CN110747138B - 一株酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一株酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌，属于微生物基因工程领域。本发明还公开了基因工程菌的构建方法，利用金担子素抗性标记AurR基因构建了FLO8基因敲除组件并成功转化酿酒酵母酵母菌株。本发明进一步地公开了基因工程菌在固定化发酵生产模型中的应用。与原始菌株相比，本发明使酿酒酵母在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中，形成的生物被膜减少，黏附性降低，游离细胞明显增多。

Description

一株酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
生物膜也称为生物被膜，一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，这些都是由生物膜的结构决定的。生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。固定化发酵和游离细胞发酵相比在固定化发酵中形成的生物膜，能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率，尤其是在分批发酵中，固定化细胞发酵能表现出更高的底物耐受性和更快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇。随着发酵批次的增加，固定化发酵体系会最终到达一个最佳稳定状态，此时的固定化细胞可以以4h的稳定发酵周期持续进行几十个批次的发酵，展现了固定化细胞出色的发酵效率和良好的发酵稳定性。
发明内容
发明目的：为了解决现有的酿酒酵母菌株絮凝特性强以及固定化发酵中生物被膜量多的问题，本发明第一方面提供了一株敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌，可定向减弱其絮凝特征以及固定化发酵中生物被膜量；第二方面提供了敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌的构建方法；第三方面提供了敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用。
技术方案：本发明第一方面所述一株酿酒酵母基因工程菌，该菌株由原始酿酒酵母的FLO8基因失活得到。FLO8基因是调控FLO基因家族的关键基因，是FLO1，FLO5，FLO9，FLO10的转录调节因子，因此本发明选取FLO8基因作为改造对象。
优选地，所述原始酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c，可商业购买得到。未失活的FLO8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述FLO8基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明第二方面所述敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以原始酿酒酵母的基因组DNA为模板，扩增得到FLO8基因的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PYX212-AurR为模板，扩增得到金担子素抗性标记AurR基因；以FLO8基因的上游同源臂、下游同源臂和金担子素抗性标记AurR基因为模板，通过重叠PCR扩增得到基因敲除片段；
(2)将步骤(1)得到的基因敲除片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得FLO8基因失活的酿酒酵母基因工程菌。
优选地，步骤(1)中扩增FLO8基因的上游同源臂时以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为引物；扩增FLO8基因的下游同源臂时以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为引物；扩增金担子素抗性标记AurR基因时以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列为引物；重叠PCR扩增基因敲除片段时以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为引物。
优选地，所述FLO8基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，FLO8基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述金担子素抗性标记AurR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
优选地，步骤(1)中得到的基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
其中，利用含有40μg/mL金担子素的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌。
本发明第三方面提供该酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用。
优选地，以所述酿酒酵母基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备乙醇。
优选地，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。
更优选地，所述固定化发酵以棉纤维材料作为固定化介质。
优选地，所述固定化发酵的发酵温度为35℃-40℃，发酵时间为27-30h。
优选地，所述发酵培养基的配方如下：60g/L-100g/L葡萄糖，4g/L-8g/L蛋白胨、4g/L-8g/L硫酸铵、3g/L-6g/L磷酸二氢钾、3g/L-6g/L酵母膏、0.5g/L-2g/L硫酸镁、0.05g/L-1g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L-1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
更优选地，所述发酵培养基的配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、4g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
有益效果：本发明公开了一株敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌，由于原始菌株S288c在固定化发酵中生物被膜形成过多，阻碍了传质传导，导致其发酵周期的加长，而敲除FLO8基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中形成的生物被膜减少，黏附性降低，游离细胞增多，加强了传质传导，缩短了发酵周期。
附图说明
图1为实施例1中FLO8基因上游、下游同源臂，AurR基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，up：FLO8LF(520bp)，AurR：AurR基因扩增片段(1788bp)，dw：FLO8R(540bp)；
图2为实施例1中FLO8基因缺失转化子的PCR鉴定电泳图，其中，M：DNA分子量marker；W为原始对照组，1、2分别为两个阳性转化子(2468bp)；
图3为实施例2中原始菌S288c(W)与FLO8基因敲除菌(△FLO8)在96孔板培养3天孔板底部吸附菌体图；
图4为实施例3中原始菌S288c(W)与FLO8基因敲除菌(△FLO8)游离发酵中摇瓶的不同表征；
图5为实施例3中原始菌S288c(W)与FLO8基因敲除菌(△FLO8)在游离发酵与固定化发酵的发酵残糖数据；
图6为实施例3中原始菌S288c(W)与FLO8基因敲除菌(△FLO8)在游离发酵与固定化发酵的发酵产物乙醇数据。
具体实施方式
实施例1
以下实施例中用到的引物如下：
AATGAAAGAATCACGGCACG(FLO8-up-F)
ggtattctgggcctccatgtcCTAACGTCAACTCACCGTG(FLO8-up-R)
aatgctggtcgctatactgACCTAGATAGAGACAAAGGCC(FLO8-down-F)
CGTAGTGGGTTGCATTGGATA(FLO8-down-R)
ACACGGTGAGTTGACGTTAGgacatggaggcccagaatac(AurR-F)
GCCTTTGTCTCTATCTAGGTcagtatagcgaccagcattc(AurR-R)
一、FLO8基因敲除片段的构建
(1)以原始酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288c)的基因组DNA为模板，利用普通PCR扩增得到FLO8基因的上游、下游同源臂扩增片段(上游同源臂扩增引物序列FLO8-up-F、FLO8-up-R分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；下游同源臂扩增引物序列FLO8-down-F、FLO8-down-R分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示)；PCR反应体系见表1，PCR反应条件如下：1)95℃预变性4min；2)94℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸2min，三个步骤进行30次循环，68℃再延伸10min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，68℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，见图1，切胶回收PCR扩增得到的FLO8基因的上游、下游同源臂扩增片段，FLO8基因的上游同源臂扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，FLO8基因的下游同源臂扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
表1PCR反应体系
Figure BDA0002262262500000041
(2)以质粒PYX212-AurR(淼灵)为模板，利用普通PCR扩增得到AurR基因扩增片段(AurR基因扩增引物序列AurR-F、AurR-R分别如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示)；PCR反应体系见表2，PCR反应条件如下：1)95℃预变性4min；2)94℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸2min，三个步骤进行30次循环，68℃再延伸10min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，68℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。通过琼脂糖凝胶电泳，见图1，切胶回收PCR扩增得到的AurR基因扩增片段，AurR基因扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
表2PCR反应体系
Figure BDA0002262262500000051
(3)以FLO8基因的上游同源臂、下游同源臂和金担子素抗性标记AurR基因为模板，以FLO8-up-F为上引物，以FLO8-down-R为下引物(FLO8-up-F核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，FLO8-down-R核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，利用重叠PCR技术扩增FLO8基因敲除片段。反应体系见表3，PCR反应条件如下：1)95℃预变性4min；2)94℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸2min，三个步骤进行30次循环，68℃再延伸10min。其中，退火温度取决于引物的Tm值，68℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb·min-1)。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图2，切胶回收得到酿酒酵母FLO8基因敲除组件。基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
表3PCR反应体系
Figure BDA0002262262500000052
二、酿酒酵母菌株感受态制备。
(1)挑取酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae S288c接种于YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养，得到活化种子液；
(2)按照体积比10％的接种比例，将种子液转接至100mL新鲜的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8-1.2之间；
(3)将步骤(2)得到的菌液冰水浴预冷30min，低温高速离心机4℃、6000r/min离心5min收集菌体；
(4)用10mL 4℃的无菌水重悬菌体，低温高速离心机4℃、6000r/min离心5min收集菌体，重复两次；用10mL4℃的1M山梨醇水溶液重悬菌体，低温高速离心机6000r/min、4℃离心5min收集菌体，重复三次；
(5)用1mL1 M山梨醇水溶液重悬菌体，分装每管90μL。
三、酿酒酵母菌株感转化及转化子的鉴定。
(1)步骤二所得分装后的菌液取1管，加入10μL步骤一得到的基因敲除片段，混合后转入电转杯；
(2)冰上放置5min；
(3)1.5kv电击4.9ms，加入1mLYPD培养基将电转液洗出，于30℃、200r/min培养2h；
(4)涂布于含有40μg/mL金担子素的YPD培养基平板上，于30℃培养至菌落长出；
(5)挑取步骤(4)得到的转化子并提取基因组作为模板，使用验证引物(核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示)进行菌落PCR扩增以鉴定FLO8基因被敲除的阳性转化子；FLO8基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
(6)挑选阳性转化子S288c-△FLO8接入5mL含有40μg/mL金担子素的YPD液体培养基中活化24h，与灭菌的30％甘油1:1混合，-80℃保藏。
实施例2
(1)各取100μL甘油菌S288c(原始菌)和S288c-△FLO8(实施例1构建得到的敲除菌)加入灭菌的5mL YPD液体培养基中过夜培养，活化；
(2)按照体积比10％的接种比例，将步骤(1)的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8～1.2之间；
(3)取2mL菌液在OD600下测量吸光值，用灭菌的YPD液体培养基稀释菌液，使得稀释后菌液OD600为0.01；
(4)取200μL稀释后的菌液加入96孔板，LB液体培养基做对照，37℃培养24h；
(5)将96孔板菌液倒出，用0.01MPBS缓冲液缓冲3次，拍干；
(6)取1％结晶紫溶液200μL加入96孔板，染色10min，PBS缓冲液冲洗，晾干；
(7)取冰醋酸200μL加入96孔板溶解后，轻轻振荡，OD600测量生物膜产率，取平均值：S288c在96孔板培养24h OD值为2.2～2.4，S288c-△FLO8的敲除菌株在96孔板培养24hOD值为1.2～1.4。实验结果如图3所示，表明敲除FLO8基因的酿酒酵母生物被膜明显减少。
实施例3
(1)各取100μL甘油菌S288c和S288c-△FLO8加入灭菌的5mL YPD液体培养基中过夜培养，活化；
(2)按照体积比10％的接种比例，将步骤(1)的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8～1.2之间；
(3)将步骤(2)的种子液转接至100mL的发酵培养基中，分为游离发酵与固定化发酵两种，进行固定化发酵时加入棉纤维材料作为固定化材料，每个摇瓶中加入4g棉纤维介质；于35℃、200r/min发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用分光光度计测定各时段发酵液残糖量，高效气相色谱仪测定发酵液中酒精的含量；
其中，发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、4g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
(4)发酵结果见图5和图6(W-野生菌游离发酵，WI-野生菌固定化发酵，△FLO8-敲除菌游离发酵，△FLO8I-敲除菌固定化发酵)由发酵数据可以看出，固定化发酵比游离发酵有稍快的耗糖和稍高的乙醇产量；而原始菌株S288c和基因改造菌株S288c-△FLO8发酵周期分别为30h和21h，基因改造菌株发酵周期缩短约9h；在发酵终点时，原始菌株S288c和基因改造菌株S288c-△FLO8乙醇产量分别为19g/L和26g/L，基因改造菌株乙醇产量提高约为7g/L。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2808
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacaacagc agcagcagca acagcagcaa cagcagtgga taaatcaacc tacggcggaa 60
aattcggatt tgaaggaaaa aatgaactgc aagaatacgc tcaatgagta catatttgac 120
tttcttacga agtcgtcttt gaaaaacact gcagcagcct ttgctcaaga tgcgcaccta 180
gatagagaca aaggccaaaa cccagtcgac ggacccaaat ctaaagaaaa caatggtaac 240
cagaatacgt tctcgaaggt agtagataca cctcaaggct ttttgtatga atggtagcaa 300
atattctggg acatctttaa taccagttct tccagaggtg gctcagagtt cgctcagcaa 360
tattatcaac tagttcttca agaacaaagg caggaacaaa tatatagaag cttggctgtt 420
catgcggcaa ggctacaaca cgatgcagaa cgaagagggg aatatagtaa cgaggacata 480
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cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga tgtgactgtc gcccgtacat 600
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gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag cagggaaacg ctcccctcac 720
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acaaagtaca cacatttacc aattgtagat acatctcttt tttgcagatg gtcatacact 1860
tcaattgaga aatacgatat atcaaagagt gatccattgg ctgcagattc aaacgatatc 1920
gaaagtgtcc ctttgtccaa cttggaactt gactttgatc ttaatatgac tgatgaaccc 1980
agtgtaagcc cttcgttatt tgatggatct acttctgttt ctcgttcgtc cgccacgtct 2040
ataacgtcac taggtgtaaa gagggcttaa actgacaata aaaagattct tgttttcaag 2100
aacttgtcat ttgtatagtt tttttatatt gtagttgttc tattttaatc aaatgttagc 2160
gtgatttata ttttttttcg cctcgacatc atctgcccag atgcgaagtt aagtgcgcag 2220
aaagtaatat catgcgtcaa tcgtatgtga atgctggtcg ctatactgat gcgcaatgtt 2280
aatatgaacc ctataccaat tcctatggtt ggtaacccta tcgttaataa tttttccatt 2340
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ccttccggcg attttacaaa tgtagggcca acccagaatc ggagtcaaaa cgttactggc 2460
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tcgtatgtga atgctggtcg ctatactgac ctagatagag acaaaggc 1788

Claims (4)

1.酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备乙醇；所述酿酒酵母基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
(1)以原始酿酒酵母的基因组DNA为模板，扩增得到FLO8基因的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PYX212-AurR为模板，扩增得到金担子素抗性标记AurR基因；以FLO8基因的上游同源臂、下游同源臂和金担子素抗性标记AurR基因为模板，通过重叠PCR扩增得到基因敲除片段；
步骤(1)中得到的基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)将步骤(1)得到的基因敲除片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得FLO8基因失活的酿酒酵母基因工程菌；
所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌由原始酿酒酵母的FLO8基因失活得到，所述原始酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c，所述FLO8基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵的发酵温度为35℃-40℃，发酵时间为21-30h。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方如下：60g/L-100g/L葡萄糖，4g/L-8g/L蛋白胨、4g/L-8g/L硫酸铵、3g/L-6g/L磷酸二氢钾、3g/L-6g/L酵母膏、0.5g/L-2g/L硫酸镁、0.05g/L-1g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L-1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
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