CN103614303A

CN103614303A - 一种表达糖化酶的里氏木霉菌株

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Publication number: CN103614303A
Application number: CN201310617839.5A
Authority: CN
Inventors: 王华明; 张慧丹; 吴佳鹏; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: CN103614303B

Abstract

本发明的目的是提供一种用于生产糖化酶的里氏木霉突变菌株，为里氏木霉HDGAU-1（Trichoderma reesei HDGAU-1），其保藏编号为CCTCC NO:M2013584。本发明的里氏木霉突变株能高效表达糖化酶，发酵酶活高达4000U/ml，比突变前提高了54%；蛋白量超过2.1g/L，比突变前提高了约50%。利用该里氏木霉突变株生产糖化酶能大幅降低糖化酶的生产成本，有利于糖化酶的广泛应用。而且本发明重组表达的糖化酶最适作用温度为70℃，最适作用pH为5.5，比目前常用的黑曲霉来源的糖化酶催化效率更高，更耐高温，能有效缩短糖化时间，降低生产成本。

Description

一种表达糖化酶的里氏木霉菌株

技术领域

本发明属于基因工程微生物构建筛选技术领域，具体涉及一种重组表达糖化酶的里氏木霉菌株及其应用。

背景技术

糖化酶，系统名为ａ-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶（ａ-1,4-glucan-glucohydrolase(EC.3.2.1.3)）。研究表明，糖化酶的作用底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性末端切开a-1,4键处，也能缓慢切开a-1,6键。因此，它能很快的把直链淀粉从非还原性末端依次切下葡萄糖单位，在遇到a-1,6键分割，先将a-1,6键分割，再将a-1,4键分割，从而使支链淀粉水解成葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵中；还广泛应用于生产各种规格的葡萄糖。

国内外葡萄糖生产大多采用酶法，酶法制糖工艺一般采用两步法，第一步用a-淀粉酶将淀粉水解成低分子量的糊精，称为液化；第二步用糖化酶将糊精水解成葡萄糖，称为糖化。但浓度较高的淀粉液糊化时，必须迅速液化，否则淀粉液粘度上升使设备无法运行，已经糊化的淀粉在温度降低后会发生老化无法液化，目前制糖工艺广泛采用喷射液化，喷射温度一般在105-108℃，现在使用的a-淀粉酶主要来源于地衣芽孢杆菌的耐高温a-淀粉酶，最适温度90℃以上，最适pH5.5-7.0。但是糖化酶的最适温度、pH等均与淀粉酶不同，因此需要调整温度和pH后才能进入糖化过程。

糖化酶在微生物中分布很广，属于糖苷水解15（GH15）蛋白质家族，至今已经有40个来源于丝状真菌、酵母菌、真细菌和古细菌的开发阅读框被划分到此家族。目前工业中常用的糖化酶均来源于黑曲霉（Aspergillus niger），最适pH4.5，最适温度60℃，因此液化完成后，需要将液化淀粉冷却至55-60℃，pH调至4.5-5.0后，加入适量的糖化酶，保持糖化48h左右，糊精就基本转化成葡萄糖；但为了缩短糖化时间，在糖化过程中，常采用高温（88-100℃），这就要求有耐高温的酶系来参与糖化作用。但目前使用的糖化酶普遍不能耐受高温，且糖化酶产量比较低，生产成本较高，因而影响了糖化酶在工业中的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组表达糖化酶的里氏木霉突变株，本发明首先构建得到重组表达糖化酶的里氏木霉工程菌，然后对其进行紫外诱变，获得糖化酶表达量大幅提高的突变株，从而有利于提高糖化酶的产量，降低生产成本，以弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于生产糖化酶的里氏木霉重组菌株，所述的菌株用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的糖化酶。

编码上述糖化酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

所述的里氏木霉菌株中转入了携带有序列为SEQ ID NO:2的表达质粒。

本发明另一个方面提供了一种用于生产糖化酶的里氏木霉突变菌株，为里氏木霉HDGAU-1（Trichoderma reesei HDGAU-1），已于2013年11月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013584。

本发明的里氏木霉突变株能高效表达糖化酶，发酵酶活高达4000U/ml，比突变前提高了54%；蛋白量超过2.1g/L，比突变前提高了约50%。利用该里氏木霉突变株生产糖化酶能大幅降低糖化酶的生产成本，有利于糖化酶的广泛应用。而且本发明重组表达的糖化酶最适作用温度为70℃，最适作用pH为5.5，比目前常用的黑曲霉来源的糖化酶催化效率更高，更耐高温，能有效缩短糖化时间，降低生产成本。

附图说明

图1：里氏木霉突变株发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图；

图2：里氏木霉突变株的菌落形态和菌丝形态，其中A为PDA培养基上的菌落形态对比，B为PDA培养基上菌落的菌丝形态对比，C为发酵液中的菌丝形态对比；

图3：重组糖化酶作用pH-相对酶活曲线图；

图4：重组糖化酶作用温度-相对酶活曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1糖化酶基因的克隆与表达载体的构建

1.1提取木霉总基因组DNA

将里氏木霉（Trichoderma reesei）接种摇瓶培养基过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mMTris-HCl,100mM EDTA,250mM NaCl,1%SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠、在珠打仪剧烈振荡2min左右；水浴锅65℃水浴20min后加入200μl 10MNH₄AC冰浴10min；13000rpm离心10min取上清，然后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min弃上清，用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入适量水溶解于-20℃保存。

1.2基因克隆

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用引物Gl-F和Gl-R（5’-ATCGGTACCATGCACGTCCTGTCGACT-3’5’-TCGTCTAGATTACGACTGCCAGGTGTCCTCCTT-3’）进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S，59℃40S，72℃2min，共30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

1.3测序分析

将1.2中回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-GA质粒并送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果，扩增产物的基因序列为SEQ ID NO:2，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1。多个克隆的结果证明没有发生扩增错误。

1.4构建载体

提取质粒pMD-GA，用XbaI和KpnI进行双酶切，回收GA片段；取2μl回收产物与NcoI和KpnI双酶切pKDN-5载体连接过夜导入大肠杆菌DH5α，获得重组表达质粒pKDN-GA，测序结果证实插入的片段能够编码序列为SEQID NO:1的糖化酶。

实施例2转化与筛选

2.1原生质体制备

接种里氏木霉（Trichoderma reesei）菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约60mlYEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、1%Uridine）的液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20ml裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.7M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000rpm，离心10min；弃上清，加10-20ml STC液（20%蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl₂）悬浮，3000rpm，离心10min；加适量STC悬浮分装（150μl/管，10⁸个/ml）。

2.2转化与验证

取2μg pKDN-GA DNA加入到150μl原生质体中，接着加入500μl25%PEG轻轻混匀，室温静置25min；然后分2-3次再加1ml25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO₄,1%KH₂PO4,0.6%(NH₄)₂SO₄,1%葡萄糖,18.3%山梨醇,0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/ml下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)₂SO₄,1.5%KH₂PO₄,0.06%MgSO₄,0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），28℃黑暗培养数天至转化子长出。

按照实施例1所述方法提取转化子基因组DNA为模板，利用实施例1所述引物Gl-F和Gl-R进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S；59℃30s，72℃2min30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，即经过上述两个PCR反应选育和验证阳性转化子。将其中一株阳性转化子命名为里氏木霉HDGA-1（Trichoderma reesei HDGA-1）。

实施例3诱变与筛选

将里氏木霉HDGA-1菌株接种到PDA培养基，30℃培养7天，用生理盐水制备单孢子悬液，其浓度控制为10⁶个/ml左右。取孢子悬液10mL放于半径为9cm的培养皿中，并将其放入带有磁力搅拌器的暗箱中，在9W紫外灯下距离20cm照射2min(紫外灯应预热30min)；然后用无菌水稀释成10⁴、10⁵、10⁶浓度，分别取0.1ml涂布PDA平皿(为防止回复突变，此操作在红灯下进行)；将涂好的平皿置于30℃的恒温培养箱中避光培养3d；将长出的形态有变化的单菌落挑到PDA培养基上培养。

实施例4发酵验证

将紫外诱变筛选的菌株和出发菌株（阴性对照）分别接种于MM发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000）培养，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测，并在显微镜下观察菌丝形态的变化。最终选出一株形态发生显著变化，且重组蛋白表达量显著提高的突变株，命名为里氏木霉HDGAU-1（Trichoderma reesei HDGAU-1）。该菌株发酵上清液SDS-PAGE电泳检测结果如图1所示，箭头所指处即为重组糖化酶，与出发菌株相比，突变株HDGAU-1的表达量得到显著提高；该菌株在PDA培养基上的菌落和菌丝形态变化情况如图2所示，与出发菌相比，突变株HDGAU-1的菌落和菌丝发生了显著的变化。

酶活测定方法

甲、乙两支50mL比色管，分别加入25mL的2％可溶性淀粉溶液和5mL的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)；于40±0.2℃的恒温水浴中预热5～10min。在甲管中加入酶制备液2.0mL摇匀并立即记时；反应1h后，立即在甲、乙两管各加0.2mL的20％氢氧化钠溶液，立即摇匀并将两管取出迅速用水冷却；然后于乙管中补加酶制备液2.0mL(作为对照)。取两管中上述反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入0.1N碘液10mL，再加0.1N氢氧化钠溶液15mL(边加边摇晃)，放置暗处15min，加入2N硫酸2mL；最后用0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至无色为终点。

酶活X＝(A-B)×N×90.05×n

其中:X——酶活力单位,μ/g(mL);

A——空白试验消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;

B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;

N——硫代硫酸钠溶液的当量浓度;

n——稀释倍数;

90.05——1mL1N硫代硫酸钠相当葡萄糖毫克数;

按照上述测定方法，取1ml上述发酵上清液进行酶活测定，以出发菌株HDGA-1发酵上清液为对照。结果显示，出发菌株发酵上清液的酶活为2598U/ml，而突变株HDGAU-1的酶活高达4000U/ml，比出发菌提高了54%，说明突变菌的糖化酶表达量较突变前得到显著提高。

采用考马斯亮蓝法测定发酵上清液的蛋白量，以出发菌株HDGA-1发酵上清液为对照。结果显示，出发菌株发酵上清液的蛋白量为1.4g/L，而突变菌株的蛋白量高达2.1g/L，比出发菌提高了50%，说明突变菌的蛋白总量较突变前得到显著提高。

将上述突变菌里氏木霉HDGAU-1（Trichoderma reesei HDGAU-1）于2013年11月20日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013584。

实施例5重组糖化酶酶学性质分析

用pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液稀释实施例4所述出发菌和突变菌发酵上清液，分别测定其酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做作用pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，本发明的里氏木霉突变菌HDGAU-1表达的糖化酶与出发菌相比，作用pH-相对酶活曲线并未发生变化，最适作用pH值均为5.5。

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，pH7.5条件下测定实施例4所述出发菌和突变菌发酵上清液酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图4所示，本发明的里氏木霉突变菌HDGAU-1表达的糖化酶与出发菌相比，作用温度-相对酶活曲线并未发生变化，最适作用温度均为70℃。

上述结果表明，本发明里氏木霉工程菌的突变并未引起其表达的糖化酶酶学性质发生失活突变。

实施例6里氏木霉突变株重组表达的糖化酶的应用

糖化酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，可应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。

实验组：利用里氏木霉突变株HDGAU-1重组表达的糖化酶（4000U/mL）对淀粉进行降解生产葡萄糖；

对照组：利用市售黑曲霉来源的糖化酶（4000U/mL，购自山东安克生物工程有限公司）对淀粉进行降解生产葡萄糖。

在葡萄糖生产过程中，先利用淀粉酶将淀粉液化，液化淀粉的pH约为5.5，不调节pH，直接将温度降至70℃，然后加入糖化酶进行后续的糖化过程。

糖化过程中各项反应指标的对比如下表所示：

注：DP1：葡萄糖；DP2：麦芽糖；DP3：麦芽三糖；DP4＋：四糖以上

从上表的结果可以看出，在70℃条件下进行糖化时，实验组3h时DE值（还原性糖值）达到77%，4h时DE值超过80%；而对照组3h时DE值只达到65%，且3-4h范围内DE值不再升高，说明3h时对照组的糖化酶已基本失活；实验组的糖化产物中葡萄糖（DP1）的比例高于64%，而对照组的糖化产物中葡萄糖仅占45%。上述结果表明，本发明重组表达的糖化酶比对照组黑曲霉来源的糖化酶催化效率更高，且更耐高温。

利用本发明的重组糖化酶进行葡萄糖生产，可实现在高温条件下的糖化，从而缩短糖化时间，减少染菌的机会；此外，淀粉液化后不需调整pH可直接进行糖化，为实际操作节省了时间，使进入发酵罐前的时间缩短，从而节约了时间及能耗，提高单位产出。

本发明的重组糖化酶还可用于甜味剂的生产中或用于生产有机物的发酵方法中，所述有机化合物例如乙醇、柠檬酸、抗坏血酸、氨基酸、抗生素等。

Claims

1.一种用于生产糖化酶的里氏木霉重组菌株，所述的菌株用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的糖化酶。

2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于所述的糖化酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.权利要求1所述的菌株中转入了携带有序列为SEQ ID NO:2的基因的表达质粒。

4.一种里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CCTCCNO:M2013584。

5.权利要求4所述的菌株在生产糖化酶中的应用。