CN103146768B

CN103146768B - 一种制备柠檬酸的方法

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Publication number: CN103146768B
Application number: CN201310105118.6A
Authority: CN
Inventors: 李北; 罗虎; 熊结青; 朱继成; 章辉平
Original assignee: Cofco Biochemical Anhui Co Ltd
Current assignee: COFCO Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2033-03-28
Also published as: CN103146768A

Abstract

本发明公开了一种制备柠檬酸的方法，该方法包括1）制备含有耐高温淀粉酶的水溶液，将含有耐高温淀粉酶的水溶液与淀粉质原料粉末混合，得到混合物，所述混合的条件包括温度为65-90℃，优选为70-85℃；2）将步骤1）中得到的混合物一次喷射至90-100℃并保持；再将一次喷射得到的产物二次喷射至120-140℃并保持；3）在酶解条件下，将步骤2）得到的产物与淀粉酶混合，进行酶解，得到含有低聚糖的液化液；4）利用所述液化液配制发酵培养基，并在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至所述发酵培养基中进行发酵。本发明方法能够有效地抑制调浆过程中微生物的生长、液化效果稳定且彻底，并有效地提高了柠檬酸的发酵效率。

Description

一种制备柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及一种制备柠檬酸的方法，特别是利用本发明工艺中制得的液化液进行发酵制柠檬酸的方法。

背景技术

目前国内企业发酵制柠檬酸的方法一般为：制备液化清液，再将获得的液化清液用于配制发酵培养基，将黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，获得柠檬酸发酵液。而制备液化清液的方法包括将玉米粉加入温度为50-60℃的水中进行调浆得到浆液，然后，添加氢氧化钙调节浆液的pH值为6.0-6.5，并加入淀粉酶，一次喷射至80-95℃，维持碘试合格后进行压滤，获得的滤液为液化清液。

上述制备液化清液的方法存在以下缺陷：

（1）淀粉酶很难与玉米粉混合均匀，液化效果不稳定。

（2）淀粉利用率低。

（3）液化不彻底，制糖粮耗高，众所周知，淀粉酶很难与没有溶胀的淀粉晶体区作用，因此，虽然加入了比较多的淀粉酶，但是淀粉质原料仍然很难液化，即使最后勉强使液化液碘试合格，但是液化液压滤困难，滤渣粘性大，含水量高，不但会把部分糖液带入滤渣中，同时还造成淀粉酶的浪费。

（4）添加氢氧化钙调节浆液的pH值存在添加过量的风险，而氢氧化钙添加过量会导致不可发酵性残糖（黑曲霉菌株不能利用的糖）的产生。

基于以上缺陷，现有的利用液化清液发酵制柠檬酸工艺中的发酵效率（酸度和转化率）也较低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高了发酵制柠檬酸工艺中的发酵效率的制备柠檬酸的方法。

本发明的发明人发现，在现有技术的调浆过程中，调浆后浆液的温度适合微生物的生长，而微生物生长会消耗淀粉质原料中的部分可溶性糖，从而导致淀粉利用率下降。另外，微生物在生长过程中还会产生杂酸和其他代谢产物，导致调浆后浆液的pH值下降，故限制调浆过程中微生物的生长能够有效地提高淀粉利用率并防止调浆后浆液的pH值下降。从而使得后续发酵制柠檬酸时的发酵效率较低。

因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种制备柠檬酸的方法，该方法包括以下步骤：

（1）制备含有耐高温淀粉酶的水溶液，将含有耐高温淀粉酶的水溶液与淀粉质原料粉末混合，得到混合物，所述混合的条件包括温度为65-90℃，优选为70-85℃；

（2）将步骤（1）中得到的混合物一次喷射至90-100℃并保持；再将一次喷射得到的产物二次喷射至120-140℃并保持；

（3）在酶解条件下，将步骤（2）得到的产物与淀粉酶混合，进行酶解，得到含有低聚糖的液化液；

（4）利用所述液化液配制发酵培养基，并在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至所述发酵培养基中进行发酵。

通过上述技术方案，本发明方法能够有效地抑制调浆过程中微生物的生长、液化效果稳定并彻底、淀粉利用率高且制糖粮耗低，而且不需要在喷射液化前添加氢氧化钙调节pH值，降低了不可发酵性残糖产生的可能性，从而能够有效地提高柠檬酸的发酵效率。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，根据GB8275-2009定义：1g固体酶粉（或1ml液体酶），于70℃、pH=6.0条件下，1min内液化1mg可溶性淀粉所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以u/g（或u/ml）表示，本发明中酶活力单位沿用此定义。另外，在未作相反说明的情况下，使用的术语“耐高温淀粉酶”是指耐高温α-淀粉酶；“淀粉酶”是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶。α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。β-淀粉酶又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1,4-糖苷键，生成麦芽糖，此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。异淀粉酶又称淀粉α-1,6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1,6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。

本发明提供的制备柠檬酸的方法包括以下步骤：

步骤（1）中，只要所述混合的条件为上述条件即可实现本发明的目的。其中，所述制备含有耐高温淀粉酶的水溶液的方法可以为本领域技术人员熟知的各种方法。而且本发明对所述混合的时间没有特别限定，一般地，所述混合的时间为3-10min。另外，所述淀粉质原料粉末的平均粒径可以为本领域常规的适于喷射液化和酶解的平均粒径，例如，可以为300-500μm。

根据本发明，步骤（1）中，所述耐高温淀粉酶的用量可以为常规用量，但优选情况下，相对于每克以干重计的淀粉质原料粉末，所述耐高温淀粉酶的用量为15-50酶活力单位，更优选为25-35酶活力单位，从而进一步提高发酵效率。所述混合物中的水含量可以为常规含量，优选情况下，所述混合物中的水含量为60-70重量%。

根据本发明，在步骤（2）中，对所述一次喷射和二次喷射的方式和时间没有特别限定，可以在本领域技术人员所公知的喷射器（例如，兆光喷射器或天长水热器）中进行喷射接触，故在此不再赘述。需要说明的是，步骤（2）中提及的喷射至某温度（以100℃为例）并保持，指的是喷射后物料的温度为100℃，并在该温度（100℃）下保持。其中，喷射后保持的时间可以在较宽范围内选择，优选地，将步骤（1）中得到的混合物一次喷射至90-100℃，并在该温度下保持60-120min；将一次喷射得到的产物二次喷射至120-140℃，并在该温度下保持4-10min。

本发明中，步骤（3）得到的液化液主要含有低聚糖（如糊精、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等），因此，步骤（3）中的酶解条件可以为本领域的常规选择，只要能够使步骤（2）得到的产物在淀粉酶的作用下产生低聚糖即可，优选地，所述液化液中低聚糖的含量为总糖含量的70-85%。

根据本发明，步骤（3）中，所述淀粉酶可以为一般的淀粉酶，如α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶；也可以为耐高温淀粉酶。优选情况下，使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。更优选使用耐高温淀粉酶即耐高温α-淀粉酶，耐高温α-淀粉酶具有极好的耐热性，是采用地衣芽孢杆菌经深层培养，提取等工序精制而成，能随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的α-1,4葡萄糖苷健使得胶状淀粉溶液的粘度迅速下降，产生可溶性糊精和寡聚糖，过度的水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。上述各种淀粉酶均可以通过商购获得。

根据本发明，步骤（3）中，所述酶解的条件可以在较宽范围内选择，优选情况下，当所述淀粉酶为耐高温淀粉酶时，所述酶解的条件包括酶解温度为90-100℃，酶解时间为12-60min。

根据本发明，步骤（3）中，所述淀粉酶的用量可以在较宽范围内选择，但优选情况下，所述淀粉酶的用量为制备含有耐高温淀粉酶的水溶液的耐高温淀粉酶用量的30-40重量%，更优选为25-35重量%。当步骤（3）中所述淀粉酶的用量在上述优选范围内时，能够获得更好的液化效果，从而进一步提高发酵效率。

根据本发明，步骤（3）中，可以通过多种方式将步骤（2）得到的产物的温度降至酶解温度，优选情况下，通过闪蒸的方式将步骤（2）得到的产物的温度降至酶解温度，以使大颗粒淀粉膨胀破裂为小颗粒淀粉，从而达到更佳的酶解效果。可以通过本领域常规的工艺进行闪蒸，因此本文不再赘述。更优选的情况下，将闪蒸后得到的冷凝水返回步骤（1）中用于制备含有耐高温淀粉酶的水溶液。这样可以循环利用资源，降低生产成本。

根据本发明，所述淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类、小麦和高粱中的一种或多种。

更优选地，所述淀粉质原料为未脱胚的玉米，此时该方法还包括除去步骤（3）中得到的液化液上层的油层。本发明的发明人发现，使用本发明的方法进行玉米淀粉质原料的预处理时，能够很好地使未脱胚玉米中的油脂脱出，且脱出的油脂漂浮于液化液的上层，可以很容易地除去，从而能够在不脱胚的情况下获得油脂量低的液化液，还能回收油脂、提高玉米淀粉质原料的利用价值，并且降低了油脂对后续发酵过程的影响。

根据本发明，所述液化液中的总糖（包括低聚糖、单糖和麦芽糖等）含量优选为16-20重量%。

根据本发明，步骤（4）中，利用所述液化液配制发酵培养基的方法可以为本领域常规使用的方法，例如，将所述液化液进行固液分离如压滤（优选情况下，所述压滤的压力为0.1-0.6MPa），选择性地稀释固液分离获得的液体，使得发酵培养基中的总糖含量为14-18重量%，灭菌待用。

根据本发明，步骤（4）中，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每克发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量为2×10⁵-6×10⁵个菌落形成单位，更优选3.5×10⁵-4.5×10⁵个菌落形成单位。

所述菌落形成单位的定义为将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在培养基平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。即每毫升菌液中含有的单细胞的数目。

所述菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数法进行测定。

根据本发明，对步骤（4）中能够生成柠檬酸的条件没有特别的限制，例如可以包括：发酵的温度为30-40℃，通气量为0.1-1体积：（体积·分钟），发酵的时间为50-80小时。一般地，还可以将发酵液中的还原糖含量为0-0.2重量%作为发酵终点的判定依据。术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示（V／V·min^-1），例如通气比为1:0.1-1，简称通气量为0.1-1体积：（体积·分钟）。

本发明所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827（上海工业微生物研究所）和黑曲霉T01（天津工业微生物所）。

所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将所述黑曲霉经过种子培养，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。所述种子培养的培养基和培养条件均可以为本领域常规的选择。

例如，所述种子培养的培养基可以通过往液化液中添加额外的氮源、磷源和无机盐，再加水稀释而获得，其中，以种子培养基的总重量为基准，液化液的用量可以为5-15重量%，氮源的用量可以为0.01-0.1重量%，磷源的用量可以为0.005-0.07重量%，无机盐的用量可以为0.1-2.6重量%，水的用量可以为75-85重量%。

例如，所述种子培养的培养条件可以包括温度为35-37℃，时间为25-40h。一般地，可以接种黑曲霉菌丝体进行种子培养，也可以接种黑曲霉孢子进行种子培养。在使用黑曲霉孢子时，接种量可以为3×10⁵-6×10⁵个孢子/g种子培养基。

黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，例如，当pH在1.8-2.5、酸度0.5-3.0%、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止种子培养。

优选情况下，所述种子培养的方法包括：将黑曲霉接种在种子培养基中进行培养，所述培养的条件使黑曲霉菌体的呼吸商为0.7-1.5，并在该呼吸商下保持2-8小时。

本发明的方法还可以包括从发酵获得的发酵液中提取并纯化柠檬酸，提取纯化的方法可以为本领域常规使用的方法，例如，通过钙盐法进行提取，并通过离子交换、浓缩、结晶和干燥等步骤进行进一步纯化。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，所用耐高温淀粉酶为购自诺维信公司的耐高温α-淀粉酶；涉及的玉米粉的质量均以玉米粉的干重计；黑曲霉菌种为黑曲霉T01，购于天津工业微生物所。

滤液DE值的测定方法为：费林法测出滤液还原糖A1（m/m），烘箱烘干法测出滤液干物含量A2（m/m），滤液DE值=（A1/A2）×100%。

压滤残渣中的水分含量通过全自动卡尔费休水分滴定仪（DL55）测得。

压滤残渣中残淀粉含量减去了滤渣中已经被酶解的能溶于水的糖含量，是不能溶于水的大分子糊精和淀粉的含量，测定方法为：取两份等量的残渣，一份加入淀粉酶和水（酶解残渣），一份加入与淀粉酶和水的总重量等量的水（溶解残渣），用费林法分别检测溶解残渣中溶解总糖的含量A重量%、加入的淀粉酶的总糖含量B重量%、残渣中酶解总糖的含量C重量%，再检测出残渣中干基含量W重量%，则酶解残渣中干基残淀粉含量=（C-B-A）×0.9/W。

制糖粮耗=投入玉米粉总重量/液化液中的总糖重量（t/t，按照GBT15038-2006的总糖直接滴定法测定液化液中的总糖重量）。

根据GB1987-2007标准检测发酵后发酵液中柠檬酸的浓度（简称酸度），并计算柠檬酸的转化率，转化率（%）=酸度×发酵液的体积/总糖的重量×100%。

实施例1

（1）将用量为35酶活力单位/g玉米粉的耐高温淀粉酶溶于水中，在70℃下，将获得的耐高温淀粉酶的水溶液与100重量份的玉米粉（平均粒径为400μm）混合，得到混合物；

（2）将混合物与150℃的饱和蒸汽在兆光喷射器中进行一次喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.05:1），一次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为90℃，并层流维持120min；再将一次喷射获得的产物与220℃的过饱和蒸汽在兆光喷射器中进行二次喷射（蒸汽与一次喷射获得的产物的重量比为0.05:1），二次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为120℃，并在该温度下保持4min；

（3）将步骤（2）得到的产物进行闪蒸（压力为-0.07MPa，时间为10s）以降温至100℃，得到预液化液。并将闪蒸后得到的冷凝水返回用于上述制备耐高温淀粉酶水溶液的步骤中。在95℃下，将该预液化液与用量为6.3酶活力单位/g玉米粉的耐高温淀粉酶混合，酶解50min。除去并回收液体上层的油层，得到液化液，将酶解产物进行压滤，测定压滤获得的滤液的DE值、压滤获得的滤渣的水分含量及残淀粉含量，并计算制糖粮耗，结果如表1所示；

（4）将压滤得到的滤液加水稀释至总糖含量为10重量%后投入发酵罐中，灭菌后接入黑曲霉菌种（接种量为：每克稀释后的液化液4×10⁵个菌落形成单位），在40℃、0.1体积：（体积·分钟）的通气条件下发酵60小时，测定发酵液的酸度，并计算柠檬酸的转化率，结果如表1所示。

实施例2

（1）将用量为25酶活力单位/g玉米粉的耐高温淀粉酶溶于水中，在85℃下，将获得的耐高温淀粉酶的水溶液与100重量份的玉米粉（平均粒径为400μm）混合，得到混合物；

（2）将混合物与160℃的饱和蒸汽在兆光喷射器中进行一次喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.05:1），一次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为100℃，并层流维持60min；再将一次喷射获得的产物与220℃的过饱和蒸汽在兆光喷射器中进行二次喷射（蒸汽与一次喷射获得的产物的重量比为0.06:1），二次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为140℃，并在该温度下保持10min；

（3）将步骤（2）得到的产物进行闪蒸（压力为-0.07MPa，时间为10s）以降温至100℃，得到预液化液。并将闪蒸后得到的冷凝水返回用于上述制备耐高温淀粉酶水溶液的步骤中。在95℃下，将该预液化液与用量为10.5酶活力单位/g玉米粉的耐高温淀粉酶混合，酶解12min。除去并回收液体上层的油层，得到液化液，将液化液进行压滤，测定压滤获得的滤液的DE值、压滤获得的滤渣的水分含量及残淀粉含量，并计算制糖粮耗，结果如表1所示。

（4）将压滤得到的滤液加水稀释至总糖含量为10重量%后投入发酵罐中，灭菌后接入黑曲霉菌种（接种量为：每克稀释后的液化液3.5×10⁵个菌落形成单位），在36℃、0.4体积：（体积·分钟）的通气条件下发酵50小时，测定发酵液的酸度，并计算柠檬酸的转化率，结果如表1所示。

实施例3

（1）将用量为30酶活力单位/g玉米粉的耐高温淀粉酶溶于水中，在80℃下，将获得的耐高温淀粉酶的水溶液与100重量份的玉米粉（平均粒径为400μm）混合，得到混合物；

（2）将混合物与158℃的饱和蒸汽在兆光喷射器中进行一次喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.05:1），一次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为98℃，并层流维持100min；再将一次喷射获得的产物与220℃的蒸汽在兆光喷射器中进行二次喷射（蒸汽与一次喷射获得的产物的重量比为0.05:1），二次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为130℃，并在该温度下保持6min；

（3）将步骤（2）得到的产物进行闪蒸（压力为-0.07MPa，时间为10s）以降温至100℃，得到预液化液。并将闪蒸后得到的冷凝水返回用于上述制备耐高温淀粉酶水溶液的步骤中。在95℃下，将该预液化液与用量为12.3酶活力单位/g玉米粉的耐高温淀粉酶混合，酶解60min。除去并回收液体上层的油层，得到液化液，将液化液进行压滤，测定压滤获得的滤液的DE值、压滤获得的滤渣的水分含量及残淀粉含量，并计算制糖粮耗，结果如表1所示；

（4）将压滤得到的滤液加水稀释至总糖含量为10重量%后投入发酵罐中，灭菌后接入黑曲霉菌种（接种量为：每克稀释后的液化液4.5×10⁵个菌落形成单位），在30℃、0.8体积：（体积·分钟）的通气条件下发酵80小时，测定发酵液的酸度，并计算柠檬酸的转化率，结果如表1所示。

实施例4

按照实施例3的方法进行柠檬酸的制备，不同的是，步骤（1）中耐高温淀粉酶的用量为12.3酶活力单位/g玉米粉，且步骤（3）中耐高温淀粉酶的用量为30酶活力单位/g玉米粉，结果如表1所示。

实施例5

按照实施例4的方法进行柠檬酸的制备，不同的是在步骤（2）中，层流维持20min，结果如表1所示。

对比例1

按照实施例3的方法进行柠檬酸的制备，不同的是，步骤（1）中，在60℃下，将获得的耐高温淀粉酶的水溶液与100重量份的玉米粉（平均粒径为400μm）混合，得到混合物，结果如表1所示。

表1

从表1的结果可以看出，本发明方法的发酵效率较高。另外，本发明的方法能够直接使用未脱胚的玉米粉来制备柠檬酸的发酵培养基，在制备液化液的过程中将玉米毛油回收后，不仅不会对柠檬酸发酵过程造成不利的影响，还在一定程度上提高了发酵效率，并充分地利用了玉米的综合利用价值。

Claims

1.一种制备柠檬酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）制备含有耐高温淀粉酶的水溶液，将含有耐高温淀粉酶的水溶液与淀粉质原料粉末混合，得到混合物，所述混合的条件包括温度为70-85℃；

（4）利用所述液化液配制发酵培养基，并在能够生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至所述发酵培养基中进行发酵，

其中，步骤（3）中，所述淀粉酶为耐高温淀粉酶，且所述酶解的条件包括酶解温度为90-100℃，酶解时间为12-60min，所述淀粉酶的用量为步骤（1）中制备含有耐高温淀粉酶的水溶液的耐高温淀粉酶用量的30-40重量%。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中，相对于每克以干重计的淀粉质原料粉末，所述耐高温淀粉酶的用量为15-50酶活力单位；所述混合物中的水含量为60-70重量%。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤（2）中，所述一次喷射后保持的时间为60-120min；所述二次喷射后保持的时间为4-10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中，通过闪蒸的方式将步骤（2）得到的产物的温度降至酶解温度。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述闪蒸后得到的冷凝水用于制备含有耐高温淀粉酶的水溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述淀粉质原料选自玉米、薯类、小麦和高粱中的一种或多种。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，所述淀粉质原料为未脱胚的玉米，且该方法还包括除去步骤（3）中得到的液化液上层的油层。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（4）中，能够生成柠檬酸的条件包括：发酵的温度为30-40℃，通气量为0.1-1体积：（体积·分钟），发酵的时间为50-80小时。