CN111269950B - 发酵生产l-苹果酸的培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了发酵生产L‑苹果酸的培养基的制备方法。制备培养基的方法采用玉米粉等工业用粮为原料，将玉米粉用水调浆，分级喷射液化，固液分离，加入回料、碳酸钙，灭菌。本发明还公开了由所制备的培养基发酵生产L‑苹果酸的方法。L‑苹果酸发酵有多种代谢途径，不同的代谢途径对溶解氧、CO2有不同的需求，本发明的发酵方法采用对溶解氧的分段控制方式，可满足L‑苹果酸不同代谢途径的工艺要求。

Description

发酵生产L-苹果酸的培养基及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，具体涉及发酵生产L-苹果酸的培养基及其制备方法，及应用所得培养基发酵生产L-苹果酸的方法。
背景技术
苹果酸，又名羟基琥珀酸或羟基丁二酸，具有右旋(D-型)、左旋(L-型)两种旋光异构体及DL-型外消旋体这三种构型。L-苹果酸广泛存在于生物体中，是生物体代谢过程TCA循环中产生的一种重要的有机酸，在食品、医药、化工、日化和保健等领域具有广泛用途。由于L-苹果酸的口感接近天然苹果的酸味，且与柠檬酸相比具有酸度大、味道柔和、滞留时间长等特点，香味特殊且不损伤口腔和牙齿，已被广泛应用于高档饮料、食品等行业，有可能替代柠檬酸成为新一代食品添加剂。此外，L-苹果酸还具有重要的生理功能，可食药两用，比如苹果酸具有护肝功能，将其与民间治疗肝病的草药配伍，开发成护肝产品，可加强人体新陈代谢，提高免疫力。
近年来，L-苹果酸市场逐渐启动，国际市场对苹果酸的需求量快速增加，已呈现严重供不应求的局面。在欧洲各国及美国和日本的食品饮料生产中，苹果酸已成为不可缺少的基本原料之一。L-苹果酸的生产方法主要有化学合成法、酶催化法和微生物发酵法，其中微生物发酵法因其具有原料来源广、成本低、工艺条件温和、产品质量稳定以及生产方式绿色环保等优势，被认为是最有前景的一种生产方式。
我国自上世纪七十年代就开始对发酵法生产L-苹果酸工艺进行研究，如北京工业微生物研究所、广州微生物研究所等。由于当时对发酵法生产L-苹果酸代谢途径不详，缺乏相应的技术手段进行代谢流分析研究结果，技术水平与产业化要求相差甚远，因此几十年来一直没有突破性进展。近年来随着科技水平的不断进步，生物工程、基因工程的成功应用，中科院天津工业技术研究所、江南大学等采用基因工程的手段构建了生产L-苹果酸的新菌株，技术水平大幅度提高，为发酵法生产L-苹果酸产业化奠定了基础。但上述单位研究的发酵工艺均采用精料发酵工艺，以葡萄糖为原料，添加多种无机盐、生长素、微量元素、有机氮等营养物组成的培养基，生产成本相对较高。
因此，需要开发降低生产成本、相对提高产酸量及转化率、缩短发酵周期的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明以玉米粉等工业用粮为原料制备培养基，培养基中无需添加各种无机盐、生长素、微量元素，培养基中的碳氮比例营养源可以根据原料本身进行合理的调整。
本发明的目的在于提供一种发酵生产L-苹果酸的培养基的制备方法。
作为本发明的一种具体实施方式，本发明提供一种发酵生产L-苹果酸的培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玉米粉用水调浆，采用二级喷射液化对玉米粉浆料进行液化，得到玉米液化液；
(2)以玉米粉调浆液化后的液化液总体积为100％计，取所述玉米液化液的10％～60％作为回料；
(3)将玉米液化液进行固液分离，过滤后分别得到玉米液化清液和滤渣，其中滤渣为玉米蛋白及不可发酵性固形物，将滤渣烘干后可作为玉米蛋白粉出售；
(4)将玉米液化清液与回料混合，加入碳酸钙，灭菌，得到所述发酵生产L-苹果酸的培养基。
作为本发明的一种具体实施方式，对玉米粉浆料进行二级喷射液化可包括以下步骤：
向玉米粉浆料中加入以每克玉米粉计10～15单位的耐高温α-淀粉酶，加热至65～75℃，维持20～30min；进行第一级喷射液化，液化温度为95～105℃，维持60～90min；进行第二级喷射液化，液化温度为120～130℃，维持10～20min；然后将温度降至90～100℃，再加入以每克玉米粉计5～10单位的耐高温α-淀粉酶，以碘试反应不变色作为液化终点。
在本发明的实施方案中，制备L-苹果酸发酵培养基所用的原料优选玉米粉，玉米粉除含有丰富的糖类、蛋白质和脂肪外，还含有钙、磷、铁、胡萝卜素、维生素B1、维生素B2和尼克酸以及谷固醇、卵磷脂、维生素E、赖氨酸等，营养成分较为全面。
与现有技术中采用葡萄糖进行发酵相比，使用玉米粉制备的L-苹果酸发酵培养基是通过液化清液与未过滤的液化液按一定的比例混合，回料不足的情况下进一步补充少量有机氮源，具有价格低廉、配方简单、利于产酸等优点。
在本发明的技术方案中，液化是指淀粉在一定条件下，经过α-淀粉酶的作用，将淀粉分子水解为糊精和低聚糖的一种化学变化。
然而，玉米粉中含有较多的蛋白质和难溶性淀粉，淀粉颗粒结构紧密，是淀粉质原料中较难液化的一种。
鉴于此，本发明对玉米粉采用二级喷射液化的方式进行液化，可使淀粉颗粒和淀粉酶充分的混合均匀，凭借耐高温α-淀粉酶较强的水解作用使充分糊化的淀粉完全液化，这就是喷射液化的实质。因此，充分糊化是完全液化的前提。
将玉米粉调浆后加入高温淀粉酶，初步加热至65～75℃维持20～30min，进行第一级喷射液化，在95～105℃的条件下液化，并维持60～90min，目的是使玉米颗粒充分吸水膨胀瓦解，使其充分糊化，大部分淀粉已转化成糊精和部分低聚糖。此时，对液化液实施第二级喷射液化，温度迅速控制在120～130℃，维持10～20min，然后闪蒸冷却降温至90～100℃，再加入高温淀粉酶，继续作用，直至完全液化。
对玉米粉进行二级喷射液化的目的，不仅是灭酶，而且是消除阻滤因子：蛋白质和难溶性淀粉。难溶性淀粉分子经过120～130℃高温及高强度的微湍流冲击，其坚韧硬束状薄膜开裂，淀粉晶体结构被破坏，在淀粉酶的作用下可转化成短链的糊精。
对玉米粉实施二级喷射液化具有较多的优势，是一种很好的液化玉米粉的方法。喷射液化法加热混合均匀、无躁声，节省蒸汽，节省酶制剂，液化较彻底，过滤速度快，更适用于大规模工业化生产。
作为本发明的另一种具体实施方式，制备液化清液所用的原料玉米粉还可用木薯粉替代，木薯粉调浆液化过滤后的液化清液加入未过滤的玉米液化液回料，进一步补充少量有机氮源制备培养基。
作为本发明的一种具体实施方式，本发明提供一种发酵生产L-苹果酸的培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)将木薯粉用水调浆，采用间歇液化或一级喷射液化对木薯粉浆料进行液化，得到木薯液化液；
(2)将玉米粉用水调浆，采用二级喷射液化对玉米粉浆料进行液化，得到玉米液化液，作为回料；
(3)将步骤(1)得到的木薯液化液进行固液分离，过滤后分别得到木薯液化清液和滤渣，其中滤渣为木薯蛋白及不可发酵性固形物；
(4)将木薯液化清液与玉米回料混合，加入碳酸钙，灭菌，得到所述发酵生产L-苹果酸的培养基。
作为本发明的一种具体实施方式，对木薯粉浆料进行一级喷射液化可包括以下步骤：
向木薯粉浆料中加入耐高温α-淀粉酶，加热至65～75℃，维持20～30min；进行一级喷射液化，液化温度为95～100℃，保温至碘试反应不变色作为液化终点。
作为本发明的一种具体实施方式，对木薯粉浆料进行间歇液化可包括以下步骤：
向木薯粉浆料中加入以每克木薯粉计8～10单位的耐高温α-淀粉酶，加热至65～75℃，维持20～30min，再加入以每克木薯粉计5～8单位的耐高温α-淀粉酶，继续升温至90～95℃，保温直至碘试反应不变色，作为液化终点。
间歇液化法是指在不停地搅拌的条件下，对淀粉乳进行加热及保温，使淀粉乳在液化的整个过程中，始终保持着良好的流动性，较少地形成不溶性淀粉颗粒。不同的淀粉质原料液化工艺和液化温度是不同的，本发明对木薯粉采用的间歇液化方式，能够使木薯粉液化完全。
在本发明的发酵生产L-苹果酸的培养基的上述制备方法中，作为本发明的一种具体实施方式，在步骤(1)中，调浆后的粉浆重量比(kg/L)为23％～35％，优选25％～30％。
作为本发明的一种具体实施方式，在步骤(3)中，固液分离处理可为板框压滤。
作为本发明的一种具体实施方式，在步骤(4)中，灭菌可为在115℃灭菌20min。
作为本发明的一种具体实施方式，在步骤(4)中，碳酸钙的加入质量为发酵起始总糖质量以葡萄糖计的65％～80％。
作为本发明的一种具体实施方式，在步骤(4)中，进一步地，除加入回料外，还可在回料量较少的情况下加入适量的有机氮源；以液化液总体积为100％计，在回料量小于20％的情况下，加入有机氮源；优选地，基于所述液化液总体积，加入0.2％～0.5％(kg/L)的有机氮源；所述有机氮源可选自豆粕粉、酵母粉、酵母浸粉、蚕蛹粉和蛋白胨等中的一种或多种，优选豆粕粉。
另外，培养基的碳氮比例还可利用原料本身进行合理的调整。
本发明的另一个目的在于提供由上述方法制备得到的培养基。
本发明的又一个目的在于提供利用所述培养基发酵生产L-苹果酸的方法，其中，将所述培养基投入发酵罐，接入发酵菌株进行发酵，得到L-苹果酸，通过分阶段控制溶氧提高L-苹果酸的转化率。优选地，发酵温度为40～50℃。优选地，发酵菌株为嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)。
作为本发明的一种具体实施方式，L-苹果酸的发酵控制工艺为：发酵16～28h之前通风比1:0.24～0.36，发酵16～28h之后通风比1:0.12～0.18；罐压0.05±0.03MPa；发酵16～28h之前通过转速控制溶氧20％～40％，发酵16～28h之后通过转速控制溶氧约8％～12％。
作为本发明的一种优选的具体实施方式，发酵16～28h之前通风比1:0.3，发酵16～28h之后通风比1:0.15；发酵16～28h之前通过转速控制溶氧20％～30％，发酵16～28h之后通过转速控制溶氧10％。
本发明具有如下的有益效果：
本发明提供的发酵生产L-苹果酸的培养基的制备方法中，采用玉米粉等工业用粮为原料，将玉米粉调浆，加入耐高温淀粉酶，分级喷射液化、固液分离，加入回料、碳酸钙，灭菌，得到用于发酵生产L-苹果酸的培养基。将该培养基接入发酵罐进行高温发酵，得到L-苹果酸。本发明所用的原料廉价易得，配方简单，易于进行工业化生产，可以显著降低原料成本。另外，鉴于L-苹果酸发酵属微饥饿状态，不同于柠檬酸的半饥饿状态，因此在制备用于L-苹果酸发酵的培养基的过程中，当回料不足时可加入少量有机氮等进行最终调整。
L-苹果酸发酵有多种代谢途径，不同的代谢途径对溶解氧、CO2有不同的需求。本发明的发酵生产L-苹果酸的方法采用对溶解氧进行分段控制的方式，可满足L-苹果酸不同代谢途径的工艺要求。分阶段控制溶氧有利于提高产酸量及转化率，缩短发酵周期。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
残糖的测定：取发酵液用浓硫酸水解后，采用费林滴定法进行测定。
总氮的测定：采用凯氏定氮法进行测定。
L-苹果酸和丁二酸的测定：向1ml发酵液中加入1ml 3M H2SO4进行充分水解后，离心，取上清液，用安捷伦1200高效液相色谱仪测定L-苹果酸含量，流动相为5M H2SO4，流速为0.5mL/min，进样量为20μL。L-苹果酸出峰时间约为10.745±0.100min，丁二酸出峰时间约为12.953±0.100min。
总酸转化率计算公式：×100％
本发明实施例所用菌种为嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，购自中科院天津工业生物技术研究所。
实施例1
1.培养基的制备
(1)将玉米粉用水调浆，粉浆比为28％，加入以每克玉米粉计15单位的耐高温α-淀粉酶，加热至65～72℃维持30min，粉浆进入喷射器，进行第一级喷射液化，温度加热至95℃，液化保温60min，然后进行第二级喷射液化，迅速升温至130℃，高温维持15min后将温度降至95℃进行二次加酶，每克玉米粉加入6单位的耐高温α-淀粉酶，以碘试反应不变色作为液化终点，得到玉米液化液；
(2)以玉米粉调浆液化后的液化液总体积为100％计，取60％的玉米液化液作为回料；
(3)将完全液化的玉米液化液经板框压滤分离处理，过滤后分别得到玉米液化清液、玉米蛋白及不可发酵性固形物；
(4)将玉米液化清液和回料投入发酵罐，按起始总糖量以葡萄糖计的75％加入碳酸钙，115℃灭菌20min，制备得到培养基。
2.发酵生产L-苹果酸
将所得培养基投入发酵罐，温度降至45℃，接入发酵菌株(嗜热毁丝霉)进行发酵。发酵起始总糖含量为20％。
3.培养条件
温度45℃；0～24h通风比1:0.3，24h～发酵结束通风比1:0.15；罐压0.05MPa；0～24h通过转速控制溶氧20％，24h～发酵结束通过转速控制溶氧约10％。
4.发酵结果
发酵周期142h，L-苹果酸含量15.8％，丁二酸含量1.2％，总酸转化率85.0％。
实施例2
1.培养基的制备
(1)将玉米粉用水调浆，粉浆比为28％，加入以每克玉米粉计15单位的耐高温α-淀粉酶，加热至65～72℃维持30min，粉浆进入喷射器，进行第一级喷射液化，温度加热至95℃，液化保温60min，然后进行第二级喷射液化，迅速升温至130℃，高温维持15min后将温度降至95℃进行二次加酶，每克玉米粉加入6单位的耐高温α-淀粉酶，以碘试反应不变色作为液化终点，得到玉米液化液；
(2)以玉米调浆液化后的液化液体积为100％计，取40％的玉米液化液作为回料；
(3)将完全液化的玉米液化液经板框压滤分离处理，过滤后分别得到玉米液化清液、玉米蛋白及不可发酵性固形物；
(4)将玉米液化清液和回料投入发酵罐，按起始总糖量以葡萄糖计的75％加入碳酸钙，115℃灭菌20min，制备得到培养基。
2.发酵生产L-苹果酸
将所得培养基投入发酵罐，温度降至40℃，接入发酵菌株(嗜热毁丝霉)进行发酵。发酵起始总糖含量为20％。
3.培养条件
温度40℃；0～24h通风比1:0.3，24h～发酵结束通风比1:0.15；罐压0.05MPa；0～24h通过转速控制溶氧25％，24h～发酵结束通过转速控制溶氧约10％。
4.发酵结果
发酵周期122h，L-苹果酸含量17.9％，丁二酸含量1.8％，总酸转化率98.5％。
实施例3
1.培养基的制备
(1)将玉米粉用水调浆，粉浆比为28％，加入以每克玉米粉计12单位的耐高温α-淀粉酶，加热至70～75℃维持30min，粉浆进入喷射器，进行第一级喷射液化，温度加热至95℃，液化保温60min，然后进行第二级喷射液化，迅速升温至130℃，高温维持15min后将温度降至98～100℃进行二次加酶，每克玉米粉加入8单位的耐高温α-淀粉酶，以碘试反应不变色作为液化终点，得到玉米液化液；
(2)以玉米调浆液化后的液化液体积为100％计，取15％的玉米液化液作为回料；
(3)将完全液化的玉米液化液经板框压滤分离处理，过滤后分别得到玉米液化清液、玉米蛋白及不可发酵性固形物；
(4)将玉米液化清液和回料投入发酵罐，并加入0.2％的豆粕粉，按起始总糖量以葡萄糖计的75％加入碳酸钙，115℃灭菌20min，制备得到培养基。
2.发酵生产L-苹果酸
将所得培养基投入发酵罐，温度降至45℃，接入发酵菌株(嗜热毁丝霉)进行发酵。发酵起始总糖含量为20％。
3.培养条件
温度45℃；0～28h通风比1:0.3，28h～发酵结束通风比1:0.15；罐压0.05MPa；0～28h通过转速控制溶氧约30％，28h～发酵结束通过转速控制溶氧约10％。
4.发酵结果
发酵周期118h，L-苹果酸含量17.9％，丁二酸含量2.0％，总酸转化率99.5％。
实施例4
1.培养基的制备
(1)将玉米粉用水调浆，粉浆比为28％，加入以每克玉米粉计10单位的耐高温α-淀粉酶，加热至70～75℃维持30min，粉浆进入喷射器，进行第一级喷射液化，温度加热至95～105℃，液化保温60min，然后进行第二级喷射液化，迅速升温至130℃，高温维持15min后将温度降至98～100℃进行二次加酶，每克玉米粉加入10单位的耐高温α-淀粉酶，以碘试反应不变色作为液化终点，得到玉米液化液；
(2)以玉米调浆液化后的液化液体积为100％计，取15％的玉米液化液作为回料；
(3)将完全液化的玉米液化液经板框压滤分离处理，过滤后分别得到玉米液化清液、玉米蛋白及不可发酵性固形物；
(4)将玉米液化清液和回料投入发酵罐，并加入0.2％的豆粕粉，按起始总糖量以葡萄糖计的75％加入碳酸钙，115℃灭菌20min，制备得到培养基。
2.发酵生产L-苹果酸
将所得培养基投入发酵罐，温度降至45℃，接入发酵菌株(嗜热毁丝霉)进行发酵。发酵起始总糖含量为20％。
3.培养条件
温度45℃；通风比1:0.3，全程通过转速控制溶氧约30％。
4.发酵结果
发酵周期120h，L-苹果酸含量15.8％，丁二酸含量2.3％，总酸转化率90.5％。
实施例5
1.培养基的制备
(1)将木薯粉用水调浆，粉浆比为25％，加入以每克木薯粉计14单位的耐高温α-淀粉酶，加热至65～72℃维持30min，粉浆进入喷射器，进行一级喷射液化，温度加热至95～100℃，液化保温约50min，以碘试反应不变色作为液化终点，得到木薯液化液；
(2)用玉米粉以与实施例1步骤(1)相同的方式制备玉米液化液，作为回料；
(3)将步骤(1)得到的完全液化的木薯液化液经过板块压滤分离处理，除去不可发酵性固形物，得到木薯液化清液；
(4)将木薯液化清液投入发酵罐，加入1％的豆粕粉，加25％的玉米液化液回料，按起始总糖量的70％加入碳酸钙，115℃灭菌20min，制备得到培养基。
2.发酵生产L-苹果酸
将所得培养基投入发酵罐，温度降至50℃，接入发酵菌株(嗜热毁丝霉)进行发酵。发酵起始总糖含量为20.2％。
3.培养条件
温度50℃；0～16h通风比1:0.3，16h～发酵结束通风比1:0.15；罐压0.05MPa；0～16h通过转速控制溶氧约30％，16h～发酵结束通过转速控制溶氧约10％。
4.发酵结果
发酵周期130h，L-苹果酸含量16.8％，丁二酸含量1.5％，总酸转化率90.6％。
实施例6
以与实施例5相同的方法制备培养基并利用所述培养基发酵生产L-苹果酸，不同之处仅在于培养基的制备步骤(1)采用间歇液化方法对木薯粉进行液化：
将木薯粉用水调浆，粉浆比为25％，加入以每克木薯粉计10单位的耐高温α-淀粉酶，加热至65～75℃维持30min，再加入以每克木薯粉计8单位的耐高温α-淀粉酶，继续升温至90～95℃，维持直至碘试反应不变色，作为液化终点，得到木薯液化液。
发酵结果
发酵周期132h，L-苹果酸含量16.0％，丁二酸含量1.4％，总酸转化率90.1％。
本发明的方法制备的培养基用于发酵L-苹果酸，发酵周期短，最短可在118h完成发酵，L-苹果酸的含量在15.8％-17.9％之间，总酸转化率最高可达99.5％。采用玉米粉或木薯粉等工业用粮为原料，相比于现有的以葡萄糖为原料的方法，明显节约了生产成本。
以上实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明所做的修改和替换，均属于本发明的范围。

Claims (6)

1.嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)发酵生产L-苹果酸的培养基发酵生产L-苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玉米粉用水调浆，采用二级喷射液化对玉米粉浆料进行液化，得到玉米液化液；调浆后的粉浆比为23%~35%，粉浆比单位为kg/L；
(2)以玉米粉调浆液化后的液化液总体积为100%计，取所述玉米液化液的40%~60%作为回料；
(3)将玉米液化液进行固液分离，得到玉米液化清液；
(4)将所述玉米液化清液与所述回料混合，加入碳酸钙，灭菌，得到所述发酵生产L-苹果酸的培养基；
将所述培养基投入发酵罐，接入发酵菌株嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)进行发酵，发酵温度为40~50℃，发酵16~28h之前通风比1:0.24~0.36，发酵16~28h之后通风比1:0.12~0.18；罐压0.05±0.03MPa；发酵16~28h之前通过转速控制溶氧20%~40%，发酵16~28h之后通过转速控制溶氧8%~12%。
2.嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)发酵生产L-苹果酸的培养基发酵生产L-苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将木薯粉用水调浆，粉浆比为25%，粉浆比单位为kg/L，采用间歇液化或一级喷射液化对木薯粉浆料进行液化，得到木薯液化液；
(2)将玉米粉用水调浆，粉浆比为28%，粉浆比单位为kg/L，采用二级喷射液化对玉米粉浆料进行液化，得到玉米液化液，作为回料；
(3)将步骤(1)得到的木薯液化液进行固液分离，得到木薯液化清液；
(4)将所述木薯液化清液，加入1%豆粕粉，加25%的玉米液化液回料，加入碳酸钙，灭菌，得到所述发酵生产L-苹果酸的培养基；
将所述培养基投入发酵罐，接入发酵菌株嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)进行发酵，发酵温度为40~50℃，发酵16~28h之前通风比1:0.24~0.36，发酵16~28h之后通风比1:0.12~0.18；罐压0.05±0.03MPa；发酵16~28h之前通过转速控制溶氧20%~40%，发酵16~28h之后通过转速控制溶氧8%~12%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述二级喷射液化包括以下步骤：
向玉米粉浆料中加入以每克玉米粉计10~15单位的耐高温α-淀粉酶，加热至65~75℃，维持20~30min；进行第一级喷射液化，液化温度为95~105℃，维持60~90min；进行第二级喷射液化，液化温度为120~130℃，维持10~20min；然后将温度降至90~100℃，再加入以每克玉米粉计5~10单位的耐高温α-淀粉酶，以碘试反应不变色作为液化终点。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述一级喷射液化包括以下步骤：
向木薯粉浆料中加入耐高温α-淀粉酶，加热至65~75℃，维持20~30min；进行一级喷射液化，液化温度为95~100℃，保温至碘试反应不变色作为液化终点；
和/或，所述间歇液化包括以下步骤：
向木薯粉浆料中加入以每克木薯粉计8~10单位的耐高温α-淀粉酶，加热至65~75℃，维持20~30min，再加入以每克木薯粉计5~8单位的耐高温α-淀粉酶，继续升温至90~95℃，保温直至碘试反应不变色，作为液化终点。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述碳酸钙的加入质量为发酵起始总糖质量以葡萄糖计的65%~80%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵16~28h之前通风比1:0.3，发酵16~28h之后通风比1:0.15；发酵16~28h之前通过转速控制溶氧20%~30%，发酵16~28h之后通过转速控制溶氧10%。
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