CN109797111B - 一种产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法，包括提高受体菌中二元酸转运蛋白的表达或活性，降低受体菌中甲基转移酶laeA的表达或活性，获得产苹果酸的工程菌。本发明有效提高苹果酸的产量，进一步地，通过引入耐酸工程菌，还有效避免中和剂的使用。

Description

一种产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域，特别是涉及一种通过基因工程手段构建苹果酸生产菌株和提高苹果酸产量的方法及应用，同时还进一步涉及耐酸的高产苹果酸生产菌株的构建及应用。

背景技术

生物法生产大宗化学品是我国经济绿色可持续发展、摆脱石油依赖的有效途径之一。苹果酸是非常重要的大宗化工产品，早在2004年就被美国能源部认定为最具竞争力的12种平台化合物之一，其被广泛用于食品、饮料、香料、医药保健、化工、塑料等行业。目前，国际市场需求量保持快速增长，市场前景广阔，实现发酵法生产苹果酸对我国建立化学品生物制造产业体系具有重要意义。

目前，合成苹果酸的相关研究主要集中在丝状真菌上。早在上世纪60年代，就有利用丝状真菌黄曲霉合成苹果酸的报道。然而，由于黄曲霉毒素的原因，利用黄曲霉发酵生产苹果酸未能得到大规模工业生产。近年来，有报道表明在米曲霉A.oryzae NRRL 3488过表达自身的丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶及C4-二羧酸转运蛋白后，其苹果酸产量得到了极大的提高，以葡萄糖为碳源时，在164小时内苹果酸产量达到了154g/L，产率为0.94g/L/h，转化率达到理论值的69％。国内江南大学对米曲霉苹果酸合成途径进行了系统代谢工程改造，苹果酸产量达到93.2g/L，生产效率为1.38g/L/h。在苹果酸合成过程中，中和剂碳酸钙与苹果酸反应，将培养基的pH保持在中性左右，利于微生物发酵生长，但会增加发酵成本，同时形成的苹果酸钙在后期的分离纯化中需要用到大量强酸，不仅增加了成本，还对环境造成了极大的危害。因此，开发耐酸的苹果酸生产菌株是解决这一问题的有效途径。

曲霉被广泛的应用在蛋白、化学品的工业化生产过程中，尤其是黑曲霉，它是多种蛋白和有机酸的生产菌株。黑曲霉在深层次发酵过程中具有极其显著的特点，在快速生长期时，其可以分泌大量有机酸(草酸、柠檬酸等)，使得发酵培养基的pH低于2。黑曲霉的这种发酵特性，不仅大大降低发酵过程中染菌的风险，还可以省去生产有机酸过程中中和有机酸所使用的大量碳酸盐，对环境友好。然而，目前黑曲霉主要还是集中在柠檬酸的生产上，并没有涉及苹果酸的生产。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法，用于提高苹果酸产量，在此基础上进一步提高工程菌的耐酸性，避免中和剂的使用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种构建产苹果酸的工程菌的方法，包括提高受体菌中二元酸转运蛋白的表达或活性，降低所述受体菌中甲基转移酶laeA的表达或活性，获得产苹果酸的工程菌。

可选地，所述二元酸转运蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或保有功能的随机和/或定点诱变序列。

可选地，提高上述受体菌中二元酸转运蛋白的表达或活性是通过向受体菌中导入二元酸转运蛋白的编码基因来实现的。

可选地，所述二元酸转运蛋白的编码基因的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的片段或保有功能的随机和/或定点诱变序列。

可选地，所述甲基转移酶laeA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列或保有功能的随机和/或定点诱变序列。

可选地，降低所述受体菌中甲基转移酶laeA的表达或活性是通过敲除或沉默所述受体菌中甲基转移酶laeA的编码基因来实现。

可选地，所述甲基转移酶laeA的编码基因的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.4所示的片段或保有功能的随机和/或定点诱变序列。

可选地，所述受体菌选自毁丝霉属(Myceliophthora)、曲霉属(Aspergillus)中的至少一种。

可选地，所述毁丝霉属菌株选自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、异梭毁丝霉(Myceliophthoraheterothallica)中的至少一种。

可选地，所述曲霉属菌株选自黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)中的至少一种。

可选地，通过同源重组法、原生质体法、农杆菌介导法、RNAi沉默法或CRISPR法降低所述甲基转移酶laeA的表达或活性。

可选地，所述受体菌选自嗜热毁丝霉，并采用同源重组法敲除所述甲基转移酶laeA的编码基因。

可选地，进行敲除时，上游同源重组片段的核苷酸序列包括SEQ ID NO.5所示片段或保有功能的随机和/或定点诱变序列，下游同源重组片段的核苷酸序列包括SEQ ID NO.6所示片段或保有功能的随机和/或定点诱变序列。

可选地，所述受体菌选自黑曲霉，并采用同源重组法敲除所述甲基转移酶laeA的编码基因。

可选地，其上游同源重组片段的核苷酸序列包括SEQ ID NO.7所示片段或保有功能的随机和/或定点诱变序列，下游同源重组片段的核苷酸序列包括SEQ ID NO.8所示片段或保有功能的随机和/或定点诱变序列。

由上述方法制备得到的用于生产苹果酸的工程菌也属于本发明的保护范围。

上述工程菌在苹果酸生产中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供生产苹果酸的方法，包括：培养所述工程菌，收集孢子，将所述孢子接种至发酵培养基中，收集发酵产物，从中获得苹果酸。

可选地，所述发酵培养基包括如下组分：100g/L葡萄糖，6.0g/L蛋白胨，150mg/L磷酸二氢钾，150mg/L磷酸氢二钾，100mg/L氯化钙，100mg/L硫酸镁，碳酸钙80.0g/L，1mg/L生物素，1mL/L微量元素，余量为水。

可选地，所述微量元素包括如下组分：氯化钠5g/L，硫酸亚铁5g/L，柠檬酸1g/L，余量为水。

如上所述，本发明的产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法，具有以下有益效果：本发明寻找到有效提高苹果酸产量的新途径，具体是通过降低受体菌中甲基转移酶laeA的表达或活性，并提高受体菌中二元酸转运蛋白的表达或活性来实现，进一步地，本发明提供了一种耐酸苹果酸工程菌及其生产苹果酸的方法，包括降低受体菌中甲基转移酶laeA的表达或活性，并提高受体菌中二元酸转运蛋白的表达或活性，获得具有耐酸特性的苹果酸工程菌株，避免了中和剂的使用。

附图说明

图1显示为二元酸转运蛋白mae基因表达载体pGL01-mae的质粒图谱。

图2显示为嗜热毁丝霉野生型菌株及其突变株的苹果酸产量图。

图3显示为敲除嗜热毁丝霉laeA的敲除载体pKO-laeA的质粒图谱。

图4显示为敲除黑曲霉laeA的敲除载体pGL01-mae-KOlaeA的质粒图谱。

图5显示为苹果酸产量随时间的变化曲线图。

图6显示为黑曲霉野生型及其突变株的柠檬酸和苹果酸产量图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在丝状真菌中，甲基转移酶可以调控次生代谢物合成过程中相关基因的表达水平，进而影响次生代谢物的积累水平。在黑曲霉中敲除或下调甲基转移酶可以减少柠檬酸的生产，本发明意外地发现，敲除黑曲霉的甲基转移酶的同时引入二元酸转运蛋白，可以获得耐酸的苹果酸生产菌株，这种新方法未见文献、专利报道。并且，本发明还意外地发现，敲除嗜热毁丝霉中的一个甲基转移酶，可以提高苹果酸的产量，目前尚未有关于甲基转移酶调控苹果酸的合成途径的报道，其作用原理也尚不清楚，不能由已知报道推测获得。

以下实施例采用的察氏固体培养基组成如下：NaNO₃ 3g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄ 0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉20g/L，余量为水，总体积为1L。

下述实施例中涉及分子生物学操作所用的限制性内切酶均购于NEB公司，质粒提取和DNA回收试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径购得。

下述实施例中，质粒pGL01的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，质粒pKO的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

实施例1

在嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)中过表达mae基因

1.过表达二元酸转运蛋白载体构建及转化

利用引物Mae-F(SEQ ID NO.13：5'-aatggttaacATGCTGACACCTCCCAAG-3’)和引物Mae-R(SEQ ID NO.14：5'-aatggttaacCTAATCAGATACATCCTC-3')，从米曲霉cDNA中扩增二元酸转运蛋白基因(简称mae基因)的编码阅读框，PCR反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix25μL，Mae-F 1μL，Mae-R 1μL，cDNA1μL，水22μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1.5min，30个循环；72℃5min，4℃5min。PCR反应结束后，使用限制性内切酶Hpa I消化PCR产物，并将其插入到质粒pGL01的EcoR V位点(质粒图谱如图1所示)，得到质粒pGL01-mae。

2.嗜热毁丝霉原生质体法转化方法

原生质体转化方法参考山东大学张美玲硕士论文“里氏木霉信号传导途径对纤维素酶的合成调控”，具体如下：嗜热毁丝霉(美国典型菌种保藏中心，ATCC424)在察氏固体培养基上在45℃条件下生长1周左右，用生理盐水收集孢子，获得新鲜孢子悬液。在察氏固体培养基上铺一层玻璃纸，加100μl孢子悬液，并用涂布棒轻轻涂匀，以防止气泡产生，大约做10个平板，45℃培养12-16小时。称取0.2g裂解酶(购自Sigma-Aldrich公司，货号L1412)，溶于30mL溶液I(山梨醇1.2M，磷酸二氢钾0.1M，pH5.5)中，混匀，过滤除菌，获得裂解液。吸取适量裂解液于无菌的培养皿中，将长有菌丝的玻璃纸倒扣在培养皿中，再加入适量裂解液，然后再放入第二张长有菌丝的玻璃纸，以此类推，直到玻璃纸全放进去，30℃静置裂解1.5-2小时。裂解后，用无菌镊子取出玻璃纸，并用3层擦镜纸过滤，获得含有原生质体的滤液，4℃条件下2000rpm离心15分钟，弃上清，用4mL溶液II(山梨醇1.0M，Tris-HCl10mM，CaCl₂50mM，pH7.5)重悬原生质体，4℃条件下2000rpm离心15分钟，弃上清。用200μL溶液II将原生质体重悬，待用。将200μL原生质体、10μg转化DNA片段、50μL溶液III(PEG6000 25％，CaCl₂50mM，Tris-HCl 10mM，pH7.5)混匀，冰上放置20分钟，然后加入2mL溶液III，室温静置5分钟，最后加入4mL溶液II，混匀。将上述混合物与50℃的含有相应抗生素的上层培养基混匀后，迅速倒在凝固的含有相应抗生素的下层平板中，凝固后45℃培养，待转化子长出后，挑至新鲜的含有相应抗生素的察氏培养基中生长。转化中所用下层培养基为山梨醇182g/L、NaNO₃ 3g/L、K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、KCl 0.5g/L、FeSO₄ 0.01g/L、蔗糖30g/L，琼脂20g/L，加水定容至1L，121℃灭菌15min；上层培养基为：山梨醇182g/L，NaNO₃ 3g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄ 0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂糖20g/L，余量为水，加水定容至1L，121℃灭菌15min。

将质粒pGL01-mae按上述方法转入嗜热毁丝霉中，将转化子挑取至含有80μg/mL的潮霉素的察氏培养基中。

3.丝状真菌基因组提取

挑取少量菌丝到含有石英砂的300μL抽提液(200mM Tris，250mMNaCl，25mMEDTA，2％SDS，pH8.5)中，旋涡剧烈振荡10min，65℃水浴30min；加入300μL苯酚/氯仿/异戊醇混合液(按体积计，苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)后旋涡混匀30s，12000rpm室温离心10min，收集上清至另一离心管中；加入2.5倍上清液体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置2小时；12000rpm室温离心10min，弃上清，用70％乙醇(5000rpm，5min)洗涤两次，4℃条件下12000rpm离心10min，弃上清，待乙醇挥发后，加入50μL无菌水，溶解基因组，待用。

4.重组真菌转化子MTmae生产苹果酸能力表征

将转化获得的转化子按上述方法提取基因组作为模板，用引物Mae-F和Mae-R进行扩增，获得相应条带的转化子即为正确转化子，命名为MTmae，待后续发酵。将转化子MTmae接种于察氏固体培养基上，45℃培养14天，收集孢子，将上述孢子以1×10⁶个/mL的接种量，接种至50mL发酵培养基中(发酵培养基组成如下：100g葡萄糖，6.0g蛋白胨，150mg磷酸二氢钾，150mg磷酸氢二钾，100mg氯化钙，100mg硫酸镁，碳酸钙80.0g，1mg生物素，1mL微量元素，余量为水，总体积为1L。其中，微量元素组成如下：氯化钠5g，硫酸亚铁5g，柠檬酸1g，余量为水，总体积为1L)，45℃，120rpm培养，第五天取样测定苹果酸含量，经过HPLC分析，图2显示为嗜热毁丝霉野生型菌株及其突变株的苹果酸产量图，MTmae的苹果酸产量为50.8g/L，即每升培养基中所产生的苹果酸为50.8g，而出发菌株几乎不产苹果酸。

实施例2

在嗜热毁丝霉重组菌中敲除甲基转移酶laeA基因

1.构建嗜热毁丝霉甲基转移酶laeA基因敲除载体

根据嗜热毁丝霉全基因组信息，设计引物扩增得到甲基转移酶laeA基因(MYCTH_2294559)上下游同源片段，引物设计如下所示：

laeA-MFF(SEQ ID NO.15)：TTCGAGATCTAACCCATCATCTCGGTCCTCTA；

laeA-MFR(SEQ ID NO.16)：TTCGAGATCTAGCTTCAAATCGCGTGTTTCAT；

laeA-MRF(SEQ ID NO.17)：TTCGACTAGTGGCAAGCCCTCCAGCCACTT；

laeA-MRR(SEQ ID NO.18)：TTCGACTAGTTTCCTGGGCAGCAGCGGAGT；

laeA-F(SEQ ID NO.19)：AATCGCACCTACCAAGAAGT；

laeA-R(SEQ ID NO.20)：ATGGTCAGTCAGCAGTGTTT。

以基因组为模板，进行PCR扩增，用引物laeA-MFF和laeA-MFR扩增获得上游同源片段，用引物laeA-MRF和laeA-MRR扩增获得下游同源片段，将上下游同源片段分别插入敲除质粒pKO的Bgl II和SpeI位点，如图3所示，获得质粒pKO-laeA。以质粒pKO-laeA为模板，用引物laeA-MFF和laeA-MRR扩增得到敲除片段，参照实施例1中的原生质体转化方法，将其转入重组子MTmae中，将转化子挑至含有100μg/mL G418的察氏培养基中，提取基因组，用引物laeA-F和laeA-R进行验证，扩增不出条带的为正确转化子，命名为MTmaeΔlaeA。

Mt上游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

Mt下游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

Mt laeA同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.甲基转移酶敲除菌株MTmaeΔlaeA产苹果酸能力表征

将转化子MTmaeΔlaeA接种于察氏固体培养基上，45℃培养14天，收集孢子，将上述孢子以1×10⁶个/mL的接种量，接种至50mL发酵培养基(与实施例1中发酵培养基相同)，45℃，120rpm培养，第五天取样测定苹果酸含量，经过HPLC分析，如图2所示，MTmaeΔlaeA的苹果酸产量为75g/L，与对照菌株MTmae相比，苹果酸产量提高了50％。

如图5所示为苹果酸产量随时间的变化情况图，从图中可以看出，随时间的延长，菌株Mtmae、菌株MtmaeΔlaeA的苹果酸产量持续升高，到第五天最高，后续变化较小，并且，我们意外地发现，菌株Mtmae的苹果酸产量显著低于菌株MtmaeΔlaeA的苹果酸产量。

实施例3

在黑曲霉(Aspergillus niger)中敲除甲基转移酶laeA同时过表达二元酸转运蛋白

1.构建黑曲霉甲基转移酶AnlaeA基因敲除载体

根据黑曲霉(荷兰微生物菌种保存中心，CBS513.88)的全基因组信息，设计引物扩增得到甲基转移酶laeA基因(Aspni7︱170198)上下游同源片段，引物设计如下所示：

laeA-AFF(SEQ ID NO.21)：ttcgagatctTTTCCCACCATTCCAGCCCT；

laeA-AFR(SEQ ID NO.22)：ttcgagatctATCGTTGTTGTCCGGGGGTT；

laeA-ARF(SEQ ID NO.23)：ttcgactagtTGAGCAGAAGGTAGCCCGTT；

laeA-ARR(SEQ ID NO.24)：ttcgactagtGAGGGTTCTTGGCGTCTGGT。

以基因组为模板，进行PCR扩增，用引物laeA-AFF和laeA-AFR扩增获得上游同源片段，用引物laeA-ARF和laeA-ARR扩增获得下游同源片段，PCR方法参照实施例1，As上游同源臂核苷酸序列如序列7所示，As下游同源臂核苷酸序列如序列8所示，将上下游同源片段分别用BglII和SpeI消化，再将消化后的上下游片段插入质粒pGL01-mae相应的酶切位点中，获得质粒pGL01-mae-KOlaeA，其物理图谱如图4所示。

2.黑曲霉原生质体转化

黑曲霉在察氏培养基上30℃生长14天，用生理盐水洗下孢子，制成孢子悬液。按1×10⁶个/mL的浓度接种孢子至ME液体培养基(麦芽提取物30g/L，蛋白胨5g/L，121℃，15min)中，30℃条件下200rpm培养过夜。用三层擦镜滤纸收集菌体，将菌体转至30mL裂解液中，35℃条件下100rpm振荡培养1.5-3小时，4℃条件下2000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积的预冷的STC(1.2M山梨醇，50mMCaCl₂，10mM Tris，pH 7.5，121℃，15min)，混匀，4℃条件下2000rpm离心10min，弃上清，加入100μLSTC(25％PEG6000，50mM CaCl₂，10mM Tris,pH 7.5，121℃，15min)，混匀，得到原生质体悬液，待用。

上述裂解液的配制方法如下：称取0.2g裂解酶(购自Sigma-Aldrich公司，货号L1412)，溶于30mL MC溶液，过滤灭菌得到。其中，MC溶液的组成如下：50mM CaCl₂，20mMMES/NaOH，pH 5.8，渗透压稳定剂(0.9M KCl或1.2M山梨醇或0.4M MgSO₄)，121℃灭菌15min。

100μL原生质体加入10μgDNA片段和330μLPEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mLPEG，室温放置10min，加入4mLSTC，混匀，再加入4mL于50℃预热的上层培养基，混匀后倒在含有100μg/mL潮霉素的下层培养基上，平板在30℃培养直至出现菌落。

以步骤2制得的质粒pGL01-mae-KOlaeA为模板，用引物laeA-AFF和laeA-ARR扩增得到敲除片段，用上述原生质体法将DNA片段转入黑曲霉中，提取转化子基因组，利用PCR进行检测。用引物Mae-F和Mae-R可以扩增获得条带且用引物laeA-AnF和laeA-AnR不能扩增获得条带的转化子为正确转化子，命名为ANmae。

laeA-AnF(SEQ ID NO.25)：ACAACTACCGGGCGACTAAT；

laeA-AnR(SEQ ID NO.26)：GATCTGGGTAAAGCCTGCCT。

3.黑曲霉重组转化子ANmae产苹果酸能力表征

将转化子ANmae接种于察氏固体培养基上，30℃培养14天，收集孢子，将上述孢子以1×10⁶个/mL的接种量，接种至50mL柠檬酸发酵培养基中(按质量占比计，柠檬酸发酵培养基配方如下：蔗糖10％，硝酸铵0.25％，硫酸镁0.1％，磷酸二氢钾0.1％，酵母浸出粉0.05％，余量为水，总体积为1L，pH 2.5，调pH所用试剂为盐酸)，30℃，250rpm培养，第五天取样测定苹果酸含量；同时，将黑曲霉野生型菌株接种至上述柠檬酸发酵培养基中，作为对照组，经过HPLC分析可知，如图6所示，黑曲霉野生型菌株的柠檬酸产量为43g/L，而几乎不产苹果酸。相反地，几乎检测不到转化子ANmae的柠檬酸产量，而苹果酸产量为35g/L。因此，敲除甲基转移酶laeA的黑曲霉是极佳的生产苹果酸的真菌底盘。

综上所述，甲基转移酶laeA参与丝状真菌次生代谢物和初级代谢物的合成，敲除甲基转移酶LaeA的编码基因可以提高某些代谢物的产量，也会降低某些代谢物的产量，因此该基因在黑曲霉或嗜热毁丝霉等受体菌中对于苹果酸合成的影响是无法推测的，需要具体试验探索。将两者结合起来，创建新型耐酸苹果酸生产细胞工厂，对苹果酸的工业化生产具有重要意义。

曲霉是有机酸发酵的传统优势菌株，尤其是黑曲霉的柠檬酸发酵，黑曲霉具有极好的耐酸性，不但在发酵过程中不易污染，而且生产有机酸过程中不需要添加中和剂(如碳酸钙等碳酸盐)，因此，该生产工艺对环境友好且具有较低的生产成本。而目前苹果酸的发酵生产都依赖于中和剂的使用，因此，构建不依赖中和剂的黑曲霉-苹果酸细胞工厂是具有创新性的，无法由现有文献数据推测获得，需要具体试验探索。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海东庚化工技术有限公司

<120> 一种产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法

<130> PCNDG192395

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 二元酸转运蛋白mae的氨基酸序列

<400> 1

Met Leu Thr Pro Pro Lys Phe Glu Asp Glu Lys Gln Leu Gly Pro Val

1 5 10 15

Gly Ile Arg Glu Arg Leu Arg His Phe Thr Trp Ala Trp Tyr Thr Leu

20 25 30

Thr Met Ser Gly Gly Gly Leu Ala Val Leu Ile Ile Ser Gln Pro Phe

35 40 45

Gly Phe Arg Gly Leu Arg Glu Ile Gly Ile Ala Val Tyr Ile Leu Asn

50 55 60

Leu Ile Leu Phe Ala Leu Val Cys Ser Thr Met Ala Ile Arg Phe Ile

65 70 75 80

Leu His Gly Asn Leu Leu Glu Ser Leu Arg His Asp Arg Glu Gly Leu

85 90 95

Phe Phe Pro Thr Phe Trp Leu Ser Val Ala Thr Ile Ile Cys Gly Leu

100 105 110

Ser Arg Tyr Phe Gly Glu Glu Ser Asn Glu Ser Phe Gln Leu Ala Leu

115 120 125

Glu Ala Leu Phe Trp Ile Tyr Cys Val Cys Thr Leu Leu Val Ala Ile

130 135 140

Ile Gln Tyr Ser Phe Val Phe Ser Ser His Lys Tyr Gly Leu Gln Thr

145 150 155 160

Met Met Pro Ser Trp Ile Leu Pro Ala Phe Pro Ile Met Leu Ser Gly

165 170 175

Thr Ile Ala Ser Val Ile Gly Glu Gln Gln Pro Ala Arg Ala Ala Leu

180 185 190

Pro Ile Ile Gly Ala Gly Val Thr Phe Gln Gly Leu Gly Phe Ser Ile

195 200 205

Ser Phe Met Met Tyr Ala His Tyr Ile Gly Arg Leu Met Glu Ser Gly

210 215 220

Leu Pro His Ser Asp His Arg Pro Gly Met Phe Ile Cys Val Gly Pro

225 230 235 240

Pro Ala Phe Thr Ala Leu Ala Leu Val Gly Met Ser Lys Gly Leu Pro

245 250 255

Glu Asp Phe Lys Leu Leu His Asp Ala His Ala Leu Glu Asp Gly Arg

260 265 270

Ile Ile Glu Leu Leu Ala Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Trp Ala Leu

275 280 285

Ser Leu Trp Phe Phe Cys Ile Ala Ile Val Ala Val Ile Arg Ser Pro

290 295 300

Pro Glu Ala Phe His Leu Asn Trp Trp Ala Met Val Phe Pro Asn Thr

305 310 315 320

Gly Phe Thr Leu Ala Thr Ile Thr Leu Gly Lys Ala Leu Asn Ser Asn

325 330 335

Gly Val Lys Gly Val Gly Ser Ala Met Ser Ile Cys Ile Val Cys Met

340 345 350

Tyr Ile Phe Val Phe Val Asn Asn Val Arg Ala Val Ile Arg Lys Asp

355 360 365

Ile Met Tyr Pro Gly Lys Asp Glu Asp Val Ser Asp

370 375 380

<210> 2

<211> 1143

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 二元酸转运蛋白mae的核苷酸序列

<400> 2

atgctgacac ctcccaagtt tgaggatgag aagcagctgg gccccgtggg tatccgggag 60

aggcttcgcc atttcacttg ggcctggtac acattaacga tgagtggagg agggctggcc 120

gtcctcatca tcagccagcc ctttgggttc cgcggattga gagagatcgg catcgctgtc 180

tatatcctca acctgatcct cttcgccctt gtctgctcta ccatggctat aaggttcatc 240

ctgcacggca accttctgga gtccctccgt catgaccgcg agggtctctt cttcccgacc 300

ttctggctct ccgtcgcaac catcatctgc ggcttgtctc gctacttcgg tgaagaatcg 360

aatgagtcct tccaactagc cctcgaagcc ctcttctgga tctactgcgt ctgcacctta 420

ctcgtcgcaa tcatccaata ctcgttcgtc ttctcatccc acaagtacgg ccttcaaacc 480

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<223> As下游同源臂

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<223> Mt laeA同源臂氨基酸序列

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Tyr Gly Tyr Phe Glu Gln Val Glu Ile Asp Trp Thr Pro Arg Cys Asp

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Gly Lys Ala Leu Gly Arg Trp Phe Asn Leu Gly Ile Arg Gln Ala Leu

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acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 3660

aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 3720

attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 3780

tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 3840

gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 3900

cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 3960

tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 4020

agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 4080

tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 4140

tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 4200

tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 4260

acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 4320

accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 4380

tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 4440

cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 4500

tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 4560

actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 4620

tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 4680

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 4740

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 4800

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt 4860

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 4920

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 4980

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 5040

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 5100

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 5160

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 5220

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 5280

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 5340

ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 5400

ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 5460

cgaggaagcg gaaga 5475

<210> 12

<211> 3828

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pKO

<400> 12

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgc 240

atgcctgcag gtcgactcta gaggatcctt cgagatctgg gcttggctgg agctagtgga 300

ggtcaacaat gaatgcctat tttggtttag tcgtccaggc ggtgagcaca aaatttgtgt 360

cgtttgacaa gatggttcat ttaggcaact ggtcagatca gccccacttg tagcagtagc 420

ggcggcgctc gaagtgtgac tcttattagc agacaggaac gaggacatta ttatcatctg 480

ctgcttggtg cacgataact tggtgcgttt gtcaagcaag gtaagtgaac gacccggtca 540

taccttctta agttcgccct tcctcccttt atttcagatt caatctgact tacctattct 600

accgaagcat cgatatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 660

tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 720

tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 780

ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 840

cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 900

aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 960

tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 1020

aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 1080

atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 1140

cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 1200

tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 1260

accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 1320

gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 1380

tctatcgcct tcttgacgag ttcttctaaa ctagtcttag ttaacgaatt cactggccgt 1440

cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 1500

acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca 1560

acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 1620

gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 1680

gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct 1740

cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt 1800

ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata 1860

ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 1920

gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 1980

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 2040

tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 2100

agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 2160

cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 2220

aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 2280

gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 2340

agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 2400

aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 2460

gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 2520

ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 2580

aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 2640

aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 2700

tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 2760

agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 2820

ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 2880

ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 2940

ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 3000

acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 3060

agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 3120

ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 3180

cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 3240

gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 3300

cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 3360

gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 3420

caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 3480

aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 3540

tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 3600

gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 3660

ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 3720

atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 3780

cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaaga 3828

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Mae-F

<400> 13

aatggttaac atgctgacac ctcccaag 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Mae-R

<400> 14

aatggttaac ctaatcagat acatcctc 28

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-MFF

<400> 15

ttcgagatct aacccatcat ctcggtcctc ta 32

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-MFR

<400> 16

ttcgagatct agcttcaaat cgcgtgtttc at 32

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-MRF

<400> 17

ttcgactagt ggcaagccct ccagccactt 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-MRR

<400> 18

ttcgactagt ttcctgggca gcagcggagt 30

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-F

<400> 19

aatcgcacct accaagaagt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-R

<400> 20

atggtcagtc agcagtgttt 20

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-AFF

<400> 21

ttcgagatct tttcccacca ttccagccct 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-AFR

<400> 22

ttcgagatct atcgttgttg tccgggggtt 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-ARF

<400> 23

ttcgactagt tgagcagaag gtagcccgtt 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-ARR

<400> 24

ttcgactagt gagggttctt ggcgtctggt 30

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-AnF

<400> 25

acaactaccg ggcgactaat 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> laeA-AnR

<400> 26

gatctgggta aagcctgcct 20

Claims (10)

1.一种构建产苹果酸的工程菌的方法，其特征在于：包括提高受体菌中二元酸转运蛋白的表达或活性，降低所述受体菌中甲基转移酶laeA的表达或活性，获得产苹果酸的工程菌；

所述甲基转移酶laeA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

降低受体菌中所述甲基转移酶laeA的表达或活性是通过敲除或沉默所述甲基转移酶laeA的编码基因来实现；

所述受体菌选自嗜热毁丝霉、黑曲霉中的至少一种；

所述二元酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：提高所述受体菌中二元酸转运蛋白的表达或活性是通过向受体菌中导入二元酸转运蛋白的编码基因来实现的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述二元酸转运蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过同源重组法、原生质体法、农杆菌介导法、RNAi沉默法或CRISPR法降低所述甲基转移酶laeA的表达或活性。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌选自嗜热毁丝霉时，采用同源重组法敲除所述甲基转移酶laeA的编码基因，进行敲除时，上游同源重组片段的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.5所示片段，下游同源重组片段的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.6所示片段。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌选自黑曲霉时，采用同源重组法敲除所述甲基转移酶laeA的编码基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：进行敲除时，上游同源重组片段的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.7所示片段，下游同源重组片段的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示片段。

8.根据权利要求1-7任意一项所述方法制得的用于生产苹果酸的工程菌。

9.根据权利要求8所述工程菌在苹果酸生产中的应用。

10.一种生产苹果酸的方法，包括：培养权利要求8所述工程菌，收集孢子，将所述孢子接种至发酵培养基中，收集发酵产物，从中获得苹果酸，所述发酵培养基包括如下组分：100g/L葡萄糖，6.0g/L蛋白胨，150mg/L磷酸二氢钾，150mg/L磷酸氢二钾，100mg/L氯化钙，100mg/L硫酸镁，碳酸钙80.0g/L，1mg/L生物素，1mL/L微量元素，余量为水；其中，所述微量元素包括如下组分：氯化钠5g/L，硫酸亚铁5g/L，柠檬酸1g/L，余量为水。