性的发热反应(兔体热反应实验)，因此在很长一段时间，疫苗生产企业均使用兔体热反应法对疫苗的半成品和成品进行疫苗含量的测定。到目前为止兔体热反应发依然是我国猪瘟疫苗生产企业使用最多的方法。但是在使用该方法时需要选择纯系大耳白兔进行，实验周期最少需要7天，猪瘟疫苗注射入家兔体内后需要连续对家兔进行每天4次的体温测定，这一方法耗时，耗力，存在严重不足，亟需更先进有效的方法提高检测效率。

除此之外，目前可以对猪瘟兔化弱毒进行定量的方法还有抗原捕获ELISA方法、免疫荧光检查法、反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)或实时反转录定量PCR(Real-TimePCR)检测法。其中抗原捕获ELISA方法已有商品化的试剂盒可供使用，但是在病毒培养过程中，收获的半成品或成品中同时存在活的猪瘟兔化弱毒、因各种外界因素失活的猪瘟兔化弱毒以及在病毒培养中细胞产生的猪瘟结构蛋白抗原等均能与ELISA包被抗原反应，因此该方法测出的数据大于实际的病毒含量，并未得到公众的认可；RT-PCR和Real-TimePCR法是通过检测病毒核酸来对病毒进行定量，在半成品和成品的检验中不能区分是活的猪瘟兔化弱毒还是失活的猪瘟兔化弱毒，因此在实际中也未广泛使用；免疫荧光定量方法是使用荧光抗体测定感染猪瘟兔化弱毒疫苗的细胞，通过测算不同稀释度出现的荧光的细胞孔数计算病毒含量，该方法的具体实施方法和细节如专利CN201310663187.9(公开日2014.03.05)所述；此外，类似的使用酶标抗体代替荧光抗体对猪瘟病毒进行定量的方法也有报道，该方法见专利CN201010237929.8(公开日2010.12.15)。以上两种方法均需要使用显微镜观察，在使用荧光抗体或酶标抗体时由于染色时间的差异等，特别是在检测样品量大时，容易造成误判，从而定量不准确，同时需要检测人员具有丰富的经验，否则容易因人为因素而形成误判。综上所述，以上方法均具有很多的不足之处，亟需更简便、快速的方法以提高检测精度，提高生产效率。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，所述方法可解决现有技术测定成本高、测定时间长、测定精度差的问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，包括：

1)、将待测猪瘟兔化弱毒疫苗样品用DMEM培养液梯度稀释后将各浓度样品分别接种到预先培养好的敏感细胞中，同时设置加入DMEM培养液的阴性对照及已知病毒效力的猪瘟兔化弱毒疫苗作为阳性对照；加入各浓度样品及对照样品后进行病毒培养；

2)、病毒培养完成后去掉细胞培养液，加入固定液进行固定，随后依次加入抗体及TMB显色液；每次换液前均去掉上一次所用溶液并用清洗；

3)、加入终止液终止反应；酶标仪读取450nm吸光值并计算病毒效力。

本申请提供的测定方法使用细胞ELISA方法的原理进行猪瘟病毒的测定，操作简单、耗时短、精度高，可大幅提高生产效率，是一种值得推广的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法。

其中，在步骤2)中，清洗所用的溶液为含有0.05％Tween-20的1×磷酸盐缓冲液。

优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤1)中，所述敏感细胞为猪睾丸细胞、猪肾细胞的原代细胞或传代细胞或兔肾细胞的原代细胞或传代细胞中的一种。

优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤1)中，所述敏感细胞培养于细胞培养板中；接种于所述细胞培养板时的细胞汇合度为90％以上，接种的密度为4～6×10⁵个/mL。

细胞汇合度是用来衡量细胞在培养皿中的总的生长情况的一个指标，指两两连接在一起的克隆数目占总的比率；接种密度不宜过小，否则细胞不能很好的生长，也不宜过大，否则细胞会堆积起来，从而降低病毒接种的阳性率。

其中，细胞培养板的孔数可根据实验中稀释的梯度数量及每个样所做的副孔数量进行调整，常用48、96、384孔。

通常细胞培养板每个孔的容积为300μl左右，因而在以上述细胞密度进行接种时，一般每个孔接种100μl。

进一步优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，所述敏感细胞培养于细胞培养板中的培养条件为：

在36～38℃，4.5～5.5％CO₂的培养环境中培养12～24小时。

优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤1)中，所述梯度稀释的具体操作包括：

使用DMEM培养液作为稀释液，以6～20个浓度梯度进行逐步稀释，每个浓度梯度的稀释倍数均为2～15倍。

浓度梯度的数量是根据细胞密度及初始病毒含量(估计值)进行确定的；稀释倍数过大则每次稀释的误差会增大，因而最大稀释倍数限定在15倍。

优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤1)中，所述病毒培养条件为：

在36～38℃，4.5～5.5％CO₂的培养环境中培养48～96小时。

优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤2)中，所述固定液为甲醇和丙酮1:1配制固定液；固定的条件和时间为：2～8℃静置30～60min。

甲醇丙酮固定液配置时候按照体积比1：1进行配置，加入固定液处理可以防止细胞发生自溶并保存细胞固有物质，使细胞基本上保持与生活时的物质一致。固定时间不宜过短也不宜过长，时间过短固定不完全，将降低抗原的反应灵敏度，造成假阴性结果；固定时间过长会造成细胞脱造成假阳性结果。

优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤2)中，所述抗体为HRP标记的抗猪瘟病毒抗体；

或抗猪瘟病毒抗体及与其种属来源相对应的HRP标记的二抗。

进一步优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，所述抗猪瘟病毒抗体为兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪瘟病毒单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤3)中，所述分析的方法为：

用Reed-Muench法计算阳性结果的TCID₅₀；

所述阳性结果为：当阳性对照孔平均值OD450≥1.0、阴性对照孔OD450<0.1、测定孔OD450nm＞2.1倍阴性对照孔平均值时的实验结果。

具体计算方法为：

LogTCID₅₀＝高于50％阳性孔率最高稀释度的对数+距离比

距离比＝(高于50％阳性孔百分数-50％)/(高于50％阳性孔率的百分数-低于50％阳性孔率的百分数)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、与使用动物测定猪瘟病毒含量相比较，避免了因动物品种以及健康状况等个体差异所造成的影响，节约了测定成本，缩短了测定时间，且提高了测定精度。

2)、与荧光定量PCR方法和抗原捕获ELISA方法相比较，该方法间接测定繁殖后代的病毒粒子，避免了因各种外界因素致死的病毒粒子的干扰，提高了测量精度。

3)、与间接或直接免疫荧光技术相比较，可以避免因荧光抗体信号衰减或样品量大时人为观测误差所致的测量误差。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

S11、材料与试剂

阳性对照病毒：猪瘟兔化弱毒疫苗株购于中国兽医药品监察所，由四川华神兽用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重点实验室繁殖分装保存备用(效价大于10⁶TCID₅₀/ml)；

测试样品：猪瘟疫苗半成品20151209批次3收和4收样品由四川华神兽用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重点实验室制备提供；

细胞系猪睾丸细胞(ST)，按照《兽药典》规程检测不含外源病毒、细菌、霉菌和支原体等污染物；

细胞培养液DMEM购于ThermoFisherScientific；细胞传代培养液含10％的猪瘟专用血清，维持液含1％的猪瘟专用血清；

血清：猪瘟专用血清购于呼和浩特草原绿野生物工程材料有限公司；

固定液：丙酮与甲醇比例为1:1配置；

抗体：兔源猪瘟多克隆抗体为实验室自制；HRP标记的羊抗兔二抗购于南京金斯瑞生物科技有限公司；

磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl8.0g、KCl0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O3.48g、KH₂PO₄0.2g，加蒸馏水至1000mL，分装，121℃灭菌30min，备用；

EDTA-胰酶溶液：0.25％的胰酶，5mMEDTA的PBS，pH7.2-7.4。

洗涤液PBST：向1000mL的PBS中加入0.5ml的Tween-20，混匀备用；

TMB(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine)显色液：单组分购于生工生物工程(上海)股份有限公司；

终止液：2MH₂SO₄；蒸馏水178.3mL中逐滴加入98％的浓硫酸21.7mL配置而成；

S12、ST细胞的制备

取传代后48小时的ST细胞，观察细胞汇合度达到90％以上，去除细胞培养液；使用PBS洗涤三次，加入EDTA-胰酶溶液消化1～5分钟；去除胰酶，加入10ml细胞传代培养液吹打细胞使细胞从细胞瓶中脱落，然后按照1：4的比例制备细胞悬液；将细胞悬液加入到96孔板中，每孔加入100μl，接种的密度为4×10⁵个/mL，共2个96孔板；37℃，5％CO₂培养12小时。

S13、测试样品的稀释

取半成品室温解冻后进行10倍倍比稀释。具体方法如下：取1.5ml离心管10个，分别编号1-10，在每个离心管中加入900μlDMEM。取半成品100μl，加入到第一个离心管中，混匀后取100μl到另外一个离心管中，以此方法稀释至第10孔。

S14、病毒接种

将稀释好的疫苗加入到96孔板中，每个梯度重复8孔，每孔100μl，每个梯度一列，并于第11列中4孔加入阳性对照病毒100μl，另外4孔作为空白对照，加入100μlDMEM；然后置37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养72小时。

S15、细胞固定

去掉细胞培养板中的液体，每孔加入200μl固定液4℃静置60min；

S16、ELISA检测

倒掉固定液，加入PBST300μl，静置3min，倒掉洗液，按照此方法连续洗涤5次；

加入猪瘟病毒抗体(兔源多克隆抗体)，按照200倍稀释，稀释液为PBST，每孔100μl，加入后室温孵育60min；

弃猪瘟抗体，使用PBST洗涤5次；

加入HRP标记的羊抗兔二抗，按照2000倍稀释，稀释液为PBST，每孔100μl，加入后室温孵育30min；

弃二抗，使用PBST洗涤5次；

加入TMB显色液，每孔100μl，室温避光显色10min；

加入终止液50μl，避免产生气泡，10min内完成测定；

酶标仪上读取450nm吸光值。

S17、结果判定

阳性对照平均值OD450≥1.0，标准阴性对照OD450<0.1时，实验成立。以测定孔OD450nm＞2.1倍阴性对照空平均值则判为阳性，否则判定为阴性。

S18、病毒含量TCID₅₀的计算

根据各稀释度阳性孔数，使用Reed-Muench方法测定20151209批次3收和4收样品的TCID₅₀分别为2.51×10⁶TCID₅₀/ml和3.39×10⁶TCID₅₀/ml。

实施例2

S21、材料与试剂

除测试样品换为猪瘟疫苗半成品20151210批次3收样品、细胞系换为猪肾细胞(PK15)外，其余与实施例S11相同。

S22、PK15细胞的制备

取传代后48小时的PK15细胞，观察细胞汇合度达到90％以上，去除细胞培养液；使用PBS洗涤三次，加入EDTA-胰酶溶液消化1～2分钟；去除胰酶，加入10ml细胞传代培养液吹打细胞使细胞从细胞瓶中脱落，然后按照1：5的比例制备细胞悬液；将细胞悬液加入到48孔板中，每孔加入100μl，接种的密度为6×10⁵个/mL，37℃，5％CO₂培养12小时。

S23、测试样品的稀释

取半成品室温解冻后进行15倍倍比稀释。具体方法如下：取1.5ml离心管6个，分别编号1-6，在每个离心管中加入900μlDMEM。取半成品100μl，加入到第一个离心管中，混匀后取100μl到另外一个离心管中，以此方法稀释至第6孔。

S24、病毒接种

将稀释好的疫苗加入到48孔板中，每个梯度重复6孔，每孔100μl，每个梯度一列，并于其中的余下的6孔加入阳性对照病毒100μl，另外6孔作为空白对照，加入100μlDMEM；然后置37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养48小时。

S25、细胞固定

去掉细胞培养板中的液体，每孔加入200μl固定液4℃静置30min；

S26、ELISA检测

倒掉固定液，加入PBST300μl，静置3min，倒掉洗液，按照此方法连续洗涤5次；

加入猪瘟病毒抗体(大鼠源多克隆抗体)，按照200倍稀释，稀释液为PBST，每孔100μl，加入后室温孵育60min；

弃猪瘟抗体，使用PBST洗涤5次；

加入HRP标记的驴抗大鼠二抗，按照2000倍稀释，稀释液为PBST，每孔100μl，加入后室温孵育30min；

弃二抗，使用PBST洗涤5次；

加入TMB显色液，每孔100μl，室温避光显色10min；

加入终止液50μl，避免产生气泡，10min内完成测定；

酶标仪上读取450nm吸光值。

S27、结果判定

阳性对照平均值OD450≥1.0，标准阴性对照OD450<0.1时，实验成立。以测定孔OD450nm＞2.1倍阴性对照空平均值则判为阳性，否则判定为阴性。

S28、病毒含量TCID₅₀的计算

根据各稀释度阳性孔数，使用Reed-Muench方法测定20151210批次3收品的TCID₅₀为3.16×10⁶TCID₅₀/ml。

实施例3

S31～S35中除细胞换为兔肾细胞的原代细胞外，其余均与S21～S25相同。

S36、ELISA检测

倒掉固定液，加入PBST300μl，静置3min，倒掉洗液，按照此方法连续洗涤5次；

加入猪瘟病毒抗体(HRP标记的小鼠源单克隆抗体)，按照200倍稀释，稀释液为PBST，每孔100μl，加入后室温孵育60min；

弃猪瘟病毒抗体，使用PBST洗涤5次；

加入TMB显色液，每孔100μl，室温避光显色10min；

加入终止液50μl，避免产生气泡，10min内完成测定；

酶标仪上读取450nm吸光值。

S37～S38与S27～S28相同。

实验例

以CN201310663187.9(以下简称对比例1)及CN201010237929.8(以下简称对比例2)中记载的技术方案作为对比例，与本申请实施例2进行比较；三组所检测的样本均一致。

表1不同检测方法比较

从上表可知，与对比例1～2相比，本申请提供的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法操作简单、耗时短、精度高，是一种值得推广的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量测定方法。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，包括：

1)、将待测猪瘟兔化弱毒疫苗样品用DMEM培养液梯度稀释后将各浓度样品分别接种到预先培养好的敏感细胞中，同时设置加入DMEM培养液的阴性对照及已知病毒效力的猪瘟兔化弱毒疫苗作为阳性对照；加入各浓度样品及对照样品后进行病毒培养；

2)、病毒培养完成后去掉细胞培养液，加入固定液进行固定，随后依次加入抗体及TMB显色液；每次换液前均去掉上一次所用溶液并清洗；

3)、加入终止液终止反应；酶标仪读取450nm吸光值并计算病毒效力。

2.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，在步骤1)中，所述敏感细胞为猪睾丸细胞、猪肾细胞的原代细胞或传代细胞或兔肾细胞的原代细胞或传代细胞中的一种。

3.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，在步骤1)中，所述敏感细胞培养于细胞培养板中；接种于所述细胞培养板时的细胞汇合度为90％以上，接种的密度为4～6×10⁵个/mL。

4.如权利要求3所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，所述敏感细胞培养于细胞培养板中的培养条件为：

在36～38℃，4.5～5.5％CO₂的培养环境中培养12～24小时。

5.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，在步骤1)中，所述梯度稀释的具体操作包括：

使用DMEM培养液作为稀释液，以6～20个浓度梯度进行逐步稀释，每个浓度梯度的稀释倍数均为2～15倍。

6.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，在步骤1)中，所述病毒培养条件为：

在36～38℃，4.5～5.5％CO₂的培养环境中培养48～96小时。

7.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，在步骤2)中，所述固定液为甲醇和丙酮1:1配制固定液；固定的条件为：2～8℃静置30～60min。

8.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，在步骤2)中，所述抗体为HRP标记的抗猪瘟病毒抗体；

或抗猪瘟病毒抗体及与其种属来源相对应的HRP标记的二抗。

9.如权利要求8所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于：

所述抗猪瘟病毒抗体为兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪瘟病毒单克隆抗体或多克隆抗体。

10.如权利要求1～9任一项所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，在步骤3)中，所述分析的方法为：

用Reed-Muench法计算阳性结果的TCID₅₀；

所述阳性结果为：当阳性对照孔平均值OD450≥1.0、阴性对照孔OD450<0.1、测定孔OD450nm＞2.1倍阴性对照孔平均值时的实验结果。