CN101846683A - 一种猪瘟活疫苗效力检验方法 - Google Patents

一种猪瘟活疫苗效力检验方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽药生物新医药技术领域，具体涉及猪瘟活疫苗的效力检验方法。通过用间接免疫荧光(IFA)方法检测活疫苗的病毒含量来评价活疫苗的效力。该方法检测时间短，并且操作简单、成本低、得到的结果准确，可重复性好，具有很好的应用价值和广阔的市场前景。

Description

一种猪瘟活疫苗效力检验方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种猪瘟活疫苗效力检验方法。
背景技术
猪瘟(Classical Swine fever，简称CSF)又称为猪霍乱(Hog cholera)或欧洲型猪瘟(European swine fever)，是一种猪急性或超急性发热的病毒传染性疾病，临床上的特征是散播迅速、发烧，解剖检验时可看到典型的出血病变。猪瘟可感染各种年龄的猪只，一年四季流行，发病率和死亡率均高，对猪危害极大。本病是威胁养猪业最重要的传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，中国则定为一类烈性传染病。许多国家和地区使用猪瘟活疫苗强制接种免疫，也是目前防治猪瘟的最佳方法。
目前，我国生产猪瘟活疫苗效力检测方法都是采用兔体反应热方法。不仅需要很多试验大白兔，费时又费力，而且由于我国纯系大耳白兔的逐渐减少和品系越来越杂，导致现如今很难用兔体反应热来准确检测活疫苗的效力。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种新的猪瘟活疫苗效力检验方法，具体地说，通过用间接免疫荧光(IFA)方法检测活疫苗在传代细胞中病毒含量来评价活疫苗的效力，替代传统的兔体反应热方法，以达到快速准确、简单有效的检测出猪瘟活活疫苗效力的目的。
本发明提供了一种猪瘟活疫苗效力检验方法，包括如下步骤：
(1)准备传代细胞
将长满单层的细胞，用EDTA-胰酶消化分散，得到传代细胞悬液；
(2)猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量测定
用细胞维持液将冻干猪瘟活疫苗回溶并稀释，将活疫苗稀释液和步骤(1)中细胞悬液加入细胞培养板中，置于培养箱中培养，同时设立不接毒正常细胞对照；
(3)间接免疫荧光(IFA)方法检测步骤(2)所得细胞中病毒含量
①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用PBS洗涤；
②加入丙酮水溶液固定；
③弃去丙酮水溶液，用PBS洗涤；
④加入PBS稀释的猪瘟阳性血清(一抗)；
⑤弃去一抗，PBS洗涤；
⑥加入PBS稀释的FITC标记兔抗猪IgG(二抗)；
⑦弃去二抗，用PBS洗涤，最后加入PBS保存；
⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，判定猪瘟活疫苗效力。
较佳的，步骤(1)中在细胞板中加入细胞悬液的同时，加入步骤(2)中经稀释的猪瘟活疫苗液。
较佳的，步骤(2)中所述猪瘟活疫苗稀释是在0-8℃低温环境下进行。
较佳的，步骤(2)中培养箱是CO2培养箱，温度为36-37℃，CO2含量为2.5％-5％，培养时间为2-5天。
较佳的，步骤(3)中PBS洗涤的次数为2-7次。
较佳的，步骤(3)中丙酮水溶液温度为0-8℃，浓度为30％-90％。
较佳的，步骤(3)中一抗的稀释倍数选择范围为50-1000倍，二抗的稀释倍数选择范围为50-10000倍。
优选的，步骤(3)中一抗的稀释倍数是400倍，二抗的稀释倍数是500倍。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
1.检测时间短，只需要3天，而通常用兔体感染剂量检测至少需要11天。
2.用细胞感染病毒，操作简单，成本低，不需要买大量的实验动物，同时不需要专人测定实验动物体温。
3.利用细胞感染病毒，条件均一、稳定，不会出现实验动物个体差异而引起的实验结果差异显著。
具体实施方式
实施例1
猪瘟活疫苗效力检验方法
1.准备传代细胞
将长满单层的猪睾丸(ST)细胞(来源于ATCC，美国典型菌毒种保藏中心)，用0.25％的胰酶(含0.02％的EDTA)消化分散后加入含3％胎牛血清的α-MEM细胞维持培养液，细胞计数后，将细胞悬液加入到96孔细胞板中，每孔100μl。
2.猪瘟活疫苗的稀释
本实施例制备了三批活疫苗，并分别测定了其抗原含量。
猪瘟活疫苗的毒株为猪瘟兔化弱毒株(中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412)。将猪瘟兔化弱毒株接种ST细胞，将收获的病毒抗原液配以适当冻干保护剂制成猪瘟活疫苗。用含3％胎牛血清的α-MEM细胞维持培养液将冻干猪瘟活疫苗回溶，在冰上或其他可保持0-8℃的低温环境中进行10倍系列稀释，取10-1-10-7稀释度加入步骤1中的细胞培养板的96孔板内，每孔100μl，每个稀释度做8孔重复，将细胞培养板置于CO2培养箱中培养，温度为36-37℃，CO2含量为2.5％-5％，培养时间为2-5天。优选地，温度为37℃、CO2含量为5％、培养时间为3天，即可进行间接免疫荧光(IFA)判定毒价。同时，设立不接毒正常细胞对照。具体步骤如下：
(1)弃去96孔板内液体，用0.01mol/L的PBS(pH值为7.4)洗2-7次，每次3min，最优地，洗涤次数为3次，每次3min；
(2)加入温度为0-8℃的30％-90％丙酮水溶液，最优地，80％的丙酮水溶液100u1/孔，4℃冰箱固定30min；
(3)弃去丙酮，用0.01mol/L的PBS(pH值为7.4)洗2-7次，每次3min，最优地，洗涤次数为3次，每次3min；
(4)加入用0.01mol/L的PBS(pH值为7.4)作50-1000倍稀释的猪瘟阳性血清(一抗，购自中国兽医药品监察所)，最优地，稀释倍数为400倍，抗体含量5μg/ml，每孔100μl，37℃作用60min；
(5)弃去一抗，用0.01mol/L的PBS(pH值为7.4)洗2-7次，每次3min，最优地，洗涤次数为3次，每次3min；
(6)加入用0.01mol/L的PBS(pH值为7.4)作50-10000倍稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记兔抗猪IgG(二抗，购自Sigma公司)，最优地，稀释倍数为500倍，抗体含量6μg/ml，每孔100μl，37℃作用60min；
(7)弃去二抗，用0.01mol/L的PBS(pH值为7.4)洗涤3次，每次10min，最后加入0.01mol/L的PBS(pH值为7.4)，每孔50μl；
(8)置于荧光显微镜下观察荧光情况，记录荧光孔数，按照Reed-Muench法计算TCID50结果；
(9)IFA荧光判定标准：设立的不接毒正常对照细胞胞浆内未出现特异黄绿色荧光，而接毒的细胞板孔内细胞胞浆内可观察到特异性的黄绿色荧光，判定为阳性孔。观察结果如下表1。
表1 间接免疫荧光(IFA)观察结果
Figure BSA00000158637500041
按照Reed-Muench法计算TCID50结果如下为表2所示。
表2 三批活疫苗的毒价测定结果
  疫苗批次   毒价测定结果(每头份含TCID50)
  Ⅰ批   104.5TCID50/头份
  Ⅱ批   104.667TCID50/头份
  Ⅲ批   104.57TCID50/头份
3.动物攻毒实验
(1)活疫苗稀释：具体稀释方法如下(每瓶疫苗按20头份计算)：
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ批疫苗，两瓶冻干疫苗用生理盐水混合回溶至40ml，每头份1ml，取其中1ml回溶后的疫苗液分别加入5.325ml、8.290ml、6.431ml生理盐水，然后再依次进行10倍系列稀释和5倍稀释，最终将每批疫苗稀释为病毒含量5TCID50/ml、1TCID50/ml、0.2TCID50/ml的疫苗使用液。具体操作如下：
取稀释后疫苗液1ml加入9ml生理盐水；取上步稀释后疫苗液1ml加入9ml生理盐水；取上步稀释后疫苗液1ml加入9ml生理盐水；取上步稀释后疫苗液2ml加入8ml生理盐水；取上步稀释后疫苗液2ml加入8ml生理盐水。
(2)动物试验设计
此项试验用39头仔猪(猪瘟抗原抗体均为阴性、体重均匀、健康)，随机分为10组，攻毒对照组为3头，免疫组每组4头。每批疫苗分别免疫3组，免疫剂量分别为0.2TCID50/头份、1TCID50/头份、5TCID50/头份。免疫后14日，免疫组连同条件相同的对照组一起注射105最小致死量(MLD)的猪瘟石门系血毒1ml(105MLD是指将猪瘟石门系血毒稀释105倍后给猪攻毒1ml，猪仍然死亡，是行业内的攻毒标准)。观察16日，判定结果，如下表3所示。根据结果，统计毒价与攻毒保护之间的相关性，统计出最小免疫剂量。
表3 动物试验设计及结果
Figure BSA00000158637500061
攻毒实验的结果表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ批猪瘟活疫苗(ST传代细胞)分别稀释到1TCID50/ml，注射1ml，即可达到仔猪全数保护量。即3批活疫苗对猪瘟石门系强毒的最小免疫剂量均为1TCID50/头份。目前猪瘟疫苗国家标准均是以一头份的疫苗稀释3000倍后免疫猪仍可以抵抗强毒攻击，而根据本发明方法，当检测的猪瘟活疫苗效价大于等于103.5TCID50/头份时，稀释3000倍后免疫猪，即能达到全数的保护效果，符合国家的检测标准。因此，根据本发明之方法，可以提出鉴定猪瘟活疫苗符合国家检测的标准。
综上所述，本发明提供一种新的猪瘟活疫苗效力检验方法，具体地说，通过用间接免疫荧光(IFA)方法检测活疫苗在传代细胞中病毒含量来评价活疫苗的效力。该方法检测时间短，并且操作简单、成本低、得到的结果准确，可重复性好，具有很好的应用价值和广阔的市场前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)准备传代细胞
将长满单层的细胞，用EDTA-胰酶消化分散，得到传代细胞悬液；
(2)猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量测定
用细胞维持液将冻干猪瘟活疫苗回溶并稀释，将活疫苗稀释液与步骤(1)中细胞悬液加入细胞培养板中，置于培养箱中培养，同时设立不接毒正常细胞对照；
(3)间接免疫荧光(IFA)方法检测步骤(2)所得细胞中病毒含量
①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用PBS洗涤；
②加入丙酮水溶液固定；
③弃去丙酮水溶液，用PBS洗涤；
④加入PBS稀释的猪瘟阳性血清(一抗)；
⑤弃去一抗，PBS洗涤；
⑥加入PBS稀释的FITC标记兔抗猪IgG(二抗)；
⑦弃去二抗，用PBS洗涤，最后加入PBS保存；
⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，判定猪瘟活疫苗效力。
2.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于：步骤(1)中在细胞板中加入细胞悬液的同时，加入步骤(2)中经稀释的猪瘟疫苗液。
3.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于：步骤(2)中所述猪瘟活疫苗稀释是在0-8℃低温环境下进行的。
4.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于：步骤(2)中培养箱是CO2培养箱，温度为36-37℃，CO2含量为2.5％-5％，培养时间为2-5天。
5.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于：步骤(3)中PBS洗涤的次数为2-7次。
6.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于：步骤(3)中丙酮水溶液温度为0-8℃，浓度为30％-90％。
7.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于：步骤(3)中一抗的稀释倍数选择范围为50-1000倍，二抗的稀释倍数选择范围为50-10000倍。
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