CN107828707A - 一种高产大分子量γ‑聚谷氨酸的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

一种高产大分子量γ‑聚谷氨酸的基因工程菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因基因工程菌技术领域，具体涉及一种高产大分子量γ‑聚谷氨酸的基因工程菌及其构建方法，通过将生产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的ywtD基因和ggt基因敲除，获得基因工程菌，该基因工程菌相比原始的枯草芽孢杆菌生产γ‑聚谷氨酸的产量提高，分子量增大，摇瓶产量达到33.5g/L，相比原始菌株提高1.6倍；分子量为800～1000KDa，相比原始菌株提高1.8倍，能够更好的应用于γ‑聚谷氨酸的生产，提升γ‑聚谷氨酸的应用价值。

Description

一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因基因工程菌技术领域，具体涉及一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌及其构建方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA)是自然界中微生物发酵产生的一种水溶性，可生物降解，不含毒性的生物高分子化合物。它对环境无污染，为绿色生物产品，具有极佳的生物可降解性、成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性、保湿性等许多独特的理化和生物学特性，可广泛的应用在食品、农业、化妆品、保健、废水处理、卫生用品、医疗等领域。
目前，国内外对γ-聚谷氨酸的研究集中于如何达到高效表达，主要是通过诱变筛选获得优良菌株，或是采用Plackett-Burman设计等方法对培养基进行优化，以达到最佳配比。近年来，国外已经开始利用分子生物学和代谢工程的理论和技术进行γ-PGA合成相关基因和相关合成酶的研究。
基因工程技术是目前全世界应用最为广泛的一种技术，特别是在生物领域的应用，促进了该领域飞跃式的发展。通过基因改造技术，对生产菌株的改造，极大的冲击了目前的常规人工育种。为菌株的生产水平带来质的提升，是一种很好的提升菌株产量的方法。
关于γ-聚谷氨酸降解的首次报道可以追溯到1954年，Thorne等在他们早期关于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis ATCC 9945A)的研究中，发现长期培养，培养基黏度会下降，而且γ-PGA的产量也会降低，提出可能是相关的酶使γ-聚谷氨酸发生了降解，后来的研究陆续证明了γ-聚谷氨酸降解酶的存在。Suzuki等从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis IFO 16449)中克隆出一个基因称ywtD，编码γ-PGA降解酶。
另外，γ-聚谷氨酸作为高分子物质，其分子量的大小会影响其成膜性、粘结性、保湿性、可塑性等性能，从而影响其应用价值和场合，因此提高γ-聚谷氨酸的分子量对于提升γ-聚谷氨酸的使用价值和经济价值具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌，该基因工程菌发酵产生γ-聚谷氨酸的产量大，分子量大。
同时，本发明还在于提供一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法。
为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，包括敲除生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌中的ywtD基因和ggt基因，即得所述的基因工程菌。
上述ywtD基因具有GENBANK序列号为NC_017196.2的第3564228位到第3565505位核苷酸序列；上述ggT基因具有GENBANK序列号为NC_000964.3的第2004677位到第2006440位核苷酸序列。
可选的，敲除ywtD基因和ggt基因的具体方法为：
1)选定能够生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌作为出发菌株；
2)敲除ywtD基因：
A：将含有ywtD基因上下游两条同源臂的DNA分子插入质粒中，得到ywtD-质粒；
B：将筛选标记基因插入到步骤A构建的ywtD-质粒中，得到ywtD-同源重组质粒；
C：将步骤B构建的ywtD-同源重组质粒导入出发菌株，得敲除ywtD基因的菌株；
3)敲除ggT基因：
a：将含有ggT基因上下游两条同源臂的DNA分子插入质粒中，得到ggT-质粒；
b：将筛选标记基因插入到步骤a构建的ywtD-质粒中，得到ggT-同源重组质粒；
c：将ggT-同源重组质粒导入步骤2)构建的敲除ywtD基因的菌株中，得敲除ywtD基因和ggT基因的菌株，即为所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌。
可选的，步骤A中ywtD基因上下游两条同源臂为ywtD基因的5’端第200-640位点序列和720-1170位点序列。
可选的，步骤B中所述筛选标记基因为壮观霉素抗性基因。
可选的，步骤A中所述质粒为pUC19质粒；步骤A中将含有ywtD基因上下游两条同源臂的DNA分子插入质粒的EcoRI、BamHI和PstI、HinIII位点之间；步骤B中将筛选标记基因插入质粒的BamHI位点。
可选的，步骤a中ggT基因上下游两条同源臂为ggT基因的5’端第1-307位点序列和1178-1764位点序列。
可选的，步骤b中筛选标记基因为红霉素抗性基因。
可选的，步骤a中质粒为pkS质粒；步骤a中将含有ggT基因上下游两条同源臂的DNA分子插入质粒的BamHI、PstI和EcoRI、XhoI位点之间；步骤b中将筛选标记基因插入质粒的PstI和EcoRI位点间。
可选的，步骤C中通过电转化法将ywtD-同源重组质粒导入出发菌株；步骤c中通过电转化法将ggT-同源重组质粒导入步骤2)构建的敲除ywtD基因的菌株中。
一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌，由上述构建方法构建而成。
本发明高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌，通过将生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的ywtD基因和ggt基因敲除，获得基因工程菌，该基因工程菌相比原始的枯草芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的产量提高，分子量增大，摇瓶产量达到33.5g/L，分子量为800～1000KDa，能够更好的应用于γ-聚谷氨酸的生产，提升γ-聚谷氨酸的应用价值。
附图说明
图1为质粒pUC19-ΔywtD的结构图；
图2为质粒pks-ΔggT的结构图；
图3为原始菌株HBY-PBS-3L发酵生产的γ-聚谷氨酸分子量测定的凝胶液相色谱图；
图4为工程菌株MD3L发酵生产的γ-聚谷氨酸分子量测定的凝胶液相色谱图；
图5为工程菌株MT3L发酵生产的γ-聚谷氨酸分子量测定的凝胶液相色谱图；
图6为工程菌株MDT3L发酵生产的γ-聚谷氨酸分子量测定的凝胶液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。但对本发明的范围没限制，实施例中所使用的方法无特别说明均为常规方法。
下述实施例使用的枯草芽孢杆菌HBY-PBS-3L来源为从纳豆中分离筛选获得。
实施例1
一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，具体操作步骤为：
1)重组质粒pUC19-ΔywtD的构建：
采用常规分子生物学技术，将枯草芽孢杆菌的ywtD基因的5’端第200-640和720-1170位的核酸序列分别克隆到pUC19质粒的EcoRI、BamHI和PstI、HinIII位点之间，所用引物分别为
ywtDupa：5'-CGGAATTCTCCCCCGGGATGACAAAAGCGGAGATT-3'，
ywtDupb：5'-CGCGGATCCTATATTTTTCGGCCTCCTG-3'，
ywtDDna：5'-AAAACTGCAGTTCAACAGGCACTCGGC-3'，
ywtDDnb：5'-CCCAAGCTTTGTACTGGCTTGTTGCG-3'；
以pHp45为模版，以AAAAATTTTTAAAATAAAAAAGGGG为引物进行PCR扩增出壮观霉素抗性基因(sp)，壮观霉素抗性基因两端都具有BamHI位点序列，通过酶切插入到质粒pUC19的BamHI位点，将质粒命名为pUC19-ΔywtD，其结构图见图1；
2)敲除ywtD基因工程菌的构建
将质粒pUC19-ΔywtD用脱盐柱脱盐后用于电转化，具体方法为：
①接种枯草芽孢杆菌HBY-PBS-3L于3mlLB培养基中，过夜培养；
②取2.6ml步骤①的过夜培养物接入40ml(LB+0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.85～0.95，然后冰水浴10min，之后在5000g，5min，4℃条件下离心收集菌体；
③用50ml预冷的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖)，重新吹悬步骤②收集的菌体，在5000g，5min，4℃条件下离心去上清，如此漂洗4次；
④将步骤③洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖)中，每个EP管分装120μl；将60μl感受态细胞中加入50ng pUC19-ΔywtD(1～8μl)，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次；
⑤电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM(LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇)，37℃，200rpm，复苏3h后，涂布含有50ug/ml壮观霉素的LB固体平板培养基上，37℃培养24-48小时，挑取单菌落，以原始菌株枯草芽孢杆菌HBY-PBS-3L为对照进行发酵验证，并筛选得到产量高、遗传稳定性好的菌株作为进一步改造的出发菌株，为敲除ywtD基因的工程菌，记为MD3L；
3)重组质粒pks-ΔggT的构建
采用常规分子生物学技术，将枯草芽孢杆菌的ggT基因的的5’端第1-307和1178-1764位的核酸序列分别克隆到pkS质粒的BamHI、PstI和EcoRI、XhoI位点之间，所用引物分别为
ggTupa：5'-CGGGATCCAAATCAAAAATTGCTCCCCG-3'，
ggTupb：5'-AAAACTGCAGTTCCGTCATACACCATCA-3'，
ggTDna：5'-CGGAATTCAACAGCCGAAAGACAA-3'，
ggTDnb：5'-CCGCTCGAGAAGATGAAGATAGACG-3'；
以pHT45为模版，以AAAACTGCAGCAAAAAATAGGCACACGAAAAACA和CGGAATTCTTGATCCGGCAAACAAACCA为引物进行PCR扩增出红霉素抗性基因(Ery)，通过酶切插入到质粒pkS的PstI和EcoRI位点间，将质粒命名为pks-ΔggT，其结构图见图2；
4)高产大分子量γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌工程菌的构建
将质粒pks-ΔggT直接用于原生质体转化，具体方法如下：
①将在LB培养集中培养至对数中期的MD3L接种到3mL PAB液体培养集中37℃培养到菌量为1～2×108cfu/mL.；低速离心收集细胞，并重悬细胞至1/10体积的SMMP中，加入终浓度为2mg/mL的溶菌酶，37℃轻柔震荡酶解，每30分钟进行镜检，直至视野中90％的细胞都形成原生质体，然后水平转子2600g离心15分钟，采用SMMP清洗收集原生质体一次；将清洗后的原生质体重悬于初始体积1/10的SMMP中，得原生质体悬液；
②取100ng/uL的质粒50uL与等体积的SMMP混合，向混合体系中加入0.5mL步骤①制得的原生质体悬液，轻轻混匀，再加入1.5mL 40％的PEG，反应2分钟后，加入5mL SMMP稀释PEG，在2600g，10min条件下离心收集转化后的原生质体细胞，将转化后的原生质体细胞重悬与1mL SMMP溶液中，并在30℃轻柔震荡培养1.5-2小时，然后涂布含有红霉素和壮观霉素抗性的DM3筛选平板，37℃培养24-48小时，挑取单菌落，以MD3L为对照进行发酵培养，筛选得到产量高、遗传稳定性好的菌株，
记为MDT3L，即为高产大分子量γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌工程菌。
对比例1构建敲除ggt基因的枯草芽孢杆菌工程菌
将质粒pkS-ΔggT用脱盐柱脱盐后用于电转化，具体方法为：
①接种枯草芽孢杆菌HBY-PBS-3L于3mlLB培养基中，过夜培养；
②取2.6ml步骤①的过夜培养物接入40ml(LB+0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.85～0.95，然后冰水浴10min，之后在5000g，5min，4℃条件下离心收集菌体；
③用50ml预冷的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖)，重新吹悬步骤②收集的菌体，在5000g，5min，4℃条件下离心去上清，如此漂洗4次；
④将步骤③洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖)中，每个EP管分装120μl；将60μl感受态细胞中加入50ng pkS-ΔggT(1～8μl)，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次；
⑤电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM(LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇)，37℃，200rpm，复苏3h后，涂布含有50ug/ml壮观霉素的LB固体平板培养基上，37℃培养24-48小时，挑取单菌落，以原始菌株枯草芽孢杆菌HBY-PBS-3L为对照进行发酵验证，并筛选得到产量高、遗传稳定性好的菌株作为进一步改造的出发菌株，为敲除ggt基因的工程菌，记为MT3L；
试验例1工程菌生产γ-聚谷氨酸产量和分子量的试验验证
1、试验方法：
1)摇瓶试验：将待试验菌株先用种子培养基37℃培养10小时，摇床转速230r/mim，再以5％接种量接种到发酵培养基中，37℃发酵培养40小时，摇床转速230r/mim；种子培养基和发酵培养基的装液量相同，即摇瓶体积500mL，装液量1/10体积；
2)摇瓶发酵结束后，取一定体积发酵液静置去除气泡，待气泡完全去除后，加水稀释为原体积的4倍；9000r/min离心15min，除去菌体，取一定体积的上清液加入3倍体积的无水乙醇，不断搅拌后，4℃静置过夜，9000r/min离心10min，去除上清液，将得到沉淀经冷冻干燥称重，计算γ-聚谷氨酸的产量。
2、分别将HBY-PBS-3L、MD3L、MT3L和MDT3L菌株采用上述试验方法测定不同菌株发酵生产γ-聚谷氨酸的摇瓶产量，结果表明，工程菌株MDT3L的γ-聚谷氨酸摇瓶产量达到33.5g/L，工程菌株MD3L的γ-聚谷氨酸的摇瓶产量达到30.2g/L，工程菌株MT3L的γ-聚谷氨酸的摇瓶产量达到31.8g/L，而原始菌株HBY-PBS-3L的γ-聚谷氨酸的摇瓶产量仅为21g/L。本发明构建的基因工程菌株MDT3L生产γ-聚谷氨酸的产量水平是原始菌株的1.6倍，提升了γ-聚谷氨酸的产量。
3、分别将HBY-PBS-3L、MD3L、MT3L和MDT3L菌株采用上述试验方法摇瓶发酵生产γ-聚谷氨酸，采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定不同菌株的发酵产物γ-聚谷氨酸的分子量，如图3～6所示，结果表明，工程菌株MDT3L发酵得到的γ-聚谷氨酸的平均分子量为：8.11×105Da，工程菌株MD3L发酵得到的γ-聚谷氨酸的平均分子量为：5.98×105Da，，工程菌株MT3L发酵得到的γ-聚谷氨酸的平均分子量为：4.42×105Da，原始菌株HBY-PBS-3L发酵得到的γ-聚谷氨酸的平均分子量为：4.28×105Da，本发明构建的基因工程菌MDT3L发酵生产的γ-聚谷氨酸的分子量提高1.8倍。

Claims (10)

1.一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括敲除生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌中的ywtD基因和ggt基因，即得所述的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，敲除ywtD基因和ggt基因的具体方法为：
1)选定能够生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌作为出发菌株；
2)敲除ywtD基因：
A：将含有ywtD基因上下游两条同源臂的DNA分子插入质粒中，得到ywtD-质粒；
B：将筛选标记基因插入到步骤A构建的ywtD-质粒中，得到ywtD-同源重组质粒；
C：将步骤B构建的ywtD-同源重组质粒导入出发菌株，得敲除ywtD基因的菌株；
3)敲除ggT基因：
a：将含有ggT基因上下游两条同源臂的DNA分子插入质粒中，得到ggT-质粒；
b：将筛选标记基因插入到步骤a构建的ywtD-质粒中，得到ggT-同源重组质粒；
c：将ggT-同源重组质粒导入步骤2)构建的敲除ywtD基因的菌株中，得敲除ywtD基因和ggT基因的菌株，即为所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌。
3.如权利要求2所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤A中ywtD基因上下游两条同源臂为ywtD基因的5’端第200-640位点序列和720-1170位点序列。
4.如权利要求2所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤B中所述筛选标记基因为壮观霉素抗性基因。
5.如权利要求2所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤A中所述质粒为pUC19质粒；步骤A中将含有ywtD基因上下游两条同源臂的DNA分子插入质粒的EcoRI、BamHI和PstI、HinIII位点之间；步骤B中将筛选标记基因插入质粒的BamHI位点。
6.如权利要求2所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤a中ggT基因上下游两条同源臂为ggT基因的5’端第1-307位点序列和1178-1764位点序列。
7.如权利要求2所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤b中筛选标记基因为红霉素抗性基因。
8.如权利要求2所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤a中质粒为pkS质粒；步骤a中将含有ggT基因上下游两条同源臂的DNA分子插入质粒的BamHI、PstI和EcoRI、XhoI位点之间；步骤b中将筛选标记基因插入质粒的PstI和EcoRI位点间。
9.如权利要求2所述的高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤C中通过电转化法将ywtD-同源重组质粒导入出发菌株；步骤c中通过电转化法将ggT-同源重组质粒导入步骤2)构建的敲除ywtD基因的菌株中。
10.一种高产大分子量γ-聚谷氨酸的基因工程菌，其特征在于，由如权利要求1～9任一项所述的构建方法构建而成。
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