CN105112352B - 一株适应全悬浮培养的st细胞及其应用和培养疫苗病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及株适应全悬浮培养的ST细胞及其在培养疫苗病毒中的应用，属于生物技术领域。本发明公开了一种适应全悬浮培养的ST细胞，命名为猪睾丸细胞悬浮适应株ST‑2014S，已于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201567，本发明还公开了利用ST细胞悬浮适应株培养疫苗病毒的方法。与现有技术相比，本发明公开的一种适应全悬浮培养的ST细胞培养疫苗病毒自动化程度高，不需要载体介入，可以在无血清或低血清培养基中悬浮培养，解决病毒培养大规模产业化的要求，开发能满足GMP生产技术要求的大规模化生产方法，拥有很好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株适应全悬浮培养的ST细胞及其在培养疫苗病毒中的应用和培养疫苗病毒的方法，属于生物技术领域。
背景技术
猪睾丸（swine testis,简称ST）细胞，是由猪睾丸原代细胞通过传代克隆筛选转化而来的工程细胞系，体外培养呈贴壁生长，可进行连续传代培养， ST细胞对多种猪病病毒比较敏感，如猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等，目前广泛应用于这几种猪病疫苗病毒的制备。
从1962年，Capstick等对BHK21细胞驯化实现悬浮培养并应用于疫苗生产，经过半个世纪的发展，细胞悬浮培养技术在生物制药行业的应用已经掀开工业化大规模生产的浪潮。
细胞悬浮培养技术以其自动化、规模化、细胞培养简易化、操作安全化、批间均一化等优势弥补了传统转瓶培养技术的众多不足，解决实际生产过程中的人工、成本、场地、生产周期、原材料控制、质量不稳定等诸多问题。
因为大多数疫苗病毒生产用细胞呈严格贴壁依赖性生长，所以制约细胞悬浮培养技术发展以及应用的关键是适应全悬浮培养的细胞株。常规ST细胞同样呈严格贴壁依赖性生长，所以CSFV、PPV、PRV、TGEV这几种病毒培养大多数采用转瓶培养方式，仅少数采用载体悬浮培养方式,还未能实现细胞全悬浮培养，细胞载体悬浮培养本质上还是贴壁依赖性培养，需要转瓶提供种子细胞，需要昂贵的微载体，需要增加微载体培养消化等步骤，细胞生长仍需要高血清含量的培养基，其中最重要的是细胞载体悬浮培养技术不能像全悬浮培养一样线性化放大，无法工业化大规模生产，这就制约了此项技术的工业化应用，这也是虽然有很多载体悬浮培养方面的研究或专利，但鲜有产品问市的原因所在。细胞全悬浮培养技术不但有线性化放大的优势，而且细胞可以用无血清或低血清培养，在降低疫苗成本，简化下游纯化工艺以及终产品安全性方面也独具优势。
发明内容
本发明目的是提供一种生产成本低、可以规模化放大培养的适应全悬浮培养的ST细胞及其在生产疫苗病毒中的应用和培养疫苗病毒的方法。
本发明采用以下技术方案实现上述目的：一株适应全悬浮培养的ST细胞，分类命名为猪睾丸细胞悬浮适应株ST-2014S，已于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201567。
ST细胞株在培养疫苗病毒中的应用。
ST细胞株在培养疫苗病毒中的应用，所述病毒为猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒，猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒。
一种ST细胞株培养疫苗病毒的方法，包括如下步骤：
（1）将液氮冻存的如权利要求1所述ST细胞株复苏，用摇瓶悬浮培养扩增，以细胞浓度5-10×105个/ml接种至生物反应器中悬浮培养，得到ST细胞悬浮培养液；
（2）当ST细胞悬浮培养液中细胞密度达到2-4×106个/ml时，用病毒培养维持培养基替换细胞生长培养基，并按照病毒培养维持培养基终体积的3.0-8.0%接种病毒；
（3）在生物反应器中继续培养悬浮细胞24-96h，收获病毒液。
所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。
与现有技术相比，本发明公开的一种适应全悬浮培养的ST细胞培养疫苗病毒自动化程度高，不需要载体介入，可以在无血清或低血清培养基中悬浮培养，解决病毒培养大规模产业化的要求，开发能满足GMP生产技术要求的大规模化生产方法，拥有很好的工业化应用前景。
附图说明
适应全悬浮培养的ST细胞，分类命名为猪睾丸细胞悬浮适应株ST-2014S，已于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201567。
图1 为ST-2014S细胞悬浮生长曲线图。
图2 为ST-2014S细胞显微图（100倍放大）。
具体实施方式
以下是本发明具体的实施方案，以进一步阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实验涉及的主要生物材料和设备
适应全悬浮培养ST细胞株，分类命名为猪睾丸细胞悬浮适应株ST-2014S，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201567，保藏日期为2015年5月13日。
细胞生长培养基：GRH公司M3专用培养基，添加3%新生牛血清，细胞生长培养基即是ST细胞悬浮株摇瓶培养与生物反应器全悬浮培养所用的营养液；
病毒培养维持培养基：GRH公司M3专用培养基，添加0.5-1.5%新生牛血清，病毒培养维持培养基即是全悬浮培养的ST细胞培养病毒所用的营养液；
疫苗病毒：猪瘟病毒（CSFV）C株，为广东永顺生物制药有限公司生产的STTM猪瘟活疫苗（传代细胞源）株分离得到；
伪狂犬病毒(PRV) Bartha-k61株，为梅里亚公司生产的伪狂犬病活疫苗株分离得到；
猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）华毒株，为哈兽研维科生物技术开发公司生产的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G型)三联活疫苗株分离得到；
猪细小病毒PPV-HN14株为本公司研发中心自行分离保存，已于2015年7月8日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC V201525；
生物反应器：美国NBS 14升搅拌式生物反应器。
实施例1 适应全悬浮培养ST细胞株的扩增培养
将保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201567的猪睾丸细胞悬浮适应株ST-2014S复苏传代培养，然后接种到生物反应器中悬浮培养，得到ST细胞悬浮培养液，具体步骤如下：
①取液氮冻存的ST-2014S细胞株，快速融化后加入盛有营养液的摇瓶中，于36～37℃培养60～72h，按照1:3-1:5的比例传代放大培养；
②将步骤①中放大培养的ST-2014S细胞株稀释至5-10×105个/ml的密度，接种入生物反应器，培养温度为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40%～60%，ST-2014S细胞悬浮生长曲线如图1所示；
③三批次生物反应器中细胞密度的测定：用生物反应器连续培养三个批次ST-2014S细胞，培养条件同步骤②，在培养的第72小时采样，细胞离心后用胰酶消化，用台盼兰染色法检测细胞密度，实验结果如表1所示。
表1
| 批次 | 1 | 2 | 3 |
| 生物反应器工作体积（升） | 9 | 8 | 10 |
| 细胞接种密度（105个/ml） | 5.6 | 9.1 | 7.4 |
| 细胞培养温度℃ | 37 | 36 | 36.5 |
| 细胞培养pH | 7.0 | 7.2 | 6.8 |
| 细胞培养溶氧浓度% | 50 | 60 | 40 |
| 细胞培养时间 | 72 | 72 | 72 |
| 收获细胞密度（105个/ml） | 31.8 | 36.9 | 34.7 |
实施例2 利用生物反应器悬浮培养ST细胞培养猪瘟病毒的方法
在摇瓶中培养扩增悬浮ST细胞，按7.5×105个/ml的密度，接种入生物反应器，细胞培养条件为：反应器工作体积10升，细胞培养温度为37℃，pH值为7.0，溶氧为50%，培养72小时，细胞密度为32.7×106个/ml时，更换为含1.0%新生牛血清的病毒培养维持培养液，按照病毒培养维持培养基体积的6%接种猪瘟病毒C株，病毒培养条件为：温度36℃，pH值为7.0，溶氧为45%，培养72小时收获第一批病毒液，继续加注病毒维持液连续培养病毒，共收获3批病毒液，病毒滴度按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》家兔定型热反应标准进行判定，收获病毒含量为4×106RID/ml。
实施例3-5 利用生物反应器悬浮培养ST细胞培养伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病病毒的方法
ST-2014S细胞悬浮培养方法同实施例2，培养72h时将细胞生长培养基更换为病毒培养维持培养基，病毒培养条件在具体实施例中按照接种病毒的不同适当调整，参照表2，所有病毒滴度的测定按照常规试验方法进行，实验结果见表2。
表2
| 实施例 | 3 | 4 | 5 |
| 生物反应器工作体积（升） | 9 | 10 | 10 |
| 细胞接种密度（105个/ml） | 8.2 | 8.7 | 9.0 |
| 72h细胞密度（105个/ml） | 32.9 | 33.4 | 34.5 |
| 接种病毒株 | PRV Bartha-k61 | TGEV 华毒株 | PPV HN14 |
| 病毒维持培养基血清含量% | 0.5 | 1.0 | 1.5 |
| 病毒接种量 | 4% | 5% | 6% |
| 病毒培养温度℃ | 37 | 36 | 37 |
| 病毒培养pH | 6.9 | 7.0 | 7.0 |
| 病毒培养溶氧浓度% | 40 | 40 | 50 |
| 病毒培养时间（h） | 48 | 48 | 48 |
| 病毒滴度 （TCID50/ml） | 9.0 | 7.5 | 8.75 |
Claims (5)
1.一株适应全悬浮培养的ST细胞，其特征在于：命名为猪睾丸细胞悬浮适应株ST-2014S，已于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201567。
2.权利要求1所述的ST细胞株在培养疫苗病毒中的应用。
3.权利要求2所述的ST细胞株在培养疫苗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒，猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒。
4.一种ST细胞株培养疫苗病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将液氮冻存的如权利要求1所述ST细胞株复苏，用摇瓶悬浮培养扩增，以细胞浓度5-10×105个/ml接种至生物反应器中悬浮培养，得到ST细胞悬浮培养液；
（2）当ST细胞悬浮培养液中细胞密度达到2-4×106个/ml时，用病毒培养维持培养基替换细胞生长培养基，并按照病毒培养维持培养基终体积的3.0-8.0%接种病毒；
（3）在生物反应器中继续培养ST悬浮细胞24-96h，收获病毒液。
5.根据权利要求4所述的ST细胞株培养疫苗病毒的方法，其特征在于：所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。
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