CN101181637A - 用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法。本发明包括如下技术步骤：(1)选择细胞系作为制苗用细胞；(2)制苗用细胞的传代与培养；(3)细胞毒种的繁殖；(4)制苗毒液的繁殖；(5)配苗、分装及冻干。本发明具有生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的猪瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

Description

用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法
                       技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法。
                       背景技术
我国目前生产猪瘟兔化弱毒疫苗所用的细胞为牛睾丸原代细胞。由于我国牛群BVD/MDV病比较普遍，用牛睾丸原代细胞制苗，易造成细胞外源病毒污染，且产毒滴度不高，批间差异大，给疫苗产量、效力的提高带来困难。
                       发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处，提供一种用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法。该方法具有生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的猪瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。
为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：
1.用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，包括如下技术步骤：
(1)选择细胞系作为制苗用细胞：
(2)制苗用细胞的传代与培养：上述细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
(3)细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬液，接种生长良好的上述细胞系单层，继续培养；每隔4-5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；
细胞毒种鉴定：细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量；
(4)制苗毒液的繁殖：取已形成良好单层的上述细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪瘟兔化弱毒的维持液，继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置-15℃以下保存；
制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量；
(5)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。
成品检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验，应符合“猪瘟活疫苗(细胞源)”规定，对猪安全无副作用。每头份疫苗含病毒≥7500个家兔感染量。
本发明是用细胞系(ST、PK15、IBRS-2)培养猪瘟兔化弱毒，收获细胞病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成细胞系猪瘟活疫苗。
上述技术方案中，(1)步骤中的细胞系为猪睾丸(ST)细胞系、猪肾(PK15)细胞系、猪肾(IBRS-2)细胞系之一。
上述技术方案中，步骤(2)、(3)、(4)中所述的细胞培养温度是36-37℃。
上述技术方案中，步骤(3)及(4)中所述的接种量为含3％-5％生产用细胞毒种或0.2％-0.5％脾毒种的维持液。
上述技术方案中，步骤(2)中所用生长液的配方是：90％-92％MEM液、8％-10％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.0-7.2。
上述技术方案中，步骤(3)及(4)中所用维持液的配方是：95％-98％MEM液、2％-5％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.2-7.4。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)用细胞系替代牛睾丸原代细胞制造猪瘟活疫苗，可解决牛源外源病原污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。
(2)采用本发明培养的猪瘟细胞毒液病毒含量高，用高滴度的抗原制造的猪瘟活疫苗可以大大提高疫苗的免疫效力，经免疫攻毒试验结果显示，对猪瘟强毒攻击可100％保护。
(3)用细胞系生产猪瘟活疫苗各批间质量差异小，具有生产工艺简单稳定、易操作、产量大、成本低等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。
                       附图说明
图1为本发明的制备流程图。
                      具体实施例
以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
(1)制苗用细胞的选择：选用猪睾丸(ST)细胞系；
(2)制苗用细胞的传代与培养：ST细胞系经EDTA-胰酶细胞分0散液消化传代，以细胞生长液于36℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
(3)细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3％的病毒悬液，接种生长良好的ST细胞系单层，置36℃继续培养。每隔4日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；
细胞毒种鉴定：细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量；
(4)制苗毒液的繁殖：取已形成良好单层的ST细胞系培养瓶，弃去营养液，接种含3％生产用细胞毒种或0.2％脾毒种的维持液，置36℃继续培养，接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置-15℃以下保存；
制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量；
(5)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，按一定的比例加入适宜稳定剂，同时加入适量的抗生素，充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。
成品检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验，应符合“猪瘟活疫苗(细胞源)”规定，对猪安全无副作用。每头份疫苗含病毒≥7500个家兔感染量。
上述所用营养液的配方是：90％MEM液、10％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.0。
上述所用维持液的配方是：95％MEM液、5％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.2。
实施例2
(1)制苗用细胞的选择：选用猪肾(PK15)细胞系；
(2)制苗用细胞的传代与培养：PK15细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
(3)细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.4％的病毒悬液，接种生长良好的PK15细胞系单层，置37℃继续培养。每隔5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；
细胞毒种鉴定：细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量；
(4)制苗毒液的繁殖：取已形成良好单层的PK15细胞系培养瓶，弃去营养液，接种含4％生产用细胞毒种或0.3％脾毒种的维持液，置37℃继续培养，接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置-15℃以下保存；
制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量；
(5)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，按一定的比例加入适宜稳定剂，同时加入适量的抗生素，充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品；
成品检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验，应符合“猪瘟活疫苗(细胞源)”规定，对猪安全无副作用。每头份疫苗含病毒≥7500个家兔感染量。
上述所用营养液的配方是：91％MEM液、9％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.1。
上述所用维持液的配方是：96％MEM液、4％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.3。
实施例3
(1)制苗用细胞的选择：选用猪肾(IBRS-2)细胞系；
(2)制苗用细胞的传代与培养：IBRS-2细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
(3)细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.5％的病毒悬液，接种生长良好的IBRS-2细胞系单层，置37℃继续培养。每隔4日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；
细胞毒种鉴定：细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量；
(4)制苗毒液的繁殖：取已形成良好单层的IBRS-2细胞系培养瓶，弃去营养液，接种含5％生产用细胞毒种或0.3％脾毒种的维持液，置37℃继续培养，接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置-15℃以下保存；
制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量；
(5)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，按一定的比例加入适宜稳定剂，同时加入适量的抗生素，充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品；
(8)成品检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验，应符合“猪瘟活疫苗(细胞源)”规定，对猪安全无副作用。每头份疫苗含病毒≥7500个家兔感染量。
一.本发明制备得到的猪瘟活疫苗与现有的同类制品的比较研究——猪瘟活疫苗(细胞系源)与猪瘟活疫苗(细胞源)的比较研究报告：
1材料
1.1疫苗猪瘟活疫苗(细胞系源)3批，批号：试ST200601、试ST200602、试ST200603。猪瘟活疫苗(细胞源)3批，批号：200601、200602、200603。以上6批疫苗的相关质量指标详见附件“产品质量检验报告”。
1.2兔本公司自繁自养的营养良好、体重1.5-3.0Kg的健康兔。
1.3试验用猪均为本公司动物场自繁自养、没有猪瘟病史和未使用过猪瘟疫苗的健康敏感猪。使用前逐头猪抽血，经中和试验法检测，猪瘟中和抗体均为阴性。
2方法与结果
2.1物理性状检验肉眼观察疫苗物理性状。两组疫苗各3批均为乳白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
2.2无菌检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15页进行检验，两组疫苗各3批均为无菌生长。
2.3支原体检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录19页进行检验，两组疫苗各3批均为无支原体生长。
2.4鉴别检验将疫苗用生理盐水稀释成每毫升含100个兔的最小感染量的病毒悬液，与等量抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置10-15℃中和1小时，其间振摇2-3次。同时设立病毒对照组和生理盐水对照组。中和结束后，分别接种兔2只，每只兔耳静脉注射1.0ml，测温方法及体温反应标准同效力检验项。两组疫苗各3批的结果，除阳性对照组出现热反应外，其余2组在接种后120小时内均不出现热反应。
2.5外源病毒检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录20页进行检验，两组疫苗各3批均为无外源病毒污染。
2.6安全检验用生理盐水将疫苗稀释成每毫升含6头份，每批疫苗分别肌肉注射健康易感猪4头，每头5ml(含30头份)。接种后测温观察和结果判定，按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)96页进行。结果见表1。
                 表1安全检验结果比较
  组别   批号   种类   剂量   数量   精神食欲   体温反应   结论
  细胞系源   试ST200601试ST200602试ST200603   中猪中猪中猪   30头份30头份30头份   4头4头4头   正常正常正常   正常正常正常   安全安全安全
细胞源   200601200602200603   中猪中猪中猪   30头份30头份30头份   4头4头4头   正常正常正常   正常正常正常   安全安全安全
2.7效力检验
2.7.1用兔检验用生理盐水将疫苗稀释成每毫升含1/2000头份、1/4000头份、1/7500头份、1/10000头份，每个稀释度分别耳静脉注射兔2只，每只1.0ml。接种后测温观察和结果判定，按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)96页进行。结果见表2。
                                表2用兔效力检验结果比较
组别 批号   疫苗稀释度(头份/ml)
  1/2000   1/4000   1/7500   1/10000
  细胞系源   试ST200601试ST200602试ST200603   ++、+++、++++、++   ++、+++、-(-、-)++、++   ++、++++、++++、+   +、+++、++++、-(-、-)
细胞源   200601200602200603   ++、++++、++++、+   +、-(-、-)+、++-、+(+、+)   -、--、--、-   -、--、--、-
注：1.++为定型热，+为轻热，±为可疑，-为无反应；
2.(+)为攻毒后热反应，(±)为攻毒后可疑反应，(-)为攻毒后无反应。
2.7.2用猪检验  将每头份猪瘟活疫苗(细胞系源)稀释3000倍，每头份猪瘟活疫苗(细胞源)稀释300倍，分别肌肉注射无猪瘟中和抗体的健康易感猪各4头，每头1.0ml。10-14日后，连同条件相同的对照猪3头，注射猪瘟石门系血毒1.0ml/头(105MLD)，观察16日。结果见表3。
                            表3用猪效力检验结果比较
组别 批号   免疫剂量(头份) 保护率 备注
细胞系源   试ST200601试ST200602试ST200603   1/30001/30001/3000   100％(4/4)100％(4/4)100％(4/4)
细胞源 200601200602200603 1/3001/3001/300 100％(4/4)100％(4/4)100％(4/4)   有1头稍有体温反应，但无猪瘟临床症状。
  对照组   0   0(0/3)
2.8剩余水份测定  按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录31页进行检验，两组疫苗各3批均符合规定。
2.9真空度测定  按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录31页进行检验，两组疫苗各3批均为符合规定。
3小结
参照《中华人民共和国兽药典》(2005年版)猪瘟活疫苗(细胞源)成品检验方法检验，结果显示：用ST细胞生产的3批猪瘟活疫苗1/3000头份免疫猪能100％产生免疫保护；1/7500头份接种兔均能符合规程兔体反应热的要求，全部合格。从疫苗的病毒含量、效力和安全检验结果可以看出，该疫苗的病毒滴度和免疫保护效力达到现有猪瘟牛睾丸原代细胞活疫苗规程标准的10倍，用ST细胞生产的3批猪瘟活疫苗以30倍剂量进行安全检验，全部合格。
二.猪瘟活疫苗(细胞系源)免疫效力的研究
1材料和方法
1.1试验用疫苗
实验室研制的猪瘟活疫苗(细胞系源)，批号分别为试ST200601、试ST200602、试ST200603，猪瘟活疫苗(细胞源)，批号为200601，经无菌检验、物理性状等检验合格后用于试验。
1.2试验动物的选择
由广东永顺生物制药有限公司自繁自养，无CSF、PR、PRRS病史以及未接种过CSF疫苗的中猪，经中和试验方法检测，选择猪瘟中和抗体阴性的健康易感猪。
1.3血清检测方法
以直接ELISA方法检测抗体，由广东永顺生物制药有限公司客户服务部负责检测。
1.4常规免疫剂量的猪瘟抗体消长规律测定及免疫持续期攻毒试验
取23头猪，随机分为5组，免疫组每组5头，对照组3头，用实验室研制的猪瘟活疫苗(细胞系源)试ST200601、试ST200602、试ST200603，猪瘟活疫苗(细胞源)200601，肌肉注射猪，每头1.0ml(含1头份)，阴性对照组以相同剂量的稀释液肌肉注射。免疫后分别于3d、7d、14d、21d、30d、45d、60d、120d、180d、240d、300d、360d抽血1次，分离血清，以直接ELISA方法测定其猪瘟抗体，制定抗体消长曲线，观察抗体消长规律。
1.5近期效力测定
取18头猪，随机分为4组，免疫组每组5头，对照组3头，用实验室研制的猪瘟活疫苗(细胞系源)试ST200601、试ST200602、试ST200603，肌肉注射猪，每头1.0ml(含1头份)。于免疫后第14天，对所有免疫猪及对照猪攻击强毒，各注射猪瘟石门系血毒1.0ml(105MLD)，观察16日，统计分析攻毒结果。
2.结果
2.1常规免疫剂量的猪瘟抗体消长规律测定
疫苗免疫后在第7天就能检测到ELISA抗体(注：0D值≥0.4为阳性)，至第35天达到高峰，抗体水平可维持到第360天。实验室研制的三批猪瘟活疫苗(细胞系源)产生的抗体水平明显高于猪瘟活疫苗(细胞源)，而且在较高的抗体水平下维持较长的时间。
2.2近期效力测定结果
通过对三批猪瘟活疫苗(细胞系源)试ST200601、试ST200602、试ST200603对免疫猪近期效力的测定效果可以看出，所有猪能够抵抗猪瘟强毒攻击，保护率达100％(5/5)。其结果见于表1。
                       表1  近期效力测定结果
组别   免疫头数(头)   攻毒剂量   免疫保护(头)   对照死亡(头)
  试ST200601试ST200602试ST200603   555   105MLD/1.0ml105MLD/1.0ml105MLD/1.0ml   5/55/55/5 3/3
3.分析与讨论
研究结果表明，三批猪瘟活疫苗(细胞系源)免疫猪后能较快产生高滴度抗体，而且抗体高峰维持时间长。通过攻毒试验证明，以单剂量的猪瘟活疫苗(细胞系源)均能抵抗猪瘟石门系血毒攻击。而在相同试验条件下，同等免疫剂量的猪瘟活疫苗(细胞源)免疫保护率明显低于猪瘟活疫苗(细胞系源)。

Claims (6)

1.用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：包括如下技术步骤：
(1)选择细胞系作为制苗用细胞：
(2)制苗用细胞的传代与培养：上述细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
(3)细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬液，接种生长良好的上述细胞系单层，继续培养；每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；
(4)制苗毒液的繁殖：取已形成良好单层的上述细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪瘟兔化弱毒的维持液，继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置-15℃以下保存；
(5)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。
2.根据权利要求1所述的用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：(1)步骤中的细胞系为猪睾丸细胞系、猪肾细胞系。
3.根据权利要求1所述的用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(2)、(3)、(4)中所述的细胞培养温度是36～37℃。
4.根据权利要求1所述的用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(3)及(4)中所述的接种量为含3％～5％生产用细胞毒种或0.2％～0.5％脾毒种的维持液。
5.根据权利要求1所述的用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(2)中所用生长液的配方是：90％～92％MEM液、8％～10％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.0～7.2。
6.根据权利要求1所述的用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：步骤(3)及(4)中所用维持液的配方是：95％～98％MEM液、2％～5％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.2～7.4。
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