CN106596430A - 一种测定猪细小病毒的tcid50的试剂盒以及应用与方法 - Google Patents

一种测定猪细小病毒的tcid50的试剂盒以及应用与方法 Download PDF

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李碧
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Abstract

本发明公开了一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法，涉及生物检测技术领域。本发明提供的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及方法能对猪细小病毒样本的TCID50进行测定。本发明提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒的TCID50进行测定，通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒的TCID50，克服了现有技术测定猪细小病毒样本的TCID50测定结果不准确，花费时间长的缺陷，实现对猪细小病毒样本的TCID50准确、快速测定。

Description

一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法。
背景技术
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，最早于1966年在用猪肾原代细胞培养猪瘟病毒时被首先发现，1967年从繁殖障碍母猪流产和死产胎儿中分离到该病毒，从而首次证明了它的致病作用。猪是PPV唯一易感动物，该病毒主要侵害母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪，造成死胎、木乃伊胎、畸形胎、流产、死产及产弱仔猪等，但母猪本身无明显症状；也可引起仔猪的腹泻、皮炎及关节炎。我国已经先后在北京、上海、湖北、河南等多地发生该病的流行。随着大型集约化养猪场的大量出现，该病呈现上升趋势，给养猪业造成巨大的经济损失。
针对该病尚无有效的治疗药物，世界范围内多采用疫苗免疫来控制本病的流行。目前，国内广泛使用PPV灭活苗来预防该病的发生，而评价PPV灭活疫苗的保护效果主要取决于疫苗中病毒的效价。因此寻求一个简单、快速、灵敏、精准的病毒效价测定方法对PPV疫苗生产工艺具有很重大的意义。
目前在疫苗生产过程中，多使用PK15和ST细胞来增殖病毒，而测定病毒效价最经典、最常用的方法是TCID50方法。TCID50(Tissue culture infective dose)，又称50％组织细胞感染量，即指能使半数组织细胞培养物感染的病毒量，可反应病毒感染性的强弱，但不准确测定感染性病毒颗粒的数量。由于PPV在细胞上增殖引起的细胞病变出现慢且不如猪伪狂犬病毒、猪乙脑病毒等产生的细胞病变易观察，利用现有技术中的方法测定猪细小病毒样本的TCID50耗时长，平均5-6天，而且需要用肉眼在显微镜下观察是否发生病变，从而计算感染病毒发生病变的病变率，容易造成病变结果的漏检，统计出错误的病变率，导致得出不准确的TCID50。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，该试剂盒对猪细小病毒TCID50的测定是通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒的TCID50，具有准确、快速的特点。
本发明的另一目的在于提供上述试剂盒在测定猪细小病毒的TCID50中的应用。采用上述试剂盒对猪细小病毒的TCID50的测定是通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒的TCID50，具有准确、快速的特点。
本发明的再一目的在于提供一种测定猪细小病毒的TCID50的方法，该方法与上述测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒联用，实现对猪细小病毒的TCID50的测定，通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒的TCID50，具有准确、快速的特点。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其包括用于固定猪细小病毒的固定液和用于结合猪细小病毒的抗体，抗体标记有用于催化底物显色的催化酶。
上述测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒在测定猪细小病毒的TCID50中应用。
一种测定猪细小病毒的TCID50的方法，其包括：
将待测猪细小病毒样本接种至含有敏感细胞的培养液中，进行病毒培养。
往经过病毒培养后的敏感细胞中加入用于固定猪细小病毒的固定液进行固定处理。
经固定处理后，加入标记有用于催化底物显色的催化酶的抗体及含有底物的显色液，进行显色反应。
于预设波长下测定待测猪细小病毒样本的吸光值，根据吸光值判断敏感细胞是否发生病变。
本发明实施例的一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法的有益效果是：本发明提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定，通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒样本的TCID50，由于本发明是通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，其具有判断准确、可靠的特点，进而克服了现有技术测定猪细小病毒样本的TCID50时需要用肉眼在显微镜下观察是否发生病变，从而导致测定结果不准确的缺陷，同时，本发明提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定花费时间短，克服了现有技术测定时间长的缺陷，实现对猪细小病毒样本的TCID50准确、快速的测定。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法进行具体说明。
一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其包括用于固定猪细小病毒的固定液和用于结合猪细小病毒的抗体，抗体标记有用于催化底物显色的催化酶。
优选地，固定液由甲醇和丙酮按体积比为0.8-1.2:1的比例配制而成。更优选地，固定液由甲醇和丙酮按体积比为1:1的比例配制而成。
由甲醇和丙酮按体积比为0.8-1.2:1的比例配制的固定液，可以防止细胞发生自溶并保存细胞固有物质，使细胞基本上保持与生活时的物质一致。
优选地，上述抗体为抗猪细小病毒的抗体，催化酶为辣根过氧化物酶。
更优选地，上述抗猪细小病毒的抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪细小病毒单克隆抗体中的任意一种。或者上述抗猪细小病毒的抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪细小病毒多克隆抗体中的任意一种。
优选地，本发明提供的试剂盒还包括抗猪细小病毒的第一抗体，上述抗体为抗第一抗体的第二抗体，催化酶为辣根过氧化物酶。
更优选地，上述第一抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪细小病毒单克隆抗体中的任意一种；或者上述第一抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪细小病毒多克隆抗体中的任意一种。上述第二抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗抗猪细小病毒抗体的单克隆抗体中的任意一种；或者上述第二抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗抗猪细小病毒抗体的多克隆抗体中的任意一种。
需要说明的是，本发明提供的试剂盒还可以包括显色液、洗涤液、终止液、封板膜中的一种或多种。显色液中包括被催化酶催化显色的底物，本发明实施例中提供的显色底物是辣根过氧化物酶常用的底物四甲基联苯胺(TMP)，其被辣根过氧化物酶催化显色后的测定波长为450nm。洗涤液为含体积分数0.04-0.06％的Tween-20的磷酸缓冲液(PBST)。终止液为浓酸或浓碱。
本发明还提供一种测定猪细小病毒的TCID50的方法，其包括：
将待测猪细小病毒样本接种至含有敏感细胞的培养液中，进行病毒培养。
具体地：用稀释液将待测猪细小病毒样本梯度稀释后接种到含有敏感细胞的细胞培养板中，每个梯度浓度设置多个重复孔，进行病毒培养，同时设置阴性对照孔和阳性对照孔。其中，阴性对照组中不接种病毒，加入相同体积的稀释液；阳性对照组中接种相同体积的已知效价的病毒液。同时设立三组平行实验。
优选地，在进行病毒培养之前，还包括敏感细胞的培养。敏感细胞的培养包括：
取传代后的敏感细胞，培养至细胞汇合度达到90％以上时，弃去细胞培养液；使用PBS洗涤三次，加入EDTA-胰酶溶液消化1-5分钟；弃去EDTA-胰酶溶液，加入10mL细胞传代培养液吹打细胞使细胞从细胞瓶中脱落，然后按照1:4-5的比例制备单细胞悬液；将单细胞悬液以1-3×105个/mL的密度接种至96孔板，每孔100μL；36-38℃，4.5-5.5％CO2培养8-12小时。
细胞汇合度是用来衡量细胞在培养皿中的总的生长情况的一个指标，指两两连接在一起的克隆数目占总的比率。接种密度不宜过小，否则细胞不能很好的生长，也不宜过大，否则不利于猪细小病毒的增殖。
其中，细胞培养板的孔数可根据实验中稀释的梯度数量及每个样所做的复孔数量进行调整，常用48、96、384孔板。通常96孔细胞培养板每个孔的容积为300μL左右，因而在以上述细胞密度进行接种时，一般每个孔接种100μL。
优选地，使用敏感细胞的培养液作为稀释液稀释待测猪细小病毒样本，以6-20个浓度梯度进行逐步稀释，任意两个浓度梯度之间的稀释倍数为2-15倍。
浓度梯度的数量是根据细胞密度及初始病毒含量(估计值)确定的；稀释倍数过大，每次稀释的误差会增大，因而最大稀释倍数限定在15倍。
优选地，敏感细胞为猪睾丸细胞的原代细胞或传代细胞；或者敏感细胞为猪肾细胞的原代细胞或传代细胞。
优选地，病毒的培养的条件为：温度为36-38℃，CO2浓度为4.5-5.5％，培养时间为8-12小时。
往经过病毒培养后的敏感细胞中加入用于固定猪细小病毒的固定液进行固定处理；
优选地，固定处理条件为：2-8℃静置30-60min。固定时间不宜过短也不宜过长，时间过短固定不完全，将降低抗原的反应灵敏度，造成假阴性结果；固定时间过长会造成细胞脱落造成假阳性结果。
经固定处理后，加入标记有用于催化底物显色的催化酶的抗体及含有底物的显色液，进行显色反应。
显色反应由抗体标记的催化酶催化显色液而产生，所以需要一定的反应的时间，一般以10-30min为宜，避光显色。
于预设波长下测定待测猪细小病毒样本的吸光值，根据吸光值判断敏感细胞是否发生病变。
具体地，显色反应完成后，加入终止液终止显色反应，避免产生气泡，并在10min内测定待测猪细小病毒样本实验孔、阴性对照孔及阳性对照孔在450nm处的吸光值。
敏感细胞发生病变的阳性判断标准为：
阳性对照组OD450的平均值≥1.0，阴性对照组OD450的平均值﹤0.1时，代表实验成立，实验数据有效。当待测猪细小病毒样本的每个梯度浓度的单个实验孔的OD450﹥2.1倍阴性对照组OD450的平均值时，判定该单个实验孔为阳性，即敏感细胞发生了病变。当待测猪细小病毒样本的每个梯度浓度的单个实验孔的OD450≤2.1倍阴性对照组OD450的平均值时，判定该单个实验孔为阴性，即敏感细胞未发生病变。
按照下列公式计算每个梯度浓度下的阳性率：
阳性率＝(累计阳性孔数/累计阳性孔数及阴性孔数的总和)×100％
其中，累计阳性孔数从高稀释度到低稀释度累积计算；累计阴性孔数从低稀释度到高稀释度累积计算。
计算TCID50：
根据每个梯度浓度的阳性率，使用Reed-Muench方法，按下式计算待测猪细小病毒样本的TCID50：
LogTCID50＝高于50％阳性率最高稀释度的对数+距离比×稀释度间距的对数
距离比＝(高于50％阳性率的百分数-50％)/(高于50％阳性率的百分数-低于50％阳性率的百分数)。
综上，本发明提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定，通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒样本的TCID50，由于本发明是通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，其具有判断准确、可靠的特点，进而克服了现有技术测定猪细小病毒样本的TCID50时需要用肉眼在显微镜下观察是否发生病变，从而导致测定结果不准确的缺陷，同时，本发明提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定花费时间短，克服了现有技术测定时间长的缺陷，实现对猪细小病毒样本的TCID50准确、快速的测定。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其包括用于固定猪细小病毒的固定液和用于结合猪细小病毒的抗体。
具体地，固定液由甲醇和丙酮按体积比1:1的比例配制而成。
抗体包括第一抗体和第二抗体。第一抗体为兔抗猪细小病毒多克隆抗体。第二抗体为羊抗兔IgG的多克隆抗体，并且第二抗体标记有辣根过氧化物酶。
本实施例提供的试剂盒通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，克服了现有技术测定猪细小病毒样本的TCID50时需要用肉眼在显微镜下观察是否发生病变，从而导致测定结果不准确的缺陷，同时，本发明提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定花费时间短，克服了现有技术测定时间长的缺陷，实现对猪细小病毒样本的TCID50快速、准确的测定。
需要说明的是，在其他实施例中，本发明提供的试剂盒还可以包括显色液、洗涤液、终止液、封板膜中的一种或多种。
实施例2
本实施例提供一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其与实施例1提供的试剂盒大致相同，其区别在于，本实施例提供的试剂盒中：
固定液由甲醇和丙酮按体积比0.8:1的比例配制而成。
第一抗体为小鼠抗猪细小病毒单克隆抗体，第二抗体为大鼠抗小鼠IgG的多克隆抗体，并且第二抗体标记有辣根过氧化物酶。
本实施例的有益效果同实施例1。
实施例3
本实施例提供一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其与实施例1提供的试剂盒大致相同，其区别在于，本实施例提供的试剂盒中：
固定液由甲醇和丙酮按体积比1.2:1的比例配制而成。
抗体为大鼠抗猪细小病毒单克隆抗体，该大鼠抗猪细小病毒单克隆抗体标记有辣根过氧化物酶。
本实施例的有益效果同实施例1。
实施例4
本实施例提供了测定猪细小病毒的TCID50的方法，其包括：
1.材料与试剂
阳性对照病毒：猪细小病毒标准毒株购于中国兽医药品监察所，由四川华神兽用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重点实验室繁殖分装保存备用(效价大于106TCID50/mL)。
待测猪细小病毒样本：待测猪细小病毒样本由四川华神兽用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重点实验室分离保存备用。
细胞系猪睾丸细胞(ST)，按照《兽药典》规程测定不含外源病毒、细菌、霉菌和支原体等污染物。
细胞培养液DMEM购于Thermo Fisher Scientific；胎牛血清(FBS)购于ThermoFisher Scientific；细胞传代培养液含体积百分数为8％的FBS；细胞维持培养液含体积百分数为2％的FBS。
固定液：丙酮与甲醇按体积比为1:1的比例配置。
抗体：第一抗体：兔抗猪细小病毒多克隆抗体由四川华神兽用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重点实验室提供；第二抗体：HRP标记的羊抗兔IgG的多克隆抗体购于南京金斯瑞生物科技有限公司。
磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.48g、KH2PO4 0.2g，加蒸馏水至1000mL，分装，121℃灭菌30min，备用。
EDTA-胰酶溶液：质量分数为0.25％的胰酶，5mM EDTA的PBS，pH 7.2-7.4。
洗涤液PBST：向1000mL的PBS中加入0.5mL的Tween-20，混匀备用。
TMB(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine)显色液：购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
终止液：2M H2SO4；向178.3mL蒸馏水中逐滴加入98％的浓硫酸21.7mL配置而成。
2.测定方法
2.1.培养敏感细胞
取传代后48小时的ST细胞，培养至细胞汇合度达到90％以上时，弃去细胞培养液；使用PBS洗涤三次，加入EDTA-胰酶溶液消化3分钟；弃去EDTA-胰酶溶液，加入10mL细胞传代培养液吹打细胞使细胞从细胞瓶中脱落，然后按照1:4的比例制备单细胞悬液；将单细胞悬液以2×105个/mL的密度接种至96孔板，每孔100μL；37℃，5％CO2培养8小时。
2.2.稀释待测猪细小病毒样本
取待测猪细小病毒样本，室温解冻后用含体积百分数为2％FBS的细胞培养液进行10倍倍比稀释。具体方法如下：取1.5mL离心管10个，在每个离心管中加入900μL含体积百分数为2％FBS的细胞培养液。取待测猪细小病毒样本100μL，加入到第一个离心管中，混匀后取100μL加入到另外一个离心管中，以此方法稀释10个浓度。
2.3.接种病毒
将稀释后的待测猪细小病毒样本加入到96孔板中，每个梯度重复8孔，每孔100μL，作为待测样本孔。同时设置阴性对照孔和阳性对照孔。其中，阴性对照孔中加入含体积百分数为2％FBS的细胞培养液100μL，重复4孔；阳性对照孔中加入含体积百分数为2％FBS的阳性对照病毒100μL，重复4孔。37℃，5％CO2恒温培养箱中培养24小时。同时设立三组平行实验。
2.4.固定处理
弃去细胞培养板中的细胞培养液，每孔加入200μL固定液4℃静置60min。
2.5.显色反应
弃去固定液，每孔加入PBST 300μL，静置3min，倒掉洗涤液，按照此方法连续洗涤5次。
每孔加入第一抗体：兔抗猪细小病毒多克隆抗体100μL，兔抗猪细小病毒多克隆抗体按照1:200的比例稀释，稀释液为PBST，随后室温孵育60min。
弃去第一抗体，使用PBST洗涤5次。
每孔加入第二抗体：HRP标记的羊抗兔抗猪细小病毒抗体的多克隆抗体100μL，按照1:2000的比例稀释，稀释液为PBST，随后室温孵育30min。
弃去第二抗体，使用PBST洗涤5次。
每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色10min。
2.6.测定
每孔加入终止液50μL，避免产生气泡，10min内测定450nm处的吸光值。
2.7.结果判定
阳性对照孔OD450的平均值≥1.0，阴性对照孔OD450的平均值﹤0.1时，代表实验成立，实验数据有效。当每个梯度浓度的待测样本孔的单个孔的OD450﹥2.1倍阴性对照孔OD450的平均值时，判定该单个孔为阳性，即敏感细胞发生了病变。当每个梯度浓度的待测样本孔的单个孔的OD450≤2.1倍阴性对照孔OD450的平均值时，判定该单个孔为阴性，即敏感细胞未发生病变。
按照下列公式计算每个梯度浓度下的阳性率：
阳性率＝(累计阳性孔数/累计阳性孔数及阴性孔数的总和)×100％
其中，累计阳性孔数从高稀释度到低稀释度累积计算；累计阴性孔数从低稀释度到高稀释度累积计算。
2.8.计算待测猪细小病毒样本的TCID50
根据每个梯度浓度的阳性率，使用Reed-Muench方法，按下式计算待测猪细小病毒样本的TCID50：
LogTCID50＝高于50％阳性率最高稀释度的对数+距离比×稀释度间距的对数
距离比＝(高于50％阳性率的百分数-50％)/(高于50％阳性率的百分数-低于50％阳性率的百分数)。
本实施例中，根据上述方法测定的待测猪细小病毒样本的TCID50为4.73×106/mL。即将待测猪细小病毒样本稀释4.73×106倍接种1mL可使50％的细胞发生病变。具体结果如表1所示。
实施例5
本实施例提供了测定细小病毒的方法，其与实施例4中提供的方法大致相同，区别在于：
本实施例中的敏感细胞为猪肾细胞(PK15)，PK15的培养：取传代后48小时的PK15细胞，培养至细胞汇合度达到90％以上时，弃去细胞培养液；使用PBS洗涤三次，加入EDTA-胰酶溶液消化1.5分钟；弃去EDTA-胰酶溶液，加入10mL细胞传代培养液吹打细胞使细胞从细胞瓶中脱落，然后按照1:5的比例制备单细胞悬液；将单细胞悬液以1×105个/mL的密度接种至96孔板，每孔100μL，37℃，5％CO2培养8小时。
显色反应中，第一抗体为大鼠抗猪细小病毒多克隆抗体(由四川华神兽用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重点实验室提供)，第二抗体为HRP标记的兔抗大鼠IgG的多克隆抗体(购于上海生工生物工程有限公司)。
本实施例中，根据上述方法测定的待测猪细小病毒样本的TCID50为2.29×106/mL。即将待测猪细小病毒样本稀释2.29×106倍接种1mL可使50％的细胞发生病变。具体结果如表1所示。
实施例6
本实施例中提供了现有技术中测定猪细小病毒的TCID50的方法，其包括：
1.培养敏感细胞
取传代后48小时的ST细胞，培养至细胞汇合度达到90％以上时，弃去细胞培养液；使用PBS洗涤三次，加入EDTA-胰酶溶液消化3分钟；弃去EDTA-胰酶溶液，加入10mL细胞传代培养液吹打细胞使细胞从细胞瓶中脱落，然后按照1:4的比例制备单细胞悬液；将单细胞悬液以2×105个/mL的密度接种至96孔板，每孔100μL；37℃，5％CO2培养8小时。
2.稀释待测猪细小病毒样本
取待测猪细小病毒样本，室温解冻后用含体积百分数为2％FBS的细胞培养液进行10倍倍比稀释。具体方法如下：取1.5mL离心管10个，在每个离心管中加入900μL含体积百分数为2％FBS的细胞培养液。取待测猪细小病毒样本100μL，加入到第一个离心管中，混匀后取100μL加入到另外一个离心管中，以此方法稀释10个浓度。
3.接种病毒
将稀释后的待测猪细小病毒样本加入到96孔板中，每个梯度重复8孔，每孔100μL，作为待测样本孔。同时设置阴性对照孔和阳性对照孔。其中，阴性对照孔中加入含体积百分数为2％FBS的细胞培养液100μL，重复4孔；阳性对照孔中加入含体积百分数为2％FBS的阳性对照病毒100μL，重复4孔。37℃，5％CO2恒温培养箱中培养24小时。同时设立三组平行实验。
4.观察并记录结果
培养5天，肉眼在显微镜下观察细胞是否发生病变，记录每个梯度浓度下细胞发生病变的孔数，按下式计算每个梯度浓度下的病变率。
病变率＝(累计发生病变的孔数/累计发生病变的孔数及未发生病变的孔数的总和)×100％
其中，累计发生病变的孔数从高稀释度到低稀释度累积计算；累计未发生病变的孔数从低稀释度到高稀释度累积计算。
5.计算待测猪细小病毒样本的TCID50
根据每个梯度浓度的病变率，使用Reed-Muench方法，按下式计算待测猪细小病毒样本的TCID50：
LogTCID50＝高于50％病变率最高稀释度的对数+距离比×稀释度间距的对数
距离比＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)。
本实施例中，根据上述方法测定出的待测猪细小病毒样本的TCID50为2.65×106/mL。即将待测猪细小病毒样本稀释2.65×106倍接种1mL可使50％的细胞发生病变。具体结果如表1所示。
实施例7
本实施例中提供了现有技术中测定猪细小病毒的TCID50的方法，其与实施例6中提供的方法大致相同，其区别在于：
本实施例中的敏感细胞为猪肾细胞(PK15)，PK15的培养：取传代后48小时的PK15细胞，培养至细胞汇合度达到90％以上时，弃去细胞培养液；使用PBS洗涤三次，加入EDTA-胰酶溶液消化1.5分钟；弃去EDTA-胰酶溶液，加入10mL细胞传代培养液吹打细胞使细胞从细胞瓶中脱落，然后按照1:5的比例制备单细胞悬液；将单细胞悬液以1×105个/mL的密度接种至96孔板，每孔100μL，37℃，5％CO2培养8小时。
本实施例中，根据上述方法测定出的待测猪细小病毒样本的TCID50为1.5×106/mL。即将待测猪细小病毒样本稀释1.5×106倍接种1mL可使50％的细胞发生病变。具体结果如表1所示。
表1实施例4-7的测定结果比较
表1中，实施例4和实施例5采用本发明提供的试剂盒以及方法分别测定了待测猪细小病毒样本对ST细胞和PK15细胞的TCID50，实施例6和实施例7采用现有技术中的方法分别测定了待测猪细小病毒样本对ST细胞和PK15细胞的TCID50。由表1可知，本发明提供的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及方法对猪细小病毒的TCID50的测定只需要花费约24小时，同时操作难度低，测定结果更准确，相对于现有技术的测定方法节约了时间，降低了操作难度，提高了测定的准确性。
综上所述，本发明提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定，通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒样本的TCID50，由于本发明是通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，其具有判断准确、可靠的特点，进而克服了现有技术测定猪细小病毒样本的TCID50时需要用肉眼在显微镜下观察是否发生病变，从而导致测定结果不准确的缺陷，同时，本发明提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定花费时间短，克服了现有技术测定时间长的缺陷，实现对猪细小病毒样本的TCID50准确、快速的测定。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，其包括用于固定猪细小病毒的固定液和用于结合所述猪细小病毒的抗体，所述抗体标记有用于催化底物显色的催化酶。
2.根据权利要求1所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，所述固定液由甲醇和丙酮按体积比为0.8-1.2:1的比例配制而成。
3.根据权利要求1所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，所述抗体为抗猪细小病毒的抗体，所述催化酶为辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗猪细小病毒的第一抗体，所述抗体为抗所述第一抗体的第二抗体，所述催化酶为辣根过氧化物酶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，所述抗体的种属来源是兔源、猪源、小鼠源或大鼠源中的任意一种。
6.权利要求1-5中任一项所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒在测定猪细小病毒样本的TCID50中的应用。
7.一种测定猪细小病毒的TCID50的方法，其特征在于，其包括：
将待测猪细小病毒样本接种至含有敏感细胞的培养液中，进行病毒培养；
往经过所述病毒培养后的所述敏感细胞中加入用于固定猪细小病毒的固定液进行固定处理；
经所述固定处理后，加入标记有用于催化底物显色的催化酶的抗体及含有所述底物的显色液，进行显色反应；
于预设波长下测定所述待测猪细小病毒样本的吸光值，根据吸光值判断所述敏感细胞是否发生病变。
8.根据权利要求7所述的测定猪细小病毒的TCID50的方法，其特征在于，将所述待测猪细小病毒样本接种至含有所述敏感细胞的所述培养液中是指：将所述待测猪细小病毒样本以6-20个浓度梯度进行梯度稀释后，将每个梯度浓度的待测猪细小病毒样本分别接种至所述培养液中，并且每个所述梯度浓度设置多个重复，其中，任意两个相邻所述梯度浓度之间的稀释倍数为2-15倍。
9.根据权利要求7或8所述的测定猪细小病毒的TCID50的方法，其特征在于，所述敏感细胞为猪睾丸细胞的原代细胞或传代细胞；或者所述敏感细胞为猪肾细胞的原代细胞或传代细胞。
10.根据权利要求7或8所述的测定猪细小病毒的TCID50的方法，其特征在于，所述病毒培养的条件为：温度36-38℃，4.5-5.5％CO2，培养24-48小时。
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