CN111808760B

CN111808760B - 一种促进宿主细胞生长速率及其底物利用的方法及应用

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Publication number: CN111808760B
Application number: CN202010892096.2A
Authority: CN
Inventors: 田朝光; 李金根; 赵祯; 顾淑莹; 刘倩; 王涵玉; 孙涛; 孙文良
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2040-08-31
Also published as: CN111808760A

Abstract

本发明提供了一种促进丝状真菌生长速率及其底物利用的方法及其在微生物发酵中的应用，属于基因工程领域。利用敲除、突变等基因工程方法对丝状真菌调控因子LaeA进行改造，所得到的重组菌株，获得生长速率和底物利用速率显著提高的能力，进而提高发酵生产有机酸等生物基化学品的生产效率。

Description

一种促进宿主细胞生长速率及其底物利用的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及调控因子LaeA在提高嗜热毁丝霉生长速率及糖代谢中的功能及其应用。

背景技术

丝状真菌是一类重要的真核微生物，广泛存在于自然界中，在工业、农业和医药等领域发挥着重要作用。里氏木霉、黑曲霉、米曲霉以及嗜热毁丝霉被广泛用于生产工业酶制剂(如纤维素酶、葡萄糖淀粉酶和淀粉酶等)和有机酸(如柠檬酸等)。与细菌、酵母相比，丝状真菌具有较高的蛋白质分泌能力，能够利用简单、廉价的培养基进行生长，在工业发酵中受到了关注。但值得注意的是丝状真菌一般存在底物利用速率低，生长较慢等问题，使得丝状真菌发酵周期较长，目标产品产率及生产强度较低，成为解决发酵成本较高、生产设备利用率低等问题的关键。

嗜热毁丝霉是天然纤维素降解高温丝状真菌，是耐高温纤维素酶的优良生产者，天然具有分泌大量生物质降解酶类的能力。嗜热毁丝霉最适生长温度为45-48℃，与纤维素酶最佳酶活温度50℃非常接近，是发酵工业非常卓越的底盘细胞。目前，经过代谢工程改造后，嗜热毁丝霉已被用于发酵生产大宗化学品，如苹果酸、富马酸等。嗜热毁丝霉最适生长温度较高，可以节约发酵过程中的冷却水用量，降低生产成本，已被证实可以用来大规模工业发酵（Visser H, Joosten V, Punt PJ, Gusakov AV, Olson PT, Joosten R, BartelsJ, Visser J. Development of a mature fungal technology and productionplatform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophilaisolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1. Ind Biotechnol.2011;7:214-23）。但是嗜热毁丝霉存在生长速率慢、发酵周期长、纤维素酶分泌相对较低等问题，限制了其工业发酵中的广泛应用。因此，有必要开发生长速率快，发酵时间短，生产有机酸如苹果酸等的产量高的嗜热毁丝霉。

全局调控因子LaeA为蛋白甲基转移酶，前期研究表明LaeA参与调控丝状真菌发育、次级代谢合成等生理过程。在本发明中通过实验证实LaeA蛋白与重要的工业丝状真菌嗜热毁丝霉的生长速率及其底物利用和发酵时间相关，突变其编码基因后能够显著目标产物的生产效率，极具推广意义。

发明内容

本发明提供了一种提高丝状真菌嗜热毁丝霉底物利用和生长速率的方法。经验证，本发明能够显著提高嗜热毁丝霉苹果酸工程菌株的生长速率，显著提高有机酸的生产效率。为达此目的，本发明采用以下技术方案。

第一方面，本发明提供一种重组丝状真菌，其特征在于，利用基因工程方法抑制丝状真菌细胞中的调控因子LaeA表达水平而获得或通过突变使其丧失/降低活性，其生长速率和/或碳源底物利用的能力得以提升，其中优选的所述碳源底物选自单糖、多糖、聚糖、植物生物质、或其组合，优选地所述多糖选自蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，纤维寡糖，木二糖，木寡糖或其组合；所述聚糖选自所述的聚糖包括纤维素、半纤维素、蔗糖、淀粉或其组合；所述的单糖选自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其组合。

在更具体的实施方式中，所述调控因子LaeA为具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽以及同源性达到或超过70%,优选80%，90%，95%，以及99%的氨基酸序列,优选其源自丝状真菌,更优选源自毁丝霉，最优选源自嗜热毁丝霉。

更优选地，所述调控因子LaeA为具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽，优选其编码核苷酸是如SEQ ID NO.2所示。

在优选地实施方式中，所述抑制丝状真菌细胞中的调控因子LaeA的活性或表达水平是通过对所述调控因子LaeA进行敲除、或突变、或表达水平被下调来实现。

其中，所述敲除是通过基因编辑方式实现,更优选地是基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法实现。所述抑制表达水平通过所述调控因子LaeA的抑制剂来实现，优选地，所述的抑制剂选自所述调控因子LaeA的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNAmiRNA、siRNA、shRNA或者活性抑制剂。

更优选的，所述突变调控因子LaeA使其丧失/降低功能是指通过基因工程删除或替换其核苷酸序列或其所编码的氨基酸序列，从而使调控因子LaeA功能丧失或下降。

在优选地实施方式中，所述突变调控因子LaeA是指对其第88位至第175位氨基酸，第89至第96位氨基酸，和/或第89位至第90位氨基酸进行删除或替换，从而使其丧失调控功能。

在优选地实施方式中，所述丝状真菌选自毁丝霉。更优选地，所述丝状真菌是嗜热毁丝霉菌。

第二方面，本发明提供一种利用嗜热毁丝霉生产有机酸的方法，其特征在于：利用本发明上述的重组丝状真菌生产有机酸，相对于野生型的丝状真菌而言提高了有机酸的合成效率。优选实施方式中，其是利用本发明上述的嗜热毁丝霉重组菌生产苹果酸和/或琥珀酸。

第三方面，本发明提供了一种构建重组丝状真菌的方法，其利用基因工程方法抑制丝状真菌细胞中的调控因子LaeA的活性或表达水平，而获得生长速率和/或碳源底物利用能力得以提升的丝状真菌。其中优选的所述碳源底物选自单糖、多糖、聚糖、植物生物质、或其组合，优选地所述多糖选自蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，纤维寡糖，木二糖，木寡糖或其组合；所述聚糖选自所述的聚糖包括纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉或其组合；所述的单糖选自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其组合。

在优选实施方式中，所述的方法通过基因编辑方式实现，更具体的基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术。更优选地，所述方法包含的元件为：Cas9蛋白编码序列（编码序列如SEQ ID NO.5所示），sgRNA调控表达框（如SEQ ID NO.3所示）和供体DNA（如SEQ ID NO.4所示）；其中，所述sgRNA转录的表达框包括对基因laeA的靶向位点的sgRNA转录的表达框的序列；所述的供体DNA序列是由laeA上/下游两条同源片段与抗性基因通过GibsonAssembly的方法连接而成，通过将所述同源供体DNA序列一起导入丝状真菌细胞，可实现高效率同源重组，若不导入同源供体DNA序列也能通过非同源端连接（NHEJ）实现所述基因位点的编辑。

在一个具体实施例中，将Cas9蛋白的表达框和调控sgRNA转录的表达框共转化进入嗜热毁丝霉菌株的原生质体细胞后，通过非同源端连接（NHEJ）对laeA位点特异性DSB的不精确修复，进而得到laeA突变株。

本发明通过失活调控因子LaeA，显著加快了嗜热毁丝霉的底物利用效率、生长速率以及产物合成效率，能够用于生产有机酸如苹果酸等。因而，本发明对于提高丝状真菌发酵水平及目标产品生产效率具有重要意义。

附图说明

图1 嗜热毁丝霉laeA突变菌株的葡萄糖消耗速率。

图2 嗜热毁丝霉laeA突变菌株在葡萄糖条件下的生物量积累。

图3 嗜热毁丝霉laeA突变菌株在不同碳源条件下生长表型分析。

图4 嗜热毁丝霉laeA突变菌株在蔗糖条件下的生物量积累。

图5 嗜热毁丝霉有机酸株JG207缺失laeA后的底物利用。

图6 嗜热毁丝霉有机酸发酵菌株JG207缺失laeA后的苹果酸产量。

图7 嗜热毁丝霉有机酸发酵菌株JG207缺失laeA后的琥珀酸产量。

图8 导入LaeA突变体后菌株KoLaeA的葡萄糖消耗速率。

图9 导入LaeA突变体后菌株KoLaeA葡萄糖条件下的生物量积累。

图10 导入LaeA突变体后菌株KoLaeA在蔗糖条件下的生物量积累。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，发现LaeA蛋白作为在丝状真菌中具有调控菌株的生长发育、碳源利用等生理活动的功能，尤其经过实验证实在嗜热毁丝霉中敲除laeA基因后，突变体表现出生长加快、糖耗加快、生物量增大等性状。另外，为了进一步证实LaeA蛋白在丝状真菌有机酸生产中作用，发明人还敲除了嗜热毁丝霉苹果酸发酵菌株laeA基因，实验证实突变体在发酵过程中底物利用速率以及苹果酸合成速率均有所提高。如此形成了本发明。

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，例如Sambrook 等人所著的《分子克隆：实验室手册》(New York: Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1 LaeA失活能够加快嗜热毁丝霉野生菌株的糖耗速率

本实施例主要针对丝状真菌中的全局性调控因子LaeA(Mycth_2294559)，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术（Liu Q, Gao RR, Li JG, Lin LC, Zhao JQ,Sun WL,Tian CG. Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilicfungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulaseproduction strain engineering. Biotechnology for Biofuels. 2017, 10:1.）将目标基因在嗜热毁丝霉中失活，以提高菌株糖耗速率。其中，LaeA蛋白的编码核苷酸序列如SEQID No.1所示。LaeA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

具体实施过程如下：

1. 载体构建

（1）sgRNA表达框构建

通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因laeA（Mycth_2294559）的靶标位点。采用融合PCR的方法将序列U6p启动子、laeA靶标位点以及引导序列连接在一起，构建sgRNA表达框载体。

PCR反应体系为：2×Phanta® Max Buffer 25μL，10 mM dNTPs 1μL，上游/下游引物各1.5μL，模板1μL，Phanta^®Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，水 19μl。

PCR反应条件为：先95℃ 30s；然后98℃ 15s， 58℃ 15s， 72℃ 45s，32个循环；最后72℃ 5min，4℃ 10min。

通过融合PCR的构建的sgRNA表达质粒U6p-laeA-sgRNA，其sgRNA转录调控元件序列如SEQ ID No.3所示。

（2）供体DNA载体构建

本发明中供体DNA片段分别由目标基因上/下游约1000bp同源片段，新霉素抗性基因表达框PtrpC-neo片段，通过Gibson Assembly的方法连接到由限制性内切酶XbaI和EcoRV线性化的质粒PPk2NeoGFP中，最终构建供体DNA片段Donor-laeA，其核酸序列如SEQID No.4所示。

PCR反应条件为：先95℃ 30s；然后98℃ 15s， 58℃ 15s， 72℃ 2min，32个循环；最后72℃ 5min，4℃ 10min。

（3）Cas9表达框构建

Cas9表达框通过PCR扩增的方式，从质粒p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC上扩增（Liu Q, Gao RR, Li JG, Lin LC, Zhao JQ,Sun WL, Tian CG. Development of agenome-editing CRISPR/ Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthoraspecies and its application to hyper-cellulase production strain engineering.Biotechnology for Biofuels. 2017, 10:1.）获得，其核酸序列如SEQ ID No.5所示。

PCR反应条件为：先95℃ 30s；然后98℃ 15s， 58℃ 15s， 72℃ 3min，32个循环；最后72℃ 5min，4℃ 10min。

本实施例中载体构建所用引物如下：

SEQ ID NO.	引物	序列（5’-3’）
			6	LaeA_UP-F	TGTGGAGTGGGCGCTTACACAGTACACGAGGACTTACAGCTTATACCTCTTATCTC
7	LaeA_UP-R	GCCCAAAAAATGCTCCTTCAATATCAGTTAACGTCGTTAGACTTCTTGGTAGGTGCGA
			8	neo-F	CGACGTTAACTGATATTGAAGGA
9	neo-R	TCAGAAGAACTCGTCAAGAA
			10	LaeA_Dn-F	TCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCTAACATCGTCTTACCCCTTG
11	LaeA_Dn-R	AGTCATGTGATTGTAATCGACCGACGGAATTGAGGATGCAGAGTAATCCATGACAGCA
			12	Cas9-F	TCCTCCGAGGTTCGACATCAGGGTT
13	Cas9-R	CTCTAAACAAGTGTACCTGTGCAT
			14	U6p-F	AGGATCGGTGGAGTGAAGTTCGGAA
15	LaeA_sgRNA-R	TCTAGCTCTAAAACTACCAGCGGCCGTTTTCGGCGAGGAAAGAAAGAAAAGAAG
			16	LaeA_sgRNA-F	CTTCTTTTCTTTCTTTCCTCGCCGAAAACGGCCGCTGGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAG
17	sgRNA-R	AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
			18	laeA_orf-F	TTATAGAGGCCACCTGTGAGTT
19	laeA_orf-R	CTCACGGGTGGCACTCACAA

2、在嗜热毁丝霉中敲除laeA

2.1嗜热毁丝霉孢子准备

将嗜热毁丝霉野生型菌株在XM平板培养基[50×Vogel’s盐20mL，木糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌；50×Vogel’s盐（1L）：柠檬酸三钠（1/2H₂O）150g，KH₂PO₄250g，NH₄NO₃ 100g，MgSO₄·7H₂O 10g，CaCl₂·2H₂O 5g，微量元素液 5mL，生物素（0.1mg/mL）2.5mL，定容体积到1L；微量元素液配方（100 mL）：5g C₆H₈O·7H₂O， 5 g ZnSO₄·7H₂O，1 gFe(NH₄)₂(SO₄)·6H₂O，0.25g CuSO₄·5H₂O，0.05g MnSO₄·H₂O，0.05 g H₃BO₃，0.05gNaMoO₄·2H₂O，溶于水中，定容至100mL]上35℃培养7天后待用。

2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化

1）菌丝体准备

将成熟的嗜热毁丝霉孢子，用0.05%吐温80灭菌水收集，经擦镜纸过滤出去菌丝后，涂布于铺有玻璃纸的GM平板[50×Vogel’s盐20mL，葡萄糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌]，37℃培养20h。

2）原生质体制备

将带有菌丝的玻璃纸放置于30mL裂解液（配方：0.15g裂解酶，无菌操作加入30mL溶液A，过滤除菌；溶液A:1.036g磷酸二氢钾，21.864g山梨醇，溶于90mL去离子水，氢氧化钾调pH到5.6，定量至100mL，高温高压灭菌）中，28℃裂解2h，每隔15min轻轻摇动。

而后经过擦镜纸过滤后，2000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入4mL溶液B（0.735g氯化钙，18.22g山梨醇，1mL Tris·HCl （1M，pH7.5），溶于90mL去离子水，盐酸调pH到7.6，定量至100mL，高温灭菌），2000rpm 4℃离心10min；弃上清，按200µL/5ug质粒加入一定体积溶液B。

3）原生质体转化

预冷的15ml离心管，加入50µL预冷PEG(12.5g PEG6000，0.368g氯化钙，500µLTris·HCl (1M pH 7.5))，10µLCas9表达框，sgRNA片段U6p-laeA-sgRNA（SEQ ID No.3）以及供体DNA片段donor-laeA（SEQ ID No.4）等比例混合溶液，200µL原生质体。放置冰上20min后加入2mL预冷PEG，室温5min，加入4mL溶液B，轻轻混匀。取3mL上述溶液加入12mL融化的含相应抗生素培养基A（葡萄糖20 g，50×Vogel’s盐20 mL，山梨醇182.2 g，琼脂糖7.5g，定容体积到1L，高温高压灭菌）中，平板中先倒入一层含抗生素G418的培养基B（葡萄糖20 g，50×Vogel’s盐20 mL，山梨醇182.2 g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌），再倒入一层混合原生质体的培养基A，35℃培养，3d-4d后于体式显微镜下挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长。

2.3 嗜热毁丝霉转化子验证

1）基因组提取

采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组DNA，具体包括以下操作：

1）2.0mL的无菌的DNA提取管中加入200mg的锆珠及1mL的裂解液（lysis buffer，配方：0.2M Tris·HCl (pH 7.5)，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％SDS(w/v)），挑取平板中生长的嗜热毁丝霉菌丝于DNA提取管中。

2）将所有DNA提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次。

3）65℃水浴30分钟，在水浴过程中每个几分钟取出漩涡振荡。

4）水浴结束后取出，每管加入 80μL pH 7.5的1M Tris·HCl中和。

5)加入400μL的酚：氯仿（1:1），13000rpm离心5分钟。

6）取300μl上清液于新的1.5mLEP管中，加入600μl 95％的乙醇（DNA）。

7）冰上孵育一小时，随后4℃，13000rpm离心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部。

8）用75％的酒精（DNA级）400μL清洗，4℃、13000rpm离心，轻轻取出上清液。

9）将EP管置于真空浓缩仪中，真空干燥酒精。

10）加入50μL ddH₂O溶解DNA，用NanoDrop测定DNA浓度，测完浓度后将提取的DNA置于-20℃冰箱保存，以备下一步进行PCR验证。

2)PCR验证嗜热毁丝霉转化子

以提取的基因组DNA为模版，用引物laeA_orf-F和laeA_orf-R对转化子进行基因PCR验证，Donor-laeA质粒为阳性对照，嗜热毁丝霉野生型基因组为阴性对照。对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳（120V电压，20分钟），在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在引物laeA_orf-F和laeA_orf-R引导下经PCR扩增获得了单一目的条带，大小与阳性对照质粒片段相同，表明laeA基因在野生型嗜热毁丝霉中成功敲除（称为laeA缺失菌株KolaeA）。

3. 嗜热毁丝霉转化子糖耗速率测定

1）采用0.05%吐温80灭菌水收集嗜热毁丝霉野生菌和laeA缺失菌株KolaeA的孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种于2%（W/V）葡萄糖液体培养基（葡萄糖20g，50×Vogel’s盐20 mL，定容体积到1L，高温高压灭菌），培养基体积为100mL/瓶，接种量均为2.5*10⁵ 个/mL， 45℃条件下培养，摇床转速150 rpm。

每隔12小时，取出1mL样品离心取上清液，测定葡萄糖含量；结果如图1所示，菌株KOlaeA菌株在48小时后将培养基中20g/L葡萄糖耗尽，相比野生型（60小时）糖耗速率提高25%，消耗同等葡萄糖时间缩短25%，说明基因laeA的缺失促进了嗜热毁丝霉对葡萄糖的利用速率, 显著缩短发酵时间。

实施例2 LaeA失活能够促进嗜热毁丝霉生物量合成

将实施例1中所构建的laeA缺失菌株KolaeA及其野生型菌株接种于2%（W/V）葡萄糖液体培养基中（葡萄糖20g，50×Vogel’s盐20 mL，定容体积到1L，高温高压灭菌），45℃条件下培养，摇床转速150 rpm。

每隔12小时，取出100mL样品抽滤烘干，测定生物量。结果如图2所示，laeA缺失菌株KolaeA生长48小时后生物量达到8.27mg/mL，相比野生型（5.508mg/mL）提高了40.6%，说明laeA失活后有助于嗜热毁丝霉糖在液体培养基中生物量的积累。

将laeA缺失菌株KolaeA与嗜热毁丝霉野生菌株点板于不同碳源平板（碳源2g，50×Vogel’s盐2mL，琼脂1.5g，定容体积到100mL，高温高压灭菌），分别以葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和纤维素为唯一碳源。用0.05%吐温80灭菌水收集获得的孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，点板的孢子量均为1*10⁵个，点板的体积为4µL，35℃条件下培养4~5天。结果如图3，在葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维素条件下，laeA缺失菌株KolaeA生长速率显著高于野生型菌株。

同时，如图4所示，在液体培养基中以蔗糖为唯一碳源时，菌株KOlaeA菌株的生物量，相比野生型提高39.1%。

综合可知，失活嗜热毁丝霉中laeA能够显著提高突变体对不同底物（葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、纤维素及蔗糖）条件下生长。

实施例3 基因laeA失活促进有机酸发酵中碳源的利用

本实施例主要针对嗜热毁丝霉有机酸发酵菌株，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术（Liu Q, Gao RR, Li JG, Lin LC, Zhao JQ,Sun WL, Tian CG. Developmentof a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthoraspecies and its application to hyper-cellulase production strain engineering.Biotechnology for Biofuels. 2017, 10:1.）将目标基因laeA（Mycth_2294559）失活，促进突变体发酵液中碳源利用，缩短发酵周期。其中嗜热毁丝霉有机酸工业菌株JG207为前期所获得（Li J, et al. Direct production of commodity chemicals fromlignocellulose using Myceliophthora thermophila. Metabolic engineering2019.DOI:10.1016/j.ymben），通过代谢工程改造，在JG207菌种中构建了有机酸途径，可以利用多种复杂碳源高效合成苹果酸和琥珀酸。

1. 突变体构建

本实施例利用实施例1中构建sgRNA表达框U6p-laeA-sgRNA（如SEQ ID No.3所示）及其供体DNA表达载体Donor-laeA（如SEQ ID No.4所示），失活嗜热毁丝霉菌株JG207中基因laeA，得到突变体菌株JG207-KOlaeA。

本实施例中嗜热毁丝霉JG207菌株laeA基因敲除过程中所使用的转化方法与验证方法均与实施例1中所述相同。

2.失活laeA转化子发酵性能测定

将所获得的突变体菌株JG207-KOlaeA与对照菌株嗜热毁丝霉JG207菌株接种于50mL发酵培养基中（磷酸二氢钾150mg/L，磷酸氢二钾150mg/L，硫酸镁100mg/L，氯化钙100mg/L，生物素1mL/L，微量元素液1mL/L，葡萄糖75g，碳酸钙80g/L，接种量均为2.5*10⁵个/mL，培养基体积为50mL/瓶，45℃条件下培养，摇床转速150 rpm。

每2天，取出1mL样品加入到1mL 20%（W/V）硫酸中，离心取上清液，测定发酵液中剩余葡萄糖含量与有机酸产量。结果如图5所示，在发酵4天后，突变体菌株JG207-KOlaeA菌株已经将葡萄糖全部耗尽，而菌株JG207需要6天时间将碳源耗尽，证明laeA基因的缺失加速了菌株JG207的耗糖速率，消耗相同量的葡萄糖，发酵时间显著缩短。

同时突变体菌株JG207-KOlaeA菌株合成苹果酸和琥珀酸的速率也有所提高，如图6所示，在发酵4天时突变体菌株JG207-KOlaeA菌株苹果酸产量达到40.8g/L，比菌株JG207发酵4天苹果酸产量32.9g/L提高了24.5%；如图7所示，失活laeA后，菌株JG207-KolaeA的琥珀酸合成效率显著高于菌株JG207，其中第四天时，琥珀酸产量达到8.7g/L，相比对照菌株JG207提高38%；同时，生产相同量的苹果酸或琥珀酸，突变体所用时间显著缩短30%以上（对照菌4天生产苹果酸水平，突变体菌种只需3天即可达到或超过其产量）。

综合可知，laeA基因的缺失加速了嗜热毁丝霉有机酸发酵菌株JG207的耗糖速率，同时提高了菌株的产酸速率，缩短了发酵时间。

实施例4 全局调控因子LaeA关键位点的鉴定与分析

本实施例主要针对实施例1中所构建的laeA(Mycth_2294559)突变体菌株KolaeA，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术（Biotechnol Biofuels 2017,10:1）将LaeA蛋白质序列中关键位点突变/删除后导入目标菌株KolaeA，获得含有laeA突变体的菌株。

其中LaeA蛋白突变体分别为laeAM1（删除第88位到第175位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.20所示，核苷酸序列如SEQ ID No.21所示）、laeAM2（删除第89到第96位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.22所示，核苷酸序列如SEQ ID No.23所示）、laeAM3（包含两个氨基酸残基突变分别为L89G和D90G，氨基酸序列如SEQ ID No.24所示，核苷酸序列如SEQ IDNo.25所示）。

具体实施过程如下：

1. 载体构建

（1）sgRNA表达框构建

通过软件sgRNACas9 tool设计抗性基因neo的靶标位点。采用融合PCR的方法将序列U6p启动子、neo靶标位点以及引导序列连接在一起，构建sgRNA表达框载体。

PCR反应体系与条件与实施例1中sgRNA表达框构建相同。

通过融合PCR的构建的sgRNA表达质粒U6p-neo-sgRNA，其sgRNA转录调控元件序列如SEQ ID No.26所示。

（2）供体DNA载体构建

本实施例中供体DNA片段由启动子PtrpC片段、目标基因下游约1000bp同源片段、laeAM1/laeAM2/laeAM3片段，通过Gibson Assembly的方法连接到由限制性内切酶XbaI和EcoRV线性化的质粒PPk2BarGFP中，最终构建供体DNA片段Donor-laeAM1、Donor-laeAM2和Donor-laeAM3，其核酸序列分别如SEQ ID No.27、SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示。

PCR反应体系与条件与实施例1中供体DNA载体构建相同。

（4）Cas9表达框构建与实施例1相同

本实施例中载体构建所用引物如下：

SEQ ID NO.	引物	序列（5’-3’）
			30	M-TrpC-F	GTGGGCGCTTACACAGTACACGAGGACTTCGACGTTATCTGATATTGAAGGAGCATT
31	M-Bar-R	CTGATGTCGAACCTCGGAGGACGTCAAGGTACATGTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGAC
			32	M-Ptef-F	GTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCGTCACCGAGATTTGACATGTACCTTGACGTCCTC
33	Tef-laeAM-R	GGAGTCCATTGCCACGGCCGAATCAGCGGAAGACATTCTGAAGAACGAAACTGGCGA
			34	laeAM-up-F	TTAAGCGCAAGTCGCCAGTTTCGTTCTTCAGAATGTCTTCCGCTGATTCGGCCGT
35	laeAM1up-R	CCAGTCGATCTCGACTTGCTCAAAGTAGCCGTAGTAGATGTGAGGGGTTTCTTGGT
			36	laeAM2up-R	TATTTATCTGCCATGTCAATGCCCCAGATGATGTGAGGGGTTTCTTGGTTGGGGAAG
37	laeAM3up-R	AATGCCCCAGATCCCTGTGCCACAGCCCAGTCCACCGATGTGAGGGGTTTCTTGGT
			38	laeAM1down-F	GTGCCCCCTTCCCCAACCAAGAAACCCCTCACATCTACTACGGCTACTTTGAGCA
39	laeAM2down-F	GTGCCCCCTTCCCCAACCAAGAAACCCCTCACATCATCTGGGGCATTGACATGGC
			40	laeAM3down-F	GCCCCCTTCCCCAACCAAGAAACCCCTCACATCGGTGGACTGGGCTGTGGCACAGGGAT
41	M-LAE-R	GTAATCCATGACAGCAACAACAGGCCAGGACTCACCGTGGCTTTCTGGCGGTA
			42	M-laeDN-F	GTTACACATCTTTACCGCCAGAAAGCCACGGTGAGTCCTGGCCTGTTGTTGCTG
43	M-laeDN-R	GTCATGTGATTGTAATCGACCGACGGAATTGAGGATCTGCTGTAAAGAGAATTAGA

2、在嗜热毁丝霉菌株KolaeA导入laeAM突变体

2.1 嗜热毁丝霉孢子准备

将嗜热毁丝霉KOlaeA菌株在XM平板培养基[50×Vogel’s盐20mL，木糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌]上35℃培养7天后待用。

2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化

1）菌丝体与原生质体制备

菌丝体与原生质体制备方法与实施例1中所述相同。

2）原生质体转化

取200µL原生质体于预冷的15ml离心管，加入50µL预冷PEG(12.5g PEG6000，0.368g氯化钙，500µL Tris·HCl (1M pH 7.5))，10µLCas9表达框，sgRNA片段U6p-neo-sgRNA（SEQ ID No.20）后，分别与体DNA片段donor-laeAM1、donor-laeAM2、donor-laeAM3等比例混合溶液，放置冰上20min后加入2mL预冷PEG，室温5min，加入4mL溶液B，轻轻混匀。取3mL上述溶液加入12mL融化的含相应抗生素培养基A（葡萄糖20 g，50×Vogel’s盐20 mL，山梨醇182.2 g，琼脂糖7.5g，定容体积到1L，高温高压灭菌）中，平板中先倒入一层含抗生素PPT的培养基B（葡萄糖20 g，50×Vogel’s盐20 mL，山梨醇182.2 g，琼脂15g，定容体积到1L，高温高压灭菌），再倒入一层混合原生质体的培养基A，35℃培养，3d-4d后于体式显微镜下挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长。

2.3 嗜热毁丝霉转化子验证

1）基因组提取

采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组DNA，具体方法与实施例1中所述相同。

2)PCR验证嗜热毁丝霉转化子

以提取的基因组DNA为模版，用引物laeAM_orf-F和laeAM_orf-R对转化子进行基因PCR验证，Donor-laeAM质粒为阳性对照，嗜热毁丝霉WT-KOlaeA基因组为阴性对照。对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳（120V电压，20分钟），在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在引物laeAM_orf-F和laeAM_orf-R引导下经PCR扩增获得了单一目的条带，大小与阳性对照质粒片段相同，表明laeAM1、laeAM2和laeAM3分别导入至菌株KolaeA中，分别获得菌株wt-laeAM1、wt-laeAM2和wt-laeAM3。

3. 嗜热毁丝霉转化子生长表型测定

1）菌株糖耗速率测定

菌株糖耗速率测定方法与实施例1中所述相同，结果如图7，菌株wt-laeAM1、wt-laeAM2和wt-laeAM3对底物葡萄糖的消耗速度与突变体KoLaeA相似，均显著高于野生型菌株，消耗同样葡萄糖，突变体菌种所用时间显著缩短。

2）葡萄糖条件下菌株生物量合成

菌株生物量合成测定方法与实施例2中所述相同，结果如图8，三种突变株在葡萄糖摇瓶中生物量积累均增加，在48小时，wt-laeAM1菌株生物量达到8g/L，wt-laeAM2菌株生物量达到6.4g/L，wt-laeAM3菌株生物量达到7.8g/L，均显著高于野生型菌株（4.95g/L）。

3）蔗糖条件下的生物量合成

在2%（W/V）蔗糖摇瓶中测定菌株的生物量积累，方法与实施例4中所述相同。结果如图9，WT-laeAM菌株生物量平均达到4.91g/L，相比野生型菌株（3.53g/L）提高39.1%。

综合可知，LaeA蛋白的第88位至第175位氨基酸，第89至第96位氨基酸，以及第89位和第90位氨基酸均为其行使功能的关键区域，对三个区域进行删除或替换后均表现为LaeA突变菌株的表型，与敲除整个ORF表型是相同的。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种促进宿主细胞生长速率及其底物利用的方法及应用

<160> 43

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 1

atgtcttccg ctgattcggc cgtggcaatg gactccgagc cttatagagg ccaccttacc 60

aacggagtgt cgcagaatcg cacctaccaa gaagtctatg ccgaaaacgg ccgctggtac 120

ggtacgttca aaaagggaaa gtacatgttt cccatcgacg aaaccgaact ggagaggctc 180

gacgtcttcc acaaaatctt cctcgttgca cgccaggagg ccactcacag tgcccccttc 240

cccaaccaag aaacccctca catcttggac ctgggctgtg gcacagggat ctggggcatt 300

gacatggcag ataaatatcc cggtggtgtc catgttggcg tcgacctcaa ctacattcag 360

cctgaattca ttcccgccaa catgcgcttc ttgcaaaagg atatcgagga caggtggcag 420

gacttggacc cgggcacgtg ggacctgatc catatgcgct gtctcatggg cagtatcagc 480

aattggcctc gggtatacgc cgagatttac aggcatctga agccgtacta cggctacttt 540

gagcaagtcg agatcgactg gaccccgcgc tgtgacgatg gctcgctgcc gcggaacggc 600

tacctcgtgc agtgggcaac ccagctcatg gatgtcatgg acagctttgg ccgccctatg 660

cgctttaata gcaacaccat caagcagcaa ctagccgatg ccgggttcga cgacatcaag 720

gaagagatta ttcagttgcc cgtcaatggc tggcctattg acacacacgg caaagccctt 780

ggtcgttggt tcaacctagg gattcggcaa gccctccagc cacttagctt ggcgcctttg 840

tgtcgaggcc ttggccggac cccagcagag gtacaggagc tggctgaaaa taccaagcat 900

gaagtgttca gcaacagcgt gcgcgcctac tgcacgttac acatctttac cgccagaaag 960

ccacggtga 969

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 2

Met Ser Ser Ala Asp Ser Ala Val Ala Met Asp Ser Glu Pro Tyr Arg

1 5 10 15

Gly His Leu Thr Asn Gly Val Ser Gln Asn Arg Thr Tyr Gln Glu Val

20 25 30

Tyr Ala Glu Asn Gly Arg Trp Tyr Gly Thr Phe Lys Lys Gly Lys Tyr

35 40 45

Met Phe Pro Ile Asp Glu Thr Glu Leu Glu Arg Leu Asp Val Phe His

50 55 60

Lys Ile Phe Leu Val Ala Arg Gln Glu Ala Thr His Ser Ala Pro Phe

65 70 75 80

Pro Asn Gln Glu Thr Pro His Ile Leu Asp Leu Gly Cys Gly Thr Gly

85 90 95

Ile Trp Gly Ile Asp Met Ala Asp Lys Tyr Pro Gly Gly Val His Val

100 105 110

Gly Val Asp Leu Asn Tyr Ile Gln Pro Glu Phe Ile Pro Ala Asn Met

115 120 125

Arg Phe Leu Gln Lys Asp Ile Glu Asp Arg Trp Gln Asp Leu Asp Pro

130 135 140

Gly Thr Trp Asp Leu Ile His Met Arg Cys Leu Met Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Asn Trp Pro Arg Val Tyr Ala Glu Ile Tyr Arg His Leu Lys Pro Tyr

165 170 175

Tyr Gly Tyr Phe Glu Gln Val Glu Ile Asp Trp Thr Pro Arg Cys Asp

180 185 190

Asp Gly Ser Leu Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Val Gln Trp Ala Thr Gln

195 200 205

Leu Met Asp Val Met Asp Ser Phe Gly Arg Pro Met Arg Phe Asn Ser

210 215 220

Asn Thr Ile Lys Gln Gln Leu Ala Asp Ala Gly Phe Asp Asp Ile Lys

225 230 235 240

Glu Glu Ile Ile Gln Leu Pro Val Asn Gly Trp Pro Ile Asp Thr His

245 250 255

Gly Lys Ala Leu Gly Arg Trp Phe Asn Leu Gly Ile Arg Gln Ala Leu

260 265 270

Gln Pro Leu Ser Leu Ala Pro Leu Cys Arg Gly Leu Gly Arg Thr Pro

275 280 285

Ala Glu Val Gln Glu Leu Ala Glu Asn Thr Lys His Glu Val Phe Ser

290 295 300

Asn Ser Val Arg Ala Tyr Cys Thr Leu His Ile Phe Thr Ala Arg Lys

305 310 315 320

Pro Arg

<210> 3

<211> 565

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 3

aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60

tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120

attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180

cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240

gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300

agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360

tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420

cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgccgaa aacggccgct 480

ggtagtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540

aagtggcacc gagtcggtgc ttttt 565

<210> 4

<211> 3099

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 4

acagcttata cctcttatct cgcatttctg tgcggactac agtacgcgca catctacagg 60

cgaccctccg tactgcctcg tgcatttgta cggtaacgct gattcttttt tcctcttttt 120

gcatttccct gccgagaccc tggctctgca tcattgcgac gtcgaggatt ttaaaggccc 180

ccccccctgc cgcttcctct ccccaaacag cagcataacc gaacgagggc gttgttggcc 240

caaggccgcc ggcatcgacc gcatcgacca catcgaccgt aatttttagc tgcaaccgcg 300

ctctgctaat tgttatataa cgcgctagct ggccaactct gcgaccacgt cgaatgccgg 360

ccgcgcctgc caccgacccg taaagcatca cgccgggcgt tacaagttct caggtgagca 420

attgttgccc tcgtcgattg ttttcctctc ttcgcactcc ggggtcccta acaggtctcg 480

tggtccacgg gtgtgcggga tcccggcttc gaccttcgcc agtcctcgtc tcatgtgttc 540

tacttttcct tctcccctcc ccaccttcac gccgtcctct tcgccttcct gaactgccaa 600

tccactctgc ggttagtcac ggcgtcttgt ctcttccatc cctttcccat cccgtgtcat 660

tggctacgtc ctttacacct gtttcgttct cccttggtca cgctgcttgg ccccgcctct 720

gtgacattat acattattta attgttcact caactcctgg agcctaacat cagttctcgt 780

tatagtctgc ggttcgtcct cgcgagccag aaccgccact tctagttgtt catgaacggc 840

tcgtccgtgc cgaaacaatg tcttccgctg attcggccgt ggcaatggac tccgagcctt 900

atagaggcca cctgtgagtt cagcccagcc gacatggcga tgaaacacgc gatttgaagc 960

tgactgtggt caccctccct gcagtaccaa cggagtgtcg cagaatcgca cctaccaaga 1020

agtctaacga cgttaactga tattgaagga gcattttttg ggcttggctg gagctagtgg 1080

aggtcaacaa tgaatgccta ttttggttta gtcgtccagg cggtgagcac aaaatttgtg 1140

tcgtttgaca agatggttca tttaggcaac tggtcagatc agccccactt gtagcagtag 1200

cggcggcgct cgaagtgtga ctcttattag cagacaggaa cgaggacatt attatcatct 1260

gctgcttggt gcacgataac ttggtgcgtt tgtcaagcaa ggtaagtgga cgacccggtc 1320

ataccttctt aagttcgccc ttcctccctt tatttcagat tcaatctgac ttacctattc 1380

tacccaagca tccaaatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg 1440

gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 1500

gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 1560

gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 1620

ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 1680

gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 1740

atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 1800

caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 1860

gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 1920

gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 1980

atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 2040

gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 2100

tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 2160

ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gctaacatcg tcttacccct tgagcagtaa 2220

atatcccggt ggtgtccatg ttggcgtcga cctcaactac attcagcctg aattgtgagt 2280

gccacccgtg agtcggccct cacgccgtgc tgctcacaca tcctagcatt cccgccaaca 2340

tgcgcttctt gcaaaaggat atcgaggaca ggtggcagga cttggacccg ggcacgtggg 2400

acctgatcca tatgcgctgt ctcatgggca gtatcagcaa ttggcctcgg gtatacgccg 2460

agatttacag gtaggtcgag cctcgtcgct catccggagc gacaggaaac actgctgact 2520

gaccatctct aaggcatctg aagccgtact acggctactt tgagcaagtc gagatcgact 2580

ggaccccgcg ctgtgacgat ggctcgctgc cgcggaacgg ctacctcgtg cagtgggcaa 2640

cccagctcat ggatgtcatg gacagctttg gccgccctat gcgctttaat agcaacacca 2700

tcaagcagca actagccgat gccgggttcg acgacatcaa ggaagagatt attcagttgc 2760

ccgtcaatgg ctggcctatt gacacacacg gcaaagccct tggtcgttgg ttcaacctag 2820

ggattcggca agccctccag ccacttagct tggcgccttt gtgtcgaggc cttggccgga 2880

ccccagcaga ggtacaggag ctggctgaaa ataccaagca tgaagtgttc agcaacagcg 2940

tgcgcgccta ctgcacgttg taagtgccat tgcgtgttgt gattctttct tcagcgtaat 3000

tcttgcgagg ttacttggct gaccggcttc agacacatct ttaccgccag aaagccacgg 3060

tgagtcctgg cctgttgttg ctgtcatgga ttactctgc 3099

<210> 5

<211> 6163

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 5

tcctccgagg ttcgacatca gggttcgtca tagggagtga aacacccgcc atgattccgt 60

agccgcgcgc gaagatacga agcagatatt tcacggacat ggcggagata cttgtttccc 120

gtactaaggt agtcatgtcg gagacatctg aacgacagag ctggccaaga gaaccgacca 180

gttgccccag gacgatctag acaaaaaaaa agagagatga gtgggccact tttgccacaa 240

catcgacggc cctgcgaccg cccccaggca aacaaacaaa ccgccgaaca ataatacttt 300

tgtcatttta ggaggagcgt tgtatggata aaaacaacat ctcgttgctg cagaatgtgg 360

acttcaaact tgcagaaaat gggaggcgga tttgcatgat cggagggtag ttgactcacg 420

ccgcaggctg caaatccgtc ctccattatt ccatgaacaa cttcgtaagg ttgggctgag 480

cgccaatgcc taacggaccg ggggccacag cgcaacgtcc cacttaaagg ccagcgtgac 540

atgccagttc cataccaagt agtggcacca gaggcggcca atgctcagta agggcaggga 600

gggaggctca aacgattggc aaaaagaggg gcttgccagt tcagttccct gtgcgagcgc 660

gagaggggca gtttcaaatc tggaggggtg tgttgcgctg gtctgaagag aaagagaaga 720

ctgtacttaa taattgttca aagagtccat catcgcgttg cggactcctc tagctgtatt 780

tagagcccta tcattacttg tcgggtgcga atcaaaatac cgggatgcag ccctctggcg 840

atttgcatgc ggttgtggag gaagtgaagc ctgaatcgcg gggctgggcg gcaaagcacg 900

acgtgaaatt cctggcgaaa ttcgagggct tgccccaccg tggttgaagt ttttgtgctg 960

cgtaacccca ccaacccgcc ttgcccctcc cgcctgccca taaaaacttc gacccctcct 1020

caaatcttct tcgattcttc ctcttcactt ccttcgtcgg catacctgat tcaagcaatc 1080

acctgccact ttcaagtgcg tataccatca tcgatacact ggttcttgac aagtacatcg 1140

tctctaactt tcctttttgc agttttcatt aagcgcaagt cgccagtttc gttcttcaga 1200

aagcttatgg actacaagga ccatgatggc gattacaagg accacgacat cgattataag 1260

gatgatgatg acaagcctcc gaggaaacgt gccaaaacag aagatgagat ggataagaag 1320

tactccatcg gcctcgacat cggcaccaac tccgtcggct gggccgtcat caccgatgag 1380

tacaaggtcc cttccaagaa gttcaaggtc ctcggcaaca ccgatcgcca ttccatcaag 1440

aagaacctga tcggcgccct cctgttcgat tccggcgaaa ccgccgaggc cacccgcctt 1500

aaacgcaccg cccgtcgccg ctacacccgc cgcaagaacc gcatctgcta cctccaagaa 1560

atcttctcca acgagatggc caaggtcgat gatagcttct tccaccgcct cgaagagtcc 1620

ttcctggtcg aagaggataa gaagcacgag cgccatccta tcttcggcaa catcgtcgat 1680

gaggtcgcct accatgagaa gtaccctacc atctaccatc tccgcaagaa gctcgtcgat 1740

tccaccgata aggccgatct ccgcctcatc tacctcgccc tcgcccatat gatcaagttc 1800

cgcggccatt tcctcatcga gggcgatctc aaccctgata actccgatgt cgataagctg 1860

ttcatccagc tcgtccagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccctat caacgcctcc 1920

ggcgtcgatg ccaaggccat cctctccgct cgcctctcca agtctcgccg ccttgagaac 1980

cttatcgccc agctccctgg cgagaagaag aacggcctct tcggcaacct gatcgccctc 2040

tccctcggcc tcacccctaa cttcaagtcc aacttcgatc tcgccgagga tgccaagctc 2100

cagctctcca aggataccta cgatgatgat ctcgataacc tcctcgccca gatcggcgat 2160

cagtacgccg atctgttcct cgccgccaag aacctctccg atgccatcct cctctccgac 2220

atcctccgcg tcaacaccga gatcaccaag gcccctctgt ccgcctccat gatcaagcgc 2280

tacgatgagc atcatcagga cctcaccctg ctcaaggccc tcgtccgcca gcagctccct 2340

gagaagtaca aagagatttt cttcgatcag tccaagaacg gctacgccgg ctacatcgat 2400

ggcggcgctt cccaagaaga gttctacaag ttcatcaagc ctatccttga gaagatggat 2460

ggcaccgagg aactcctcgt caagctcaac cgcgaggacc tcctccgcaa gcagcgcacc 2520

ttcgataacg gctccatccc tcatcaaatc catctcggcg agctgcatgc catcttgcgc 2580

cgccaagagg atttctaccc attcctcaag gataaccgcg agaagatcga aaagattctc 2640

accttccgca tcccttacta cgtcggccct ctcgctcgcg gcaactcccg cttcgcctgg 2700

atgacccgca agtccgagga aaccatcacc ccttggaact tcgaggaagt cgtcgataag 2760

ggcgcctccg cccagtcctt catcgagcgc atgaccaact tcgataagaa cctccctaac 2820

gagaaggtcc tccctaagca ctccctgctc tacgagtact tcaccgtcta caacgagctg 2880

accaaggtca agtacgtcac cgagggtatg cgcaagcctg ccttcctgtc cggcgagcag 2940

aagaaggcca tcgtcgatct gctgttcaag accaaccgca aggtcaccgt caagcagctc 3000

aaagaggatt acttcaagaa aatcgagtgc ttcgattccg tcgagatcag cggcgtcgag 3060

gaccgcttca acgcctccct cggaacctac catgatctcc tcaagattat caaggataag 3120

gatttcctcg acaacgagga aaacgaggac atccttgagg acatcgtcct caccctcacc 3180

ctcttcgagg accgcgaaat gatcgaggaa cgcctcaaga cctacgccca tctcttcgat 3240

gataaggtca tgaagcagct caagcgccgt cgctacaccg gctggggtcg cctctcccgc 3300

aagctcatca acggcatccg cgataagcag tccggcaaga ctatcctcga tttcctcaag 3360

tccgatggct tcgccaaccg caacttcatg cagctcatcc atgatgattc cctcaccttc 3420

aaagaggaca tccagaaggc ccaggtcagc ggccagggcg attccctcca tgagcatatc 3480

gccaacctcg ccggctcccc tgccatcaag aagggcatcc tccagaccgt caaggtcgtc 3540

gatgagctgg tcaaggtcat gggccgccat aagcctgaga acatcgtcat cgagatggcc 3600

cgcgagaacc agaccaccca gaagggccag aagaactccc gcgagcgcat gaagcgcatc 3660

gaggaaggca tcaaagagct gggcagccaa atcctcaaag agcatcctgt cgagaacacc 3720

cagctccaga acgagaagct ctacctctac tacctccaga acggccgcga tatgtacgtc 3780

gatcaagagc tggacatcaa ccgcctctcc gattacgatg tcgatcatat cgtccctcag 3840

tccttcctga aggatgattc catcgataac aaggtcctca cccgctccga taagaaccgc 3900

ggcaagtccg ataacgtccc ttccgaagag gtcgtcaaga agatgaagaa ctactggcgc 3960

cagctcctca acgccaagct catcacccag cgcaagttcg ataacctcac caaggccgag 4020

cgcggtggcc tctccgagct ggataaggcc ggcttcatca agcgccagct cgtcgaaacc 4080

cgccagatca ccaagcacgt cgcccaaatc ctcgattccc gcatgaacac caagtacgat 4140

gagaacgata agctcatccg cgaagtcaag gtcatcaccc tcaagtccaa gctcgtcagc 4200

gatttccgca aggatttcca gttctacaag gtccgcgaga tcaacaacta ccatcatgcc 4260

catgatgcct acctcaacgc cgtcgtcggc accgccctca tcaagaagta ccccaagctc 4320

gaatccgagt tcgtctacgg tgattacaag gtctacgatg tccgcaagat gatcgccaag 4380

tccgagcaag agatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctactccaa catcatgaat 4440

ttcttcaaga ccgaaatcac cctcgccaac ggcgaaatcc gcaagcgccc tctcatcgag 4500

actaacggcg agactggcga gatcgtctgg gataagggcc gcgatttcgc caccgtccgc 4560

aaggtcctct ccatgcctca ggtcaacatc gtcaagaaaa ccgaggtcca gaccggcggc 4620

ttctccaaag agtccatcct ccccaagcgc aactccgata agctgatcgc ccgcaagaag 4680

gattgggacc ctaagaagta cggcggcttc gattccccta ccgtcgccta ctccgtcctc 4740

gtcgtcgcca aggtcgagaa gggcaagtcc aagaagctca agtccgtcaa agagctgctc 4800

ggcatcacta ttatggaacg ctccagcttc gagaagaacc ctatcgattt ccttgaggcc 4860

aagggctaca aagaggtcaa gaaggacctc atcatcaagc tccccaagta ctccctgttc 4920

gagcttgaga acggccgcaa gcgcatgctc gcctccgccg gtgagcttca gaagggcaac 4980

gagctggccc tgccttccaa gtacgtcaac ttcctctacc tcgcctccca ttacgagaag 5040

ctcaagggct cccctgagga taacgagcag aagcagctgt tcgtcgagca gcataagcac 5100

tacctcgatg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agcgcgtcat cctcgccgat 5160

gccaacctcg ataaggtcct gtccgcctac aacaagcacc gcgataagcc tatccgcgag 5220

caggccgaga acatcatcca tctcttcacc ctcaccaacc tcggtgcccc tgccgccttc 5280

aagtacttcg ataccaccat cgatcgcaag cgctacacct ccaccaaaga ggtcctggac 5340

gccaccctca tccatcagtc catcaccggc ctctacgaaa cccgcatcga tctctcccag 5400

ctcggcggcg accctccgag gaaacgtgcc aaaacagaag atgagtgatg aggatccact 5460

taacgttact gaaatcatca aacagcttga cgaatctgga tataagatcg ttggtgtcga 5520

tgtcagctcc ggagttgaga caaatggtgt tcaggatctc gataagatac gttcatttgt 5580

ccaagcagca aagagtgcct tctagtgatt taatagctcc atgtcaacaa gaataaaacg 5640

cgttttcggg tttacctctt ccagatacag ctcatctgca atgcattaat gcattgactg 5700

caacctagta acgccttnca ggctccggcg aagagaagaa tagcttagca gagctatttt 5760

cattttcggg agacgagatc aagcagatca acggtcgtca agagacctac gagactgagg 5820

aatccgctct tggctccacg cgactatata tttgtctcta attgtacttt gacatgctcc 5880

tcttctttac tctgatagct tgactatgaa aattccgtca ccagcncctg ggttcgcaaa 5940

gataattgca tgtttcttcc ttgaactctc aagcctacag gacacacatt catcgtaggt 6000

ataaacctcg aaatcanttc ctactaagat ggtatacaat agtaaccatg catggttgcc 6060

tagtgaatgc tccgtaacac ccaatacgcc ggccgaaact tttttacaac tctcctatga 6120

gtcgtttacc cagaatgcac aggtacactt gtttagaggg agc 6163

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgtggagtgg gcgcttacac agtacacgag gacttacagc ttatacctct tatctc 56

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gcccaaaaaa tgctccttca atatcagtta acgtcgttag acttcttggt aggtgcga 58

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cgacgttaac tgatattgaa gga 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tcagaagaac tcgtcaagaa 20

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagctaa catcgtctta ccccttg 57

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

agtcatgtga ttgtaatcga ccgacggaat tgaggatgca gagtaatcca tgacagca 58

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tcctccgagg ttcgacatca gggtt 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ctctaaacaa gtgtacctgt gcat 24

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

aggatcggtg gagtgaagtt cggaa 25

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

tctagctcta aaactaccag cggccgtttt cggcgaggaa agaaagaaaa gaag 54

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

cttcttttct ttctttcctc gccgaaaacg gccgctggta gttttagagc tagaaatag 59

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

aaaaagcacc gactcggtgc c 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ttatagaggc cacctgtgag tt 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ctcacgggtg gcactcacaa 20

<210> 20

<211> 235

<212> PRT

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 20

Met Ser Ser Ala Asp Ser Ala Val Ala Met Asp Ser Glu Pro Tyr Arg

1 5 10 15

Gly His Leu Thr Asn Gly Val Ser Gln Asn Arg Thr Tyr Gln Glu Val

20 25 30

Tyr Ala Glu Asn Gly Arg Trp Tyr Gly Thr Phe Lys Lys Gly Lys Tyr

35 40 45

Met Phe Pro Ile Asp Glu Thr Glu Leu Glu Arg Leu Asp Val Phe His

50 55 60

Lys Ile Phe Leu Val Ala Arg Gln Glu Ala Thr His Ser Ala Pro Phe

65 70 75 80

Pro Asn Gln Glu Thr Pro His Ile Tyr Tyr Gly Tyr Phe Glu Gln Val

85 90 95

Glu Ile Asp Trp Thr Pro Arg Cys Asp Asp Gly Ser Leu Pro Arg Asn

100 105 110

Gly Tyr Leu Val Gln Trp Ala Thr Gln Leu Met Asp Val Met Asp Ser

115 120 125

Phe Gly Arg Pro Met Arg Phe Asn Ser Asn Thr Ile Lys Gln Gln Leu

130 135 140

Ala Asp Ala Gly Phe Asp Asp Ile Lys Glu Glu Ile Ile Gln Leu Pro

145 150 155 160

Val Asn Gly Trp Pro Ile Asp Thr His Gly Lys Ala Leu Gly Arg Trp

165 170 175

Phe Asn Leu Gly Ile Arg Gln Ala Leu Gln Pro Leu Ser Leu Ala Pro

180 185 190

Leu Cys Arg Gly Leu Gly Arg Thr Pro Ala Glu Val Gln Glu Leu Ala

195 200 205

Glu Asn Thr Lys His Glu Val Phe Ser Asn Ser Val Arg Ala Tyr Cys

210 215 220

Thr Leu His Ile Phe Thr Ala Arg Lys Pro Arg

225 230 235

<210> 21

<211> 708

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 21

atgtcttccg ctgattcggc cgtggcaatg gactccgagc cttatagagg ccaccttacc 60

aacggagtgt cgcagaatcg cacctaccaa gaagtctatg ccgaaaacgg ccgctggtac 120

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gacgtcttcc acaaaatctt cctcgttgca cgccaggagg ccactcacag tgcccccttc 240

cccaaccaag aaacccctca catctactac ggctactttg agcaagtcga gatcgactgg 300

accccgcgct gtgacgatgg ctcgctgccg cggaacggct acctcgtgca gtgggcaacc 360

cagctcatgg atgtcatgga cagctttggc cgccctatgc gctttaatag caacaccatc 420

aagcagcaac tagccgatgc cgggttcgac gacatcaagg aagagattat tcagttgccc 480

gtcaatggct ggcctattga cacacacggc aaagcccttg gtcgttggtt caacctaggg 540

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ccagcagagg tacaggagct ggctgaaaat accaagcatg aagtgttcag caacagcgtg 660

cgcgcctact gcacgttaca catctttacc gccagaaagc cacggtga 708

<210> 22

<211> 314

<212> PRT

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 22

Met Ser Ser Ala Asp Ser Ala Val Ala Met Asp Ser Glu Pro Tyr Arg

1 5 10 15

Gly His Leu Thr Asn Gly Val Ser Gln Asn Arg Thr Tyr Gln Glu Val

20 25 30

Tyr Ala Glu Asn Gly Arg Trp Tyr Gly Thr Phe Lys Lys Gly Lys Tyr

35 40 45

Met Phe Pro Ile Asp Glu Thr Glu Leu Glu Arg Leu Asp Val Phe His

50 55 60

Lys Ile Phe Leu Val Ala Arg Gln Glu Ala Thr His Ser Ala Pro Phe

65 70 75 80

Pro Asn Gln Glu Thr Pro His Ile Ile Trp Gly Ile Asp Met Ala Asp

85 90 95

Lys Tyr Pro Gly Gly Val His Val Gly Val Asp Leu Asn Tyr Ile Gln

100 105 110

Pro Glu Phe Ile Pro Ala Asn Met Arg Phe Leu Gln Lys Asp Ile Glu

115 120 125

Asp Arg Trp Gln Asp Leu Asp Pro Gly Thr Trp Asp Leu Ile His Met

130 135 140

Arg Cys Leu Met Gly Ser Ile Ser Asn Trp Pro Arg Val Tyr Ala Glu

145 150 155 160

Ile Tyr Arg His Leu Lys Pro Tyr Tyr Gly Tyr Phe Glu Gln Val Glu

165 170 175

Ile Asp Trp Thr Pro Arg Cys Asp Asp Gly Ser Leu Pro Arg Asn Gly

180 185 190

Tyr Leu Val Gln Trp Ala Thr Gln Leu Met Asp Val Met Asp Ser Phe

195 200 205

Gly Arg Pro Met Arg Phe Asn Ser Asn Thr Ile Lys Gln Gln Leu Ala

210 215 220

Asp Ala Gly Phe Asp Asp Ile Lys Glu Glu Ile Ile Gln Leu Pro Val

225 230 235 240

Asn Gly Trp Pro Ile Asp Thr His Gly Lys Ala Leu Gly Arg Trp Phe

245 250 255

Asn Leu Gly Ile Arg Gln Ala Leu Gln Pro Leu Ser Leu Ala Pro Leu

260 265 270

Cys Arg Gly Leu Gly Arg Thr Pro Ala Glu Val Gln Glu Leu Ala Glu

275 280 285

Asn Thr Lys His Glu Val Phe Ser Asn Ser Val Arg Ala Tyr Cys Thr

290 295 300

Leu His Ile Phe Thr Ala Arg Lys Pro Arg

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<210> 23

<211> 945

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 23

atgtcttccg ctgattcggc cgtggcaatg gactccgagc cttatagagg ccaccttacc 60

aacggagtgt cgcagaatcg cacctaccaa gaagtctatg ccgaaaacgg ccgctggtac 120

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cccaaccaag aaacccctca catcatctgg ggcattgaca tggcagataa atatcccggt 300

ggtgtccatg ttggcgtcga cctcaactac attcagcctg aattcattcc cgccaacatg 360

cgcttcttgc aaaaggatat cgaggacagg tggcaggact tggacccggg cacgtgggac 420

ctgatccata tgcgctgtct catgggcagt atcagcaatt ggcctcgggt atacgccgag 480

atttacaggc atctgaagcc gtactacggc tactttgagc aagtcgagat cgactggacc 540

ccgcgctgtg acgatggctc gctgccgcgg aacggctacc tcgtgcagtg ggcaacccag 600

ctcatggatg tcatggacag ctttggccgc cctatgcgct ttaatagcaa caccatcaag 660

cagcaactag ccgatgccgg gttcgacgac atcaaggaag agattattca gttgcccgtc 720

aatggctggc ctattgacac acacggcaaa gcccttggtc gttggttcaa cctagggatt 780

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<210> 24

<211> 322

<212> PRT

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 24

Met Ser Ser Ala Asp Ser Ala Val Ala Met Asp Ser Glu Pro Tyr Arg

1 5 10 15

Gly His Leu Thr Asn Gly Val Ser Gln Asn Arg Thr Tyr Gln Glu Val

20 25 30

Tyr Ala Glu Asn Gly Arg Trp Tyr Gly Thr Phe Lys Lys Gly Lys Tyr

35 40 45

Met Phe Pro Ile Asp Glu Thr Glu Leu Glu Arg Leu Asp Val Phe His

50 55 60

Lys Ile Phe Leu Val Ala Arg Gln Glu Ala Thr His Ser Ala Pro Phe

65 70 75 80

Pro Asn Gln Glu Thr Pro His Ile Gly Gly Leu Gly Cys Gly Thr Gly

85 90 95

Ile Trp Gly Ile Asp Met Ala Asp Lys Tyr Pro Gly Gly Val His Val

100 105 110

Gly Val Asp Leu Asn Tyr Ile Gln Pro Glu Phe Ile Pro Ala Asn Met

115 120 125

Arg Phe Leu Gln Lys Asp Ile Glu Asp Arg Trp Gln Asp Leu Asp Pro

130 135 140

Gly Thr Trp Asp Leu Ile His Met Arg Cys Leu Met Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Asn Trp Pro Arg Val Tyr Ala Glu Ile Tyr Arg His Leu Lys Pro Tyr

165 170 175

Tyr Gly Tyr Phe Glu Gln Val Glu Ile Asp Trp Thr Pro Arg Cys Asp

180 185 190

Asp Gly Ser Leu Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Val Gln Trp Ala Thr Gln

195 200 205

Leu Met Asp Val Met Asp Ser Phe Gly Arg Pro Met Arg Phe Asn Ser

210 215 220

Asn Thr Ile Lys Gln Gln Leu Ala Asp Ala Gly Phe Asp Asp Ile Lys

225 230 235 240

Glu Glu Ile Ile Gln Leu Pro Val Asn Gly Trp Pro Ile Asp Thr His

245 250 255

Gly Lys Ala Leu Gly Arg Trp Phe Asn Leu Gly Ile Arg Gln Ala Leu

260 265 270

Gln Pro Leu Ser Leu Ala Pro Leu Cys Arg Gly Leu Gly Arg Thr Pro

275 280 285

Ala Glu Val Gln Glu Leu Ala Glu Asn Thr Lys His Glu Val Phe Ser

290 295 300

Asn Ser Val Arg Ala Tyr Cys Thr Leu His Ile Phe Thr Ala Arg Lys

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Pro Arg

<210> 25

<211> 975

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 25

atgtcttccg ctgattcggc cgtggcaatg gactccgagc cttatagagg ccaccttacc 60

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gacgtcttcc acaaaatctt cctcgttgca cgccaggagg ccactcacag tgcccccttc 240

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attcagcctg aattcattcc cgccaacatg cgcttcttgc aaaaggatat cgaggacagg 420

tggcaggact tggacccggg cacgtgggac ctgatccata tgcgctgtct catgggcagt 480

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aacggctacc tcgtgcagtg ggcaacccag ctcatggatg tcatggacag ctttggccgc 660

cctatgcgct ttaatagcaa caccatcaag cagcaactag ccgatgccgg gttcgacgac 720

atcaaggaag agattattca gttgcccgtc aatggctggc ctattgacac acacggcaaa 780

gcccttggtc gttggttcaa cctagggatt cggcaagccc tccagccact tagcttggcg 840

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aagcatgaag tgttcagcaa cagcgtgcgc gcctactgca cgttacacat ctttaccgcc 960

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<210> 26

<211> 565

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 26

aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60

tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120

attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180

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aagtggcacc gagtcggtgc ttttt 565

<210> 27

<211> 4116

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 27

cgacgttatc tgatattgaa ggagcatttt ttgggcttgg ctggagctag tggaggtcaa 60

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gctcgaagtg tgactcttat tagcagacag gaacggggac attattatca tctgctgctt 240

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cttaagttcg cccttcctcc ctttatttca gattcaatct gacttaccta ttctacccaa 360

gcatccaaat gagcccagaa cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc gaggcggaca 420

tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc aacttccgta 480

ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg gagcgctatc 540

cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg ggcccctgga 600

aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc ccccgccacc 660

agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct gaagtccctg gaggcacagg 720

gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga cccgagtgtg cgcatgcacg 780

aggcgctcgg atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag cacgggaact 840

ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc cgtccggtcc 900

tgcccgtcac cgagatttga catgtacctt gacgtcctcc gaggttcgac atcagggttc 960

gtcataggga gtgaaacacc cgccatgatt ccgtagccgc gcgcgaagat acgaagcaga 1020

tatttcacgg acatggcgga gatacttgtt tcccgtacta aggtagtcat gtcggagaca 1080

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tattccatga acaacttcgt aaggttgggc tgagcgccaa tgcctaacgg accgggggcc 1440

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accagaggcg gccaatgctc agtaagggca gggagggagg ctcaaacgat tggcaaaaag 1560

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atcatcgata cactggttct tgacaagtac atcgtctcta actttccttt ttgcagtttt 2100

cattaagcgc aagtcgccag tttcgttctt cagaatgtct tccgctgatt cggccgtggc 2160

aatggactcc gagccttata gaggccacct taccaacgga gtgtcgcaga atcgcaccta 2220

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cgacgacatc aaggaagaga ttattcagtt gcccgtcaat ggctggccta ttgacacaca 2640

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aaataccaag catgaagtgt tcagcaacag cgtgcgcgcc tactgcacgt tacacatctt 2820

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tgctcctccg acacaaggcc agacctggtt cgccggcgaa tcacgggact tccgtttttc 3000

tagaatttca ctttctgctg gcttgttgga gaccatacac cacccggaac gaccggggac 3060

ggcagcccca tagccgatca tccggctgcc ctcccccccc ccctcaaccc cttctccccc 3120

ctcaccccca ccccgggggg tacttgtttg gaacgcaccc tgtctcagct gaagaggaac 3180

tgcaatctgc gacaccagag tggacaaccc tccagcactc gctgcttttc cgttgccatg 3240

tcaaccccgc ggccatggga cagcaaggac ggcaacccgt ttcttcataa ctacatcccg 3300

ccaaattcgt tggttacctc tctataatgt taagctcgtc ttcttctctc ccctcaaagt 3360

gtgcggggtt tgcgacatgg aggacagaca ggaagagcat ttggatcgac cccaaagcag 3420

cgtgtgcggt ggcaagttac tgggctcagt gcaaccggag ctttggtgtc atcggacaca 3480

tcagagctac tctatatctt gctgcagttg gcaattcaat catgcggcca tgcaactcaa 3540

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ccccaccagc caccgcagag ttatctgaac atgccaaccc gacgtctacg cagtcaccga 3660

tgctgccccc gccttacccc caccacgacg aaggctggaa gtgagaagcc cggctacggt 3720

ttcgaaatta gcacggccgg gggggggggg gggggttcac cccttgatgg tgtgtcggca 3780

gtccttaatg ggatattggg taatggggag ctatcaaggt tgtgttgtac atacatctcg 3840

gtctcgggtc cggatggcct accctgtcca ccttcccccg tccaagaagc aaccttggca 3900

tcttagctaa ctcggttggc acttcgcgat ccccatttca tgtatatagc ccaaagggaa 3960

ggaaaaaaaa aggaagatct caaaggctgc tatgtatcaa ccgttctcgt gggctgttcg 4020

ctattccctg gttttcgatg ctcagttcag ggcgtcgctt gggagtatct tggtttcctc 4080

tcttttacca tgatgttcta attctcttta cagcag 4116

<210> 28

<211> 4353

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 28

cgacgttatc tgatattgaa ggagcatttt ttgggcttgg ctggagctag tggaggtcaa 60

caatgaatgc ctattttggt ttagtcgtcc aggcggtgag cacaaaattt gtgtcgtttg 120

acaagatggt tcatttaggc aactggtcag atcagcccca cttgtagcag tagcggcggc 180

gctcgaagtg tgactcttat tagcagacag gaacggggac attattatca tctgctgctt 240

ggtgcacgat aacttggtgc gtttgtcaag caaggtaagt ggacgacccg gtcatacctt 300

cttaagttcg cccttcctcc ctttatttca gattcaatct gacttaccta ttctacccaa 360

gcatccaaat gagcccagaa cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc gaggcggaca 420

tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc aacttccgta 480

ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg gagcgctatc 540

cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg ggcccctgga 600

aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc ccccgccacc 660

agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct gaagtccctg gaggcacagg 720

gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga cccgagtgtg cgcatgcacg 780

aggcgctcgg atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag cacgggaact 840

ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc cgtccggtcc 900

tgcccgtcac cgagatttga catgtacctt gacgtcctcc gaggttcgac atcagggttc 960

gtcataggga gtgaaacacc cgccatgatt ccgtagccgc gcgcgaagat acgaagcaga 1020

tatttcacgg acatggcgga gatacttgtt tcccgtacta aggtagtcat gtcggagaca 1080

tctgaacgac agagctggcc aagagaaccg accagttgcc ccaggacgat ctagacaaaa 1140

aaaaagagag atgagtgggc cacttttgcc acaacatcga cggccctgcg accgccccca 1200

ggcaaacaaa caaaccgccg aacaataata cttttgtcat tttaggagga gcgttgtatg 1260

gataaaaaca acatctcgtt gctgcagaat gtggacttca aacttgcaga aaatgggagg 1320

cggatttgca tgatcggagg gtagttgact cacgccgcag gctgcaaatc cgtcctccat 1380

tattccatga acaacttcgt aaggttgggc tgagcgccaa tgcctaacgg accgggggcc 1440

acagcgcaac gtcccactta aaggccagcg tgacatgcca gttccatacc aagtagtggc 1500

accagaggcg gccaatgctc agtaagggca gggagggagg ctcaaacgat tggcaaaaag 1560

aggggcttgc cagttcagtt ccctgtgcga gcgcgagagg ggcagtttca aatctggagg 1620

ggtgtgttgc gctggtctga agagaaagag aagactgtac ttaataattg ttcaaagagt 1680

ccatcatcgc gttgcggact cctctagctg tatttagagc cctatcatta cttgtcgggt 1740

gcgaatcaaa ataccgggat gcagccctct ggcgatttgc atgcggttgt ggaggaagtg 1800

aagcctgaat cgcggggctg ggcggcaaag cacgacgtga aattcctggc gaaattcgag 1860

ggcttgcccc accgtggttg aagtttttgt gctgcgtaac cccaccaacc cgccttgccc 1920

ctcccgcctg cccataaaaa cttcgacccc tcctcaaatc ttcttcgatt cttcctcttc 1980

acttccttcg tcggcatacc tgattcaagc aatcacctgc cactttcaag tgcgtatacc 2040

atcatcgata cactggttct tgacaagtac atcgtctcta actttccttt ttgcagtttt 2100

cattaagcgc aagtcgccag tttcgttctt cagaatgtct tccgctgatt cggccgtggc 2160

aatggactcc gagccttata gaggccacct taccaacgga gtgtcgcaga atcgcaccta 2220

ccaagaagtc tatgccgaaa acggccgctg gtacggtacg ttcaaaaagg gaaagtacat 2280

gtttcccatc gacgaaaccg aactggagag gctcgacgtc ttccacaaaa tcttcctcgt 2340

tgcacgccag gaggccactc acagtgcccc cttccccaac caagaaaccc ctcacatcat 2400

ctggggcatt gacatggcag ataaatatcc cggtggtgtc catgttggcg tcgacctcaa 2460

ctacattcag cctgaattca ttcccgccaa catgcgcttc ttgcaaaagg atatcgagga 2520

caggtggcag gacttggacc cgggcacgtg ggacctgatc catatgcgct gtctcatggg 2580

cagtatcagc aattggcctc gggtatacgc cgagatttac aggcatctga agccgtacta 2640

cggctacttt gagcaagtcg agatcgactg gaccccgcgc tgtgacgatg gctcgctgcc 2700

gcggaacggc tacctcgtgc agtgggcaac ccagctcatg gatgtcatgg acagctttgg 2760

ccgccctatg cgctttaata gcaacaccat caagcagcaa ctagccgatg ccgggttcga 2820

cgacatcaag gaagagatta ttcagttgcc cgtcaatggc tggcctattg acacacacgg 2880

caaagccctt ggtcgttggt tcaacctagg gattcggcaa gccctccagc cacttagctt 2940

ggcgcctttg tgtcgaggcc ttggccggac cccagcagag gtacaggagc tggctgaaaa 3000

taccaagcat gaagtgttca gcaacagcgt gcgcgcctac tgcacgttac acatctttac 3060

cgccagaaag ccacggtgag tcctggcctg ttgttgctgt catggattac tctgcaggat 3120

cgtggcacgc acaacccagg ccgatggtcg gggcagtagg ccattcggcg tatccgctgc 3180

tcctccgaca caaggccaga cctggttcgc cggcgaatca cgggacttcc gtttttctag 3240

aatttcactt tctgctggct tgttggagac catacaccac ccggaacgac cggggacggc 3300

agccccatag ccgatcatcc ggctgccctc cccccccccc tcaacccctt ctcccccctc 3360

acccccaccc cggggggtac ttgtttggaa cgcaccctgt ctcagctgaa gaggaactgc 3420

aatctgcgac accagagtgg acaaccctcc agcactcgct gcttttccgt tgccatgtca 3480

accccgcggc catgggacag caaggacggc aacccgtttc ttcataacta catcccgcca 3540

aattcgttgg ttacctctct ataatgttaa gctcgtcttc ttctctcccc tcaaagtgtg 3600

cggggtttgc gacatggagg acagacagga agagcatttg gatcgacccc aaagcagcgt 3660

gtgcggtggc aagttactgg gctcagtgca accggagctt tggtgtcatc ggacacatca 3720

gagctactct atatcttgct gcagttggca attcaatcat gcggccatgc aactcaattc 3780

actccgctgc tgcccaggaa atggaggaag ccgattgggg ccccaaagca ggcccggccc 3840

caccagccac cgcagagtta tctgaacatg ccaacccgac gtctacgcag tcaccgatgc 3900

tgcccccgcc ttacccccac cacgacgaag gctggaagtg agaagcccgg ctacggtttc 3960

gaaattagca cggccggggg gggggggggg ggttcacccc ttgatggtgt gtcggcagtc 4020

cttaatggga tattgggtaa tggggagcta tcaaggttgt gttgtacata catctcggtc 4080

tcgggtccgg atggcctacc ctgtccacct tcccccgtcc aagaagcaac cttggcatct 4140

tagctaactc ggttggcact tcgcgatccc catttcatgt atatagccca aagggaagga 4200

aaaaaaaagg aagatctcaa aggctgctat gtatcaaccg ttctcgtggg ctgttcgcta 4260

ttccctggtt ttcgatgctc agttcagggc gtcgcttggg agtatcttgg tttcctctct 4320

tttaccatga tgttctaatt ctctttacag cag 4353

<210> 29

<211> 4377

<212> DNA

<213> Myceliophthora thermophila

<400> 29

cgacgttatc tgatattgaa ggagcatttt ttgggcttgg ctggagctag tggaggtcaa 60

caatgaatgc ctattttggt ttagtcgtcc aggcggtgag cacaaaattt gtgtcgtttg 120

acaagatggt tcatttaggc aactggtcag atcagcccca cttgtagcag tagcggcggc 180

gctcgaagtg tgactcttat tagcagacag gaacggggac attattatca tctgctgctt 240

ggtgcacgat aacttggtgc gtttgtcaag caaggtaagt ggacgacccg gtcatacctt 300

cttaagttcg cccttcctcc ctttatttca gattcaatct gacttaccta ttctacccaa 360

gcatccaaat gagcccagaa cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc gaggcggaca 420

tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc aacttccgta 480

ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg gagcgctatc 540

cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg ggcccctgga 600

aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc ccccgccacc 660

agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct gaagtccctg gaggcacagg 720

gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga cccgagtgtg cgcatgcacg 780

aggcgctcgg atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag cacgggaact 840

ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc cgtccggtcc 900

tgcccgtcac cgagatttga catgtacctt gacgtcctcc gaggttcgac atcagggttc 960

gtcataggga gtgaaacacc cgccatgatt ccgtagccgc gcgcgaagat acgaagcaga 1020

tatttcacgg acatggcgga gatacttgtt tcccgtacta aggtagtcat gtcggagaca 1080

tctgaacgac agagctggcc aagagaaccg accagttgcc ccaggacgat ctagacaaaa 1140

aaaaagagag atgagtgggc cacttttgcc acaacatcga cggccctgcg accgccccca 1200

ggcaaacaaa caaaccgccg aacaataata cttttgtcat tttaggagga gcgttgtatg 1260

gataaaaaca acatctcgtt gctgcagaat gtggacttca aacttgcaga aaatgggagg 1320

cggatttgca tgatcggagg gtagttgact cacgccgcag gctgcaaatc cgtcctccat 1380

tattccatga acaacttcgt aaggttgggc tgagcgccaa tgcctaacgg accgggggcc 1440

acagcgcaac gtcccactta aaggccagcg tgacatgcca gttccatacc aagtagtggc 1500

accagaggcg gccaatgctc agtaagggca gggagggagg ctcaaacgat tggcaaaaag 1560

aggggcttgc cagttcagtt ccctgtgcga gcgcgagagg ggcagtttca aatctggagg 1620

ggtgtgttgc gctggtctga agagaaagag aagactgtac ttaataattg ttcaaagagt 1680

ccatcatcgc gttgcggact cctctagctg tatttagagc cctatcatta cttgtcgggt 1740

gcgaatcaaa ataccgggat gcagccctct ggcgatttgc atgcggttgt ggaggaagtg 1800

aagcctgaat cgcggggctg ggcggcaaag cacgacgtga aattcctggc gaaattcgag 1860

ggcttgcccc accgtggttg aagtttttgt gctgcgtaac cccaccaacc cgccttgccc 1920

ctcccgcctg cccataaaaa cttcgacccc tcctcaaatc ttcttcgatt cttcctcttc 1980

acttccttcg tcggcatacc tgattcaagc aatcacctgc cactttcaag tgcgtatacc 2040

atcatcgata cactggttct tgacaagtac atcgtctcta actttccttt ttgcagtttt 2100

cattaagcgc aagtcgccag tttcgttctt cagaatgtct tccgctgatt cggccgtggc 2160

aatggactcc gagccttata gaggccacct taccaacgga gtgtcgcaga atcgcaccta 2220

ccaagaagtc tatgccgaaa acggccgctg gtacggtacg ttcaaaaagg gaaagtacat 2280

gtttcccatc gacgaaaccg aactggagag gctcgacgtc ttccacaaaa tcttcctcgt 2340

tgcacgccag gaggccactc acagtgcccc cttccccaac caagaaaccc ctcacatcgg 2400

tggactgggc tgtggcacag ggatctgggg cattgacatg gcagataaat atcccggtgg 2460

tgtccatgtt ggcgtcgacc tcaactacat tcagcctgaa ttcattcccg ccaacatgcg 2520

cttcttgcaa aaggatatcg aggacaggtg gcaggacttg gacccgggca cgtgggacct 2580

gatccatatg cgctgtctca tgggcagtat cagcaattgg cctcgggtat acgccgagat 2640

ttacaggcat ctgaagccgt actacggcta ctttgagcaa gtcgagatcg actggacccc 2700

gcgctgtgac gatggctcgc tgccgcggaa cggctacctc gtgcagtggg caacccagct 2760

catggatgtc atggacagct ttggccgccc tatgcgcttt aatagcaaca ccatcaagca 2820

gcaactagcc gatgccgggt tcgacgacat caaggaagag attattcagt tgcccgtcaa 2880

tggctggcct attgacacac acggcaaagc ccttggtcgt tggttcaacc tagggattcg 2940

gcaagccctc cagccactta gcttggcgcc tttgtgtcga ggccttggcc ggaccccagc 3000

agaggtacag gagctggctg aaaataccaa gcatgaagtg ttcagcaaca gcgtgcgcgc 3060

ctactgcacg ttacacatct ttaccgccag aaagccacgg tgagtcctgg cctgttgttg 3120

ctgtcatgga ttactctgca ggatcgtggc acgcacaacc caggccgatg gtcggggcag 3180

taggccattc ggcgtatccg ctgctcctcc gacacaaggc cagacctggt tcgccggcga 3240

atcacgggac ttccgttttt ctagaatttc actttctgct ggcttgttgg agaccataca 3300

ccacccggaa cgaccgggga cggcagcccc atagccgatc atccggctgc cctccccccc 3360

cccctcaacc ccttctcccc cctcaccccc accccggggg gtacttgttt ggaacgcacc 3420

ctgtctcagc tgaagaggaa ctgcaatctg cgacaccaga gtggacaacc ctccagcact 3480

cgctgctttt ccgttgccat gtcaaccccg cggccatggg acagcaagga cggcaacccg 3540

tttcttcata actacatccc gccaaattcg ttggttacct ctctataatg ttaagctcgt 3600

cttcttctct cccctcaaag tgtgcggggt ttgcgacatg gaggacagac aggaagagca 3660

tttggatcga ccccaaagca gcgtgtgcgg tggcaagtta ctgggctcag tgcaaccgga 3720

gctttggtgt catcggacac atcagagcta ctctatatct tgctgcagtt ggcaattcaa 3780

tcatgcggcc atgcaactca attcactccg ctgctgccca ggaaatggag gaagccgatt 3840

ggggccccaa agcaggcccg gccccaccag ccaccgcaga gttatctgaa catgccaacc 3900

cgacgtctac gcagtcaccg atgctgcccc cgccttaccc ccaccacgac gaaggctgga 3960

agtgagaagc ccggctacgg tttcgaaatt agcacggccg gggggggggg ggggggttca 4020

ccccttgatg gtgtgtcggc agtccttaat gggatattgg gtaatgggga gctatcaagg 4080

ttgtgttgta catacatctc ggtctcgggt ccggatggcc taccctgtcc accttccccc 4140

gtccaagaag caaccttggc atcttagcta actcggttgg cacttcgcga tccccatttc 4200

atgtatatag cccaaaggga aggaaaaaaa aaggaagatc tcaaaggctg ctatgtatca 4260

accgttctcg tgggctgttc gctattccct ggttttcgat gctcagttca gggcgtcgct 4320

tgggagtatc ttggtttcct ctcttttacc atgatgttct aattctcttt acagcag 4377

<210> 30

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

gtgggcgctt acacagtaca cgaggacttc gacgttatct gatattgaag gagcatt 57

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

ctgatgtcga acctcggagg acgtcaaggt acatgtcaaa tctcggtgac gggcaggac 59

<210> 32

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

gtaccgcccc gtccggtcct gcccgtcacc gagatttgac atgtaccttg acgtcctc 58

<210> 33

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

ggagtccatt gccacggccg aatcagcgga agacattctg aagaacgaaa ctggcga 57

<210> 34

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

ttaagcgcaa gtcgccagtt tcgttcttca gaatgtcttc cgctgattcg gccgt 55

<210> 35

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

ccagtcgatc tcgacttgct caaagtagcc gtagtagatg tgaggggttt cttggt 56

<210> 36

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

tatttatctg ccatgtcaat gccccagatg atgtgagggg tttcttggtt ggggaag 57

<210> 37

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

aatgccccag atccctgtgc cacagcccag tccaccgatg tgaggggttt cttggt 56

<210> 38

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

gtgccccctt ccccaaccaa gaaacccctc acatctacta cggctacttt gagca 55

<210> 39

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

gtgccccctt ccccaaccaa gaaacccctc acatcatctg gggcattgac atggc 55

<210> 40

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

gcccccttcc ccaaccaaga aacccctcac atcggtggac tgggctgtgg cacagggat 59

<210> 41

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

gtaatccatg acagcaacaa caggccagga ctcaccgtgg ctttctggcg gta 53

<210> 42

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

gttacacatc tttaccgcca gaaagccacg gtgagtcctg gcctgttgtt gctg 54

<210> 43

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

gtcatgtgat tgtaatcgac cgacggaatt gaggatctgc tgtaaagaga attaga 56

Claims

1.一种重组嗜热毁丝霉菌在生产琥珀酸中的应用，其特征在于：所述重组嗜热毁丝霉菌是利用基因工程方法抑制嗜热毁丝霉菌细胞中的调控因子LaeA的活性或表达水平而获得。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，生产琥珀酸时的碳源底物选自单糖、多糖、聚糖、植物生物质、或其组合。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多糖选自蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，纤维寡糖，木二糖，木寡糖或其组合；所述聚糖选自纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉或其组合；所述的单糖选自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其组合。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控因子LaeA为如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制嗜热毁丝霉菌细胞中的调控因子LaeA的活性或表达水平是通过对所述调控因子LaeA进行敲除、或突变、或表达水平被下调来实现。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调控因子LaeA的突变是通过基因工程的方法对LaeA蛋白的第88位至第175位氨基酸进行删除以实现其活性的丧失或下降。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调控因子LaeA的突变是通过基因工程的方法对LaeA蛋白的第89至第96位氨基酸进行删除以实现其活性的丧失或下降。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，调控因子LaeA的突变是通过基因工程的方法对LaeA蛋白的第89至90位氨基酸进行替换以使其活性丧失或下降。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，抑制表达水平通过所述调控因子LaeA的抑制剂来实现。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂选自所述调控因子LaeA的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA或者活性抑制剂。