CN112779174A - 一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌由原始酿酒酵母利用CRISPR‑Cas9技术敲除基因Cln3后改造而成，敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显增强，在固定化发酵中形成的生物被膜增多，增加了生物产量，缩短了发酵周期，提高了发酵效率。

Description

一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于基因工程及微生物技术领域，具体涉及一株利用CRISPR-Cas9技术敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，更重要的是，生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇，展现了固定化细胞出色的发酵效率和发酵能力。
成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，即CRISPR)II型系统是细菌免疫系统，现已被改造用于基因工程。CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内，CRISPR-Cas9技术风靡全球，成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株利用CRISPR-Cas9技术敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。
发明思路：核细胞周期由一系列环素和激酶伙伴驱动，包括酵母中的G1环素Cln3。作为此级联的第一步，Cln3具有独特的定位，可以确定分部的关键增长率阈值。有数据表明(Michael Polymenis,Emmett V.Schmidt.Coupling of cell division to cell growthby translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast[J].Cold Spring HarborLaboratory Press,1997,11(19).)，Cln3的转化调控提供了一个机制耦合细胞生长和分裂。因此，本发明选取Cln3基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以提高固定化发酵中生物被膜量，进而提高发酵效率和发酵能力。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母的Cln3基因失活。
其中，所述酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308。
其中，所述Cln3基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Cln3基因失活前的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将Cas9质粒上gRNA scaffold序列上的靶位点改为基因Cln3的靶位点，优选地，选用pCAS#60847基因靶位点可以是任何满足以下两点条件的约20nt的DNA序列，该序列在基因组中是特异存在的；靶位点紧邻着PAM(Protospacer Adjacent Motif)区并位于PAM区上游；
(2)提取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因组；
(3)以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，在Cln3基因的靶向序列的上下游各设置长度为500bp的同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以Cln3基因的上游同源臂、下游同源臂为模板，通过重叠PCR扩增得到基因敲除片段；
(4)将步骤(1)和(3)得到的质粒和基因敲除片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得Cln3基因失活的酿酒酵母基因工程菌。
步骤(3)中，扩增Cln3基因上游同源臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
步骤(3)中，所述Cln3基因上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
步骤(3)中，扩增Cln3基因下游同源臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。
步骤(3)中，所述Cln3基因下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
步骤(3)中，所述重叠PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。
步骤(3)中，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
步骤(4)中，利用含有500g/mLG418的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌在促进生物膜形成中的应用。
进一步地，本发明公开了上述酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用。
其中，所述酿酒酵母基因工程菌的种子液按照5％～20％的体积比接种于发酵培养基中；优选为按照10％的体积比。
优选地，通过固定化发酵制备乙醇。
其中，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。
优选地，所述固定化发酵以棉纤维材料作为固定化介质。
其中，所述固定化介质的浓度为10～70g/L，优选为40g/L。
其中，所述发酵的温度为30℃-40℃。
其中，所述发酵的时间为20-30h。
其中，所述发酵的发酵培养基配方如下：50-110g/L葡萄糖，3-6g/L蛋白胨、0.3-0.6g/L硫酸铵、2-5g/L磷酸二氢钾、2-5g/L酵母膏、0.3-0.6g/L硫酸镁、0.01-1g/L七水合硫酸亚铁、0.01-1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
优选地，所述酵的发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明公开了一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌，由于原始菌株S288c在固定化发酵中生物被膜形成过少，导致其发酵周期较长，发酵效率较低，而敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显增强，在固定化发酵中形成的生物被膜增多，增加了生物产量，缩短了发酵周期，提高了发酵效率。
附图说明
图1为实施例1中Cln3基因上游、下游同源臂的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，up：Cln3F(500bp)，down：Cln3R(500bp)；
图2为实施例1中Cln3基因敲除片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，基因敲除片段：1000bp；
图3为实施例1中质粒构建片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，片段1：756bp，片段2：201bp；
图4为实施例1中质粒构建片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，质粒构建片段：937bp；
图5为实施例1中Cln3基因缺失转化子的PCR鉴定电泳图，其中，M：DNA分子量marker；W为原始对照组，1、2、3、4、5全部为阳性转化子(1100bp)；
图6为实施例2中原始菌S288c(W)与Cln3基因敲除菌(ΔCln3)在96孔板培养1天孔板染色脱色图；
图7为实施例3中原始菌S288c(W)与Cln3基因敲除菌(ΔCln3)在游离发酵与固定化发酵的发酵残糖数据；
图8为实施例3中原始菌S288c(W)与Cln3基因敲除菌(ΔCln3)在游离发酵与固定化发酵的发酵产物乙醇数据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：重组菌S288c-ΔCln3的构建
一、Cln3基因敲除片段的构建
(1)以原始酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288c)的基因组DNA为模板，利用普通PCR扩增得到Cln3基因的上游、下游同源臂扩增片段(上游同源臂扩增引物序列Cln3-up-F、Cln3-up-R分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；下游同源臂扩增引物序列Cln3-down-F、Cln3-down-R分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)；PCR反应体系见表1，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，见图1，切胶回收PCR扩增得到的Cln3基因的上游、下游同源臂扩增片段，Cln3基因的上游同源臂扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，Cln3基因的下游同源臂扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002916302670000051
(2)以步骤(1)得到的Cln3基因的上游同源臂、下游同源臂为模板，以Cln3-up-F为上游引物，以Cln3-down-R为下游引物(Cln3-up-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Cln3-down-R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，利用重叠PCR技术扩增Cln3基因敲除片段。反应体系见表2，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图2，切胶回收得到酿酒酵母Cln3基因敲除组件。基因敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO.11所示。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002916302670000052
Figure BDA0002916302670000061
二、质粒改造
(1)利用限制性内切酶SnaBⅠ和BglⅡ获得线性化质粒pCAS#60847，线性化体系见表3，胶回收大片段。以pCAS#60847序列为模板，利用普通PCR扩增得到包含Cln3基因靶位点的两个片段1、2(片段1扩增引物序列1-F、1-R分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；片段2扩增引物序列2-F、2-R分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；靶位点序列如SEQ IDNO.16所示)；PCR反应体系见表4，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，见图3，切胶回收PCR扩增得到的片段1和2，片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
表3质粒线性化体系
Figure BDA0002916302670000062
表4 PCR反应体系
Figure BDA0002916302670000063
Figure BDA0002916302670000071
(2)以步骤(1)得到的片段1和2为模板，以1-F为上游引物，以2-R为下游引物(1-F核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，2-R核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)，利用重叠PCR技术扩增片段。反应体系见表5，PCR反应条件如下：1)95℃预变性3min；2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，三个步骤进行35次循环，72℃再延伸5min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。其中，退火温度取决于引物的Tm值，72℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图4，切胶回收得到酿酒酵母Cln3基因靶位点组件。靶位点片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
表5 PCR反应体系
Figure BDA0002916302670000072
(3)利用一步克隆操作将步骤(2)中重叠PCR技术扩增片段与酶切质粒导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α—pCAS#60847—Cln3菌株。提取所获得的目标大肠杆菌的质粒。一步克隆操作严格按照Vazyme公司一步克隆试剂盒内附操作步骤进行操作。质粒提取过程完全按照Takara公司质粒提取试剂盒内附的操作要求进行操作。
(5)质粒酶切验证并测序。
三、酿酒酵母菌株感受态制备。
(1)挑取酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae S288c接种于YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养，得到活化种子液；
(2)按照体积比1％的接种比例，将种子液转接至100mL新鲜的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8-1.2之间；
(3)将步骤(2)得到的菌液冰水浴预冷30min，低温高速离心机4℃、4000r/min离心5min收集菌体；
(4)用25mL预冷无菌水重悬菌体，低温高速离心机4℃、4000r/min离心5min收集菌体，重复两次；用10mL预冷的1M山梨醇水溶液重悬菌体，低温高速离心机4000r/min、4℃离心5min收集菌体，重复两次；
(5)用1mL1 M山梨醇水溶液重悬菌体，分装每管100μL。
四、酿酒酵母菌株感受态转化及转化子的鉴定。
(1)步骤二所得分装后的菌液取1管，加入1μL pCAS#60847—Cln3质粒和5uL步骤一得到的基因敲除片段，混合后转入电转杯；
(2)冰上放置5min；
(3)1.5kv电击5.0ms，加入1mLYPD培养基将电转液洗出，于30℃、200r/min培养1h；
(4)涂布于含有500μg/mLG418的YPD培养基平板上，于30℃培养至菌落长出；
(5)挑取步骤(4)得到的转化子并提取基因组作为模板，使用验证引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)进行菌落PCR扩增以鉴定Cln3基因被敲除的阳性转化子，见图5；Cln3基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(6)挑选阳性转化子S288c-ΔCln3接入5mL含有500μg/mLG418的YPD液体培养基中活化24h，与灭菌的30％甘油1：1混合，-80℃保藏。
上述过程所使用的引物如下：
CGCCTGGCGTTGTCCTTTCTGCCCC(Cln3-up-F)-SEQ ID NO.3
aaatatcaggacgaagatggTACATGGTTTCCAATTCTTG(Cln3-up-R)-SEQ ID NO.4
acaagaattggaaaccatgtACCATCTTCGTCCTGATATTT(Cln3-down-F)-SEQ ID NO.5
AATGAGGAAACAAGAGATAATTGGT(Cln3-down-R)-SEQ ID NO.6
atcactcgattggtccatctgtcag-SEQ ID NO.7
tctgaatcaaatcataccgcaaaac-SEQ ID NO.8
GTCTCTATATACTACGTATAGGAAATG-SEQ ID NO.12
CTGTGGATTGTGATTTTAATAAAGTCCCATTCGCCACCCG-SEQ ID NO.13
ATTAAAATCACAATCCACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-SEQ ID NO.14
GCAAGCTAAACAGATCTCTAGACCTATATC-SEQ ID NO.15
实施例2
(1)各取10μL甘油菌S288c(原始菌)和S288c-ΔCln3(实施例1构建得到的敲除菌)加入灭菌的5mLYPD液体培养基中过夜培养，活化；
(2)按照体积比1％的接种比例，将步骤(1)所得的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在2.0左右；
(3)取2mL步骤(2)所得菌液在OD600下测量吸光值，用灭菌的YPD液体培养基稀释菌液，使得稀释后菌液OD600为1；
(4)取190μLYPD培养基和10μL步骤(3)稀释后的菌液加入96孔板，30℃培养24h；
(5)将96孔板菌液倒出，用0.01M PBS缓冲液缓冲3次，拍干；
(6)取1％结晶紫溶液200μL加入96孔板，染色10min，PBS缓冲液冲洗，晾干；
(7)取冰醋酸200μL加入96孔板溶解后，轻轻振荡，OD570测量生物膜产率，取平均值：S288c在96孔板培养24h OD值为0.4左右，S288c-ΔCln3的敲除菌株在96孔板培养24hOD值为0.7左右。实验结果如图6所示，表明敲除Cln3基因的酿酒酵母生物被膜明显增多。
实施例3
(1)各取10μL甘油菌S288c(原始菌)和S288c-ΔCln3(实施例1构建得到的敲除菌)加入灭菌的5mLYPD液体培养基中过夜培养，活化；
(2)按照体积比1％的接种比例，将步骤(1)所得的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8～1.2之间；
(3)将步骤(2)的种子液按10％的接种体积比例转接至100mL的发酵培养基中，分为游离发酵与固定化发酵两种。
进行固定化发酵时：向发酵培养基中加入棉纤维材料作为固定化材料，每个摇瓶中加入4g棉纤维介质；于30℃、200r/min发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用测糖仪测定各时段发酵液残糖量，高效气相色谱仪测定发酵液中酒精的含量；
进行分离发酵时：仅不添加固定化材料，其余与固定化发酵相同；
其中，发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
(4)发酵结果见图7和图8(W-野生菌游离发酵，WI-野生菌固定化发酵，ΔCln3-敲除菌游离发酵，ΔCln3I-敲除菌固定化发酵)由发酵数据可以看出，固定化发酵比游离发酵有较快的耗糖速率和较高的乙醇产量；原始菌株S288c和基因改造菌株S288c-ΔCln3固定化发酵的周期分别为31h和23h，基因改造菌株发酵周期缩短约8h，耗糖率提高了约35％；在固定化发酵终点时，原始菌株S288c和基因改造菌株S288c-ΔCln3乙醇产量分别为21g/L和32g/L，基因改造菌株乙醇产量提高约为11g/L，发酵效率提高了约52％。
序列表
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<211> 1743
<212> DNA
<213> Cln3基因失活前的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccatat tgaaggatac cataattaga tacgctaatg caaggtatgc taccgctagt 60
ggcacttcca ccgccactgc cgcctctgtc agcgctgcct catgtcctaa tttgcccttg 120
ctcttgcaaa agaggcgggc cattgctagt gcaaagtcta aaaaccctaa tctcgttaaa 180
agagaattgc aagcacatca ctcagcgatc agcgaataca ataatgatca attggaccac 240
tatttccgtc tttcccacac agaaaggccg ctgtacaacc tgactaactt caactctcag 300
ccacaagtta atccgaagat gcgtttcttg atctttgact tcatcatgta ctgtcacaca 360
agactcaatc tatcgacctc gactttgttc cttactttca ctatcttgga caagtattcc 420
tcgcggttca ttatcaagag ttacaactac cagctcttgt ccttgaccgc gctttggatt 480
tcgtccaaat tttgggactc caagaataga atggccactt tgaaagtctt gcaaaacttg 540
tgttgcaatc aatattctat aaagcaattc acgactatgg aaatgcatct tttcaaatca 600
ctcgattggt ccatctgtca gtcggcaaca ttcgactcct acatcgacat cttcttgttc 660
caatctacgt ccccgttatc gcctggcgtt gtcctttctg cccctttgga agctttcatt 720
caacagaaac tggccttatt aaataacgct gctggtactg ctattaataa atcgtcctct 780
tctcaaggcc cctctttgaa catcaacgag atcaaattgg gtgccattat gttgtgcgag 840
ttagcttcct tcaatctcga attatcattt aaatatgatc gttcactaat tgcgctgggt 900
gcaattaacc tcatcaaatt atctttgaac tactataatt caaacctttg ggaaaatatc 960
aatctggctt tggaggaaaa ctgccaagac ctagatatta aattgtcaga aatctctaat 1020
actttattgg atatagcaat ggaccaaaat tctttcccct ccagtttcaa atcaaaatat 1080
ttgaatagca ataagacatc tttagcaaaa tctctcttag acgcattaca aaactattgt 1140
attcaattga aactggaaga attctaccgt tcacaagaat tggaaaccat gtacaatact 1200
atctttgctc agtcctttga cagcgattca ttgacttgtg tttactcaaa tgctactact 1260
ccaaagagcg ctacggtttc atctgcggcc acagactatt tctcggatca cactcattta 1320
agaaggttga ccaaagatag catttctcca ccatttgcct tcactccaac ctcatcttca 1380
tcctctccat ctccattcaa ttccccttac aagacttcaa gttcaatgac gaccccagac 1440
tctgcatcac accattcaca ttcaggttcg ttctcttcta cccaaaattc ttttaaaagg 1500
tcactgagca tcccacaaaa ttcaagcatc ttttggccaa gcccactaac tcccaccacc 1560
ccatctctaa tgtcaaatag aaaattatta caaaatttat ctgtgcgttc aaaaagatta 1620
tttcctgtta gacccatggc cactgctcac ccatgctctg cccccaccca actgaaaaag 1680
agatcaactt cctctgtgga ttgtgatttt aatgatagta gcaacctcaa gaaaactcgc 1740
tga 1743
<210> 2
<211> 1243
<212> DNA
<213> Cln3基因失活后前的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccatat tgaaggatac cataattaga tacgctaatg caaggtatgc taccgctagt 60
ggcacttcca ccgccactgc cgcctctgtc agcgctgcct catgtcctaa tttgcccttg 120
ctcttgcaaa agaggcgggc cattgctagt gcaaagtcta aaaaccctaa tctcgttaaa 180
agagaattgc aagcacatca ctcagcgatc agcgaataca ataatgatca attggaccac 240
tatttccgtc tttcccacac agaaaggccg ctgtacaacc tgactaactt caactctcag 300
ccacaagtta atccgaagat gcgtttcttg atctttgact tcatcatgta ctgtcacaca 360
agactcaatc tatcgacctc gactttgttc cttactttca ctatcttgga caagtattcc 420
tcgcggttca ttatcaagag ttacaactac cagctcttgt ccttgaccgc gctttggatt 480
tcgtccaaat tttgggactc caagaataga atggccactt tgaaagtctt gcaaaacttg 540
tgttgcaatc aatattctat aaagcaattc acgactatgg aaatgcatct tttcaaatca 600
ctcgattggt ccatctgtca gtcggcaaca ttcgactcct acatcgacat cttcttgttc 660
caatctacgt ccccgttatc gcctggcgtt gtccaatact atctttgctc agtcctttga 720
cagcgattca ttgacttgtg tttactcaaa tgctactact ccaaagagcg ctacggtttc 780
atctgcggcc acagactatt tctcggatca cactcattta agaaggttga ccaaagatag 840
catttctcca ccatttgcct tcactccaac ctcatcttca tcctctccat ctccattcaa 900
ttccccttac aagacttcaa gttcaatgac gaccccagac tctgcatcac accattcaca 960
ttcaggttcg ttctcttcta cccaaaattc ttttaaaagg tcactgagca tcccacaaaa 1020
ttcaagcatc ttttggccaa gcccactaac tcccaccacc ccatctctaa tgtcaaatag 1080
aaaattatta caaaatttat ctgtgcgttc aaaaagatta tttcctgtta gacccatggc 1140
cactgctcac ccatgctctg cccccaccca actgaaaaag agatcaactt cctctgtgga 1200
ttgtgatttt aatgatagta gcaacctcaa gaaaactcgc tga 1243
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 上游同源臂扩增引物序列Cln3-up-F(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcctggcgt tgtcctttct gcccc 25
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 上游同源臂扩增引物序列Cln3-up-R(Artificial Sequence)
<400> 4
aaatatcagg acgaagatgg tacatggttt ccaattcttg 40
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 下游同源臂扩增引物序列Cln3-down-F(Artificial Sequence)
<400> 5
acaagaattg gaaaccatgt accatcttcg tcctgatatt t 41
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 下游同源臂扩增引物序列Cln3-down-R(Artificial Sequence)
<400> 6
aatgaggaaa caagagataa ttggt 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 验证引物(Artificial Sequence)
<400> 7
atcactcgat tggtccatct gtcag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 验证引物(Artificial Sequence)
<400> 8
tctgaatcaa atcataccgc aaaac 25
<210> 9
<211> 500
<212> DNA
<213> Cln3基因上游同源臂的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctttctgccc ctttggaagc tttcattcaa cagaaactgg ccttattaaa taacgctgct 60
ggtactgcta ttaataaatc gtcctcttct caaggcccct ctttgaacat caacgagatc 120
aaattgggtg ccattatgtt gtgcgagtta gcttccttca atctcgaatt atcatttaaa 180
tatgatcgtt cactaattgc gctgggtgca attaacctca tcaaattatc tttgaactac 240
tataattcaa acctttggga aaatatcaat ctggctttgg aggaaaactg ccaagaccta 300
gatattaaat tgtcagaaat ctctaatact ttattggata tagcaatgga ccaaaattct 360
ttcccctcca gtttcaaatc aaaatatttg aatagcaata agacatcttt agcaaaatct 420
ctcttagacg cattacaaaa ctattgtatt caattgaaac tggaagaatt ctaccgttca 480
caagaattgg aaaccatgta 500
<210> 10
<211> 500
<212> DNA
<213> Cln3基因下游同源臂的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatcttcgt cctgatattt gatcttggtg attggtgaaa tgttgttatt atgtgtattc 60
gaaattttag aattgatcgc cattatcaag tcgtcaaaat tccaaacttt ttctaccaaa 120
agtgtgaaga tctcgctact agaggtatta ttagagttgt tattatatga tatcctgaag 180
agtatggaag attctggaat agagttcttg aaattttctg aaatggattt aatttcactt 240
tcgaaacttg atgaagtggt cctccgttta ggcaggacat ccgaaaccct tttcatatga 300
gaacttgaga aagaagccat actatcgtgt gtctggcggc tgttgtgatg attcggtgta 360
ttcatagttg tggtgggtga catcattgaa gatgatttgg ctgtcgatga agtcgtcgat 420
gttgaagagt gatgtcttgc cttaaactgc tcatttttca gatcatgaat caactgttgt 480
aaacacgatg accaattatc 500
<210> 11
<211> 1000
<212> DNA
<213> 基因敲除片段的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctttctgccc ctttggaagc tttcattcaa cagaaactgg ccttattaaa taacgctgct 60
ggtactgcta ttaataaatc gtcctcttct caaggcccct ctttgaacat caacgagatc 120
aaattgggtg ccattatgtt gtgcgagtta gcttccttca atctcgaatt atcatttaaa 180
tatgatcgtt cactaattgc gctgggtgca attaacctca tcaaattatc tttgaactac 240
tataattcaa acctttggga aaatatcaat ctggctttgg aggaaaactg ccaagaccta 300
gatattaaat tgtcagaaat ctctaatact ttattggata tagcaatgga ccaaaattct 360
ttcccctcca gtttcaaatc aaaatatttg aatagcaata agacatcttt agcaaaatct 420
ctcttagacg cattacaaaa ctattgtatt caattgaaac tggaagaatt ctaccgttca 480
caagaattgg aaaccatgta ccatcttcgt cctgatattt gatcttggtg attggtgaaa 540
tgttgttatt atgtgtattc gaaattttag aattgatcgc cattatcaag tcgtcaaaat 600
tccaaacttt ttctaccaaa agtgtgaaga tctcgctact agaggtatta ttagagttgt 660
tattatatga tatcctgaag agtatggaag attctggaat agagttcttg aaattttctg 720
aaatggattt aatttcactt tcgaaacttg atgaagtggt cctccgttta ggcaggacat 780
ccgaaaccct tttcatatga gaacttgaga aagaagccat actatcgtgt gtctggcggc 840
tgttgtgatg attcggtgta ttcatagttg tggtgggtga catcattgaa gatgatttgg 900
ctgtcgatga agtcgtcgat gttgaagagt gatgtcttgc cttaaactgc tcatttttca 960
gatcatgaat caactgttgt aaacacgatg accaattatc 1000
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 片段1扩增引物序列1-F(Artificial Sequence)
<400> 12
gtctctatat actacgtata ggaaatg 27
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 片段1扩增引物序列1-R(Artificial Sequence)
<400> 13
ctgtggattg tgattttaat aaagtcccat tcgccacccg 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 片段2扩增引物序列2-F(Artificial Sequence)
<400> 14
attaaaatca caatccacag gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 片段2扩增引物序列2-R(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaagctaaa cagatctcta gacctatatc 30
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 靶位点序列(Artificial Sequence)
<400> 16
attaaaatca caatccacag 20
<210> 17
<211> 756
<212> DNA
<213> 片段1的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtctctatat actacgtata ggaaatgttt acattttcgt attgttttcg attcactcta 60
tgaatagttc ttactacaat ttttttgtct aaagagtaat actagagata aacataaaaa 120
atgtagaggt cgagtttaga tgcaagttca aggagcgaaa ggtggatggg taggttatat 180
agggatatag cacagagata tatagcaaag agatactttt gagcaatgtt tgtggaagcg 240
gtattcgcaa tattttagta gcccgttaca gtccggtgcg tttttggttt tttgaaagtg 300
cgtcttcaga gcgcttttgg ttttcaaaag cgctctgaag ttcctatact ttctagagaa 360
taggaacttc ggaataggaa cttcaaagcg tttccgaaaa cgagcgcttc cgaaaatgca 420
acgcgagctg cgcacataca gctcactgtt cacgtcgcac ctatatctgc gtgttgcctg 480
tatatatata tacatgagaa gaacggcata gtgcgtgttt atgcttaaat gcgtatatgt 540
gttatgtagt atactctttc ttcaacaatt aaatactctc ggtagccaag ttggtttaag 600
gcgcaagact gtaatttatc actacgaaat cttgagatcg ggcgttcgac tcgcccccgg 660
gagagatggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa caccttcggg 720
tggcgaatgg gactttatta aaatcacaat ccacag 756
<210> 18
<211> 201
<212> DNA
<213> 片段2的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 18
attaaaatca caatccacag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttatttttt gtcactattg 120
ttatgtaaaa tgccacctct gacagtatgg aacgcaaact tctgtctagt ggatataggt 180
ctagagatct gtttagcttg c 201
<210> 19
<211> 937
<212> DNA
<213> 靶位点片段的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtctctatat actacgtata ggaaatgttt acattttcgt attgttttcg attcactcta 60
tgaatagttc ttactacaat ttttttgtct aaagagtaat actagagata aacataaaaa 120
atgtagaggt cgagtttaga tgcaagttca aggagcgaaa ggtggatggg taggttatat 180
agggatatag cacagagata tatagcaaag agatactttt gagcaatgtt tgtggaagcg 240
gtattcgcaa tattttagta gcccgttaca gtccggtgcg tttttggttt tttgaaagtg 300
cgtcttcaga gcgcttttgg ttttcaaaag cgctctgaag ttcctatact ttctagagaa 360
taggaacttc ggaataggaa cttcaaagcg tttccgaaaa cgagcgcttc cgaaaatgca 420
acgcgagctg cgcacataca gctcactgtt cacgtcgcac ctatatctgc gtgttgcctg 480
tatatatata tacatgagaa gaacggcata gtgcgtgttt atgcttaaat gcgtatatgt 540
gttatgtagt atactctttc ttcaacaatt aaatactctc ggtagccaag ttggtttaag 600
gcgcaagact gtaatttatc actacgaaat cttgagatcg ggcgttcgac tcgcccccgg 660
gagagatggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa caccttcggg 720
tggcgaatgg gactttatta aaatcacaat ccacaggttt tagagctaga aatagcaagt 780
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttta 840
ttttttgtca ctattgttat gtaaaatgcc acctctgaca gtatggaacg caaacttctg 900
tctagtggat ataggtctag agatctgttt agcttgc 937

Claims (10)

1.一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，该菌株由原始酿酒酵母的Cln3基因失活后改造得到，所述Cln3基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述原始酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所用Cln3基因通过CRISPR-Cas9敲除。
4.权利要求1-3任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将Cas9质粒上gRNA scaffold序列上的靶位点改为基因Cln3的靶位点，得到修改后的质粒；
（2）提取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因组；
（3）以步骤（2）得到的基因组DNA为模板，在Cln3基因的靶向序列的上下游各设置长度为500bp的同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以Cln3基因的上游同源臂、下游同源臂为模板，通过重叠PCR扩增得到基因敲除片段；
（4）将步骤（1）和（3）得到的修改后质粒和基因敲除片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得Cln3基因失活的酿酒酵母基因工程菌。
5.权利要求1-3中任意一项所述酿酒酵母基因工程菌在促进生物膜形成中的应用。
6.权利要求1-3中任意一项所述酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过固定化发酵制备乙醇。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为30℃-40℃。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵的发酵培养基配方如下：50-110g/L葡萄糖，3-6 g/L蛋白胨、0.3-0.6 g/L硫酸铵、2-5 g/L磷酸二氢钾、2-5 g/L酵母膏、0.3-0.6 g/L硫酸镁、0.01-1 g/L七水合硫酸亚铁、0.01-1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAURA L. NEWCOMB, ET AL.,: ""Glucose Regulation of Saccharomyces cerevisiae Cell Cycle Genes"", 《EUKARYOTIC CELL》 *
倪坚: ""Cln3缺失对酿酒酵母生长的影响"", 《实验生物学报》 *

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